Células Pluripotenciais Induzidas

Células Pluripotenciais Induzidas
Uma vez dominados os processos envolvidos na obtenção, cultivo, e
diferenciação de CTE em células de interesse clínico, outra limitação prática deve
ser levada em conta. Apesar de bancos de CTE poderem ser eventualmente criados,
permitindo o estabelecimento de grandes coleções, elas dificilmente iriam
abranger toda a diversidade existente. Assim, as CTE teriam seu uso restrito a
receptores histo-compatíveis. Uma das alternativas à criação de bancos de CTE
envolve a reprogramação do núcleo de células somáticas (no caso, o paciente sem
doador) pelo citoplasma de um oócito, de forma a obter CTEh autólogas. Esta
abordagem é também conhecida como clonagem terapêutica uma vez que não visa
gerar um indivíduo clonado, mas somente CTE para uso terapêutico.
A reprogramação do núcleo somático induzida pelo citoplasma de oócitos
resulta da presença de diferentes moléculas, incluindo fatores de transcrição e
outras
proteínas.
Recentemente,
vários
grupos
relataram
a
indução
de
pluripotência em fibroblastos primários humanos através da transdução dos
mesmos com vetores virais expressando os genes OCT4, C-MYC, KLF4 e SOX2. As
chamadas
células-tronco
pluripotentes
induzidas
(iPS)
têm
morfologia
característica de CTEs, expressam marcadores de células pluripotentes e são
capazes de se diferenciar in vitro e in vivo em tecidos derivados dos três folhetos
embrionários. Assim, a geração de iPS a partir da indução de células somáticas por
fatores específicos, poderia representar uma alternativa para a obtenção de
células tronco histo-compatíveis.
Os resultados preliminares obtidos pelo grupo coordenado pelo Dr. Dimas
Tadeu Covas do Hemocentro de Ribeirão Preto mostram a eficiência na produção
de
vetores
lentivirais,
na
transdução
de
células-tronco
mesenquimais
e
progenitores endoteliais e na modificação do padrão de expressão de célulastronco endoteliais com gene Nanog. Assim, este grupo, através do sub-projeto 5,
intitulado “Modificação gênica de células-tronco”, terá como objetivo geral,
modificar geneticamente Células Tronco Mesenquimais (CTM) e células progenitoras
endoteliais com vetores lentivirais contendo fatores de transcrição, com o intuito
de transformar células multipotentes em células pluripotentes e com maior
capacidade de expansão in vitro. Para tanto, o projeto envolverá as seguintes
abordagens: a) transduzir CTM com vetores lentivirais 1054-CIGWS contendo um dos
fatores de transcrição (Nanog, Oct3/4, Sox 2, β-catenina, Kfl4, c-myc, Esrrb, Tcl 1e
Tbx 3) juntamente com o gene GFP para que as células transduzidas possam ser
selecionadas por citometria de fluxo (GFP positivas); b) Inicialmente, as
transduções de CTM serão realizadas com um fator de transcrição de cada vez e
posteriormente um conjunto de quatro vetores serão utilizados para transdução; c)
avaliar as alterações causadas no perfil de expressão gênica; d) avaliar mudanças
na morfologia das células transformadas; e) determinar se as células modificadas
apresentam marcadores típicos de células-tronco embrionárias (como por exemplo:
fosfatase alcalina e/ou antígenos SSEA-1) e por fim avaliar se estas células
modificadas adquirem a capacidade de se diferenciar em tecidos dos três folhetos
germinativos.
Uma grande limitação dos estudos pré-clínicos com CTEs é a falta de
modelos animais de grande porte onde se possa realizar esses testes, uma vez que
uma série de dificuldades técnicas e biológicas dificultam e/ou impedem o
estabelecimento de CTEs a partir de embriões desses modelos. Com isto em mente,
o grupo coordenado pela Dra. Lygia da Veiga Pereira da USP de São Paulo através
do sub-projeto 6, intitulado “Estabelecimento de linhagens de células tronco
pluripotentes induzidas (iPS) de modelos animais de grande porte”, pretende
desenvolver uma metodologia para estabelecer linhagens de iPS de modelos
animais de grande porte, especificamente de primatas não-humanos e cães. As
células geradas serão utilizadas em ensaios pré-clínicos de lesão de medula
espinhal nos respectivos modelos animais. Para este fim: vetores lentivirais da
empresa AddGene (EUA) serão empacotados em células 293 por co-transfecção
transiente com vetores de empacotamento; culturas de fibroblastos caninos e de
macacos serão transduzidos com lentivírus expressando o gene repórter GFP para
avaliação de eficiência de transdução com diferentes sistemas de empacotamento;
transdução dos fibroblastos animais com vetores de indução de acordo com as
condições estabelecidas acima, e isolamento de iPS em meio de cultura específico
para CTE (caso não consigamos estabelecer as iPS usando vetores com genes
humanos de indução, serão isolados os homólogos de cada espécie por RT-PCR de
embriões pré-implantação, e novos vetores espécie-específicos serão construídos e
utilizados
para
indução);
caracterização
da
pluripotência
das
iPS
por
imunofluorescência, diferenciação in vitro em corpos embrióides e in vivo por
ensaio de formação de teratomas; diferenciação neural das iPS animais por cultura
em meio com acido retinóico; transplante das células diferenciadas em modelos de
lesão de medula.
Apesar de ainda inadequadas para uso clínico, as iPS são uma ferramenta
importante de pesquisa básica, principalmente aquelas células derivadas de
indivíduos com diferentes doenças genéticas. Assim, o grupo coordenado pela Dra.
Lygia da Veiga Pereira através do sub-projeto 7, intitulado “Estabelecimento de
linhagens de células tronco pluripotentes induzidas (iPS) a partir de fibroblastos
de pacientes com doenças genéticas mendelianas e multifatoriais (com
componente genético)”, pretende implantar a metodologia de geração de iPS
humanas de forma a poder estabelecer iPS a partir de diferentes tecidos de
pacientes com doenças genéticas de interesse do grupo, particularmente pacientes
com displasia óssea, diabetes tipo I, esclerose múltipla e leucemia promielocitica
aguda. As iPS estabelecidas servirão como modelo experimental para o estudo dos
mecanismos básicos por trás das respectivas doenças. Além disso, serão construídos
novos vetores baseados em adenovirus, que não se integram ao genoma, de forma
a gerarmos iPS não modificadas geneticamente, mais adequadas para o uso clínico.
Com esta finalidade, as seguintes abordagens experimentais serão utilizadas:
vetores lentivirais da empresa AddGene (EUA) serão empacotados em células 293
por
co-transfecção
transiente
com
vetores
de
empacotamento;
células
mesenquimais de medula óssea de pacientes com diabetes tipo 1 e de leucemia
PMA congeladas serão expandidas em cultura para transdução com vetores virais;
padronização de estabelecimento de linhagem de células adequadas para indução a
partir de sangue periférico humano; transdução das células humanas com vetores
lentivirais e seleção de células iPS em meio de cultura de CTEhs; caracterização
das iPS por imunofluorescência e FACS com marcadores de células pluripotentes
(OCT4,
NANOG,
SSEA-1,2,3,4);
diferenciação
em
corpos
embrióides
e
caracterização por imunofluorescência; formação de teratomas em camundongos
SCID;
caracterização
da
pluripotência
das
iPS
por
imunofluorescência,
diferenciação in vitro em corpos embrioides e in vivo por ensaio de formação de
teratomas.
Apesar das técnicas de indiferenciação induzida pela incorporação de fatores
de transcrição no genoma de células somáticas (Takahashi e Yamanaka, 2006)
constituírem possíveis aliados à terapia celular autóloga, é importante ressaltar
neste contexto que a aplicação prática de células induzidas à diferenciação pela
modificação genética ainda precisa ser melhor estudada e avaliada (Liu, 2008). Por
outro lado, a técnica de transferência de núcleo (TN) é bem estabelecida e já se
mostrou capaz de produzir animais saudáveis a termo, confirmando a capacidade
eficiente de reprogramação de uma célula diferenciada (Wilmut, Schnieke et al.,
1997; Keefer, Keyston et al., 2002). Adicionalmente, quando utilizado como
receptor, o citoplasto bovino já se mostrou capaz de reprogramar células
diferenciadas de diversas espécies (Chen, Wen et al., 2002; Illmensee, Levanduski
et al., 2006), suportando o desenvolvimento embrionário inicial necessário para o
isolamento de células-tronco embrionárias. Aliada à reprogramação eficiente do
citoplasto, a abundância e facilidade de obtenção de material biológico torna o
modelo bovino adequado para o estabelecimento de metodologias eficientes de
obtenção de células pluripotentes de origem embrionária pela reprogramação de
células somáticas diferenciadas de diversas espécies (Cibelli, Stice et al., 1998).
Com isto em vista, o grupo coordenado pelo Dr. Flavio Vieira Meirelles da
USP de Pirassununga através do sub-projeto 8, intitulado “Células pluripotentes
autólogas geradas a partir de células somáticas diferenciadas”, terá como
objetivo geral, caracterizar metodologias de obtenção de células pluri/totipotentes
a partir de células somáticas em termos de morfologia, expressão gênica e estudos
epigenéticos. Além de determinar uma metodologia mais adequada no modelo
bovino comparando os grupos com o controle e aplicá-la no sistema interespecífico.
Para esta finalidade, inicialmente será estabelecida uma linhagem celular somática
bovina derivada do cultivo in vitro de fibroblastos adultos. Uma parte destas
células será utilizada na transdução lentiviral de fatores de transcrição
responsáveis pela indiferenciação celular (Takahashi e Yamanaka, 2006). Tais
células serão caracterizadas no modelo bovino e, juntamente com as células não
modificadas, serão utilizadas como doadoras de núcleo no processo de
transferência nuclear. Células embrionárias derivadas destes processos serão
comparadas entre si e com aquelas somáticas indiferenciadas em termos de
morfologia, expressão gênica e epigenética. Serão também comparadas com as
células embrionárias obtidas através de processos naturais de fertilização. A
metodologia que prover características mais parecidas com aquelas do grupo
controle será julgada a mais adequada para a produção de células-tronco a partir
de células somáticas diferenciadas e, portanto, será utilizada no modelo
interespecífico, onde serão produzidas células pluripotentes de primatas.
A reprogramação do núcleo de células somáticas pelo citoplasma de um
oócito implica na combinação entre o genoma nuclear de um indivíduo e o
mitocondrial de outro. Considerando o grande potencial deste tipo de abordagem
no desenvolvimento futuro da terapia celular, o controle da herança mitocondrial é
de suma importância para viabilizar i) a produção de células-tronco humanas por
reprogramação da célula doadora de núcleo em citoplasma não humano e, ii) a
produção de células-tronco humanas autólogas (Illmensee, Levanduski et al.,
2006). Neste sentido, o modelo bovino é interessante pela abundância de material
disponível e pelo grande conhecimento disponível sobre os mecanismos que
regulam a herança do DNA mitocondrial (mtDNA) durante a embriogênese. Em
embriões bovinos produzidos por transferência de núcleo de células somáticas, a
porcentagem de mtDNA da célula doadora de núcleo aumenta entre o terceiro e o
quarto ciclo celular em relação ao mtDNA proveniente do oócito (Ferreira,
Meirelles et al., 2007). Por outro lado, a centrifugação de zigotos bovinos
possibilita a depleção mecânica de parte das mitocôndrias sem comprometer o
desenvolvimento embrionário, pois o embrião é capaz de repor o mesmo conteúdo
de mtDNA observado em blastocistos não depletados (Chiaratti et al., 2008). Além
disso, com a depleção mitocondrial é possível introduzir uma maior quantidade de
mitocôndrias exógenas nos zigotos (Ferreira et al., submetido).
Frente ao exposto, o grupo coordenado pelo Dr. Flavio Vieira Meirelles da
USP de Pirassununga através do sub-projeto 9, intitulado “Modelo animal para
estudo da herança mitocondrial intra e inter-espécie”, terá como objetivo geral,
avaliar a viabilidade da produção de embriões contendo mtDNA de origem somática
intra e inter-específico e aumentar a porcentagem herdada deste mtDNA pelos
blastocistos. Mais especificamente, pretende-se produzir blastocistos bovinos (Bos
taurus) que contenham mtDNA de origem somática intra (B. indicus) ou interespecífica (Homo sapiens) em heteroplasmia com mtDNA de origem embrionária
(herdado do oócito) e; adicionalmente, desenvolver um método para aumentar a
porcentagem herdada nos blastocistos de mtDNA somático (B. indicus ou H.
sapiens). Para isso, as seguintes abordagens tecnológicas serão empregadas:
Estabelecimento de linhagens mesenquimais de células oriundas de B. indicus e H.
sapiens; enucleação de células mesenquimais por centrifugação e fusão dos
citoplastos para utilização como doadores de citoplasma (Shay, Gershenbaum et
al., 1975; Marchington, Barlow et al., 1999); produção in vitro de zigotos bovinos
(B. taurus) partenogenéticos a partir de oócitos aspirados de ovários coletados em
abatedouro e maturados in vitro (Meo, Yamazaki et al., 2007); centrifugação dos
zigotos para concentrar as mitocôndrias num dos pólos do embrião e remoção de
parte das mitocôndrias por micromanipulação (Ferreira et al., submetido); fusão
dos citoplastos (B. indicus ou H. sapiens) aos zigotos depletados (B. taurus) e
cultivo in vitro (Inoue, Nakada et al., 2000); determinação da porcentagem de
mtDNA (mtDNA somático em relação à quantidade total de mtDNA) mediante PCR
em Tempo Real imediatamente à fusão, às 72 horas (embriões com cinco ou mais
células) e às 168 horas (blastocistos) após a ativação partenogenética (Ferreira et
al. submetido)(Ferreira, Meirelles et al., 2007). A porcentagem de mtDNA será
analisada considerando como efeito o citoplasto usado (B. indicus e H. sapiens), o
momento da análise (0, 72 e 168 horas) e a interação ambos os fatores.