Participação do óxido nítrico na infecção experimental de cães pelo

Universidade Federal de Ouro Preto
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas
Participação do óxido nítrico na infecção experimental
de cães pelo Trypanosoma cruzi
Ouro Preto, MG
Dezembro de 2007
Paula Melo de Abreu Vieira
Participação do óxido nítrico na infecção experimental
de cães pelo Trypanosoma cruzi
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Biológicas do Núcleo
de Pesquisas em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Ouro Preto, como
parte integrante dos requisitos para obtenção
do Título de Mestre em Ciências Biológicas,
área de concentração Imunobiologia de
Protozoários.
Orientadora: Profa Cláudia Martins Carneiro
Ouro Preto, MG
Dezembro de 2007
VIEIRA, P.M.A.
Dedicatória
Dedico esse trabalho aos
meus pais, José Eduardo
e Laura, pelo amor
incondicional e apoio
constante.
i
VIEIRA,P.M.A
Agradecimentos
À Professora Cláudia Martins Carneiro o meu agradecimento pela confiança depositada
em mim, pela orientação, pelas conversas, pelo exemplo de ética e profissionalismo.
Serei sempre uma eterna admiradora.
À “Mandinha” por ter compartilhado não só as aflições, mas as pequenas alegrias do
dia-a-dia, pela extraordinária amizade que em tão pouco tempo se tornou essencial para
mim. Obrigada por todo o apoio e compreensão minha amiga!
À Jú e Nadinha pela valiosa amizade e constante carinho. Obrigada pelo inestimável
apoio e por compartilhar momentos de efêmeras tristezas e grandes alegrias, com muitas
gargalhadas.
Ao Professor Alexandre Barbosa Reis pela colaboração, pelas criticas e sugestões tão
importantes, e acima de tudo por sua paciência em me ouvir.
À todos os amigos do Laboratório de Imunopatologia: Ana, Carol, Kátia, Raquel,
Bruno, Rodrigo, Henrique, Samuel, Sheler, Wendel e Rafael pela ótima convivência e
colaboração em todos os momentos.
Ao Professor Luiz Cosme Cotta Malaquias não só pela colaboração nesta dissertação,
mas pela orientação na iniciação científica, despertando em mim o desejo de ser
cientista.
Ao Rodolfo Giunchetti pela ajuda com as análises estatísticas e por ser sempre
prestativo e atencioso, esclarecendo minhas dúvidas.
ii
VIEIRA,P.M.A
Agradecimentos
À Maria Chaves pelos ensinamentos das técnicas histológicas e pela amizade.
À Cida pela prestatividade e disposição em resolver nossos problemas.
Aos meus pais e as minhas irmãs, Júlia e Eduarda, por permitirem que eu fizesse minhas
escolhas estando sempre presentes. Sigo firme meu caminho por que sei que quando
precisar terei em vocês um porto seguro.
iii
VIEIRA,P.M.A
Sumário
1. Introdução............................................................................................................. 1
1.1- Óxido nítrico...................................................................................................... 2
1.2- Síntese de Óxido Nítrico .................................................................................... 3
1.3- iNOS.................................................................................................................. 5
1.4 - NO produzido pela iNOS .................................................................................. 6
1.5- Trypanosoma cruzi e a doença de Chagas .......................................................... 7
1.6- NO e o Trypanosoma cruzi .............................................................................. 11
1.7 - Participação do Baço e Linfonodo na infecção pelo T. cruzi ............................ 13
1.8 – Modelo Canino na infecção pelo T. cruzi........................................................ 15
2. Objetivos............................................................................................................. 16
2.1- Objetivo geral .................................................................................................. 17
2.2- Objetivos específicos ....................................................................................... 17
3. Material e Métodos ............................................................................................. 18
3.1 - Atividades previamente realizadas .................................................................. 20
3.1.1 - Animais.................................................................................................... 20
3.1.2 - Infecção dos cães...................................................................................... 20
3.1.3 - Curva de parasitemia ................................................................................ 21
3.1.4 - Coleta de soro .......................................................................................... 21
3.1.5 - Resposta imune celular ex vivo ................................................................. 21
3.1.6 - Necrópsia, coleta, fixação e processamento do material para microscopia
óptica .................................................................................................................. 22
3.2 - Atividades realizadas neste estudo................................................................... 22
3.2.1 - Dosagem sérica do NO............................................................................. 22
3.2.2 - Colorações empregadas ............................................................................ 23
3.2.3 - Avaliação histopatológica do Baço e Linfonodo cervical .......................... 24
3.2.4 Quantificação da inflamação na área cardíaca ............................................. 25
3.2.5 - Imuno-histoquímica para detecção do T. cruzi .......................................... 26
3.2.6 - Imuno-histoquímica para a detecção da expressão de iNOS...................... 27
3.2.7 Análise quantitativa da expressão de iNOS ................................................. 29
3.2.8 - Análise Estatística .................................................................................... 29
4. Resultados........................................................................................................... 31
4.1 – Níveis Séricos de Óxido Nítrico ..................................................................... 32
4.2 – Comparação entre os Níveis Séricos de Óxido Nítrico com as Curvas de
Parasitemia ............................................................................................................. 34
4.3 - Correlação entre os Níveis Séricos de Óxido Nítrico e o Fenótipo das Células do
Sangue Periférico.................................................................................................... 35
4.4 - Análise histopatológica ................................................................................... 36
4.5 - Expressão de iNOS ......................................................................................... 50
4.6 - Comparação entre a expressão de iNOS e as alterações histopatológicas ......... 55
4.7 - Correlação entre a expressão de iNOS e o parasitismo tecidual ....................... 56
4.8 - Correlação entre a expressão de iNOS tecidual e os níveis séricos de Óxido
Nítrico..................................................................................................................... 56
5. Discussão............................................................................................................ 57
6. Perspectivas ........................................................................................................ 67
7. Referências Bibliográficas................................................................................... 69
iv
VIEIRA,P.M.A
Lista de Figuras
Figura 1: Representação esquemática das reações catalisadas pelas NOS (GROVES e
WANG, 2000). ............................................................................................................. 3
Figura 2: Delineamento experimental, demonstrando as atividades previamente
realizadas e realizadas neste trabalho. ......................................................................... 19
Figura 3: Fotomicrografias do baço de cães não infectados e infectados com formas
tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. .... 39
Figura 4: Fotomicrografias do linfonodo cervical de cães não infectados e infectados
com formas tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas
da cepa Be-78 do
Trypanosoma cruzi. .................................................................................................... 43
Figura 5: Fotomicrografias do ventrículo direito de cães infectados com formas
tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. ... 46
Figura 6: Análise morfométrica do parasitismo tecidual nas diferentes regiões do
coração em cães infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM: ) ou
sangüíneas (TS: ) da cepa Be- 78 do Trypanosoma cruzi. ......................................... 47
Figura 7: Fotomicrografias do átrio direito e septo interventricular de cães não
infectados e infectados com formas tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da cepa
Be-78 do Trypanosoma cruzi. .................................................................................... 48
Figura 8: Análise morfométrica do infiltrado inflamatório nas diferentes regiões
cardíacas em cães não infectados (Controle: ), infectados com formas tripomastigotas
metacíclicas (TM: ) ou sangüíneas (TS: )............................................................... 49
Figura 9: Fotomicrografias do baço e linfonodo cervical de cães não infectados
(Controle) e infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM) ou sangüíneas
(TS) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. ................................................................ 52
Figura 10: Fotomicrografias do ventrículo esquerdo baço de cães não infectados
(Controle) e infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM) ou sangüíneas
(TS) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. ................................................................ 53
Figura 11: Análise morfométrica da área expressando iNOS nos fragmentos de baço,
linfonodo cervical e diferentes regiões cardíacas em cães não infectados (Controle: ),
infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM: ) ou sangüíneas (TS: ) da
cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. ............................................................................. 54
v
VIEIRA,P.M.A
Lista de Tabelas
Tabela 1:Funções do Óxido Nítrico no Sistema Imunológico ........................................ 7
Tabela 2:Avaliação histopatológica do baço................................................................ 24
Tabela 3: Avaliação histopatológica do linfonodo. ...................................................... 25
Tabela 4: Avaliação histopatológica do baço de cães não infectados (Controle),
infectados com formas tripomastigotas metacílicas (TM) ou sangüíneas (TS) da cepa
Be-78 do Trypanosoma cruzi. ↑ : Aumento e ↓ : Diminuição...................................... 38
Tabela 5: Avaliação histopatológica do Linfonodo cervical de cães não infectados
(Controle) e infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM) ou sangüíneas
(TS) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. ↑ : Aumento e ↓ : Diminuição. ................ 42
vi
VIEIRA,P.M.A
Lista de Gráficos
Gráfico 1: Cinética da dosagem dos níveis séricos de NO (Nitrato+Nitrito) em cães não
infectados (Controle:
), infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM:
) ou sangüíneas (TS:
) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. .................. 32
Gráfico 2: Linha de tendência da cinética da dosagem dos níveis séricos de NO
(Nitrato+Nitrito) em cães não infectados (Controle:
), infectados com formas
tripomastigotas metacíclicas (TM:
) ou sangüíneas (TS:
) da cepa Be-78 do
Trypanosoma cruzi. .................................................................................................... 33
Gráfico 3: Cinética da dosagem dos níveis séricos de NO (Nitrato+Nitrito) (TM:
;
) versus parasitemia (TM:
; TS:
) em cães infectados com formas
TS:
tripomastigotas metacíclicas (TM) ou sangüíneas (TS) da cepa Be-78 do Trypanosoma
cruzi............................................................................................................................ 34
Gráfico 4: Correlação positiva entre os níveis séricos de NO e o percentual de células T
CD5+ (A) e a subpopulação T CD4+ (B) em cães infectados com formas tripomastigotas
metacíclicas (TM) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. ........................................... 35
Gráfico 5: Correlação entre a expressão da enzima iNOS com o nível sérico de NO
(35ºDAI) no átrio esquerdo de cães infectados com formas tripomastigotas metacíclicas
(TM). .......................................................................................................................... 56
vii
VIEIRA,P.M.A
Lista de Abreviaturas
AD – Átrio direito
AE –Átrio esquerdo
Be-78 - Cepa Berenice -78
cNOS - Enzimas óxido nítrico síntase constitutivas
DAI - Dias após a infecção
DC - Doença de Chagas
eNOS - Enzima óxido nítrico síntase endotelial
IL-10 - Interleucina-10
IL-12 - Interleucina -12
IL-13 - Interleucina-13
IL-4 - Interleucina -4
IFN-γ - Interferon gamma
iNOS - Enzima óxido nítrico síntase induzível
L-NMMA – Ng –monometil – L - arginina
NK - Célula Natural Killer
nNOS - Enzima óxido nítrico síntase neuronal
NO - Óxido Nítrico
NO-2 - Nitrito
NO-3 - Nitrato
PALS - Bainha linfóide periarteriolar
PAP – peroxidase anti-peroxidase
SMF - Sistema mononuclear fagocitário
TGF-β - Fator de crescimento beta
TM - Grupo de cães infectados com formas tripomastigotas metacíclicas
TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa
TS - Grupo de cães infectados com formas tripomastigotas sangüíneas
VD – Ventrículo direito
VE – Ventrículo esquerdo
viii
VIEIRA, P.M.A.
Resumo
Durante a fase da aguda da infecção pelo Trypanosoma cruzi ocorre uma síntese
sistêmica de citocinas pró-inflamatórias, que ativam componentes da imunidade inata,
como as células NK e macrófagos. Uma vez ativadas estas células passam a expressar
iNOS e a produzir Óxido Nítrico (NO) que poderá contribuir no controle da
parasitemia e do parasitismo tecidual. Este trabalho teve como objetivo avaliar a
participação do NO durante a fase aguda da infecção de cães com formas
tripomastigotas sangüíneas (grupo TS, n=4) ou metacíclicas (grupo TM, n=4) da cepa
Berenice-78 do T. cruzi em relação ao grupo Controle (n=4). A parasitemia foi
determinada diariamente a partir do 10º dia após a infecção (DAI) até sua negativação.
Soro e sangue foram coletados no período que antecedeu a infecção e aos sete, 14, 21,
28 e 35º DAI para dosagem sérica de NO e fenotipagem (linfócitos T THY-1+, CD5+,
CD4+ e CD8+, linfócitos B CD21+ e monócitos CD14+). Os animais foram
eutanaziados ao final da fase aguda e o baço, linfonodo cervical e coração (átrios e
ventrículos direito e esquerdo, septo interventricular e ponta) foram coletados e
processados rotineiramente para inclusão em parafina. A avaliação histopatológica, a
quantificação do parasitismo tecidual e da área marcada para iNOS foram realizadas
em cortes histológicos corados pela HE ou submetidos a reações de imunohistoquímica peroxidase anti-peroxidase e estreptoavidina-biotina-peroxidase,
respectivamente. Os animais do grupo TM apresentaram aumento nos níveis séricos de
NO ao longo da infecção comparado aos grupos Controle e TS e um atraso no pico de
parasitemia em relação ao grupo TS. Somente no grupo TM foi observada correlação
positiva entre os linfócitos T CD5+ e CD4+ com os níveis séricos de NO, sugerindo
que estas células contribuem para o aumento dos níveis séricos de NO encontrados
neste grupo. O mesmo padrão observado no soro foi encontrado no baço, onde o grupo
TM apresentou maior área marcada para iNOS em relação aos grupos Controle e TS.
Entretanto, no linfonodo cervical o grupo TS revelou diminuição na área marcada para
iNOS quando comparado aos grupos Controle e TM. Este fato pode estar relacionado
à diminuição do número de macrófagos na zona medular neste grupo. Não foi
observado parasitismo tecidual no baço e linfonodo cervical. O coração dos animais
do grupo TM apresentou menor parasitismo tecidual e maior área marcada para iNOS
enquanto que os animais do grupo TS apresentaram infiltrado inflamatório e
parasitismo maiores e menor área marcada para iNOS. Com exceção do ventrículo
esquerdo onde a expressão de iNOS foi maior no grupo TS. Os resultados observados
nesta dissertação verificaram que a fonte do inóculo pode interferir no
desenvolvimento da fase aguda da doença de Chagas. Ao que parece, animais
infectados com as formas TM induzem uma resposta inicial mais eficaz, que limita a
parasitemia e, posteriormente, o parasitismo tecidual, refletindo em menor resposta
inflamatória, caracterizando um quadro de menor dano tecidual. Por outro lado,
animais infectados com as formas TS não seriam capazes de logo no início da
infecção, induzir uma resposta imune mais elaborada, e conseqüentemente não
alcançam o controle rápido da infecção contribuindo para o desenvolvimento de
intensas alterações histológicas, principalmente cardíacas. Portanto, o NO apresenta
durante a fase aguda da infecção experimental de cães um papel imunoprotetor.
ix
VIEIRA,P.M.A.
Abstract
During the acute phase of Trypanosoma cruzi infection happens a systemic synthesis of
pro-inflammatory cytokines that activates some components of the innate immunity,
such as NK cells and macrophages. Once activated, these cells start to express iNOS
and to produce Nitric Oxide (NO) what may contribute in the parasitemia and tissue
parasitism control. This study aimed to evaluate the participation of NO during the
acute phase of dogs infected with blood (BT group, n=4) or metacyclic forms (MT
group, n=4) of the Berenice-78 T. cruzi strain in relation to the Control group (n=4).
Parasitemia was followed since the 10th day after infection (d.a.i) up to negativation by
fresh blood examination collected from the marginal ear vein. Serum and blood was
collected before the infection and seven, 14, 21, 28 and 35 d.a.i. to determine the NO
seric level and phenotyping (lymphocytes T THY-1+, CD5+, CD4+ and CD8+,
lymphocytes B CD21+ and monocytes CD14+) respectively. The animals were
euthanized in the end of the acute phase. Spleen, cervical lymphnode and heart (right
and left atria and ventricle, interventricular septum and tip) were collected and
processed routinely for inclusion in paraffin. The animals of the MT group presented
increase in the seric levels of NO throughout the infection when compared with the
Control and BT groups and a delay in the parasitemia peak when compared with the BT
group. Only in the MT group a positive correlation was observed between the T CD5+
and CD4+ lymphocytes and the seric levels of NO. This suggests that these cells
contribute to the increase of the seric levels of NO found in this group. The same pattern
observed in the serum was found in the spleen, where the MT group presented larger
area marked for iNOS in relation to the Control and BT groups. However, in the
cervical lymphnode the BT group revealed decrease of the area marked for iNOS when
compared to the Control and MT groups. This fact can be related to the decrease of the
macrophages numbers in the medullar zone of this group. Tissue parasitism was not
observed in the spleen and cervical lymphnode. The heart of MT group presented
smaller tissue parasitism and larger area marked for iNOS while the animals of the BT
group presented higher inflammatory infiltrated, larger tissue parasitism and smaller
area marked for iNOS, excepted to left ventricle. The results demonstrated that the
source of the inoculum could interfere in the development of the acute phase of the
Chagas disease. Apparently MT forms induce in the animals a more effective initial
response that limits the parasitemia and the tissue parasitism, what reflects in smaller
inflammatory response and tissue damage. On the other hand, BT forms seem not to be
able to induce a more elaborated immune response in the beginning of the infection.
Consequently animals infected with BT forms don't reach the fast control of the
infection what probably contributes to the development of intense histological
alterations, especially in the heart. Taken together, these results suggest that NO
presented an important immunoprotection role during acute phase of Be-78 T. cruzi
infection in dogs.
x
1. Introdução
VIEIRA,P.M.A.
Introdução
1.1- Óxido nítrico
O óxido nítrico (NO) é uma espécie reativa de nitrogênio, uma das menores
moléculas sinalizadoras com atividade biológica, sendo relativamente instável,
apresentando propriedades que facilitam sua difusão através das membranas celulares
sem o auxílio de transportadores específicos (MAYER & HEMMENS, 1997). É uma
molécula gasosa simples altamente reativa que desempenha várias funções fisiológicas
importantes como o relaxamento do endotélio, a regulação da pressão sangüínea basal, a
neurotransmissão e a citotoxicidade mediada por macrófagos. É incolor à temperatura
ambiente, pouco solúvel em água (QUEIROZ & BATISTA, 1999) e altamente reativo,
com vida média de 5 a 30 segundos devido a sua rápida oxidação e conseqüente geração
de Nitrito (NO-2) e Nitrato (NO-3) (MARLETTA et al., 1988; MAYER et al., 1989;
HEVEL et al., 1991; STAMLER et al., 1992).
Até meados da década de 1980, o NO era considerado apenas membro de uma
família de poluentes ambientais indesejáveis e carcinógenos potenciais (DUSSE et al.,
2003). O interesse pelas funções biológicas do NO começou a partir de três linhas de
pesquisas distintas, que culminaram com a determinação do envolvimento desta
molécula em processos biológicos importantes: (1) investigação do papel do NO no
relaxamento do vaso sangüíneo (IGNARRO,1987; KATSUKI et al., 1977); (2)
produção de óxidos de nitrogênio pelos mamíferos (GREEN et al., 1981) e (3)
mecanismo de ação de neurotransmissores (BREDT et al., 1989; KNOWLES et al.,
1989). O desfecho comum dessas três linhas de pesquisas fez com que o NO passasse a
ser um dos mais importantes mediadores dos processos intra e extracelulares.
O NO também tem um importante papel no sistema imunológico. Ele está
envolvido na patogenia e controle de doenças infecciosas, tumores, processos autoimunes e doenças degenerativas crônicas (BOGDAN, 2001). Devido a sua variedade de
parceiros de reação (DNA, proteínas, tióis de baixo peso molecular, grupos prostéticos),
2
VIEIRA,P.M.A.
Introdução
sua vasta produção (por três diferentes NO sintases - NOS) e o fato de que sua atividade
ser fortemente influenciada pela suas concentrações, o NO continua a surpreender
(BOGDAN, 2001).
1.2- Síntese de Óxido Nítrico
A síntese do NO é intermediada por um grupo de enzimas genericamente chamadas
de óxido nítrico sintases (NOS) a partir do aminoácido L-arginina. Tais sintases
catalisam a oxidação de uma molécula de L-arginina pelo oxigênio molecular obtendo
como produto final L-citrulina e uma molécula de NO (PALMER et al., 1988;
STUEHR et al., 1991; MARLETTA, 1994).
Nesta reação a L-arginina é transformada em um intermediário, a NG-hidroxi-Larginina com a presença de nicotinamida-adenina-dinucleotído-fosfato-hidrogênio
(NADPH) e Ca2+ sendo necessário mais NADPH e (O2) para a formação de L-citrulina
e NO (FILHO et al., 2000).
Figura 1 - Representação esquemática das reações catalisadas pelas NOS (GROVES e
WANG, 2000).
A NOS é uma proteína dimérica e o monômero de suas isoformas possui massa
molecular que varia de 135 a 164 kDa. Existem três isoformas específicas de NOS,
sendo uma NOS induzida (iNOS) e duas NOS constitutivas (cNOS), sendo estas duas
3
VIEIRA,P.M.A.
Introdução
designadas NOS neuronal (nNOS) e NOS endotelial (eNOS) (CERQUEIRA et al,
2002). As NOS diferem quanto ao peso molecular, a forma de ativação e a capacidade
de síntese de NO (MARLETTA, 1994).
A nNOS é expressa no tecido nervoso, tanto em neurônios adultos como nos
neurônios em desenvolvimento e também nos astrócitos. A eNOS é principalmente
expressa no endotélio, mas também pode ser encontrada em neurônios e miócitos
cardíacos (MARSDEN et al., 1993; BREDT & SNYDER, 1994; ABE et al., 1997;
CORK et al., 1998; GUIX et al., 2005).
As duas cNOS são classificadas como cálcio-dependentes, pois necessitam de
Ca2+ para sua ativação, ou seja, é necessária determinada concentração de Ca2+
intracelular para existir a atividade enzimática, caso ocorra queda no nível de Ca2+ as
enzimas tornam-se inativas. Já a iNOS é classificada como cálcio-independente, pois
sua ativação não é regulada pela presença de Ca2+ .
As NOS estão presentes no citosol, e requerem NADPH, tetrahidrobiopterina
(BH4), flavina adenina dinucleotídeo (FAD), flavina mononucleotídeo (FMN) e heme
como co-fatores (CERQUEIRA et al., 2002).
Todas as isoformas de NOS podem ser inibidas por análogos da L-arginina Nsubstituídos, como a NG-monometil-L-arginina (L-NMMA), N-imino-etil-L-ornitina (LNIO), NG-amino-L-arginina (L-AAA), NG-nitro-L-arginina (L-NA) e o metil éster
correspondente,
o
NG-nitro-L-arginina-metil-éster
(L-NAME).
Estes
análogos
competem com a L-arginina e agem como inibidores estereoespecíficos da NOS. Além
destes inibidores, a aminoguanidina é também capaz de inibir a NOS e apresenta uma
relativa seletividade para iNOS (DUSSE et al., 2003).
4
VIEIRA,P.M.A.
Introdução
1.3- iNOS
A iNOS não é expressa sob condições normais, é induzida por citocinas e/ou
endotoxinas em uma variedade de células, incluindo-se macrófagos, linfócitos T, células
endoteliais, células dendríticas, células Natural Killers (NK), miócitos, hepatócitos,
condrócitos, neutrófilos e plaquetas (MONCADA et al., 1991). Esta isoforma requer
algumas horas para ser expressa, mas, uma vez sintetizada, libera quantidades maiores
de NO que as cNOS e a produção deste continua indefinidamente até que a L-arginina
ou os co-fatores necessários para sua síntese sejam depletados ou ocorra morte celular
(DUSTING et al., 1995).
A expressão da iNOS é o resultado de uma resposta inflamatória localizada ou
difusa resultante de uma infecção ou dano tecidual (CERQUEIRA et al., 2002). As altas
concentrações de NO, tóxicas para micróbios, parasitos e células tumorais, podem
também lesar células saudáveis vizinhas, sendo este mecanismo responsável pela
maioria dos processos inflamatórios e auto-imunes (FILHO et al., 2000). Assim, onde a
resposta inflamatória é parte de uma resposta adaptativa (isto é, infecção ou sepse), a
expressão de iNOS é benéfica; quando a expressão da iNOS é parte da inflamação
anormal (não-adaptativa), a expressão de iNOS pode ser nociva, isto é, doença autoimune (CERQUEIRA et al., 2002).
A indução da iNOS é regulada positivamente por citocinas pró-inflamatórias
(IFN-γ e TNF-α) (DINARELLO, 2000) e negativamente por citocinas anti-inflamatórias
como o TGF-β (VODOVOTZ, 1997) e a IL-10 (MOORE et al., 2001). Além destas
citocinas, a iNOS também é induzida por complexos imunes, produtos virais e
microbianos (proteínas, lipídeos, polissacarídeos).
Recentemente vários trabalhos têm demonstrado que algumas quimiocinas, como
por exemplo, RANTES, JE/MCP-1, MIP-1α e MIP-1β, podem induzir a produção de
5
VIEIRA,P.M.A.
Introdução
NO e atividade tripanomicida dependente do NO pelos macrófagos murinos e miócitos
cardíacos (VILLALTA et al., 1998; ALIBERTI et al., 1999).
O fator de transformação de crescimento β (TGF- β) inibe a expressão de iNOS
através dos mecanismos de transcrição, pós-transcrição e pós-tradução (VODOVOTZ et
al., 1993). Já a IL-10 inibe a via dependente de arginina que leva a síntese do NO
(OSWALD et al., 1992). Uma variedade de outras moléculas sinalizadoras, incluindo
IL-4 e IL-13, inibe a expressão de iNOS por mecanismos ainda desconhecidos.
1.4 - NO produzido pela iNOS
O NO resultante da ativação da iNOS possui ação citotóxica e citostática,
promovendo a destruição de microorganismos, parasitos e células tumorais (DUSSE et
al., 2003). Dentro dos fagolisossomos, o NO pode se combinar com peróxido ou
superóxido de hidrogênio, gerados pela fagócito-oxidase, para produzir radicais
peroxinitrito altamente reativos que podem eliminar microorganismos (BOGDAN,
2001).
Em processos infecciosos, células ativadas como macrófagos, neutrófilos e
células endoteliais secretam simultaneamente NO e intermediários reativos do oxigênio,
e a ação citotóxica indireta do NO consiste, principalmente, na sua reação com esses
intermediários do oxigênio (DUSSE et al., 2003). Na célula-alvo, o NO combina-se
com grupos metais de enzimas responsáveis pela síntese de DNA e pelo ciclo
respiratório, levando à morte celular (MONCADA & HIGGS, 1993).
O NO é uma molécula efetora bactericida do sistema imune inato podendo inibir
a síntese do DNA da bactéria através da inibição da ribonucleotídio redutase bacteriana
(FANG, 1997). O NO produzido pela iNOS também tem importante função na inibição
da replicação de uma variedade de vírus (Herpesvírus, Picornavírus e Coronavírus)
6
VIEIRA,P.M.A.
Introdução
sendo as proteases virais o alvo do NO. As principais funções do NO no Sistema Imune
estão apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1:Funções do Óxido Nítrico no Sistema Imunológico
Categoria
Atividade antimicrobiana
Atividade anti-tumoral
Dano tecidual
(imunopatologia)
Produtores de NO (exemplos)
Efeitos do NO
Elimina ou reduz a
Macrófagos, micróglia,
replicação dos
neutrófilos, eosinófilos,
agentes infecciosos
fibroblastos, células endoteliais,
(vírus, bactéria,
células epiteliais.
protozoários, fungos,
helmintos)
Elimina ou inibe o
Macrófagos, eosinófilos
crescimento de
células tumorais
Macrófagos, micróglia,
Necrose ou fibrose
astroglia, queratinócitos
do parênquima
Segundo BOGDAN (2001).
A indução da síntese de NO por macrófagos ativados é crucial para o
desenvolvimento da imunidade contra grande número de patógenos. O efeito protetor do
NO aos microrganismos intracelulares tem sido evidenciado em vários modelos
experimentais como na leishmaniose onde, o mesmo foi demonstrado in vitro (GREEN
et al., 1990) e in vivo (LIEW et al., 1990). Em macrófagos murinos o NO produzido
pela iNOS é uma das moléculas mais importantes responsáveis pela morte da
Leishmania in vitro e in vivo (SISTO et al., 2001).
1.5- Trypanosoma cruzi e a doença de Chagas
O protozoário T. cruzi é o agente etiológico da tripanossomíase americana,
denominada doença de Chagas que representa um problema de saúde pública na
América do Sul e Central, com uma estimativa de 13 milhões de pessoas infectadas, e
ainda 100 milhões de pessoas, aproximadamente 25% da população da América Latina,
correm risco de adquirir a doença (WHO, 2005). O agravamento das condições sócio7
VIEIRA,P.M.A.
Introdução
econômicas, transfusões sangüíneas e imigrações de pessoas infectadas para outros
continentes, aumentam ainda mais o risco de infecções.
O T. cruzi é um protozoário hemoflagelado pertencente à ordem Kinetoplastida,
família Tripanosomatidae que infecta o homem e uma grande variedade de mamíferos.
Os principais hospedeiros invertebrados, vetores da doença de Chagas, são insetos
hematófagos da subfamília Triatominae, popularmente conhecidos como “barbeiros”.
Este protozoário tem três diferentes estágios morfológicos. No hospedeiro
invertebrado são encontradas as formas epimastigotas e tripomastígotas metacíclicas,
enquanto, no hospedeiro vertebrado as formas tripomastigotas sangüíneas e amastigotas
são as formas infectantes e a de desenvolvimento intracelular, respectivamente. Ao se
alimentar com o sangue de mamíferos infectados pelo parasito, o triatomíneo ingere a
forma tripomastigota sangüínea do parasito. No estômago do inseto, as formas
tripomastigotas se transformam nas formas epimastigotas (não-infectivas) e seguem
para o intestino onde se reproduzem extracelularmente por divisão binária simples. Uma
vez que elas alcançam o reto, as epimastigotas se diferenciam em formas
tripomastigotas metacíclicas que são eliminadas nas fezes durante o repasto sangüíneo,
penetrando pelo local da picada ou mucosa, infectando as células do sistema
mononuclear fagocitário (SMF). As formas metacíclicas infectam as células hospedeiras
e se transformam em amastigotas intracelulares, dando início a uma série de replicações.
Após vários ciclos de multiplicação as amastigotas se diferenciam em tripomastigotas,
que são liberadas na corrente sangüínea prontas para infectar outras células hospedeiras
e dar início a novas replicações, disseminando a infecção para os diferentes tecidos e
órgãos.
Os mecanismos de transmissão incluem as vias vetoriais, transfusional, congênita,
oral e por acidentes de laboratório (PRATA, 2001). A vetorial representa a principal e
mais freqüente forma de transmissão, sendo o Triatoma infestans e o Rhodnius prolixus
8
VIEIRA,P.M.A.
Introdução
os mais importantes vetores no ciclo doméstico da doença de Chagas (KOLLIEN &
SCHAUB, 2000).
Apesar de o hospedeiro vertebrado desenvolver uma resposta imune celular e
humoral, a infecção crônica é mantida por um número reduzido de formas
tripomastigotas circulantes no sangue periférico, dando origem a um problema de saúde
pública, que é a transmissão do parasito por transfusão sangüínea (SILVA et al., 1993),
transformando-se essa na segunda via mais importante de transmissão. Em 10 países da
América do Sul e três da América Central, quase 100% dos doadores de sangue são
monitorados. Taxas de infecção variam de 0,1 a 4,2% na Argentina, Brasil, Chile e
Uruguai, podendo chegar a 24,4% na Bolívia.
Diferentes trabalhos demonstraram que glicoconjugados na superfície das formas
tripomastigotas sangüíneas e amastigotas estariam envolvidos na iniciação da
inflamação e da resposta imune pela promoção da síntese de citocinas que ativariam
diferentes compartimentos do sistema imune, enquanto que as formas tripomastigotas
metacíclicas, aparentemente, não estariam envolvidas na iniciação da inflamação,
provavelmente devido a diferenças na composição antigênica (CAMARGO et al.,
1997a; COELHO et al., 2002).
Considerando que as formas infectantes tripomastigotas sangüíneas e metacíclicas
apresentam diferenças em vários aspectos torna-se importante realizar em modelos
experimentais avaliações parasitológicas e patológicas centradas nas formas infectantes,
uma vez que, as formas tripomastigotas metacíclicas, representam a infecção natural
pelo vetor e as formas tripomastigotas sangüíneas a infecção por transfusão de sangue
contaminado ou transmissão congênita, para uma melhor compreensão dos processos de
formação de lesão quando a transmissão do T. cruzi ocorre por essas distintas formas
infectantes.
9
VIEIRA,P.M.A.
Introdução
Embora já tenha sido demonstrado que a resposta imune do hospedeiro é um
importante fator para determinar o curso da infecção, o conhecimento desta e suas
diferenças de ativação em indivíduos infectados com as formas tripomastigotas
metacíclicas e sangüíneas ainda é pouco conhecido o que justifica a realização destes
estudos em cães, uma vez que os mesmos reproduzem a doença humana.
A doença de Chagas humana é caracterizada por duas fases distintas. A fase
aguda, que dura aproximadamente dois a quatro meses, é geralmente assintomática,
entretanto, os sinais e sintomas quando presentes são mais frequentemente relacionados
ao estado imunológico do hospedeiro. Esta fase é caracterizada por uma elevada
parasitemia e parasitismo tecidual, processo inflamatório intenso, quadro toxêmico
febril e clínico fugaz (GOLGHER & GAZZINELLI, 2004). Nessa fase, as principais
lesões observadas nesse período ocorrem no tecido cardíaco e a gravidade das lesões
está relacionada diretamente aos níveis de parasitemia e à carga parasitária tecidual
(PARADA et al., 1997).
Após a fase aguda, inicia-se a fase crônica da doença, que se perpetua por toda a
vida do hospedeiro. Nessa fase os níveis de parasitemia tornam-se subpatentes, devido
ao controle da proliferação do parasito pelo sistema imune. Entretanto, as seqüelas das
lesões desenvolvidas na fase aguda podem ter conseqüências patofisiológicas na fase
crônica da doença (ANDRADE, 1991). A maioria dos indivíduos (70%) permanece na
forma indeterminada caracterizada pela ausência de alterações nos exames
eletrocardiográficos e radiológicos do tórax e abdômen. Porém, alguns indivíduos, cerca
de 20 a 35%, desenvolvem lesões irreversíveis no sistema nervoso autônomo do
coração, esôfago e/ou cólon, sendo estas as formas clínicas da doença de Chagas
(MONCAYO, 2003).
Embora grande parte dos casos crônicos apresente uma evolução lenta e benigna
(CHAGAS, 1911; DIAS et al., 1956) uma parcela significativa acaba por falecer devido
10
VIEIRA,P.M.A.
Introdução
a problemas cardiovasculares (TEIXEIRA et al., 1997). Na América Latina, a doença de
Chagas representa a primeira causa de lesão cardíaca em jovens e adultos em idade
economicamente produtiva (MONCAYO, 2003).
1.6- NO e o Trypanosoma cruzi
O mecanismo de ação pelo qual o NO realiza seu efeito citotóxico contra o T.
cruzi não está completamente esclarecido, mas parece que o NO é capaz de interferir
diretamente no metabolismo do parasito, como por exemplo, inibindo a atividade da
enzima cruzipaína que tem um importante papel na nutrição e invasão celular pelo T.
cruzi (VENTURINI et al., 2000).
Durante a fase da aguda da infecção pelo T. cruzi ocorre uma síntese sistêmica de
citocinas pró-inflamatórias, que ativam componentes da imunidade inata, como as
células NK (LIEKE et al., 2006) e macrófagos. Uma vez ativadas, estas células passam
a expressar iNOS e a produzir NO em altas quantidades que irão controlar a parasitemia
durante a fase aguda da doença.
A ativação precoce do sistema imune inato está aparentemente envolvida na
resistência do hospedeiro ao T. cruzi. A estimulação da síntese de IL-12 e TNF-α pelos
macrófagos ativam as células NK que passam a produzir IFN-γ e favorecendo a
diferenciação dos linfócitos T no fenótipo Th1, que consiste na principal população
celular produtora de INF-γ. Os macrófagos ativados pelo IFN-γ e TNF-α irão produzir
NO que é o principal responsável pelo controle da replicação do parasito na fase aguda
da doença (VESPA et al., 1994; ALIBERTI et al., 1996; HOLSCHER et al., 1998).
MICHAILOWSKY et al. (2001) avaliaram o papel endógeno da IL-12, IFN-γ e
iNOS na resistência de camundongos infectados pela cepa colombiana de T. cruzi. Eles
observaram que camundongos knockout para estas citocinas e enzima apresentaram
11
VIEIRA,P.M.A.
Introdução
100% de mortalidade na fase aguda da doença, indicando que a IL-12, IFN-γ e iNOS
são essenciais para a resistência do hospedeiro à infecção por este parasito.
MACHADO et al. (2000) estudaram a participação dos cardiomiócitos na
atividade tripanosomicida dependente de NO. Os resultados indicam que os
cardiomiócitos estão ativamente integrados nos fenômenos inflamatórios, secretando
citocinas, quimiocinas e NO, o que pode atrair leucócitos para o foco inflamatório e
controlar a replicação intracelular dos parasitos.
Em modelo murino foi observado que o NO só é eficaz durante as primeiras duas
semanas da fase aguda da doença, tempo no qual as células NK são conhecidas por
controlar a infecção, tornando-se dispensáveis após este período, quando os níveis de
parasitemia são controlados pelas células CD8+ (SAEFTEL et al, 2001).
Entretanto, o NO, através do seu potencial oxidativo, pode ter um papel maléfico
na patogênese da doença de Chagas. Quantidades excessivas do NO têm efeitos
prejudiciais devido a sua atividade pró-inflamatória, causando por exemplo, a perda de
neurônios do plexo mientérico durante a fase aguda, o que posteriormente pode estar
relacionado com o megaesôfago na fase crônica da doença (ARANTES et al., 2004).
Estudos em modelo murino demonstraram que quantidades exacerbadas de NO
produzidas ao longo da infecção pelo T. cruzi, provocam dano no DNA das células do
coração e baço, causando a destruição das mesmas (RIBEIRO et al., 2007).
MARTINS et al. (1998) em seu estudo, quantificaram os níveis de apoptose em
esplenócitos durante a fase aguda, in vitro e in vivo, em camundongos infectados pelo T.
cruzi. Eles observaram que os maiores níveis de NO nos sobrenadantes de cultura de
esplenócitos coincidiam com os picos de parasitemia e com o alto nível de apoptose. Já
quando se inibia a produção do NO por meio de L-NMMA houve uma redução no nível
de apoptose nos esplenócitos. Deste modo, eles concluíram que a apoptose nestes
esplenócitos estava sendo induzida pelo NO.
12
VIEIRA,P.M.A.
Introdução
1.7 - Participação do Baço e Linfonodo na infecção pelo T. cruzi
O baço e os linfonodos são órgãos linfóides secundários, onde as respostas dos
linfócitos aos antígenos estranhos são iniciadas e desenvolvidas, sendo os linfonodos os
órgãos nos quais as respostas imunológicas adquiridas são iniciadas e o baço o principal
local de respostas imunológicas a antígenos provenientes do sangue.
Localizado no abdômen, diretamente abaixo do diafragma e conectado ao
estômago, o baço é o maior filtro de sangue do corpo humano, composto por dois
compartimentos distintos morfologicamente e funcionalmente, a polpa vermelha e a
polpa branca (STEININGER & BARTH, 2000).
A polpa vermelha é um filtro de sangue que remove material estranho e
danificado. Também é local para estoque de ferro, eritrócitos e plaquetas. A estrutura
especializada do sistema venoso da polpa vermelha dá a esta área sua capacidade única
de filtrar o sangue e remover velhos eritrócitos.
A função linfóide é exercida na polpa branca. Esta é subdividida em bainha
linfóide periarteriolar (PALS), folículos e zona marginal, composta de linfócitos,
macrófagos, células dendríticas e plasmócitos. A correta organização e manutenção da
polpa branca é controlada por quimiocinas específcas que atraem as células T e B aos
seus respectivos domínios, desta forma estabelecendo zonas específicas dentro da polpa
branca.
As PALS são as zonas de células T, nesta região os linfócitos T interagem com
as células dentríticas e sofrem estimulação antigênica. Os folículos são as regiões das
células B, e estão interligados às PALS e são tipicamente encontrados em regiões de
bifurcação das arteríolas centrais. Os folículos podem conter centros germinais, que se
formam após estimulação antigênica.
13
VIEIRA,P.M.A.
Introdução
Os folículos estão cercados por uma borda de linfócitos e macrófagos, chamados
de zona marginal. Esta zona tem por função escanear a circulação sistêmica a procura
de antígenos e patógenos atuando efetivamente no processamento antigênico. Nesta área
há um grupo único de macrófagos, os macrófagos metalofílicos. Estes são importantes
na eliminação de microorganismos e vírus.
A total organização e imunofisiologia da polpa branca é extremamente similar à
estrutura e função dos linfonodos. Uma importante diferença é a maneira pela qual os
linfócitos entram nos dois órgãos linfóides. Nos linfonodos, a maioria dos linfócitos tem
acesso pelas veias endoteliais altas e vasos linfáticos aferentes enquanto que o acesso ao
baço se dá pela zona marginal (MEBIUS & KRAAL, 2005).
Os linfonodos são pequenos agregados de tecidos ricos em linfócitos localizados
em toda a extensão dos canais linfáticos ao longo do corpo. São divididos em três áreas
funcionais que dão suporte as respostas imunes adquiridas. Estas áreas são: (1) zona
cortical (composta predominantemente de folículos ricos em células B; (2) zona
paracortical: rica em células T e (3) medula: com sinusóides e cordões medulares,
compostos predominantemente por plasmócitos e macrófagos. Cada linfonodo está
cercado por uma cápsula fibrosa através da qual penetram inúmeros vasos linfáticos
aferentes que liberam a linfa em um seio subcapsular ou marginal.
Várias alterações do sistema imune são observadas durante a fase aguda da
infecção pelo T. cruzi. Nos órgãos linfóides secundários, alguns autores têm relatado
esplenomegalia e linfadenopatia, com ativação policlonal persistente de linfócitos T e B
(MINOPRIO, 2001; BRENER & GAZINELLI, 1997).
14
VIEIRA,P.M.A.
Introdução
1.8 – Modelo Canino na Infecção pelo T. cruzi
Atualmente, o modelo canino (Canis familiaris) consagrou-se pela alta
representatividade na investigação de diversos aspectos da doença, como elevada
susceptibilidade à infecção e similaridade nas manifestações das fases aguda e crônica
com os humanos, sendo possível reproduzir a fase aguda sintomática e a fase crônica
em suas formas indeterminada e cardíaca (ANDRADE & ANDRADE, 1980;
ANDRADE et al., 1984 ; LANA et al., 1988; LANA et al., 1992; GUEDES, 2001;
BAHIA et al., 2002).
A possibilidade de se avaliar aspectos parasitológicos e imunológicos
relacionados à patogênese da doença de Chagas, num modelo que reproduz a
cardiopatia chagásica de forma muito semelhante à humana, possibilitou que o nosso
grupo de pesquisa realizasse estudos para avaliar a resposta imune de cães infectados
com as formas TS ou TM da cepa Be-78. Os resultados da avaliação do sangue
periférico por citometria de fluxo revelaram que frente à infecção ocorre um aumento
no percentual de células T CD8+, aumento este maior nos animais infectados por formas
TM. Outro resultado interessante foi à diminuição no número de monócitos circulantes
(CD14+) em animais infectados com formas sangüíneas (CARNEIRO et al., 2007).
Diante do exposto, essa dissertação pretende investigar aspectos da participação
do NO, no decorrer da fase aguda da infecção experimental de cães por formas TM,
simulando a transmissão vetorial, e TS, simulando a transmissão transfusional (ou
qualquer mecanismo de transmissão que envolva as formas TS) da cepa Be-78 do T.
cruzi. Esta estratégia permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos relacionados
à patogênese da doença de Chagas no modelo canino.
15
2. Objetivos
VIEIRA,P.M.A.
Objetivos
2.1- Objetivo geral
Avaliar a participação do NO durante a fase aguda da infecção de cães com formas
tripomastigotas sangüíneas ou metacíclicas da cepa Berenice-78 do T. cruzi.
2.2- Objetivos específicos
Determinar a cinética dos níveis séricos do NO e correlacioná-la à curva de parasitemia e aos
percentuais de células mononucleares (THY-1+, CD5+, CD4+, CD8+, CD21+, e CD14+) no
sangue periférico;
Determinar as alterações histopatológicas, o parasitismo e a expressão da enzima iNOS no baço,
linfonodo cervical e diferentes regiões cardíacas (átrios e ventrículos esquerdo e direito,
ponta e septo interventricular);
Correlacionar a expressão da enzima iNOS no baço, linfonodo cervical e diferentes regiões
cardíacas com as alterações histopatológicas, parasitismo tecidual e os níveis séricos de NO;
17
3. Material e Métodos
VIEIRA,P.M.A.
Materiais e Métodos
Obtenção das
ninhadas
Vacinação sêxtupla: 30, 50, 70 e 90 dias
Vermifugação 15, 30 e 45 dias
após o nascimento
Controle
(n= 4)
Cães infectados com formas
formas tripomastigotas metacíclicas
TM
(n= 4)
Parasitemia
10º dia após a infecção até a negativação
Cães infectados com formas
tripomastigotas sangüíneas
TS
(n= 4)
Atividades previamente realizadas
Cães não infectados
Imunofenotipagem
(THY-1 +, CD4+, CD8+, CD14+, CD5+ e
CD21 +)
dias 0, 7, 14, 21, 28 e 35
Necropsia
42º dia após infecção
HE e Imuno-histoquímica anti-iNOS e
T. cruzi (Baço, Linfonodo cervical,
Átrios direito e esquerdo, Ventrículos
direito e esquerdo, Septo e Ponta)
Análise estatística
Atividades realizadas neste estudo
Dosagem sérica de NO
Dias 0, 7,14,21,28 e 35
Figura 2: Delineamento experimental, ilustrando as atividades previamente realizadas e
àquelas realizadas neste trabalho.
19
VIEIRA,P.M.A.
Materiais e Métodos
3.1 - Atividades previamente realizadas
3.1.1 - Animais
Foram utilizados 12 cães jovens sem raça definida, de ambos os sexos (seis
machos e seis fêmeas), nascidos na Maternidade do Biotério Central da Universidade
Federal de Ouro Preto.
Os filhotes foram mantidos com a mãe até o desmame. Neste período foi
realizado o controle de endo e ectoparasitoses e aos 30, 50, 70 e 90 dias de idade. Os
cães foram vacinados pela via subcutânea no dorso anterior, com a vacina Vanguard®
HTLP 5/CV-L Laboratório Pfizer LTDA, contra Parvovirose, Cinomose, Leptospirose
canina, Coronavírus, Adenovírus Tipo 2 e Parainfluenza. Com 120 dias de idade, os
animais foram divididos em três grupos experimentais de quatro animais cada: Controle,
Infectado com formas tripomastigotas metacíclicas (TM) e Infectado com formas
Tripomastigotas Sangüíneas (TS).
3.1.2 - Infecção dos cães
Os cães foram inoculados com 2000 formas tripomastigotas sangüíneas (TS) ou
metacíclicas (TM) por Kg de massa corporal pela via intraperitonial. As formas
sangüíneas foram obtidas de camundongos infectados pela cepa Be-78 (T. cruzi I), por
via intraperitonial e as formas metacíclicas de ninfas de Triatoma infestans provenientes
da colônia de triatomíneos do Laboratório de Doença de Chagas.
20
VIEIRA,P.M.A.
Materiais e Métodos
3.1.3 - Curva de parasitemia
A parasitemia dos animais foi avaliada diariamente a partir do 10° dia após a
inoculação, através da coleta de cinco µl de sangue da veia marginal da orelha dos cães
e examinados ao microscópio óptico para quantificação dos parasitos utilizando a
técnica descrita por BRENER (1962). O período pré-patente, período patente e o pico
máximo de parasitemia foram determinados.
3.1.4 - Coleta de sangue e soro
O sangue e soro dos animais foram coletados no período que antecedeu a
infecção e aos sete, 14, 21, 28 e 35 dias após a infecção (DAI).
3.1.5 - Resposta imune celular ex vivo
O fenótipo das populações celulares do sangue periférico foi determinado até o
35º dia, conforme técnica estabelecida por Reis et al. (2005). As reações de
imunofenotipagem foram realizadas nos dias zero, sete, 14, 21, 28 e 35 após a infecção.
Foi avaliado o percentual médio das populações de linfócitos T (THY-1+ e CD5+) e suas
subpopulações (CD4+, CD8+), de linfócitos B (CD21+) e de monócitos (CD14+). Para
obtenção dos dados, foi utilizado um citômetro de fluxo (FACScalibur – Becton
Dickinson, San Jose, EUA) acoplado a computador onde os dados foram armazenados e
posteriormente analisados pelo programa Cell Quest (Becton Dickinson, San Jose,
EUA).
21
VIEIRA,P.M.A.
Materiais e Métodos
3.1.6 - Necrópsia, coleta, fixação e processamento do material para microscopia
óptica
Os animais foram eutanasiados no 42° DAI (0,5 mL/Kg de massa corporal por
via endovenosa de tiopental sódico – 0,03g/ml de solução salina 0,8%) sendo procedida
a necrópsia.
Durante a necrópsia foram coletados fragmentos dos átrios direito e esquerdo,
ventrículos direito e esquerdo, ponta e septo interventricular do coração, baço e
linfonodo cervical in totum fixados em formol a 10% tamponado (pH 7.2). Os
fragmentos das várias regiões do coração, do baço e do linfonodo cervical foram
processados rotineiramente e incluídos em parafina.
3.2 - Atividades realizadas neste estudo
3.2.1 - Dosagem sérica do NO
A avaliação das concentrações do NO foi realizada pela medida de nitritos
(NO2) e nitratos (NO3-), segundo o método de GREEN et al., (1982). Os soros dos cães
infectados e normais foram codificados antes da execução dos experimentos de
dosagem do NO sérico e após as reações foram decodificados para análise dos dados
obtidos.
As amostras foram descongeladas e alíquotas de 50µl foram transferidas para
eppendorfs de 500µl e diluídas em 50 µl de água destilada. Para a conversão de nitratos
a nitritos foram adicionados às amostras 30 µl de um coquetel contendo 10 µl de FAD
(Sigma), diluído 1:10 em água destilada , 10 µl de NADPH (Sigma) e 10 µl da enzima
Nitrato redutase (Sigma). As amostras foram incubadas por 12hs à 18hs, a 37ºC.
22
VIEIRA,P.M.A.
Materiais e Métodos
No dia seguinte foi realizada a desproteinização através da adição de 10µl de
sulfato de zinco (ZnSO4), seguida por cinco minutos de centrifugação a 5000 rpm. Após
esta etapa, as amostras foram plaqueadas em duplicata em placas de 96 poços de fundo
chato. Seguiu-se com a aplicação de 50µl do reagente de Griess, e incubação a
temperatura ambiente por 10 minutos. O reagente foi preparado na hora do uso,
misturando partes iguais de duas soluções A e B na proporção de 1:1. Sendo a solução
A composta de Sulfanilamida 1% (MERCK) e a solução B de Naftilenodiamino 0.7%.
A seguir foi determinada a absorbância a 570 nm em leitor de ELISA (Molecular
Devices, E Max, USA). A concentração do NO foi determinada utilizado-se como
padrão concentrações de 0,78 a 100 µM de nitrato de sódio (NaNO2) Os resultados
foram expressos em µM de NO pela média de duas dosagens realizada em dias
alternados.
3.2.2 - Colorações empregadas
Os blocos de parafina obtidos foram submetidos à microtomia para a obtenção
de cortes com espessura de quatro µm. Foram confeccionadas quatro lâminas dos blocos
parafinizados do baço, do linfonodo cervical e das diferentes regiões cardíacas.
Dos três cortes obtidos para o estudo do baço, linfonodo cervical e das diferentes
regiões do coração, o primeiro foi corado pelo método de Hematoxilina-Eosina (HE)
para análise rotineira das alterações histopatológicas; o segundo e o terceiro foram
utilizados em reações imuno-histoquímicas para detecção do parasito e expressão de
iNOS, respectivamente.
23
VIEIRA,P.M.A.
Materiais e Métodos
3.2.3 - Avaliação histopatológica do Baço e Linfonodo cervical
As análises histopatológicas do baço e linfonodo cervical foram realizadas
segundo ELMORE (2006a) e ELMORE (2006b), respectivamente. Esta avaliação
seguiu o descrito nas Tabelas 2 e 3 para cada um dos compartimentos destes órgãos. A
análise foi semi-quantitativa, sendo 0 = ausência de alteração; 1 = aumento/diminuição
discreta; 2 = aumento/diminuição moderada e 3 = aumento/diminuição intensa.
Tabela 2: Roteiro para avaliação histopatológica do baço. A ausência de alteração, o
aumento ou a diminuição discreta, moderada ou acentuada do tamanho, quantidade ou
número foram avaliados na região da PALS (zona periarteriolar de linfócitos T), zona
marginal, folículos e polpa vermelha esplênica.
Intensidade
PALS
Aumento/Diminuição do tamanho
Aumento/Diminuição na quantidade
Aumento/Diminuição no número de linfócitos
Zona Marginal
Aumento/Diminuição do tamanho
Aumento/Diminuição no número de linfócitos
Folículos
Aumento/Diminuição na quantidade
Aumento/Diminuição no número de linfócitos
Aumento/Diminuição dos centros germinais
Polpa vermelha
Aumento/Diminuição do tamanho
Aumento/Diminuição no número de macrófagos
Aumento no número de células hematopoiéticas
Aumento nos números
Células plasmáticas
Células apoptóticas
Macrófagos vacuolizados com corpos
apoptóticos
Fibrose
Necrose
24
VIEIRA,P.M.A.
Materiais e Métodos
Tabela 3: Roteiro para avaliação histopatológica do linfonodo cervical. A ausência de
alteração, o aumento ou a diminuição discreta, moderada ou acentuada da área,
tamanho, quantidade ou número foram avaliados na região do córtex ou medula do
linfonodo cervical.
Intensidade
Córtex
Aumento/Diminuição da área
Aumento/Diminuição no número de folículos
Aumento/Diminuição no desenvolvimento do centro germinal
Aumento/Diminuição no número de linfócitos
Aumento no número de:
Células apoptóticas
Células plasmáticas
Macrófagos vacuolizados
Necrose
Medula
Aumento/Diminuição da área
Aumento/Diminuição no número de linfócitos
Aumento/Diminuição no número de macrófagos
Aumento/Diminuição no número de células plasmáticas
Aumento no número de:
Células apoptóticas
Macrófagos vacuolizados
Necrose
3.2.4 Quantificação da inflamação na área cardíaca
Todos os núcleos celulares presentes nos fragmentos das diferentes regiões do
coração foram quantificados em 20 imagens (campos) aleatórias (área total percorrida
igual a 1,5 x 106 µm2). As imagens visualizadas pela objetiva 40x foram digitalizadas
através da microcâmera Leica DM5000B e do programa Leica Application Suite
(Verssão 2.4.0 R1). Para a análise das imagens obtidas foi utilizado o programa Leica
QWin V3. O processo inflamatório foi determinado pelo número de núcleos das células
presentes nos animais não-infectados ± desvio padrão, os animais infectados com o T.
cruzi com valores da quantificação de núcleos celulares acima desta média foram
considerados com inflamação cardíaca.
25
VIEIRA,P.M.A.
Materiais e Métodos
3.2.5 - Imuno-histoquímica para detecção do T. cruzi
Os cortes histológicos do baço, linfonodo cervical e das diferentes regiões
cardíacas foram desparafinizados em duas trocas de xilol de 15 minutos cada e
hidratados em concentrações decrescentes de álcool (100, 90, 80 e 70%) por cinco
minutos cada. Após a hidratação, ocorreu a lavagem dos cortes por cinco minutos em
em PBS (phosphate buffer saline) pH 7,2-7,4 também por cinco minutos.
Posteriormente, os cortes foram submetidos ao bloqueio da peroxidase endógena
em um banho de 30 minutos em PBS/Peróxido de Hidrogênio (240 ml de PBS e 10ml
de Peróxido de Hidrogênio 30%) à temperatura ambiente. Seguiu-se lavagem em PBS,
por três banhos consecutivos, de cinco minutos cada.
Para bloquear as reações cruzadas inespecíficas, aplicou-se o soro normal de
cabra diluído na proporção 1:50 em PBS, por 30 minutos em câmara úmida a
temperatura ambiente.
Em seguida, os cortes foram incubados com anticorpo primário (anti- T. cruzi
produzido em coelho – produção própria – diluição 1:1000 em PBS/Albumina 0,1%)
por 12hs a 18hs em câmara úmida a 4°C. Após a incubação com o anticorpo primário,
os cortes foram lavados em PBS, por três banhos de cinco minutos cada.
Os cortes foram, então, incubados com o anticorpo secundário (anti-IgG de
coelho, produzido em cabra, diluído 1:200 em PBS/Albumina 0,1%) em câmara úmida
por 30 minutos a 37°C. Os cortes retirados da câmara úmida receberam novamente três
banhos, de cinco minutos cada, em PBS.
Procedeu-se à aplicação do complexo peroxidase-antiperoxidase (PAP – SIGMA
– diluído 1:250 em PBS/Albumina 0,1%) e os cortes foram incubados em câmara úmida
por 30 minutos a 37°C. Seguiram-se três banhos de cinco minutos cada, em PBS.
26
VIEIRA,P.M.A.
Materiais e Métodos
Para a revelação da reação, os cortes foram incubados por cinco minutos à
temperatura ambiente com a solução de DAB (50 mg de Diaminobenzidina em 250 ml
de PBS e 500 µl de Peróxido de Hidrogênio 30%). Os cortes foram, então, lavados por
cinco minutos em água corrente e contracorados com Hematoxilina de Harris por 10
segundos. Novamente foram lavados por cinco minutos em água corrente e desidratados
em duas passagens pelo álcool absoluto. As lâminas foram montadas com Bálsamo do
Canadá (Pró-Cito) e lamínulas.
Em cada bateria de imuno-histoquímica, para controle da reação foram incluídos
dois cortes obtidos de coração de camundongo infectado pelo T. cruzi e sacrificado na
fase aguda da doença. Em um deles, usado como controle negativo, o antisoro anti-T.
cruzi foi substituído por PBS e no outro, usado como controle positivo, procedeu-se à
técnica de imuno-histoquímica descrita anteriormente. Ainda como controle da reação,
os cortes do baço e linfonodo cervical de cães não-infectados foram incluídos na bateria.
O parasitismo do baço, linfonodo cervical e das diferentes regiões do coração foi
quantificado em 30 campos microscópios aleatórios (objetiva de 40X) nas lâminas
submetidas às reações imuno-histoquímicas.
3.2.6 - Imuno-histoquímica para a detecção da expressão de iNOS
Os cortes de baço, linfonodo cervical e das diferentes regiões cardíacas foram
desparafinizados em xilol (dois banhos de 15 minutos cada) e hidratados em
concentrações decrescentes de álcool (100, 90, 80 e 70%) em banhos de cinco minutos
cada. Em seguida, os cortes foram lavados em água corrente por cinco minutos e então
se procedeu o bloqueio da peroxidase endógena (180ml de álcool metílico/20ml de
27
VIEIRA,P.M.A.
Materiais e Métodos
Peróxido de Hidrogênio 30%) por 30 minutos à temperatura ambiente. Seguiu-se a
lavagem em PBS por três banhos de cinco minutos cada.
Para a recuperação antigênica foi utilizado o tampão citrato pH 6.0 em forno de
microondas por 10 minutos. Depois de retiradas do forno de microondas, os cortes
foram deixados à temperatura ambiente para ocorrer um resfriamento progressivo dos
mesmos ainda imersos no tampão citrato pH 6.0. Só então foram lavados em PBS, em
três banhos de cinco minutos cada.
Após a secagem das bordas dos cortes com papel absorvente, aplicou-se o soro
normal de cavalo (R.T.U. Vectastain Universal Elite ABC; Vector Laboratories, Inc.)
por 30 minutos em câmara úmida a 37°C, com o objetivo de bloquear sítios
inespecíficos. Em seguida, secou-se o excesso de soro normal de cavalo e os cortes
foram incubados por 12hs à 18hs em câmara úmida a 4°C com o anticorpo policlonal
IgG de coelho anti-iNOS (Rabbit anti-Mouse iNOS, SC-651, Santa Cruz
Biotechnology, INC.) diluído 1:200 em solução diluente de anticorpo com componentes
redutores de background (DakoCytomation, USA).
Posteriormente, os cortes foram lavados em PBS e incubados com o anticorpo
secundário biotinilado (R.T.U. Vectastain Universal Elite ABC; Vector Laboratories,
Inc.) por 30 minutos em câmara úmida a 37°C. Seguiram-se três banhos de cinco
minutos cada, em PBS. Os cortes foram então incubados com o complexo ABC (R.T.U.
Vectastain Universal Elite ABC; Vector Laboratories, Inc.) por 30 minutos em câmara
úmida a 37°C. Seguiu-se a lavagem em PBS, três banhos de cinco minutos cada.
A revelação da reação da peroxidase foi obtida através da incubação em solução
de DAB (50mg de Diaminobenzidina em 250 mL de PBS e 500 µl de Peróxido de
Hidrogênio 30%) durante cinco minutos. No intuito de interromper a revelação, os
cortes foram lavados em água corrente por cinco minutos. Para realizar a contra28
VIEIRA,P.M.A.
Materiais e Métodos
coloração, foi utilizada a Hematoxilina de Harris por 10 segundos à temperatura
ambiente seguida pela lavagem dos cortes, por 5 minutos, em água corrente. O material
foi desidratado em álcool absoluto e seco em estufa 56°C. Após a secagem dos cortes na
estufa, as lâminas foram montadas com Bálsamo do Canadá (Pró-Cito) e lamínula.
Como controle da reação, foram incluídos dois cortes de pele obtidos de cão
inoculado com antígeno de Leishmania braziliensis e saponina. Em um deles, usado
como controle negativo, o anticorpo anti-iNOS foi substituído por PBS e no outro,
usado como controle positivo, procedeu-se a técnica imuno-histoquímica descrita
anteriormente. Os cortes assim obtidos foram utilizados para analisar a expressão de
iNOS no baço, linfonodo cervical e nas diferentes regiões cardíacas.
3.2.7 Análise quantitativa da expressão de iNOS
Estudos morfométricos da expressão de iNOS foram realizados através da análise
de imagem (obtidas por uma microcâmera Leica DM5000B e analisadas pelo programa
Leica QWin V3) pela medida da área marcada para iNOS em 20 imagens (campos)
aleatórias (área total percorrida igual a 1,5 x 106 µm2) no baço, linfonodo cervical e
diferentes regiões cardíacas. Todas as análises foram efetuadas na objetiva de 40x.
3.2.8 - Análise Estatística
Os testes estatísticos foram realizados com o apoio instrumental dos softwares
Minitab 13.20 para Windows (Minitab Inc., Pennsylvania, USA) e GraphPad Prism
4.03 (Prism Software, Irvine, CA, USA).
29
VIEIRA,P.M.A.
Materiais e Métodos
Para comparação dos níveis séricos de NO, do processo inflamatório e da área
marcada para iNOS foi realizada análise de variância (ANOVA one-way). Quando as
alterações foram significativas, o teste de Tukey foi realizado para determinar as
diferenças específicas entre as médias.
A parasitemia foi analisada pelo teste não paramétrico Kolmogorov-Sminorv
(KS), que compara a área sob a curva entre duas amostras (CONOVER, 1980).
As análises de correlação foram executadas através do teste de Spearman com
intervalo de confiança de 95%.
Para a análise das alterações histopatológicas do baço e linfonodo cervical foi
uitilizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, com pós-teste de Dunns.
Para a análise do parasitismo tecidual foi utilizado teste T de Student pareado.
Diferenças entre médias com valores de P menores que 0,05 foram consideradas
estatisticamente significativas.
30
4. Resultados
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
4.1 – Níveis Séricos de Óxido Nítrico
No Gráfico 1 estão apresentados os resultados da dosagem dos níveis séricos de
NO (Nitrito + Nitrato) realizada antes da infecção e aos 7, 14, 21, 28 e 35 DAI.
Observa-se que os animais pertencentes ao grupo TM apresentaram níveis
significativamente maiores de NO quando comparados aos animais dos grupos Controle
e TS no 14o e 28o DAI. Esta produção se iniciou no 7º e decaiu a partir do 28o DAI. Nos
animais dos grupos Controle e TS foram observados, ao longo do tempo, níveis
semelhantes de NO. Não foram observadas diferenças significativas na análise
longitudinal.
µM)
Nitrito + Nitrato (µ
50
40
*
*
30
20
10
0
0
7
14
21
28
35
Dias após a infecção
Gráfico 1: Cinética da dosagem dos níveis séricos de NO (Nitrato+Nitrito) em cães não
), infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM:
infectados (Controle:
) ou sangüíneas (TS:
) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi.
* diferença significativa do grupo TM em relação aos grupos Controle e TS.
32
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
A análise de regressão linear (Gráfico 2) demonstrou aumento significativo dos
níveis séricos de NO ao longo do tempo para o grupo TM (y= 0,515x + 22,28 r2= 0,08).
Nos grupos Controle e TS verificou-se redução dos níveis séricos de NO ao longo do
tempo (Controle: y= -1,4946x + 17,379 r2= 0,3866 e TS y= -1,0603x + 18,688 r2=
0,308).
50
40
y = 0,515x + 22,28
R2 = 0,008
Nitrito+ Nitrato (µ
µ M)
30
20
y = -1,0603x + 18,688
R2 = 0,308
10
y = -1,4946x + 17,379
R2 = 0,3866
0
0
7
14
21
28
35
Dias após a infecção
Gráfico 2: Linha de tendência da cinética dos níveis séricos de NO (Nitrato+Nitrito) em
), infectados com formas tripomastigotas
cães não infectados (Controle:
metacíclicas (TM:
) ou sangüíneas (TS:
) da cepa Be-78 do Trypanosoma.
cruzi.
33
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
4.2 – Comparação dos Níveis Séricos de Óxido Nítrico com as Curvas de
Parasitemia
No Gráfico 3 está representada a comparação entre os níveis séricos de NO e as
curvas de parasitemia dos animais dos grupos TM e TS. Não foram observadas
diferenças significativas da área sob a curva de parasitemia entre os grupos TM e TS.
No entanto, a produção mais precoce de NO nos animais do grupo TM pode estar
80
8000
70
7000
60
6000
50
5000
40
4000
30
3000
20
2000
10
1000
0
0
0
7
14
21
28
Número de parasitos/0,1 ml de sangue
µM)
Nitrito + Nitrato (µ
relacionada ao pico de parasitemia mais tardio neste grupo.
35
Dias após a infecção
;
Gráfico 3: Cinética da dosagem dos níveis séricos de NO (Nitrato+Nitrito) (TM:
TS:
) versus parasitemia (TM:
; TS:
) em cães infectados com formas
tripomastigotas metacíclicas (TM) ou sangüíneas (TS) da cepa Be-78 do Trypanosoma
cruzi.
34
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
4.3 - Correlação entre os Níveis Séricos de Óxido Nítrico e o Fenótipo das Células
do Sangue Periférico
Foi realizada análise de correlação entre os níveis séricos de NO e o fenótipo das
células do sangue periférico: linfócitos T (THY-1+, CD5+) e suas subpopulações (CD4+,
CD8+), linfócitos B (CD21+) e monócitos (CD14+). Nos grupos Controle e TS não
houve correlação entre os níveis séricos de NO e o fenótipo das células do sangue
periférico. Entretanto, no grupo TM observou-se correlação positiva entre os níveis
séricos de NO e o percentual de linfócitos T CD5+ e CD4+ (Gráfico 4 A e B). Estes
dados demonstram que o aumento dos níveis séricos de NO ocorreu simultaneamente ao
aumento de linfócitos T CD5+ e CD4+ no sangue periférico.
A 100
B 60
45
75
CD4+
CD5+
P = 0,0442; r = 0,4328
P = 0,0460; r = 0,4201
30
50
15
25
0
0
50
NO
100
0
150
0
50
NO
100
150
Gráfico 4: Correlação positiva entre os níveis séricos de NO e o percentual de células T
CD5+ (A) e a subpopulação T CD4+ (B) em cães infectados com formas tripomastigotas
metacíclicas (TM) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi.
35
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
4.4 - Análise histopatológica
Baço
Não foi observado parasitismo esplênico nos animais dos diferentes grupos
avaliados.
Na Tabela 4 esta apresentada a análise histopatológica realizada no baço de cães
não infectados e infectados com formas tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da
cepa Be-78 do T. cruzi.
Nos animais do grupo Controle não foram observadas alterações nas regiões da
PALS, zona marginal e polpa vermelha. Porém, 100% dos cães apresentaram um
aumento discreto na quantidade de folículos e no número de linfócitos nos folículos, e
em apenas 25% foi observado um discreto aumento nos centros germinativos.
Os cães do grupo TM apresentaram um aumento moderado no tamanho,
quantidade e número de linfócitos na PALS. Na zona marginal em 100% dos animais
observou-se um aumento intenso no tamanho e no número de linfócitos. Na região dos
folículos 75% dos cães demonstraram um moderado aumento no número dos mesmos e
25% um aumento discreto. Verificou-se um aumento moderado no número de linfócitos
e dos centros germinais em 75% dos cães, enquanto que em 25% foi observado um
aumento discreto. Na polpa vermelha, metade dos cães exibiu um aumento moderado no
tamanho da mesma, e a outra metade um aumento intenso. A avaliação dos macrófagos
mostrou um intenso aumento em 75% dos cães e em 25% um aumento moderado. Em
relação ao aumento no número de células hematopoiéticas, em metade dos animais foi
intenso, ao passo que em 25% foi moderado e em 25% não foi observada alteração.
No grupo TS observou-se um aumento discreto no tamanho da região da PALS
em 75% dos animais e em 25% um aumento moderado. Em metade dos cães foi
observado um aumento discreto e na outra metade um aumento moderado na quantidade
36
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
de PALS e de linfócitos na mesma. Na zona marginal, tanto para o aumento no tamanho
quanto para o número de linfócitos 75% dos cães apresentaram um aumento moderado e
25% um aumento discreto. Na região dos folículos metade dos animais apresentou um
aumento moderado na quantidade de folículos e no número de linfócitos. Os centros
germinais apresentaram-se intensamente aumentados em 75% dos animais. Verificou-se
um aumento intenso no tamanho da polpa vermelha em 75% dos animais acompanhado
por um aumento moderado, discreto ou ausência de alterações no número de
macrófagos em 50, 25 e 25% destes animais, respectivamente. Ainda na polpa
vermelha, 100% dos animais apresentaram um aumento discreto no número de células
hematopoiéticas. O número de células apoptóticas, diferente do observado nos grupos
Controle e TM, estava moderadamente aumentado em 50% dos cães deste grupo.
Não foram observadas alterações no número de células plasmáticas ou de
macrófagos vacuolizados com corpos apoptóticos assim como não houve fibrose ou
necrose em todos os grupos avaliados.
A análise estatística revelou aumento significativo nas regiões da PALS
(tamanho, quantidade e número de linfócitos), zona marginal (tamanho e número de
linfócitos), folículos (número de linfócitos e centros germinais) e polpa vermelha
(número de macrófagos e células hematopoiéticas) dos animais do grupo TM em
relação aos animais do grupo Controle. Em relação aos animais do grupo TS houve um
aumento significativo nos centros germinais e na polpa vermelha (tamanho e número de
células apoptóticas) em relação ao grupo Controle.
37
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
Controle
n (%)
Sem
alteração
Discreto
Moderado
TM
n (%)
Intenso
Sem
alteração
Discreto
Moderado
TS
n (%)
Intenso
Sem
alteração
Discreto
Moderado
Intenso
PALS
Tamanho
Quantidade
o
Linfócitos (n )
4(100%)
↑4(100%)
↑ 3(75%)
↑ 1(25%)
4(100%)
↑4(100%)
↑ 2(50%)
↑ 2(50%)
4(100%)
↑4(100%)
↑ 2(50%)
↑ 2(50%)
Zona Marginal
Tamanho
o
Linfócitos (n )
4(100%)
↑4(100%)
↑ 1(25%)
↑ 3(75%)
4(100%)
↑4(100%)
↑ 1(25%)
↑ 3(75%)
↑ 1(25%)
↑ 2(50%)
↑ 1(25%)
↑ 1(25%)
↑ 2(50%)
↑ 1(25%)
Folículos
↑ 4(100%)
Quantidade
o
↑ 3(75%)
↑ 4(100%)
↑ 3(75%)
↑ 1(25%)
↑ 1(25%)
↑ 3(75%)
↑ 1(25%)
↑ 1(25%)
↑ 3(75%)
4(100%)
↑ 2(50%)
↑ 2(50%)
↑ 1(25%)
↑ 3(75%)
4(100%)
↑ 1(25%)
↑ 3(75%)
↑ 1(25%)
↑ 2(50%)
Linfócitos (n )
Centros germinais
↑1(25%)
3 (75%)
Polpa vermelha
Tamanho
o
Macrófagos (n )
Céls
hematopoiéticas
(no)
Céls apoptóticas
(no)
4(100%)
1 (25%)
4(100%)
2 (50%)
↑2(50%)
1 (25%)
↑ 1(25%)
↑ 2(50%)
↑4(100)
↑ 2(50%)
↑ 2(50%)
Tabela 4: Avaliação histopatológica do baço de cães não infectados (Controle), infectados com formas tripomastigotas metacílicas (TM) ou
sangüíneas (TS) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. ↑ : Aumento e ↓ : Diminuição.
38
Resultados
Controle
VIEIRA,P.M.A.
D
B
E
TS
TM
A
50 µm
C
100 µm
F
Figura 3: Fotomicrografias do baço de cães não infectados e infectados com formas
tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. (A)
ausência de células inflamatórias no átrio direito do grupo controle; (B) infiltrado
inflamatório discreto e (C) moderado observado no grupo TM e TS, respectivamente;
(D) ausência de células inflamatórias no septo interventricular do grupo controle; (E e
F) infiltrado inflamatório intenso no septo interventricular dos grupos TM e TS,
respectivamente. Hematoxilina-Eosina, Barra= 50µm.
39
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
Linfonodo Cervical
Não foi observado parasitismo no linfonodo cervical dos animais pertencentes
aos diferentes grupos avaliados.
A Tabela 5 mostra os resultados da avaliação histopatológica do Linfonodo
Cervical de cães não infectados e infectados com formas tripomastigotas metacíclicas
ou sangüíneas da cepa Be-78 do T. cruzi.
Os animais do grupo Controle não apresentaram alterações na região do córtex,
porém na zona medular 25% dos animais apresentaram um aumento discreto na área e
no número de linfócitos. Não foram observadas alterações nos demais aspectos
avaliados.
Em todos os animais infectados foram observadas alterações tanto na zona
cortical quanto na medular. Porém, não houve mudanças no número de células
plasmáticas, macrófagos vacuolizados ou presença de necrose em nenhuma das regiões
analisadas para ambos os grupos infectados.
Com relação às células apoptóticas, no córtex 25% dos animais do grupo TM
apresentaram um aumento discreto destas células, enquanto em 75% não foram
observadas células apoptóticas. No grupo TS, 25% dos animais tiveram um aumento
intenso e 75% não apresentaram alterações na presença destas células. Na medula
nenhum animal do grupo TS apresentou células apoptóticas, enquanto que no grupo TM
50% apresentou um aumento moderado.
Na região cortical, metade dos animais do grupo TM apresentou um aumento
moderado desta região, e 25% exibiram aumento intenso e os outros 25% não
apresentaram alterações. Com relação ao aumento no número de folículos, em 50% dos
cães não houve alterações, em 25% um aumento moderado e em 25% um aumento
40
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
intenso. No aspecto do desenvolvimento do centro germinativo e do número de
linfócitos cada animal deste grupo apresentou um padrão de alteração, variando de
ausente a intenso. Na região medular, todos os cães do grupo TM apresentaram um
aumento moderado na área e no número de linfócitos. Não houve aumento no número
de macrófagos nesta região.
Nos animais do grupo TS, 50% deles apresentaram um aumento moderado na
área cortical e os outros 50% não exibiram alteração na área. Apenas um cão apresentou
aumento moderado no número de folículos. Não foram observadas alterações nos
centros germinativos em 50% dos cães do grupo TS, porém nos outros 50% houve um
aumento discreto nos centros germinativos. Quanto ao número de linfócitos, metade dos
cães não apresentou qualquer mudança, entretanto na outra metade, este aumento variou
de moderado a intenso. Para a zona medular, apenas um cão apresentou um aumento
moderado na área e número de linfócitos. Todos os animais deste grupo apresentaram
moderada redução no número de macrófagos na medula.
A análise estatística revelou só haver diferença significativa nas alterações da
zona medular. Os animais do grupo TM apresentaram um aumento significativo na área
e no número de linfócitos quando comparado ao grupo Controle. Já nos animais do
grupo TS foi observado uma diminuição significativa de macrófagos em relação aos
grupos Controle e TS.
41
Controle
n(%)
Sem
alteração
Discreto
Moderado
TM
n(%)
Intenso
Sem
alteração
Discreto
TS
n(%)
Moderado
Intenso
Sem
alteração
Discreto
Moderado
Intenso
Córtex
Área
o
4(100%)
1(25%)
↑ 2(50%)
↑1(25%)
2(50%)
↑ 2(50%)
↑ 1(25%)
↑ 1(25%)
3(75%)
↑ 1(25%)
Folículos (n )
4(100%)
2(50%)
Desenvolvimento do centro
germinal
4(100%)
1(25%)
↑1(25%)
↑ 1(25%)
↑ 1(25%)
2(50%)
Linfócitos (no)
4(100%)
1(25%)
↑1(25%)
↑ 1(25%)
↑ 1(25%)
2(50%)
4(100%)
3(75%)
↑1(25%)
o
Céls. apoptóticas (n )
↑2(50%)
↑ 1(25%)
↑1(25%)
↑1(25%)
3(75%)
Medula
3(75%)
↑1(25%)
↑4(100%)
3(75%)
↑ 1(25%)
Linfócitos (n )
3(75%)
↑1(25%)
↑4(100%)
3(75%)
↑ 1(25%)
Macrófagos (no)
4(100%)
4(100%)
Céls. apoptóticas (no)
4(100%)
2(50%)
Área
o
↓4(100%)
↑2(50%)
4(100%)
Tabela 5: Avaliação histopatológica do Linfonodo cervical de cães não infectados (Controle) e infectados com formas tripomastigotas
metacíclicas (TM) ou sangüíneas (TS) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. ↑ : Aumento e ↓ : Diminuição.
42
Resultados
Controle
VIEIRA,P.M.A.
D
B
E
TS
TM
A
50 µm
C
100 µm
F
Figura 4: Fotomicrografias do linfonodo cervical de cães não infectados e infectados
com formas tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da cepa Be-78 do Trypanosoma
cruzi. (A) ausência de células inflamatórias no átrio direito do grupo controle; (B)
infiltrado inflamatório discreto e (C) moderado observado no grupo TM e TS,
respectivamente; (D) ausência de células inflamatórias no septo interventricular do
grupo controle; (E e F) infiltrado inflamatório intenso no septo interventricular dos
grupos TM e TS, respectivamente. Hematoxilina-Eosina, Barra= 50µm.
43
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
Coração
Nas Figuras 5 e 6 estão apresentados, respectivamente, os resultados da
avaliação qualitativa e quantitativa do parasitismo nas diferentes regiões cardíacas de
cães infectados com formas tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da cepa Be-78
do T. cruzi.
Na Figura 5 observa-se a presença de parasito no ventrículo direito de cães
infectados com as formas tripomastigotas metacíclicas (Figura 5 A) ou sangüíneas
(Figura 5 B).
A análise morfométrica do parasitismo tecidual (Figura 6) realizada nas
diferentes regiões cardíacas apresentou aumento significativo de parasitos no ventrículo
direito dos animais do grupo TS em relação aos animais do grupo TM. Entretanto,
embora não tenha sido observada diferença significativa nas outras regiões, os animais
do grupo TS revelaram um parasitismo tecidual mais elevado que o grupo TM.
Nas Figuras 7 e 8 estão apresentados, respectivamente, os resultados da
avaliação qualitativa e quantitativa do infiltrado inflamatório nas diferentes regiões
cardíacas de cães não infectados e infectados com formas tripomastigotas metacíclicas
ou sangüíneas da cepa Be-78 do T. cruzi.
Na Figura 7 observa-se aspecto histológico normal no átrio direito (Figura 7 A) e
no septo interventricular (Figura 7 D) do grupo Controle. Nos animais infectados,
observou-se processo inflamatório constituído predominantemente por células
mononucleadas, apresentando morfologia de linfócitos em sua maioria. O grupo TM
exibiu processo inflamatório focal (Figura 7 B e E), enquanto que nos animais do grupo
TS a inflamação foi difusa (Figura 7 C e F).
A análise morfométrica (Figura 8) realizada nas diferentes regiões cardíacas
44
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
revelou aumento significativo no número de núcleos celulares presentes no átrio direito
e na ponta dos animais do grupo TS em relação aos animais dos grupos Controle e TM.
Nos átrios e ventrículos esquerdo houve aumento significativo apenas entre os animais
dos grupos Controle e TS. Enquanto que no ventrículo direito e no septo interventricular
tanto o grupo TM quanto o TS apresentaram um aumento significativo quando
comparados ao grupo Controle.
Os animais do grupo TS apresentaram maior processo inflamatório quando
comparado ao Controle em todas as regiões cardíacas avaliadas (p<0,05). No grupo TM,
apenas o ventrículo direito e o septo apresentaram processo inflamatório
significativamente maiores que o grupo controle. A comparação entre os animais do
grupo TM aos animais do grupo TS mostrou diferença significativa apenas no átrio
direito e na ponta, com processo inflamatório maior no grupo TS. Entretanto, de uma
maneira geral, observou-se que este processo inflamatório sempre foi maior nos animais
do grupo TS quando comparados aos animais do grupo TM. Além disso, vale a pena
ressaltar que o processo inflamatório no septo sempre se apresentou mais exuberante.
45
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
TM
50 µm
B
C
D
TS
A
Figura 5: Fotomicrografias do ventrículo direito de cães infectados com formas
tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. (A)
cão infectado por formas tripomastigotas metacíclicas; (B) cão infectado por formas
tripomastigotas sangüíneas. Imuno-histoquímica para detecção do parasito (peroxidase
anti-peroxidase), Barra= 50µm.
46
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
AD
AE
30000
4500
20000
3000
10000
1500
0
0
VD
VE
60
45000
Área (µ
µ m2)
a
40
30000
20
15000
0
0
Ponta
Septo
30
30
20
20
10
10
0
TM
0
TS
TM
TS
Grupos
Figura 6: Análise morfométrica do parasitismo tecidual nas diferentes regiões cardíacas
em cães infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM: ) ou sangüíneas
(TS: ) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. AD: átrio direito; AE: átrio esquerdo; VD:
ventrículo direito e VE: ventrículo esquerdo. “a”: diferença significativa em relação ao
grupo TM.
47
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
Atrio direito
Septo interventricular
Controle
50 µm
D
B
B
E
C
F
TS
TM
AA
Figura 7: Fotomicrografias do átrio direito e septo interventricular de cães não
infectados e infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM) ou sangüíneas
(TS) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. (A) ausência de células inflamatórias no
átrio direito do grupo controle; (B) infiltrado inflamatório discreto e (C) moderado
observado no grupo TM e TS, respectivamente; (D) ausência de células inflamatórias no
septo interventricular do grupo controle; (E e F) infiltrado inflamatório intenso no septo
interventricular dos grupos TM e TS, respectivamente. Hematoxilina-Eosina, Barra=
50µm.
48
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
AD
AE
1500
1500
1000
Núcleos celulares/1,5 x 106 µ m2
a
ab
1000
500
500
0
0
VD
1500
VE
a
1500
a
a
1000
1000
500
500
0
0
Ponta
1500
Septo
3000
ab
a
1000
2000
500
1000
0
Controle
TM
0
TS
a
Controle
TM
TS
Grupos
Figura 8: Análise morfométrica do infiltrado inflamatório nas diferentes regiões
cardíacas em cães não infectados (Controle: ), infectados com formas tripomastigotas
metacíclicas (TM: ) ou sangüíneas (TS: ) da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. AD:
átrio direito; AE: átrio esquerdo; VD: ventrículo direito e VE: ventrículo esquerdo. “a”:
diferença significativa em relação ao grupo Controle e “b” em relação ao grupo TM.
49
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
4.5 - Expressão de iNOS
Nas Figuras 9, 10 e 11 estão apresentados, respectivamente, os resultados da
avaliação qualitativa e quantitativa da expressão da iNOS no baço, linfonodo cervical e
nas diferentes regiões cardíacas de cães não infectados e infectados com formas
tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da cepa Be-78 do T. cruzi.
Observou-se maior área marcada para iNOS no baço do grupo TM (Figura 9B)
em relação aos grupos Controle (Figura 9A) e TS (Figura 9C). A polpa vermelha foi a
região na qual se concentrou a maior parte da marcação para iNOS nos três grupos
experimentais. Porém, nos animais do grupo TM havia uma forte marcação logo abaixo
da cápsula que não foi observada nos outros grupos. Em todos os grupos infectados
houve marcação na zona marginal e na polpa vermelha, entretanto apenas no grupo TS
foi encontrada marcação para iNOS nos folículos.
No linfonodo cervical verificou-se redução na área marcada para de iNOS no
grupo TS (Figura 9F) em relação aos grupos Controle e TM (Figuras 9D e E). A região
na qual se encontrou maior intensidade de marcação para iNOS foi a zona medular em
ambos os grupos.
No ventrículo esquerdo observou-se um aumento na área marcada para iNOS no
grupo TS (Figura 10A) em relação aos grupos Controle e TM (Figuras 10B e C). Em
geral, os vasos de todas as regiões cardíacas apresentaram intensa marcação para os
animais do grupo TM e TS.
No baço (Figura 11) foi observado o mesmo padrão para expressão de iNOS
demonstrado na dosagem dos níveis séricos de NO. O grupo TM apresentou uma área
significativamente maior com marcação para iNOS quando comparado aos grupos TS e
Controle.
50
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
No linfonodo cervical (Figura 11) não houve diferença nas áreas marcadas para
iNOS entre os grupos TM e Controle. Entretanto, no grupo TS observou-se uma área
significativamente menor marcada para iNOS quando comparada aos grupos Controle e
TS.
No coração (Figura 11) verificou-se diferença significativa no ventrículo
esquerdo, onde os animais do grupo TS apresentaram uma maior área marcada para
iNOS em relação aos animais dos grupos Controle e TS. Nos outros fragmentos não
houve diferença significativa, porém observou-se uma área maior marcada para iNOS
sempre nos animais do grupo TM.
51
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
Baço
Controle
Linfonodo cervical
D
B
E
C
F
TS
TM
A
50 µm
Figura 9: Fotomicrografias do baço e linfonodo cervical de cães não infectados (Controle)
e infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM) ou sangüíneas (TS) da cepa
Be-78 do Trypanosoma cruzi. (A) grupo controle pequena área marcada para iNOS no
baço; (B) intensa marcação para iNOS no baço do grupo TM e (C) pequena área marcada
para iNOS no baço do grupo TS; (D e E) intensa marcação para iNOS no linfonodo
cervical dos grupos Controle e TM, respectivamente; (F) redução da área marcada para
iNOS no linfonodo cervical do grupo. Imuno-histoquímica para detecção de iNOS, Barra=
50µm.
52
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
50 µm
A
B
C
50 µm
Figura 10: Fotomicrografias do ventrículo esquerdo de cães não infectados (Controle) e
infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM) ou sangüíneas (TS) da cepa
Be-78 do Trypanosoma cruzi. (A e B) pequena área marcada para iNOS nos grupos
Controle e TM; (C) intensa marcação para iNOS no grupo TS. Imuno-histoquímica para
detecção de iNOS, Barra= 50µm.
53
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
Baço
40
Linfonodo
80
a
30
60
20
40
10
ab
20
b
0
0
Área (µ
µ m2) x 104
AD
AE
120
60
90
45
60
30
30
15
0
0
VD
VE
2000
1400
1500
1050
1000
700
500
350
0
0
ab
Ponta
Septo
40
140
30
105
20
70
10
35
0
Controle
TM
0
TS
Controle
TM
TS
Grupos
Figura 11: Análise morfométrica da área expressando iNOS nos fragmentos de baço,
linfonodo cervical e diferentes regiões cardíacas em cães não infectados (Controle: ),
infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM: ) ou sangüíneas (TS: ) da
cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. AD: átrio direito; AE: átrio esquerdo; VD:
ventrículo direito e VE: ventrículo esquerdo. “a”: diferença significativa em relação ao
grupo Controle e “b” em relação ao grupo TM.
54
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
4.6 - Comparação entre a expressão de iNOS e as alterações histopatológicas
No baço, os animais do grupo TM apresentaram maior área marcada para iNOS
e maiores alterações histológicas, principalmente nas regiões da PALS e Zona Marginal
com aumento no tamanho e no número de linfócitos nestas regiões em relação ao grupo
Controle. Este grupo também apresentou um aumento significativo no número de
linfócitos nos folículos e de macrófagos na polpa vermelha em relação ao grupo
Controle.
No linfonodo cervical nos animais do grupo TS observou-se uma área
significativamente menor marcada para iNOS quando comparada aos grupos Controle e
TM, estes mesmos animais também apresentaram uma diminuição significativa de
macrófagos na zona medular em relação os grupos Controle e TM. Deste modo, sendo o
macrófago uma das principais células a expressar iNOS pode se relacionar a diminuição
da expressão de iNOS com a diminuição do número de macrófagos na zona medular, já
que esta área foi a que apresentou maior área marcada para iNOS em ambos os grupos.
Os animais do grupo TM não demonstraram diferença significativa na área marcada
para iNOS em relação ao grupo Controle, porém apresentaram alterações histológicas
significativas na área e no número de linfócitos na zona medular em comparação ao
grupo Controle.
Os animais do grupo TS apresentaram maiores níveis de inflamação nas
diferentes regiões cardíacas, porém foram os que obtiveram menores áreas marcadas
para iNOS, com exceção do ventrículo esquerdo. O inverso foi observado nos animais
do grupo TM, tendo esses menores níveis de inflamação e maior área marcada para
iNOS nas diferentes regiões cardíacas.
55
VIEIRA,P.M.A.
Resultados
4.7 - Correlação entre a expressão de iNOS e o parasitismo tecidual
Foi realizada análise de correlação entre a expressão da iNOS e o parasitismo
tecidual nas diferentes regiões cardíacas nos grupos TM e TS. Para ambos os grupos
não houve correlação entre a expressão da iNOS e o parasitismo tecidual. Entretanto, os
animais do grupo TS apresentaram menor expressão de iNOS (com exceção do
ventrículo esquerdo, onde TS apresentou maior área marcada para iNOS) e maior
parasitismo tecidual quando comparado ao grupo TM.
4.8 - Correlação entre a expressão de iNOS tecidual e os níveis séricos de Óxido
Nítrico
Foi realizada análise de correlação entre os níveis séricos de NO e a expressão
da iNOS nos diferentes tecido analisados. Nos grupos Controle e TS não houve
correlação entre os níveis séricos de NO e a expressão tecidual. Entretanto, no grupo
TM observou-se correlação negativa entre os níveis séricos de NO e a expressão da
enzima iNOS no átrio esquerdo.
P = 0,0329; r = - 0,9671
Nitrito + Nitrato (µ
µ M)
20
10
0
0
500000
1000000
iNOS (µ
µm2)
1500000
Gráfico 5: Correlação entre a expressão da enzima iNOS e o nível sérico de NO no átrio esquerdo
de cães infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TM) da cepa Be-78 do Trypanosoma
cruzi.
56
5. Discussão
VIEIRA,P.M.A.
Discussão
Neste trabalho foi avaliada a participação sistêmica e compartimentalizada do
NO em cães infectados com formas tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da
cepa Be-78 do T. cruzi. Cada uma dessas formas infectantes apresenta características
peculiares que implicam nas análises in vitro e in vivo em respostas imunes
diferenciadas (BRENER & GAZZINELLI, 1997; CARNEIRO et al., 2007).
Ao trabalhar nesta linha de raciocínio, algumas possibilidades distintas da
transmissão do parasito podem ser abordadas. A utilização de formas tripomastigotas
metacíclicas reproduz, em parte, o que acontece na natureza, nas infecções por vetores.
Por outro lado, a infecção com formas tripomastigotas sangüíneas , o que acontece em
casos de transmissão transfusional ou mesmo em acidentes de laboratório e,
principalmente,
na
maioria
das
infecções
experimentais
onde
as
formas
tripomastigotas sangüíneas são mais utilizadas por serem mais facilmente obtidas e
mantidas em laboratório.
Para mimetizar estes mecanismos de transmissão, o ideal seria a utilização das
vias conjuntival e endovenosa, entretanto, a via intraperitoneal foi escolhida neste
trabalho por garantir a infectividade de 100% dos animais, independente da forma
infectante (BAHIA et al., 2002).
A destruição das formas tripomastigotas na fase aguda da infecção é
dependente, além de outros fatores (PASCUTTI et al., 2003; CARDILLO et al.,
2007), da produção de NO que é catalisado pela enzima óxido nítrico sintase induzível
(iNOS) (VESPA et al., 1994; PETRAY et al., 1995; ALIBERTI et al., 1996;
HOLSCHER et al., 1998). Mais precisamente, os macrófagos infectados pelo T. cruzi
irão produzir IL-12, responsável pela síntese inicial de IFN-γ pelas células NK. O IFNγ tem um papel importante na ativação de macrófagos, que irão produzir altos níveis
58
VIEIRA,P.M.A.
Discussão
de NO que controlarão efetivamente a replicação do parasito (CARDILLO et al.,
1996; SARDINHA et al., 2006).
Foi demonstrado que as glicoproteínas tipo mucinas ancoradas em
glicosilfosfatidilinositol (GPI mucinas) purificadas das formas tripomastigotas
sangüíneas , mas não aquelas das formas epimastigotas ou tripomastigotas
metacíclicas, iniciam potencialmente a resposta pró-inflamatória (citocinas e produção
de NO) através da produção de IFN-γ em macrófagos murinos. Além disso, quando
comparada com as GPI mucinas das tripomastigotas metacíclicas, as GPI mucinas da
tripomastigotas sangüíneas são 100-1000 vezes mais reativas na indução de citocinas
pró-inflamatórias (IL-12 e TNF-α) e NO pelos macrófagos murinos (CAMARGO et
al., 1997a; CAMARGO et al., 1997b).
Neste trabalho os animais infectados com formas tripomastigotas metacíclicas
(TM) foram os maiores produtores de NO sérico em comparação aos grupos Controle e
TS, diferente do observado in vitro (Camargo et al., 1997a; Camargo et al., 1997b).
Entretanto, deve-se levar em consideração que são dois experimentos distintos, sendo
um deles com macrófagos de camundongos em cultura o que em muito difere do
modelo cão utilizado neste trabalho. Porém, este aumento poderia estar relacionado a
elevadas expressão de iNOS observada nos diferentes tecidos avaliados que tem contato
direto com o sangue (baço e coração). Desta forma, estes compartimentos poderiam
contribuir para o aumento sistêmico (sérico) do NO do grupo TM.
Entretanto, diferença no perfil de NO sérico observada entre os grupos TM e
TS provavelmente deve-se à interação parasito/hospedeiro estabelecida precocemente
pelas diferentes formas infectantes sendo que ao final da fase aguda este efeito
desaparece.
59
VIEIRA,P.M.A.
Discussão
A partir do 28° DAI os animais do grupo TM apresentaram uma queda nos
níveis séricos de NO, igualando-se aos níveis dos grupos Controle e TS no 35° DAI.
Estes achados estão de acordo com os encontrados por SAEFTEL et al. (2001), que
demonstraram no modelo murino que o NO tem sua importância para o controle da
infecção nas primeiras três semanas, ocorrendo uma diminuição em seus níveis após
este período.
Não foi observado parasitismo tecidual no baço e linfonodo cervical em
nenhum dos cães avaliados, o que poderia ser explicado pelo fato da cepa Be-78 ser
miotrópica, tendo preferência assim por cardiomiócitos e não por células do sistema
mononuclear fagocitário. O parasitismo cardíaco foi discreto tanto no grupo TM
quanto no grupo TS, havendo diferença significativa apenas no VD onde o grupo TS
apresentou maior parasitismo tecidual. Esta semelhança poderia estar relacionada ao
período de realização da necrópsia dos animais em fase de parasitemia negativa
(CARNEIRO et al., 2007). O período pré-patente foi maior no grupo TM, sugerindo
que a interação entre as formas tripomastigotas metacíclicas e células do hospedeiro
vertebrado ocorreu mais lentamente, com um período de latência maior até a liberação
do parasito na corrente sanguínea (CARNEIRO et al., 2007), o que explicaria o
processo inflamatório menos intenso neste grupo. Porém, apesar da ausência de
correlação entre o nível sérico de NO e o parasitismo tecidual, os níveis elevados e
precoces de NO no grupo TM também estaria, provavelmente, relacionado ao maior
controle do parasitismo tecidual. Este controle reflete em um atraso no pico de
parasitemia quando comparado ao grupo TS o que também poderia explicar o maior
período de pré-patência observado no grupo TM.
Neste trabalho foi encontrada uma correlação positiva entre os níveis séricos de
NO e a porcentagem da população dos linfócitos T CD5+ e sua subpopulação T CD4+
60
VIEIRA,P.M.A.
Discussão
nos animais do grupo TM, evidenciando que estas células participariam diretamente
ou indiretamente da produção de NO. Diretamente as células T CD4+ poderiam estar
produzindo NO a partir da enzima iNOS a semelhança do observado por TAYLORROBINSON et al. (1994) ou, como demonstrado por inúmeros autores, os linfócitos T
CD4+ produziriam IFN-γ que ativariam os macrófagos na produção de NO a partir da
enzima iNOS (RUSSO et al., 1988; ARAUJO, 1989; ROTTENBERG et al., 1993;
ROTTENBERG et al., 1995).
Adicionalmente, CARNEIRO et al. (2007) observaram nestes mesmos cães
diminuição significativa de células CD4+ no sangue periférico dos animais do grupo
TM em relação aos animais do grupo TS no 28° DAI. Isto evidenciaria uma maior
migração destas células para os sítios de inflamação neste grupo, o que poderia ser
responsável pela maior produção de NO nos tecidos dos animais do grupo TM.
Entretanto, inúmeras tentativas de caracterização das células T (CD4+ e CD8+) nos
tecidos, tanto congelados quanto parafinizados foram realizadas, sem sucesso.
No baço o percentual de linfócitos T CD4+ foi significativamente menor nos
animais dos grupos TM e TS em relação ao grupo Controle (dados não publicados),
levando a crer que estas células estariam migrando para o coração na tentativa de
controlar a replicação do parasito neste órgão. Por outro lado, o percentual das células
T CD8+ no baço dos animais do grupo TM foi significativamente maior do que o
observado no grupo Controle Como esta célula é uma das responsáveis pela produção
de IFN-γ (SARDINHA et al., 2006) e como este grupo apresentou aumento
significativo de macrófagos na polpa vermelha, é possível especular que o aumento da
expressão de iNOS neste órgão deve-se ao aumento destas células, considerando que
os linfócitos T CD8+ produzem IFN-γ que ativariam os macrófagos a expressarem
iNOS.
61
VIEIRA,P.M.A.
Discussão
No linfonodo cervical não foram observadas diferenças significativas no
percentual das diferentes populações celulares entre os grupos estudados (dados não
publicados). Neste trabalho não houve diferença significativa na área marcada para
iNOS ente os grupos Controle e TM, levantando a hipótese de que na infecção por
formas tripomastigotas metacíclicas do T. cruzi o linfonodo tem um papel menor
contra o parasito quando comparado ao observado nos compartimentos baço e coração
bem como no soro.
Nos animais do grupo TM foram observadas maiores alterações esplênicas
quando comparados aos animais do grupo Controle. Entre estas alterações está o
aumento no número de linfócitos e macrófagos nas regiões da PALS, zona marginal e
polpa vermelha. Tendo em vista que o grupo TM foi o que apresentou maior área
marcada para iNOS e maiores níveis séricos de NO, pode-se relacionar o aumento
destas células com a alta expressão de iNOS e níveis séricos de NO encontrados neste
grupo, levantado a hipótese de que os animais infectados com as formas
tripomastigotas metacíclicas teriam uma maior migração de monócitos e linfócitos
para o baço, possibilitando assim uma alta expressão de iNOS e posterior produção de
NO pelos animais deste grupo quando comparados aos grupos Controle e TS.
Ainda no baço, foi observado um aumento significativo no número de células
apoptóticas no grupo TS. Este aumento pode estar relacionado à supressão de células
T, e isso justificaria a baixa produção de NO neste grupo quando comparado aos
animais do grupo TM. RIBEIRO et al. (2007) demonstraram que a infecção pelo T.
cruzi leva a apoptose dos esplenócitos, sugerindo que o parasito tenha um papel
genotóxico sobre o baço.
No linfonodo cervical observou-se diminuição no número de macrófagos na
zona medular dos animais do grupo TS em relação aos grupos Controle e TM. Os
62
VIEIRA,P.M.A.
Discussão
animais deste grupo apresentaram diminuição significativa na área marcada para iNOS
neste órgão, o que permite especular que a diminuição do número de macrófagos está
relacionada a baixa expressão de iNOS, em relação aos grupos TM e Controle. Os
macrófagos são os principais produtores de NO na fase aguda da doença de Chagas e a
migração de monócitos para o coração pode ter ocorrido contribuindo para o
acentuado infiltrado inflamatório observado neste grupo (TS).
PARK et al. (2000) observaram a presença do mRNA da iNOS nas células
cardíacas normais humanas, levando a crer que o músculo cardíaco expressaria a
iNOS em condições basais constitutivamente. Isto explicaria a expressão para esta
enzima encontrada nas diferentes regiões cardíacas dos animais Controle do presente
trabalho.
CHANDRASEKAR et al. (1998) observaram através de estudos imunohistoquímicos em ratos que a partir das 36 horas após a infecção havia alta expressão
de iNOS nas artérias e arteríolas, que foi se reduzindo até o 15° DAI, ocorrendo o
inverso nos cardiomiócitos, tendo estes apresentado intensa marcação para iNOS no
15° DAI. O mesmo padrão foi observado neste trabalho, com forte marcação nas
artérias, e principalmente nos cardiomiócitos. Estes mesmos autores relataram
marcação apenas na polpa vermelha e artérias do baço, não observando marcação na
região dos folículos, o que está, em parte, de acordo com os resultados apresentados
nesta dissertação para o grupo TM. Porém, os animais do grupo TS apresentaram
marcação na região dos folículos.
Os animais do grupo TS apresentaram processo inflamatório maior quando
comparado aos grupos Controle e TM, porém estes animais revelaram menor área
marcada para iNOS de um modo geral. Este fato poderia estar relacionado a presença
de citocinas anti-inflamatórias, como IL-10 e TGF-β (OSWALD et al., 1992, SHER et
63
VIEIRA,P.M.A.
Discussão
al., 1992), que são capazes de desativar os macrófagos não permitindo a expressão da
enzima iNOS. Com base nesses dados, torna-se extremamente importante a avaliação
dessas citocinas nos tecidos destes animais.
Os resultados observados nesta dissertação reforçam os obtidos por Carneiro et
al, (2007) que verificaram que a fonte do inóculo pode interferir no desenvolvimento
da fase aguda da doença de Chagas. Ao que parece, animais infectados com as formas
TM induzem uma resposta inicial mais eficaz, que limita a parasitemia e,
posteriormente, o parasitismo tecidual, refletindo em menor resposta inflamatória,
caracterizando um quadro de menor dano tecidual. Por outro lado, animais infectados
com as formas TS não seriam capazes de logo no início da infecção, induzir uma
resposta imune mais elaborada, e conseqüentemente não alcançam o controle rápido
da infecção contribuindo para o desenvolvimento de intensas alterações histológicas,
principalmente cardíacas.
Considerando o padrão distinto de manifestação do parasitismo, parasitemia e
alterações histológicas teciduais nas infecções pelas formas TM e TS, o presente estudo
permite a proposição da utilização da infecção por formas TS no intuito de se induzir de
forma mais intensa alterações imunopatológicas sistêmica e compartimentalizada no
modelo canino. Esta abordagem poderia ser útil como um modelo para o estudo das
alterações imunopatológicas na doença de Chagas.
64
6. Conclusões
VIEIRA, P.M.A.
Conclusões
A interação inicial entre formas tripomastigotas metacíclicas e o hospedeiro
vertebrado induz um perfil de resposta imunopatológica diferente daquela observada na
infecção com formas tripomastigotas sangüíneas . Neste sentido, a participação do NO
durante a fase aguda da infecção de cães por formas TM está relacionada a proteção
quando comparado ao grupo TS. Esta proposição é sustentada pelos seguintes achados:
- níveis séricos elevados de NO estão relacionados a um atraso no pico de
parasitemia no grupo TM;
- níveis séricos elevados de NO estão correlacionados aos linfócitos T CD5+ e
sua subpopulação CD4+, sugerindo a participação destas células na produção de NO no
grupo TM;
- a maior expressão de iNOS no grupo TM favoreceu o menor parasitismo e
alterações histopatológicas cardíacas;
- o baço do grupo TM apresentou maior reatividade quando comparado ao
Controle e TS, sugerindo proteção;
- no baço, coração e soro há um comportamento semelhante em relação ao
NO/iNOS independente da forma infectante;
- no linfonodo há um comportamento distinto, comparado aos demais
compartimentos avaliados, onde na infecção por TM aparentemente não ocorrem
modificações na expressão de iNOS em comparação ao controle enquanto que no grupo
TS há uma redução da área positiva para iNOS, sugerindo imunomodulação.
66
7. Perspectivas
VIEIRA, P.M.A.
Perspectivas futuras
Entender os mecanismos de interação entre as diferentes formas infectantes
tripomastigotas metacíclicas e sanguíneas e as células infectadas no início da fase
aguda, que acarretam nas diferenças demonstradas neste trabalho.
68
8. Referências Bibliográficas
VIEIRA,P.M.A.
Referências Bibliográficas
ABE, K., PAN, L.H., WATANABE, M., KONNO, H., KATO, T., ITOYAMA, Y.
Upregulation of protein-tyrosine nitration in the anterior horn cells of amyotrophic
lateral sclerosis. Neurological Research. 19: 124-128, 1997.
ALIBERTI, J.C.; CARDOSO, M.A.G.; MARTINS, G.A.; GAZZINELLI, R.T.;
VIEIRA, L.Q.; SILVA, J.S. IL-12 mediates resistance to Trypanosoma cruzi
infection in mice and is produced by normal murine macrophage in response to live
trypomastigote. Infect. Immunol. 64: 1961-1967, 1996.
ALIBERTI, J.C., MACHADO, F.S., SOUTO, J.T., CAMPANELLI, A.P., TEIXEIRA,
M.M., GAZZINELLI, R.T., SILVA, J.S. β-Chemokines enhance parasite uptake
and promote nitric oxide-dependent microbiostatic activity in murine inflammatory
macrophages infected with Trypanosoma cruzi. Infect Immunol. 67: 4819-4826,
1999
ANDRADE, Z.A. & ANDRADE, S.G. A patologia da doença de Chagas experimental
no cão. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 75:77-95, 1980.
ANDRADE, Z.A., ANDRADE, S.G., SADIGURSKY, M. Damage and healing in the
conduction tissue oh the heart (An experimental study in dogs infected with
Trypanosoma cruzi). J. Pathol. 143:93-101, 1984.
ANDRADE, Z.A. Pathogenesis of Chagas' disease. Res. Immunol. 142(2): 126-129,
1991.
ARANTES, R. M., MARCHE, H. H., BAHIA, M. T., CUNHA, F. Q., ROSSI, M. A.,
SILVA, J. S. Interferon-gamma-induced nitric oxide causes intrinsic intestinal
denervation in Trypanosoma cruzi-infected mice. Am.J.Pathol. 164 (4):1361-1368,
2004.
ARAUJO, F.G. Development of resistance to Trypanosoma cruzi in mice depends on a
viable population of L3T4+ (CD4+) T lymphocytes. Infect. Immun. 57: 2246-2248,
1989.
BAHIA, M.T., TAFURI, W.L., CALIARI, M.V., VELOSO, V.M., CARNEIRO, C.M.,
GEORGE, L.L.M.C., LANA, M. Comparison of Trypanosoma cruzi infection in
dogs inoculated with blood or metacyclic trypomastigotes of Berenice-62 and
Berenice-78 strains via intraperitoneal and conjunctival routes. Revista da
Sociedade de Medicina Tropical. 35(4):339-345, 2002.
BOGDAN, C. Nitric Oxide and the immune response. Nature Immunology. 2(10):907916, 2001.
BREDT, D.S. & SNYDER, S.H. Nitric oxide mediates glutamate-linked enhancement
of cGMP levels in the cerebellum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:9030-3, 1989.
BREDT, D.S. & SNYDER, S.H. Transient nitric oxide synthase neurons in embryonic
cerebral cortical plate, sensory ganglia, and olfactory epithelium. Neuron. 13(2):
301-313, 1994.
BRENER, Z. Therapeutic activity and criterion of cure on mice experimentally infected
with Trypanosoma cruzi. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 4:389-396, 1962.
BRENER, Z. & GAZZINELLI, R.T. Immunological control of Trypanosoma cruzi
infection and pathogenesis of Chagas' disease. Int. Arch. Allergy Immunol.
114:103-110, 1997.
CAMARGO, M.M.; ALMEIDA, I.C.; PEREIRA M.E.; FERGUSON, M.A.;
TRAVASSOS, L.R.; GAZZINELLI, R.T. Glycosylphosphatidylinisitolánchored
mucin-like glycoproteins isolated from Trypanosoma cruzi trypomastigotes initiate
the synthesis of proinflammatory cytokines by macrophages. J. Immunol. 158 (12):
5890-5901, 1997a.
70
VIEIRA,P.M.A.
Referências Bibliográficas
CAMARGO, M.M.; ANDRADE, A.C.; ALMEIDA, I.C.; TRAVASSOS, L.R.;
GAZZINELLI, R.T. Glycoconjugates isolated from Trypanosoma cruzi but not
from Leishmania species membranes trigger nitric oxide synthesis as well as
microbicidal activity in IFN-gamma – primed macrophages. J. Immunol. 159:
6131-6139, 1997b.
CARDILLO, F.; VOLTARELLI, J.C.; REED, S.G.; SILVA, J.S. Regulation of
Trypanosoma cruzi infecion in mice by gamma interferon and interleukin-10: role
of NK cells. Infect. Immun. 64:128-134, 1996.
CARDILLO, F.; POSTOL, E.; NIHEI, J.; AROEIRA, L.S.; NOMIZO, A.; MENGEL,
J.. B cells modulate T cells so as to favour T helper type 1 and CD8+ T-cell
responses in the acute phase of Trypanosoma cruzi infection. Immunology. 122:584595, 2007.
CARNEIRO, C.M.; MARTINS-FILHO, O.A.M.; REIS, A.B.; VELOSO, V.M.;
ARAÚJO, F.M.G.; BAHIA, M.T.; LANA, M.; MACHADO-COELHO, G.L.L;
GAZZINELLI, G.; CORREA-OLIVEIRA, R. TAFURI, W.L. Differential impact
of metacyclic and blood trypomastigotes on parasitological, serological and
phenotypic features triggered during acute Trypanosoma cruzi infection in dogs.
Acta Tropica. 101: 120-129, 2007.
CERQUEIRA, N.F. & YOSHIDA, W.B. Óxido Nítrico.Revisão. Acta Cir. Bras.
17(6):417-423,2002.
CHAGAS, C. Nova entidade mórbida do homem. Resumo geral de estudos etiológicos
e clínicos. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 3: 219-275, 1911.
CHANDRASEKAR, B.; MELBY, P.C.; TROYER, D.A.; COLSTON, J.T.;
FREEMAN, G.L. Temporal expression of pro-inflammatory cytokines and
inducible nitric oxide synthase in experimental acute chagasic cardiomyopathy. Am.
J. Pathol. 152: 925:934, 1998.
COELHO, P.S.; KLEIN, A.; TALVANI, A.; COUTINHO, S.F.; TAKEUCHI, O.;
AKIRA, S.; SILVA, J.S.; CANIZZARO, H.; GAZZINELLI, R.T.; TEIXEIRA,
M.M. Glycosylphosphatidylinositol-anchored mucin-like glycoproteins isolated
from Trypanosoma cruzi trypomastigotes induce in vivo leukocyte recruitment
dependent on MCP-1 production by IFN-gamma-primed-macrophages. J. Leukoc.
Biol. 71(5): 837-844, 2002.
CORK, R.J., PERRONE, M.L., BRIDGES, D., WANDELL, J., SCHEINER, C.A.,
MIZE, R.R. A web-accessible digital atlas of the distribution of nitric oxide
synthase in the mouse brain, Progress in Brain Research. 118: 37-50, 1998.
DIAS, E.; LARANJA, F.S.; MIRANDA, A.; NOBREGA, G. Chagas' disease; a clinical,
epidemiologic, and pathologic study. Circulation. 14(6): 1035-1060, 1956.
DINARELLO, C.A. Proinflammatory cytokines. Chest. 118(2): 503-508, 2000.
DUSTING, G.J; MACDONALD, P.S. Endogenous nitric oxide in cardiovascular
disease and transplantation. Ann. Med. 27: 395-406, 1995.
DUSSE, L.M.S., VIEIRA, L.M., CARVALHO, M.G. Revisão sobre óxido nítrico.
Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial.39(4):343-350, 2003.
ELMORE, S.A. Enhaced histopatholy of the Spleen. Toxicologic Pathology.34:648655, 2006a.
ELMORE, S.A. Enhaced histopathology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology.
34:634-647, 2006b.
FANG, F. C. Perspectives series, host/pathogen interactions. Mechanisms of nitric
oxide – related antimicrobial activity. J. Clin. Invest. 99: 2818-2825, 1997.
FILHO, R.F., ZILBERSTEIN, B. Óxido nítrico: o simples mensageiro percorrendo a
complexidade. Metabolismo, síntese e funções. Rev. Ass. Med. Brasil. 46(3):26571
VIEIRA,P.M.A.
Referências Bibliográficas
271, 2000.
GOLGHER, D. & GAZZINELLI, R.T. Innate and acquired immunity in the
pathogenesis of Chagas disease. Autoimmunity. 37(5): 399-409, 2004.
GREEN, L.C., TANNENBAUM, S.R., GOLDMANN, P. Nytrate synthesis in the
germfree and conventional rat. Science. 212:56-58, 1981.
GREEN, L.C., WAGNER, D.A., GLOGLOWSKI, J., SKIPPER, P.L., WISHNOK, J.S.,
TANNENBAUM, S.R. Analysis of nitrate, nitrite, and 15Nnitrate in biological
fluids. Anal Biochem. 126: 131-138, 1982.
GREEN, L.C., CRAWFORD, R.M., HOCKMEYER, J.T., MELTZER, M.S., NACY,
C.A. Leishmania major amastigotes initiate L-arginine-dependent killing
mechanism in IFN-γ stimulated macrophages by induction of tumor necrosis factorα. J Immunol. 145: 4290-4297, 1990.
GROVES, J.T., WANG, C.C.Y. Nitric oxide synthase: models and mechanisms.
Current Opinion in Chemical Biology. 4: 687–695, 2000.
GUEDES, P.M.M. Avaliação do cão como modelo experimetal para a quimioterapia da
doença de Chagas. Tese, UFOP. 106P, 2001.
GUIX, F.X., URIBESALGO, I., COMA, M., MUÑOZ, F.J. The physiology and
pathophysiology of nitric oxide in the brain. Progress in Neurobiology. 76(2): 126152, 2005.
HEVEL, J.M.; WHITE, K.A.; MARLETTA, M.A. Purification of inducible murine
macrophage nitric oxide synthase: identification as a flavoprotein. J Biol Biochem.
266: 22789-22791, 1991.
HOLSCHER, C., KOHLER, G., MULLER, U., MOSSMANN, H., SCHAUB, G. A.,
BROMBACHER, F. Defective nitric oxide effector functions lead to extreme
susceptibility of Trypanosoma cruzi-infected mice deficient in gamma interferon
receptor or inducible nitric oxide synthase. Infect.Immun. 66 (3):1208-1215, 1998.
IGNARO, L.J., BUGA, G.M., WOOD, K.S., BYRNS, R.E., CHAUDHURI, G.
Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is
nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:9265-9269, 1987.
KNOWLES, R.G., PALACIOS, M., PALMER, R.M., MONCADA, S. Formation of
nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction
mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc Nat Aca Sci USA.
86: 5159-5162, 1989.
KATSUKI, S.; ARNOLD, W.; MITTAL, C.; MURAD, F. Stimulation of guanylate
cyclase by sodium nitroprusside, nitroglycerin and nitric oxide in various tissue
preparations and comparison to the effects of sodium azide and hydroxylamine. J.
Cyclic. Nucleotide Res. 3(1): 23-35, 1977.
KOLLIEN, A.H. & SCHAUB, G.A. The development of Trypanosoma cruzi in
triatominae. Parasitol. Today. 16(9): 381-387, 2000.
KRAUTZ, G.M.; KISSINGER, J.C.; KRETTLI, A.U. The targets of the lytic antibody
response against Trypanosoma cruzi. Parasitol. Today. 16(1): 31-34, 2000.
LANA, M., CHIARI, E., TAFURI, W.L. Experimental Chagas's disease in dogs. Mem.
Inst. Oswaldo Cruz. 87(1):59-71, 1992.
LANA, M.; TAFURI, W.L.; CALIARI, M.V.; BAMBIRRA, E.A.; CHIARI, C.A.;
RIOS LEITE, V.H.; BARBOSA, A.J.A.; TOLEDO, M.J.O.; CHIARI, E. Fase
crônica cardíaca fibrosante da tripanossomíase cruzi experimental no cão. Rev. Soc.
Bras. Med. Trop. 21(3): 113-121, 1988.
LIEKE, T.; STEEG, C.; GRAEFE, S.E.; FLEISCHER, B. JACOBS, T. Interaction of
natural killer cells with Trypanosoma cruzi-infected fibroblasts. Clin. Exp.
Immunol. 145(2): 357-364, 2006.
72
VIEIRA,P.M.A.
Referências Bibliográficas
LIEW, F.Y., MILLOT, S., PARKINSON, C., PALMER, R.M.J., MONCADA, S.
Macrophage killing of Leishmania parasite in vivo is mediated by nitric oxide from
L-arginine. J Immunol. 144: 4794 –4797, 1990.
MACHADO, F. S., MARTINS, G. A., ALIBERTI, J. C., MESTRINER, F. L.,
CUNHA, F. Q., SILVA, J. S. Trypanosoma cruzi-infected cardiomyocytes produce
chemokines and cytokines that trigger potent nitric oxide-dependent trypanocidal
activity. Circulation 102 (24):3003-3008, 2000.
MARLETTA, M. A.; YOON, P.S.; IYENGAR, R.; LEAF, C.D.; WISHNOK, J.S.
Macrophage oxidation of L-arginine to nitrite and nitrate: nitric oxide is an
intermediate. Biochemistry. 27(24): 8706-8711, 1988.
MARLETTA, M. A. Nitric oxide synthase: aspects concerning structure and catalysis.
Cell. 78:927-930, 1994.
MARTINS, G. A., CARDOSO, M. A., ALIBERTI, J. C., SILVA, J. S. Nitric oxideinduced apoptotic cell death in the acute phase of Trypanosoma cruzi infection in
mice. Immunol.Lett. 63 (2):113-120, 1998.
MARSDEN, P.A., HENG, H.H., SCHERER, S.W., STEWART, R.J., HALL, A.V.,
SHI, X.M., TSUI, L.C., SCAPPERT, K.T. Structure and chromosomal of the
human constitutive endothelial nitric oxide synthase gene. The Journal of Biology
Chemistry. 268: 17478-17488, 1993.
MAYER, B.; SCHIMIDT, K.; HUMBERT, P.; BOHME, E. Biosynthesis of
endothelium-derived relaxing factor: a cytosolic enzyme in porcine aortic
endothelial cells Ca2+-dependently converts L-arginine into an activator of soluble
guanylyl cyclase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 164(2): 678-685, 1989.
MAYER, B. & HEMMENS, B. Biosynthesis and action of nitric oxide in mammalian
cells. Trends Biochem. Sci. 22(12): 477-481, 1997.
MEBIUS, R.E. & KRAAL, G. Structure and function of the spleen. Nat Ver Immunol.
5:606-616, 2005.
MICHAILOWSKY, V., SILVA, N. M., ROCHA, C. D., VIEIRA, L. Q., LANNESVIEIRA,J., GAZZINELLI, R. T. Pivotal role of interleukin-12 and interferongamma axis in controlling tissue parasitism and inflammation in the heart and
central nervous system during Trypanosoma cruzi infection. Am.J.Pathol. 159
(5):1723-1733, 2001.
MINOPRIO, P. Parasite polyclonal activators: new targets for vaccination approaches?
Int. J. Parasitol. 31: 588-591, 2001.
MONCADA, S., PALMER, R.M.J., HIGGS, E.A. Nitric oxide: pathophysiology, and
pharmacology. Pharmacol. Rev. 43:109-142, 1991.
MONCADA, S. & HIGGS, A. The L-arginine-nitric oxide pathway. N. Engl. J. Med.
329(27): 2002-2012, 1993.
MONCAYO, A. Chagas disease: current epidemiological trends after the interruption of
vectorial and transfusional transmission in the Southern Cone countries. Mem. Inst.
Oswaldo Cruz. 98(5):577-591, 2003.
MOORE, K.W.; de WAAL MALEFYT, R.; COFFMAN, R.L.; O’GARRA, A.
Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor. Annu. Rev. Immunol. 19: 683-765,
2001.
OSWALD, I.P., WYNN, T.A., SHER, A., JAMES, S.L. Interleukin-10 inhibits
macrophage microbicidal activity by blocking the endogenous production of tumor
necrosis factor alpha required as a costimulatory factor for interferon gama-induced
activation. Proc Natl Acad Sci USA. 89: 8676-8680, 1992.
OSWALD, I.P., GAZZINELLI, R.T., SHER, A., JAMES, S.L. IL-10 synergizes with
IL-4 and transforming growth factor-beta to inhibit macrophage cytotoxic activity.
73
VIEIRA,P.M.A.
Referências Bibliográficas
J. Immunol. 148: 3578-3582, 1992.
PALMER, R.M.J., ASHTON, D.S., MONCADA, S. Vascular endothelial cells
synthesize nitric oxide from l-arginine. Nature. 333:664-666, 1988.
PARADA, H.; CARRASCO, H.A.; ANEZ, N.; FUENMAYOR, C.; INGLESSIS, I.
Cardiac involvement is a constant fiding in acute Chagas’ disease: a clinical
parasitological and histopathological study. Int. J. Cardiol. 60: 49-54, 1997.
PARK, C.S.; KRISHNA, G.; AHN, M.; KANG, J.; CHUNG, W.; KIM, D.; HWANG,
H.; LEE, J.; PAIK, S.; CHA, Y. Differential and constitutive expression of
neuronal, inducible, and endothelial nitric oxide synthase mRNAs and proteins in
pathologically normal human tissues. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 4(5):
459-471, 2000.
PASCUTTI, M.F.; BOTTASSO, O.A.; HOURQUESCOS, M.C.; WIETZERBIN, J.;
REVELLI, S. Age-related increase in resistance to acute Trypanosoma cruzi
infection in rats is associated with an appropriate antibody response. Scand. J.
Immunol. 58(2): 173-179, 2003.
PETRAY, P.; CASTANOS-VELEZ, E.; GRINSTEIN, S.; ORN, A.; ROTTENBERG,
M.E. Role of nitric oxide in resistance and histopathology during experimental
infection with Trypanosoma cruzi. Immun. Lett. 47: 121-126, 1995.
PRATA, A. Clinical and epidemiological aspects of Chagas disease. Lancet. Infect.
Dis.1(2):92-100, 2001.
QUEIRÓZ, S. L & BATISTA, A. Z. Funções Biológicas do Óxido Nítrico. Química
Nova. 22 (4):584-590, 1999.
REIS, A.B.; CARNEIRO, C.M.; CARVALHO, M.G.; TEIXEIRA-CARVALHO, A.;
GIUNCHETTI, R.C.; MAYRINK, W.; GENARO, O.; CORRÊA-OLIVEIRA, R.;
MARTINS-FILHO, O.A. Establishment of a microplate assay for flow cytometric
assessment and it is use for the evaluation of age-related phenotypic changes in
canine whole blood leukocytes. Vet. Immunol. Immunopathol. 103: 173-185, 2005.
RIBEIRO, D. A., CALVI, S. A., PICKA, M. M., PERSI, E., DE CARVALHO, T. B.,
CAETANO, P. K., NAGOSHI, L. R., LIMA, C. R., MACHADO, J. M.,
SALVADORI, D. M. DNA damage and nitric oxide synthesis in experimentally
infected Balb/c mice with Trypanosoma cruzi. Exp.Parasitol. 116 (3):296-301,
2007.
ROTTENBERG, M.E.; BAKHIET, M.; OLSSON, T. Differential susceptibilities of
mice genimically deleted of CD4 and CD8 to infections with Trypanosoma cruzi or
Trypanosoma brucei. Infect. Immun. 61: 5129-5133, 1993.
ROTTENBERG, M.E.; RIARTE, A.; SPORRONG, L. Outcome of infection with
different strains of Trypanosoma cruzi in mice lacking CD4 and/or CD8. Immunol.
Lett. 45: 53-60, 1995.
RUSSO, M.; MINOPRIO, P.; COUTINHO, A.; HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ, M.
Depletion of L3T4+ T lymphocytes during acute Trypanosoma cruzi ifection
abolish macrophage and B lymphocyte activation but not tissue inflammatory
reaction. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 83: 527-538, 1988.
SAEFTEL, M., FLEISCHER, B., HOERAUF, A. Stage-dependent role of nitric oxide
in control of Trypanosoma cruzi infection. Infect.Immun. 69 (4):2252-2259, 2001.
SARDINHA, L.R.; ELIAS, R.M.; MOSCA, T. Contribution of NK, NK T, gammadelta
T, and alphabeta T cells to the gamma interferon response required for liver
protection against Trypanosoma cruzi. Infect. Immun. 74:2031-2042, 2006.
SHER, A., GAZZINELLI, R.T., OSWALD, I.P., CLERICI, M., KULBERG,M.,
PEARCE, E.J., BERZOFSKY, J.A., MOSMANN, T.M., JAMES, S.L., MORCE,
H.C., SHEARER, G. Role of T-cell derived cytokines in the downregulation of
74
VIEIRA,P.M.A.
Referências Bibliográficas
immune responses in parasitic and retroviral infection. Immuno. Rev. 127: 183-204,
1992.
SILVA, J.S.; BARRAL-NETO, M.; REED, S.G. Aggravation of both Trypanosoma
cruzi and murine leukemia virus by concomitant infections. Am. J. Trop. Med. Hyg.
49(5): 589-597, 1993.
SISTO, M.; BRANDONISIO, O.; PANARO, M.A.; ACQUAFREDDA, A.;
LEOGRANDE, D.; FASANELLA, A.; TROTTA, T.; FUMAROLA, L.; MITOLO,
V. Inducible nitric oxide synthase expression in Leishmania-infected dog
macrophages. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 24(4): 247-254, 2001.
STAMLER, J.S., SINGEL, D.J., LOSCALZO, J. Biochemistry of nitric oxide and its
redox-activated forms. Science. 258:1898-1901, 1992.
STEINIGER, B. & BARTH, P. Microanatomy and function of the spleen. Adv. Anat.
Embryol. Cell Biol. 151: 1-101, 2000.
STUEHR, D.J., KWON, N.S., NATHAN, C.F., GRIFFITH, O.W., FELDMAN, P.L.,
WISEMAN, J. Nw-hydroxy-L-arginine is an intermediate in the biosynthesis of
nitric oxide from L-arginine. The Journal of Biology Chemistry. 266(10): 62596263, 1991.
TAYLOR-ROBINSON, A.W.; LIEW, F.Y.; SEVERN, A.; XU, D.; MCSORLEY, S.J.;
GARSIDE, P.; PADRON, J.; PHILLIPS, R.S. Regulation of the immune response
by nitric oxide differentially produced by T helper type 1 and T helper type 2 cells.
Eur. J. Immunol. 24(4): 980-984, 1994.
TEIXEIRA, V.P.; HIAL, V.; GOMES, R.A.; CASTRO, E.C.; REIS, M.G.;
RODRIGUES, M.L.; GUIMARAES,J.V.; DOS REIS, M.A. Correlation between
adrenal central vein parasitism and heart fibrosis in chronic chagasic myocarditis.
Am. J. Trop. Méd. Hyg. 56(2): 177-180, 1997.
VENTURINI, G., SALVATI, L., MUOLO, M., COLASANTI, M., GRADON, L.I.,
ASCENZI, P. Nitric oxide inhibits cruzipain, the major papain-like cysteine
proteinase from Trypanosoma cruzi. Biochem.Biophys.Res.Commun. 270 (2):437441, 2000.
VESPA, G. N., CUNHA, F. Q., SILVA, J. S. Nitric oxide is involved in control of
Trypanosoma cruzi-induced parasitemia and directly kills the parasite in vitro.
Infect.Immun. 62 (11):5177-5182, 1994.
VILLALTA, F., ZHANG, Y., BIBB, K.E, KAPPES J.C., LIMA, M.F. The cysteinecysteine family of chemokines RANTES, MIP-α and MIP-β induce trypanocidal
activity in human activity in human macrophages via nitric oxide. Infect Immunol.
66: 4690-4695, 1998.
VODOVOTZ, Y., BOGDAN, C., PAIK, J., XIE, Q.W., NATHAN, C. Mechanisms of
supression of macrophage nitric oxide release by transforming growth factor beta. J
Exp Med. 178: 605-613, 1993.
VODOVOTZ, Y. Controlo f nitric oxide production by transforming growth factor-beta
1: mechanistic insights and potential relevance to human disease. Nitric Oxide Biol
Chem. 1: 3-17, 1997.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Tropical Disease Research: progress 2003-2004
Seventeenth Programme Report oh the UNICEF/UNDP/World Bank/WHO. Special
Programme for Research & Training in Tropical Diseases. Programme Report n.
17, Geneva, 2005.
75