Kits de teste BRCA
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Testes de triagem de BRCA e tecnologias ideais para o teste: Uma visão geral © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Fevereiro 2015 660,036.011 ATLAS validade Fevereiro 2016. © AstraZeneca 2015. FOR HEALTHCARE PROFESSIONAL USE ONLY. Conteúdo Introdução ao câncer de ovário e triagem BRCA Detecção das mutações em ponto Detecção de grandes rearranjos Teste BRCA - validação, interpretação, laudo clínico e prestadores de serviço Teste BRCA somático Quem é encaminhado para teste atualmente - e no futuro? Resumo © AstraZeneca 2015. FOR USO HEALTHCARE APENAS POR PROFISSIONAL SAÚDE. PROFESSIONALDA USE ONLY. Introdução ao câncer de ovário e triagem BRCA © USO HEALTHCARE APENAS POR PROFISSIONAL SAÚDE. © AstraZeneca AstraZeneca 2015. 2015. FOR PROFESSIONALDA USE ONLY. Introdução ao câncer de ovário e triagem BRCA Introdução ao câncer de ovário Europa – Europa do Norte tem a incidência mais alta de câncer de ovário e mortalidade1 EUA – Câncer de ovário é o nono tipo de câncer mais comum e a quinta causa de morte por câncer em mulheres,2 depois de câncer de pulmão e brônquios, colorretal e pancreático – Câncer de ovário é responsável por cerca de 3% dos cânceres femininos e aproximadamente por 5% das mortes por câncer em mulheres2 Globalmente – Estima-se que aproximadamente 240.000 mulheres são diagnosticadas com câncer de ovário anualmente, sendo responsável por aproximadamente 4% de todos os casos de câncer em mulheres3 – Câncer de ovário é responsável por aproximadamente 140.000 mortes a cada ano4 – Taxa de sobrevida em 5 anos para mulheres com câncer de ovário é aproximadamente metade daquela para mulheres com câncer de mama (44% vs. 90%)5,6 – ~15% dos casos de câncer de ovário demonstraram relação familiar4 1. Cramer DW. Hematol Oncol Clin North Am 2012;26:1–12; 2. Jemal A, et al. CA Cancer J 2010;60:277–300; 3. GLOBOCAN, 2012. http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx; 4. Romero I, et al. Endocrinology 2012;153:1593–602; 5. American Cancer Society. http://www.cancer.org/acs/groups/cid/documents/webcontent/003130-pdf; 6. American Cancer Society. www.cancer.org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/document/acspc-036845.pdf. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Introdução ao câncer de ovário e triagem BRCA Introdução ao BRCA BRCA1 e BRCA2 são genes supressores de tumor1,2 – Proteínas BRCA funcionais regulam o crescimento celular e previnem a divisão celular anormal que poderia levar ao desenvolvimento do tumor – Proteínas BRCA são expressas em muitos tecidos diferentes e atingem o seu nível mais alto de expressão Proteína BRCA1 Proteína BRCA2 durante a fase S, indicativo do seu papel no reparo DSB do DNA Tumourigênese em portadoras de mutação BRCA1 / 2 germinativa (herdada) segue uma hipótese de dois acertos3 – Primeiro ‘acerto’ sendo devido a uma mutação herdada de um alelo BRCA – Segundo ‘acerto’ devido à inativação do segundo alelo tipo selvagem Tipos principais de mutação – Mutação em ponto: Pares de base de DNA ‘substituídos’ alteram a estrutura /função da proteína ou expressão gênica4 – Mutações de desvio de estrutura ou inserção / deleção que alteram a estrutura de leitura4 – Grandes rearranjos: Seções de DNA que são transferidas para uma nova posição no genoma, completamente deletadas ou novas seções são inseridas, todas as quais podem alterar a expressão e afetar a função das proteínas resultantes5 – Todos estes tipos de mutações são encontrados em BRCA1 / 26 DSB, ruptura de dupla-fita. 1. Gudmundsdottir K, et al. Oncogene 2006;25:5864–74; 2. Venkitaraman AR. J Cell Sci 2001;114(pt20):3591–8; 3. Esteller M, et al. Hum Mol Genet 2001;10:3001–7; 4. Clancy S. Nature Education 2008;1:187; 5. Edwards PA. J Pathol 2010;220:2442–54; 6. Larsson N, et al. EMQN Guidelines 2007; MRC-Holland b.v. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Introdução ao câncer de ovário e triagem BRCA Processo de teste BRCA Teste genético é realizado em muitos países para detectar mutações BRCA1 e BRCA2 1 A seleção de candidatos adequados para teste é tipicamente baseada nas diretrizes estabelecidas nos países individuais ou por sociedades internacionais maiores2 Amostra de sangue tipicamente usada1 – Outros tipos de amostra podem ser usados, por exemplo, esfregaço bucal2 Os critérios de teste genético podem diferir entre os países com base na prevalência de mutação1 Processo típico de teste BRCA Paciente preenchendo diretrizes é encaminhada para teste Aconselhamento genético Teste de sangue Análise Resultados do teste Início do tratamento Aconselhamento genético 1. Balmaña J, et al. Ann Oncol 2011;22(Suppl. 6):vi31–vi34; 2. Daly M, et al. NCCN Guidelines. Genetic/familial high-risk assessment: breast and ovarian. Version 4.2013. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Introdução ao câncer de ovário e triagem BRCA Mutações comuns BRCA Mutações em Ponto Um estudo constatou que mutações em ponto de BRCA ocorrem em 33% de 251 pacientes representativas da população de teste genético nos EUA1 Rearranjos grandes Deleção ou duplicação de um/diversos éxons no gene3 Pode ser responsável por até 12% das alterações em BRCA 3 Mutações podem ser encontradas em qualquer local das regiões codificadoras ou sequências intrônicas conservadas de qualquer gene2 Detecção destas mutações nocivas exige tecnologia sofisticada, técnicas robustas e processos validados e com garantia da qualidade mRNA, ácido ribonucleico mensageiro. 1. Palma MD, et al. Cancer Res 2008;68:7006–14; 2. Palma M, et al. Crit Rev Oncol Hematol 2006;57:1–23; 3. Walsh T, et al. JAMA 2006;295:1379–88. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Detecção das mutações em ponto © AstraZeneca 2015. FOR USO HEALTHCARE APENAS POR PROFISSIONAL SAÚDE. PROFESSIONALDA USE ONLY. Detecção das mutações em ponto Detecção das mutações em ponto Método Detalhes Referência Rizzo JM, Buck MJ. Cancer Prev Res 2012;5:887–900 Sequenciamento direto (Sanger) Método bem estabelecido que detecta de forma robusta todas as mutações no gene, exceto rearranjos grandes Este método é rotineiramente disponível na maioria dos laboratórios Sequenciamento NGS Métodos de présequenciamento: SSCA, HA, DGGE, SSCP, CCM/FAMA, DHPLC Um método que deve detectar todas as mutações no gene. Zero falso-positivo reportado para rearranjos grandes Sequenciamento direcionado permite identificação de mutações causadoras de doença para diagnóstico de condições patológicas Frequentemente usados para reduzir a quantidade de sequenciamento necessária ao determinar amostras para sequência Depende de diferenças estruturais pequenas no DNA entre genes BRCA normais e mutados e assim sua motilidade durante eletroforese através de gel/matriz Em teoria, estes métodos podem detectar todas as mutações nos genes, mas na prática nem todas as mutações podem ser detectadas Todas as mutações ainda precisam ser totalmente confirmadas e caracterizadas por sequenciamento direto Ellard S, et al. Clinical Molecular Genetics Society Practice Guidelines 2009 Walsh T, et al. PNAS 2010;107:12629–33 Grada A, Weinbrecht K. J Invest Dermatol 2013;133:e11 Ricevuto E, et al. Clin Cancer Res 2001;7:1638–46 Gross E, et al. Hum Mutat 2000;16:345–53 Palma M, et al. Crit Rev Oncol Hematol 2006;57:1–23 CCM/FAMA, análise de clivagem química de incompatibilidade/ análise de incompatibilidade assistida por fluorescência; DGGE, eletroforese em gel por gradiente desnaturizante; DHPLC, cromatografia líquida de alto desempenho desnaturizante; HA, análise heteroduplex; NGS, sequenciamento de próxima geração; SSCA, análise de conformação de fita única; SSCP, polimorfismo de conformação de fita única. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Detecção das mutações em ponto Sequenciamento direto (Sanger) ‘Padrão ouro’ de sequenciamento de DNA pelos últimos 37 anos1,2 Método confiável para teste BRCA e amplamente usado1 (~75% dos labs)3 Não detecta rearranjos grandes1 Vantagens 1,2,4 Amplamente disponível Desvantagens 1,2,4 Fluxo de trabalho simples Análises múltiplas (amplificação concomitante de múltiplas sequências alvo) não são possíveis * Tecnologia estabelecida Rendimento limitado Automatizado Custo-efetividade diminuindo em comparação com melhora nos métodos NGS Define mutação Tria região completa Não consegue detectar grandes rearranjos *Novel Meta-PCR pode permitir análise múltipla para diversos éxons de até 1000bp de extensão.5 1. Ellard S, et al. Clinical Molecular Genetics Society Practice Guidelines 2009; 2. Rizzo JM, Buck MJ. Cancer Prev Res 2012;5:887–900; 3. Apresentação do Dr Andrew Wallace. Realizada no European Society for Human Genetics Congress, Milan, 2014; 4. Walsh T, et al. PNAS 2010;107:12629-33; 5. Wallace AJ, et al. Genet Test 1999;3:173–83. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Detecção das mutações em ponto Métodos de pré-sequenciamento podem auxiliar a reduzir o ônus de sequenciamento Técnica pré-sequenciamento para detectar alterações de sequência1 Pode reduzir a quantidade necessária de análise de sequenciamento 1,2 Nenhuma pode ser definida como ideal ou pode garantir a identificação de todas as mutações predisponentes ao câncer nos genes BRCA1/2 1 Todas as mutações ainda precisam ser totalmente caracterizadas por sequenciamento de DNA1 Vantagens1–3 Desvantagens1,3 Custo baixo Provável detecção <100% Mais rápido Necessita confirmação Sanger das mutações potenciais para classificação Necessita validação completa Pode detectar substituições de único nucleotídeo e pequenas inserções/deleções Fluxo de trabalho complexo 1. Palma M, et al. Crit Rev Oncol Hematol 2006;57:1–23; 2. Ricevuto E, et al. Clin Cancer Res 2001;7:1638–46; 3. Gross E, et al. Hum Mutat 2000;16:345–53. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Detecção das mutações em ponto Sequenciamento de próxima geração (NGS) Boa tecnologia para teste BRCA 1,2 – Alto rendimento – Custo reduzido Massivamente paralelo, alta capacidade, capaz de múltiplos – usa menos DNA, rendimento aumentado2,3 Gera enorme quantidade de dados por teste, mas tempo de resposta menor para a mesma quantidade de dados Sanger1,3 Vantagens2–6 Desvantagens2–6 Alto rendimento Capacidade para múltiplos Capacidade de tecnologia atualmente modesta, mas crescente, uma vez que mais laboratórios de teste BRCA investem em equipamento Custo menor Alto custo inicial Análise automatizada Teste positivo necessita sequenciamento Sanger para confirmação Usa menos DNA Fluxo de trabalho complexo Pode correr em paralelo com outros genes Armazenamento dedicado de dados e análise necessária Baixa sensibilidade para grandes inserções/deleções > 20 pares de bases Diversas plataformas NGS estão atualmente em uso2 Os perfis destas plataformas variam muito significantemente2 1. Meldrum C, et al. Clin Biochem Rev 2011;32:177; 2. Mardis ER. Annu Rev Genomics Hum Genet 2008;9:387–402; 3. Grada A, Weinbrecht K. J Invest Dermatol 2013;133:e11; 4. Walsh T, et al. PNAS 2010;107:12629–33; 5. Idris SF, et al. Expert Rev Mol Diagn 2013;13:167–81; 6. Ellard S, et al. Clinical Molecular Genetics Society 2014. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Detecção das mutações em ponto Plataformas NGS comuns fornecem fluxo de trabalho flexível e simples O sequenciador Illumina MiSeq desktop e o Life Technologies Ion Torrent PGM System são os instrumentos diagnósticos mais comuns atualmente usados1–5 – Capacidade do instrumento está em conformidade com um rendimento de teste BRCA típico para laboratório diagnóstico (1–96 pacientes por vez) – Tempos de preparo e de teste permitem que os resultados sejam fornecidos em um período de tempo aceitável – Instrumentos são flexíveis: possibilidade de avaliar poucos genes em muitas amostras ou muitos genes em poucas amostras – Fluxo de trabalho é simples, pode ser automatizado e os kits de reagente estão disponíveis Sequenciador MiSeq desktop 1. Loman N, et al. Nat Biotechnol 2012;30:434–9; 2. http://res.illumina.com/documents/products/illumina_sequencing_introduction.pdf; 3. www.illumina.com/systems/miseq.ilmn Used with permission from MRC-Holland b.v.; 4. tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/Targeted-Sequencing-Brochure.pdf. 5. Larsson N, et al. EMQN workshop, 24– 25 October 2007, Würzburg, Germany. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Detecção das mutações em ponto Kits comerciais para teste BRCA também estão disponíveis Diversos kits comerciais para teste BRCA estão disponíveis, que fornecem ensaios préfabricados e otimizados para teste BRCA Estes kits podem ser usados nas plataformas NGS previamente descritas e incluem: Kits comercialmente disponíveis Fornecedor: Multiplicom BRCA Mastr Dx (CE-IVD) e Multiplicom HP Kit (RUO-IVD) Ion AmpliSeq™ BRCA1 e BRCA2 Panel (RUO-IVD) Método NGS Uso de ambos os kits em combinação permite a detecção de pequenas mutações de inserção/deleção nos trechos de homopolímero codificador dos genes direcionados em algumas plataformas NGS www.multiplicom.com/products/ BRCA-mastr-dx Fornecedor: Life Technologies Método NGS www.lifetechnologies.com Informações disponíveis limitadas CE-IVD, a marcação CE é uma declaração do fabricante que o produto preenche os requerimentos das diretivas aplicáveis da Comunidade Europeia para diagnósticos in vitro (IVD) RUO, apenas para uso em pesquisa. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Detecção das mutações em ponto Há uma tendência significante para adotar NGS como um método de teste BRCA Esquema BRCA (2012/2013 e 2014) • 131 laboratórios – 27 países • 20 países UE/EFTA 2012–2013 7% 2014 3% 1% 3% 3% 6% Sanger 19% NGS HRM dHPLC CSCE 75% 83% • 83% apenas sequenciamento Sanger • 6% NGS + • 11% scan mutação > Sanger • 75% apenas sequenciamento Sanger • 19% NGS + • 6% scan mutação > Sanger Redesenhado da apresentação de Dr Andrew Wallace. Realizada na European Society for Human Genetics Congress, Milan, 2014 e baseada nos dados gentilmente fornecidos pelo Dr Simon Patton CMFT Manchester Reino Unido. EFTA, Associação Europeia de Livre Comércio; CSCE, eletroforese capilar sensível à conformação; HRM, fusão de alta resolução; dHPLC, cromatografia livre de alto desempenho desnaturalizante. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Detecção de grandes rearranjos © AstraZeneca 2015. FOR USO HEALTHCARE APENAS POR PROFISSIONAL SAÚDE. PROFESSIONALDA USE ONLY. Detecção de grandes rearranjos Há diversos métodos disponíveis para a detecção de grandes rearranjos Amplificação de sonda dependente de ligação múltipla (MLPA) – Conjuntos de sondas MRC-Holland P002 (BRCA1) e P045 (BRCA2) 1,2 – Está se tornando um método popular para a detecção de grandes rearranjos3 PCR Multiplex Quantitativo de Fragmentos Fluorescentes Curtos (QMPSF)4 – Fornece maior cobertura de éxons BRCA2 do que MLPA PCR Quantitativo (qPCR)5 – Caro e trabalho intenso para todos os éxons de BRCA1 / 2 Ensaios personalizados – Específico para descobrir rearranjos • BRCA2 Alu insertion c.156_157insAlu – alta frequência em Portugal6 1. http://www.mlpa.com/WebForms/WebFormProductDetails.aspx?Tag=_tz2fAPIAupKyMjaDF-E-t9bmuxqlhe_Lgqfk8Hkjuss.&ProductOID=_cntjdkpAKTM; 2. http://www.mlpa.com/WebForms/WebFormProductDetails.aspx?Tag=_tz2fAPIAupKyMjaDF-E-t9bmuxqlhe_Lgqfk8Hkjuss.&ProductOID=_nbFCWKbNdrA; 3. Larsson N, et al. EMQN Guidelines 2007; MRC-Holland; 4. Casilli F, et al. J Med Genet 2006;43:e49; 5. Presentation by Dr Andrew Wallace, Regional Molecular Genetics Service, St Mary's Hospital Manchester, Manchester, UK; 6. Peixeto A, et al. Breast Cancer Res Treat 2009;114:31–8. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Teste BRCA– validação, interpretação, laudo clínico e prestadores de serviço MLPA é um método popular 1. Denaturação e hibridização Primer PCR de sequência X Primer PCR de sequência Y Sequência hibridização (esquerda) Exemplo de dados obtidos de um paciente com uma mutação tipo deleção no gene BRCA (painel superior) em comparação com um paciente sem mutações (painel inferior)5 Sequência hibridização (direita) 2. Litigação 3. PCR com primers universais X e Y Amplificação exponencial apenas de sondas litigadas 4. e 5. Eletroforese de produtos de amplificação e análise de fragmentos Vantagens1–3 Desvantagens2,4 Consumo de pouca amostra Tempo de resposta rápido Pode ser afetado por qualidade inadequada da amostra de DNA Cuidado necessário para garantir classificação robusta de deleções de único éxon Fluxo de trabalho simples Kit amplamente disponível Informações limitadas na localização dos pontos de ruptura de deleção/duplicação Necessita de equipe técnica altamente treinada 1.https://mlpa.com/WebForms/WebFormMain.aspx?Tag=zjCZBtdOUyAt3KF3EwRZhNWLtcfv9pVl/tHJIM%5Cfa9FWO8KMqctOGIoqYwxaGF9Y; 2. Larsson N, et al. EMQN Guidelines 2007. MRC-Holland b.v.; 3. Hogervorst F, et al. Cancer Res 2003;63:1449–53; 4. https://www.mlpa.com/WebForms/WebFormMain.aspx?Tag=_wl2zCjirCGANQgZPuTixn01pTTvcNt-SNVkcQD5y3xyfzzlPuIuIw..#_wl2zCji-rCGANQgZPuTixn01pTTvcNt-SNVkcQD5y3wJNHQv1W9n7qQJdPOAXzXRQk8vfODyZTM; 5. AZ material, BRCA Testing Manual. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Teste BRCA – validação, interpretação, laudo clínico e prestadores de serviço © AstraZeneca 2015. FOR USO HEALTHCARE APENAS POR PROFISSIONAL SAÚDE. PROFESSIONALDA USE ONLY. Teste BRCA– validação, interpretação, laudo clínico e prestadores de serviço Validação dos métodos de teste genético Estimativa da especificidade, sensibilidade, robustez do teste Ligado ao método e análise dos dados para assegurar que o método de teste seja realizado de forma robusta e consistente e que os resultados sejam replicáveis e capazes de serem reproduzidos Tipicamente obtido ao se testar uma série de amostras com uma ampla variedade de tipos diferentes de mutação conhecida previamente verificada usando um método independente Todos os ensaios devem ser validados antes do uso clínico e um documento de validação deve ser preparado Mattocks CJ, et al. Eur J Hum Gen 2010;18:1276–88. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Teste BRCA– validação, interpretação, laudo clínico e prestadores de serviço Interpretação e laudo clínico Essencial para estabelecer um papel causal da mutação e se é prejudicial1 Relatório deve ser gerado com base na classificação da mutação2 Sistema de cinco classes para classificar variantes comumente usadas nos laboratórios, com base nos critérios da Agência Internacional para Pesquisa em Câncer [International Agency for Research on Cancer (IARC)] (www.iarc.fr)2,3 Resultado do teste Exemplo Classe 1–5 Mutação patogênica/ suspeita Término precoce da proteína Variante genética de significância incerta (VUS) Algumas variantes com troca de sentido (missense) e deleções na estrutura Conteúdo do relatório Tanto classe 5e4 Mutação associada à doença detectada Tanto classe 3e2 Variante de significância desconhecida detectada Base para teste preditivo de membros da família, pode ser usado para tratamento clínico do paciente Significância clínica desconhecida Sem evidência para alterar o tratamento clínico do paciente ou oferecer testes preditivos para familiares Variante genética, polimorfismo Variante genética altamente improvável de contribuir substancialmente para dados de frequência de alelo de risco para câncer para sugerir polimorfismo Nenhuma mutação detectada (NMD) Variantes genéticas na região codificadora de proteína que não altera sequência de aminoácido ou não são preditivas de afetar significantemente a proteína Classe 1 A variante foi confirmada como clinicamente não relevante, e não mencionada no relatório clínico, uma vez que é variante neutra benigna Detalhes sobre a extensão e limites das análises (por exemplo, tipos de mutação que não são abrangidos) Sugestão para testes adicionais Familiares devem ser testados se houver histórico familiar forte de mutações BRCA Disposição herdada não pode ser excluída 1. Larsson N, et al. EMQN Guidelines 2007; MRC-Holland;.b.v. 2. Wallis Y, et al. Practice Guidelines ACGS 2013. http://www.acgs.uk.com/media/774853/evaluation_and_reporting_of_sequence_variants_bpgs_june_2013_-_finalpdf.pdf; 3. Plon SE, et al. Human Mutation 2008;29:1287–91. Tabela fornecida como uma comunicação pessoal de Dr Emma Howard, Genomic Diagnostics Laboratory, St Mary’s Hospital, Manchester, UK. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Teste BRCA– validação, interpretação, laudo clínico e prestadores de serviço Exemplo de um laudo clínico com mutação patogênica ANÁLISE MUTAÇÃO BRCA1/BRCA2 NOME: DATA NASCIMENTO: SEXO: NHS No: SUA REF: NOSSA REF: ENDEREÇO: Xxx Xxxx 00-XXX-0000 Feminino 111 111 1111 GYYY 123456.014 Não fornecido DATA: MOTIVO PARA ENCAMINHAMENTO: Afetada com câncer de ovário e tem histórico familiar de câncer de ovário, triagem BRCA1/2 foi solicitada. RESULTADOS: NOME (DN) Xxx Xxxx (00-XXX-0000) CONDIÇÃO CLÍNICA Câncer de ovário RESULTADO HETEROZIGORO para BRCA2 c.9294C>G p.(Tyr3098Ter) COMENTÀRIOS: Triagem da amostra DNA de linfócito da paciente identificou uma mutação sem sentido heterozigota c.9294C>G p.(Tyr3098Ter) no exon 25 do gene BRCA2. Nenhuma outra diferença foi detectada por análise de sequenciamento da amostra de DNA de linfócito da paciente e a sequência referência (exceto polimorfismos reconhecidos). Análise de dosagem de MLPA não demonstrou evidência para a presença de uma delação ou duplicação completa de exon envolvendo quaisquer dos exon BRCA1 ou BRCA2 que foram testados. A mutação BRCA2 c.9294C>G p.(Tyr3098Ter) foi descrita previamente em famílias com câncer de mama/ovário e é reportada na base de dados BIC como clinicamente importante. Consequentemente, esta mutação é considerada patogênica. Teste para esta mutação está disponível para outros membros da família em risco, quando apropriado. NOTAS: A sequência codificadora completa de BRCA1 e BRCA2, incluindo encaixe doador e sítios de aceitação, foi amplificada usando PCR amplo longo seguido por triagem usando sequenciamento de próxima geração com sequenciamento Illumina MiSeq por tecnologia de síntese. A região codificadora completa e sequências paralelas a +/- 15bp foram sujeitas a um mínimo de 100 x de cobertura com mutação e variante denominada por uma análise de pipeline personalizada de bioinformática. Qualquer região em que isto não foi possível, foi triada por sequenciamento de Sanger bidirecional. Mutações e variantes não classificadas foram confirmadas usando sequenciamento Sanger (usando BigDye ver.3.1). Análise de número de cópias (dosagem)foi por MLPA usando a mistura de sondas P002-C2 (BRCA1)e P045-B3 (BRCA2) MRCHolland que faz ensaio do número de cópias de todos os éxons codificadores: 24 de BRCA1 e 27 de BRCA2. Mutações foram reportadas em conformidade com as diretrizes HGVS sobre nomenclatura de mutação (http://www.hgvs.org/.) e são denominadas de acordo com os Números de Acesso Genbank NM_007294.3 (BRCA1) ou NM_000059.3 (BRCA2). PREPARADO: AUTORIZADO: Cientista Clínico Cientista Clínico Fornecido por Manchester Centre for Genomic Medicine, Manchester, UK. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Teste BRCA– validação, interpretação, laudo clínico e prestadores de serviço Exemplo de um laudo clínico com mutação VUS ANÁLISE DE MUTAÇÃO BRCA1/BRCA2 NOME: Xxxx Xxxxxx DATA DE NASCIMENTO: SEXO: Masculino NHS No: 111 111 1111 SUA REF: GYYY NOSSA REF: 14006325 ENDEREÇO: DATA: .Não fornecido 30-Jun-2014 MOTIVO PARA ENCAMINHAMENTO: Histórico familiar de câncer de mama, triagem mutação BRCA1/2 foi solicitada. RESULTADOS: NOME (DN) Xxxx Xxxxxx (00-XXX-1111) CONDIÇÃO CLÍNICA RESULTADO Histórico familiar câncer de mama HETEROZIGOTO para BRCA2 c.2803G>C p.(Asp935His) [Veja Comentários] COMENTÁRIOS: Triagem da amostra de DNA de linfócito deste paciente identificou uma variante heterozigota c.2803G>C p.(Asp935His) no exon 11 do gene BRCA2. Nenhuma outra diferença foi detectada por análise de sequenciamento da amostra de DNA de linfócito do paciente e a sequência referência (exceto polimorfismos reconhecidos). Análise de dosagem de MLPA não demonstrou evidência para a presença de uma delação ou duplicação completa de exon envolvendo quaisquer dos exon BRCA1 ou BRCA2 que foram testados. Não constatamos previamente esta variante em família afetada por câncer de mama; no entanto, foi previamente reportado na literatura como uma variante não classificada [Ref 1, 2, 3]. Análises in silico usando o Alamut Mutation Interpretation Software Package (ver. 2.3.5) sugerem que esta variante não afeta um resíduo de aminoácido evolucionariamente conservado, é menos provável de prejudicar a função normal e não é preditiva de afetar as junções normais. Teste em familiares afetados para determinar se esta variante segrega doença pode auxiliar na classificação desta variante. Concluindo, identificamos uma variante falta de sentido de significância clínica. Com nosso conhecimento atual sobre esta variante, não recomendamos que sua presença ou ausência seja usada para tratamento clínico. NOTAS: A sequência codificadora completa de BRCA1 e BRCA2, incluindo encaixe doador e sítios de aceitação, foi amplificada usando PCR amplo longo seguido por triagem usando sequenciamento de próxima geração com sequenciamento Illumina MiSeq por tecnologia de síntese. A região codificadora completa e sequências paralelas a +/- 50bp foram sujeitas a um mínimo de 100 x de cobertura com mutação e variante denominada por uma análise de pipeline personalizada de bioinformática. Qualquer região em que isto não foi possível, foi triada por sequenciamento de Sanger bidirecional. Mutações e variantes não classificadas foram confirmadas usando sequenciamento Sanger (usando BigDye ver.3.1). Análise de número de cópias (dosagem) foi por MLPA usando a mistura de sondas P002-C2 (BRCA1) e P045-B3 (BRCA2) MRC-Holland que faz ensaio do número de cópias de todos os éxons codificadores: 24 de BRCA1 e 27 de BRCA2. Mutações foram reportadas em conformidade com as diretrizes HGVS sobre nomenclatura de mutação (http://www.hgvs.org/.) e são denominadas de acordo com os Números de Acesso Genbank NM_007294.3 (BRCA1) ou NM_000059.3 (BRCA2). [Ref 1] Vogel KJ, Atchley DP, Erlichman J, Broglio KR, Ready KJ, Valero V, Amos CI, Hortobagyi GN, Lu KH, Arun B. BRCA1 and BRCA2 genetic testing in Hispanic patients: mutation prevalence and evaluation of the BRCAPRO risk assessment model. J Clin Oncol. 2007 Oct 10;25(29):4635-41. [Ref 2] Edwards SM, Kote-Jarai Z, Meitz J, Hamoudi R, Hope Q, Osin P, Jackson R, Southgate C, Singh R, Falconer A, Dearnaley DP, Ardern-Jones A, Murkin A, Dowe A, Kelly J, Williams S, Oram R, Stevens M, Teare DM, Ponder BA, Gayther SA, Easton DF, Eeles RA; Cancer Research UK/Bristish Prostate Group UK Familial Prostate Cancer Study Collaborators; British Association of Urological Surgeons Section of Oncology. Two percent of men with early-onset prostate cancer harbor germline mutations in the BRCA2 gene. Am J Hum Genet. 2003 Jan;72(1):1-12. [Ref 3] Haffty BG, Choi DH, Goyal S, Silber A, Ranieri K, Matloff E, Lee MH, Nissenblatt M, Toppmeyer D, Moran MS. Breast cancer in young women (YBC): prevalence of BRCA1/2 mutations and risk of secondary malignancies across diverse racial groups. Ann Oncol. 2009 Oct;20(10):1653-9. PREPARADO: AUTORIZADO: Cientista Clínico Cientista Clínico Fornecido por Manchester Centre for Genomic Medicine, Manchester, UK. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Teste BRCA– validação, interpretação, laudo clínico e prestadores de serviço Há diversos prestadores de serviço de teste BRCA para mutações germinativas* Empresa Teste Plataformas Myriad Genetics1 BRCAAnalysis® Sequenciamento Sanger e NGS Ambry Genetics2 Análise de sequência BRCA1 / 2 e deleção/duplicação NGS e aCGH Quest Diagnostics3 BRCAvantage™ avaliação abrangente (BRCA1/2) NGS e MLPA Análise de sequência BRCA1 / 2 e deleção/duplicação GeneDx4 NGS (HiSeq), exon-level aCGH e MLPA Confirma por sequenciamento capilar, qPCR, MLPA ou repete aCGH DNA Traits (Gene by Gene)5 BRCA1 / 2 Sequenciamento Sanger de exons ±50 pares de bases Emory Genetics Laboratory6 Painel de sequência BRCA1 / 2 e deleção/duplicação Sequenciamento Sanger, CGH InVitae7 BRCA1 / 2 Centogene 8 Sequenciamento NGS (codificando ±10 pares de base) NGS para deleções intragênicas e duplicações BRCA1 / 2 Sequenciamento Sanger Genekor9 BRCA1 / 2 NGS e MLPA Sistemas10 BRCA1 / 2 Sequenciamento Sanger, NGS e MLPA The Doctors Laboratory11 BRCA1 / 2 Não especificado aCGH, hibridização genômica comparativa de matriz; CGH, hibridização genômica comparativa. *Em muitos países, incluindo Reino Unido, laboratórios públicos são os principais fornecedores de teste e muitos estão dispostos a aceitar encaminhamento privado. 1. Myriad Genetics. www.myriad.com; 2. Ambry www.ambrygen.com/genomic-services/brca1-and-brca2-test-offerings-clinical-trials-and-research; 3. BRCAvantage www.brcavantage.com/provider-resources/#.U2Ij3clwbAo 4. GeneDx www.genedx.com/wp-content/uploads/2013/10/info_sheet_BRCA1-2_seq_del_dup.doc.pdf; 5. GenebyGene www.genebygene.com/products/brca12#; 6. Emory Genetics genetics.emory.edu/egl/tests/view.php?testid=4306; 7. InVitae www.invitae.com/en/physician/conditiondetail/CND0089/; 8. Centogene http://www.centogene.com/centogene/centogene-test-catalogue-detail.php?test=Test&ID=20001&search=Test&disease=BRCA1 BRCA2 (Sanger_sequencing); 9. Genekor http://www.genekor.com/hereditary-breast-ovarian-cancer-brca1&2-p-211.html; 10. Sistemas https://www.sistemasgenomicos.com/web_sg/webing/servicios.php?id=19_288; 11. The Doctors Laboratory http://www.tdlpathology.com/test-information/a-z-test-list/b. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Teste BRCA somático © AstraZeneca 2015. FOR USO HEALTHCARE APENAS POR PROFISSIONAL SAÚDE. PROFESSIONALDA USE ONLY. Teste BRCA somático Mutações BRCA somáticas (apenas tumor) no câncer de ovário Percentual de mutações BRCA germinativas e BRCA somáticas no câncer de ovário1–3 Menos câncer de ovário contém mutações BRCA somáticas (apenas tumor) em comparação com mutações BRCA germinativas1–3 90% 80% Proporção de pacientes, Nenhuma diferença significante na PFS foi reportada para pacientes que eram positivas para mutação BRCA somática versus germinativa após quimioterapia a base de platina1 100% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Ovário BRCA1 / 21 Ovário seroso alto grau BRCA12 Sem mutação Ovário seroso Ovário seroso Ovário seroso alto grau alto grau alto grau BRCA22 Mutação BRCA germinativa 1. Hennessy BT, et al. J Clin Oncol 2010;28:3570–6; 2. Yang D, et al. JAMA 2011;306:1557–65; 3. McAlpine JN, et al. Mod Pathol 2012;25:740–50. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. BRCA13 BRCA23 Mutação BRCA somática Teste BRCA somático Métodos de teste de mutação somática de BRCA Poucos laboratórios de serviço oferecem teste clínico de rotina para triagem BRCA tumoral1–3 Métodos de teste BRCA germinativo pode precisar ser re-desenvolvido para: – Funcionar em DNA de baixa qualidade de tecido tumoral FFPE4 DNA de amostras tumorais podem ser de qualidade ruim e baixo resultado, portanto, detecção mais sensível de mutação pode ser obtida com NGS4 Kits BRCA comercialmente desenvolvidos para uso em amostras tumorais Método Detalhes Fornecedor: QIAGEN GeneRead DNAseq Targeted Exon Enrichment Breast Panel (RUO)1 Método NGS para uso no material FFPE Análise de 20 genes incluindo BRCA1 e BRCA2 – os genes BRCA podem ser selecionados separadamente BRCA Mastr Dx para material congelado de tumor (CE-KIT)2 Fornecedor: Multiplicom Método NGS apenas para tecido congelado Ion AmpliSeq™ BRCA1 and BRCA2 Panel (RUO-IVD)3 Fornecedor: Life Technologies Método NGS Informações disponíveis limitadas FFPE, fixado em formalina e embebido em parafina. 1. www.qiagen.com; 2. www.multiplicom.com/brca-mastr-dx-leaflet; 3. www.lifetechnologies.com; 4. Bourgon R, et al. Clin Cancer Res 2014;20:2080–91. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Teste BRCA somático Fornecedores de serviço de teste BRCA: Mutações somáticas Foundation Medicine oferece um serviço de teste BRCA que é realizado no tecido tumoral (FFPE ou biópsia com agulha)1 FoundationOne1 – Usa NGS – Pode identificar alterações no número de cópias, inserções, deleções e rearranjos – Resultados de perfil são reportados para o médico e pareados com terapias direcionadas e/ou estudos clínicos 1. Foundation Medicine www.foundationmedicine.com/. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Quem é encaminhado para teste BRCA? © AstraZeneca 2015. FOR USO HEALTHCARE APENAS POR PROFISSIONAL SAÚDE. PROFESSIONALDA USE ONLY. Quem é encaminhado para teste BRCA? Quem é encaminhado para teste atualmente? Os perfis dos adultos encaminhados para teste genético podem diferir entre os países com base nas diretrizes e prevalência de mutação 1 Critérios atuais tipicamente incluem idade e histórico familiar e pessoal de câncer2,3 Critérios clínicos para encaminhamento para teste BRCA1−3 Histórico familiar conhecido de mutação BRCA1 / 2 nociva – Pelo menos três casos de câncer de mama e/ou ovário, em pelo menos um <50 anos de idade – Dois casos de câncer de mama <40 idade Histórico pessoal / familiar das combinações de: câncer de mama em homens, câncer de ovário epitelial, câncer de mama feminino de início precoce, câncer pancreático ou câncer de próstata agressivo Judeu Ashkenazi com câncer de mama com <60 anos Câncer de mama bilateral em jovens Câncer de mama e ovário na mesma paciente 1. Balmaña J, et al. Ann Oncol 2011;22(Suppl. 6):vi31–vi34; 2. Meyer LA, et al. Obstet Gynecol 2010;115:945–52; 3. Daly MB, et al. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines) Genetic/Familial High-Risk Assessment: Breast and Ovarian 2013. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Quem é encaminhado para teste BRCA? Há um potencial para que a condição BRCA pudesse informar o tratamento para a paciente em mulheres diagnosticadas com câncer de ovário O conhecimento da condição de mutação BRCA poderia potencialmente ter uma utilidade clínica que pode afetar o tratamento da paciente1–3 – Pacientes portadoras de uma mutação BRCA parecem demonstrar uma resposta favorável à terapia a base de platina1–3 Resposta ao tratamento com platina: – Um estudo demonstrou que 38% das pacientes com tumor de ovário recidivante sensível à platina apresentava mutações BRCA em comparação com 17% das pacientes com tumor de ovário resistente à platina4 – Uma frequência de mutação combinada de BRCA1 / 2 de 44% foi reportada em um estudo em pacientes com tumor de ovário recidivante sensível à platina5 A sobrevida melhorada observada em pacientes BRCA é impulsionada pelas portadoras de mutação conhecida – A condição BRCA precisa ser identificada no momento do diagnóstico para fornecer melhores informações sobre as decisões de tratamento 6 1. Lee JM, et al. J Natl Cancer Inst 2014;106; 2. Alsop K, et al. J Clin Oncol 2012;30:2654–63; 3. Pennington K, et al. Clin Cancer Res 2014;20:764–75; 4. Dann R, et al. Gynecol Oncol 2012;125:677–82; 5. Ledermann J, et al. N Engl J Med 2012;366:1382–92; 6. Norquist B, et al. Gynecol Oncol 2013;128:483–7. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Quem é encaminhado para teste BRCA? Uma proporção significante de mulheres com câncer de ovário com mutação em BRCA não apresenta histórico familiar relevante Em um estudo epidemiológico realizado na Austrália, até 44% das pacientes com câncer de ovário, que também eram portadoras de BRCA, não tinham fatores de risco familiares prévios e tornaram-se assim o primeiro alerta para os familiares1 1. Alsop K, et al J Clin Oncol 2012;30:2654–63. © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. Resumo © AstraZeneca 2015. FOR USO HEALTHCARE APENAS POR PROFISSIONAL SAÚDE. PROFESSIONALDA USE ONLY. Resumo Resumo BRCA1 e BRCA2 são genes supressores de tumor que parecem estar relacionados com um risco aumentado de desenvolvimento de determinados tipos de câncer, particularmente câncer de ovário e de mama – Mutações comuns em BRCA1 e BRCA2 incluem mutações em ponto, desvios de estrutura e rearranjos grandes Teste genético está amplamente disponível para detectar mutações BRCA1 e BRCA2: – Mutações em ponto e mutações de desvio de estrutura podem ser detectadas por sequenciamento Sanger e NGS – Rearranjos grandes são comumente detectados usando MLPA – Teste para mutações somáticas não estão atualmente disseminados Sequenciamento Sanger ainda é comumente usado em muitos laboratórios: o uso de tecnologias NGS está aumentado com reduções associadas no custo e tempo © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE. AstraZeneca reconhece, com agradecimentos, as opiniões de especialistas e diretrizes recebidas de: Dr Andrew Wallace, Dr Emma Howard e membros associados do Genomic Diagnostic Laboratory, Manchester Centre for Genomic Medicine, Manchester Reino Unido durante o desenvolvimento desta plataforma educacional © AstraZeneca 2015. USO APENAS POR PROFISSIONAL DA SAÚDE.
