modalidade artigos - IPTSP

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
CAROLINA AGUIAR DE ARAÚJO MACHADO
Avaliação da atividade da zidovudina (AZT) no metabolismo de promastigotas
de Leishmania (Viannia) braziliensis.
Goiânia
2013
CAROLINA AGUIAR DE ARAÚJO MACHADO
Avaliação da atividade da zidovudina (AZT) no metabolismo de promastigotas
de Leishmania (Viannia) braziliensis.
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de PósGraduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de
Doutor em Medicina Tropical e Saúde Pública.
Orientadora: Profª. Drª. Marina Clare Vinaud
Co-orientador: Prof. Dr. Ruy de Souza Lino Junior
Goiânia
2013
i
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO
Aluna: Carolina Aguiar de Araújo Machado
Orientadora: Profª. Drª. Marina Clare Vinaud
Co-orientador: Prof. Dr. Ruy de Souza Lino Junior
Membros:
1. Profª. Drª. Adelair Helena dos Santos – IPTSP/UFG
2. Prof. Dr. Cirano José Ulhoa – ICB/UFG
3. Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra - IPTSP/UFG
4. Profª. Drª. Roseli Aparecida da Silva Gomes – UFTM /MG
5. Prof. Dr. Éverton Kort Kamp Fernandes (Suplente) - IPTSP/UFG
6. Prof. Dr. Luiz Carlos da Cunha (Suplente) – FF/UFG
7. Prof. Dr. Milton Adriano Pelli de Oliveira (Suplente) – IPTSP/UFG
8. Drª. Tatiane Luiza da Costa (Suplente) - HC/UFG
Data:03/07/2013.
ii
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu esposo Rodolpho Teles Machado, companheiro e
intercessor. A ele minha gratidão e amor.
iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me conceder saúde para realizar este trabalho.
Ao meu esposo Rodolpho Teles Machado por, junto comigo, seguir minha
vocação e ser meu melhor amigo, companheiro e exemplo de dedicação.
A meus pais Valdeina Barbosa Aguiar de Araujo e Rubens Pereira de Araujo,
minhas maiores referências de vida.
A meus irmãos Aline Aguiar de Araujo e Marcos Alexandre Araujo Pinheiro
que além de grandes amigos me presentearam com minha sobrinha Valentina Aguiar
Araujo Pinheiro, o amor da titia.
Ao meu irmão Arpuim Aguiar de Araujo por ser um grande incentivador da
minha vocação.
Ao carinho da minha irmã Flanders Auxiliadora e sua família: Demilson Bose,
Nayara Carvalho e meu afilhado Demilson Junior .
As primas-irmãs Aurenice Milhomens de Araujo e Lorena Siqueira de Araujo.
Ao sogro Alcides Machado e ao cunhado Pablo Teles Machado pelas orações e
torcida.
A minha orientadora e amiga Profª Drª Marina Clare Vinaud por sempre fazer
além do que se propôs ao me orientar.
Aos professores que contribuíram com minha história: ao meu co-orientador Dr.
Ruy de Souza Lino Junior, Dr. José Clecildo Barreto Bezerra, Drª. Ana Maria de Castro,
Dr. Milton Adriano Pelli de Oliveira.
Aos colegas que fazem parte da equipe do Laboratório de estudos da relação
parasito-hospedeiro (LAERPH): Aline Almeida Barbaresco, Carolina Miguel Fraga,
Nayana Ferreira de Lima, Flávia Martins Nascente, Hânstter Hállisson, Juliana
Boaventura Avelar, Letícia de Almeida Leandro, Luciana Damascena, Lilian Cristina
Morais de Andrade, Liliane Siriano, Tatiane Luiza da Costa.
Aos amigos: Camilla Luiza Batista, Carlos Antônio Pereira, Pe. David Pereira de
Jesus, Djones Ribeiro, Eliene Santos, Flávia Ikeda e Araujo, Kaique Batista, Kamilla
Gomes Camargo, Kleber Moreira, Luana Neres, Maria Neide Mota, Rodrigo Rodrigues
Vaz.
A todos os irmãos do Seminário São João Maria Vianney.
iv
A todos os professores e funcionários do Programa de Pós Graduação em
Medicina Tropical e Saúde Pública.
v
SUMÁRIO
Pág.
1
RESUMO
xiv
ABSTRACT
xv
INTRODUÇÃO
1
1.1-
Leishmania sp
1
1.2-
Ciclo biológico
2
1.3-
Fatores epidemiológicos
3
1.4-
Leishmanioses
4
1.5-
Coinfecção Leishmania/HIV
8
1.6-
Metabolismo de Leishmania spp
9
a) Via glicolítica
10
b) Ciclo do ácido tricarboxílico
11
c) Catabolismos de ácidos graxos
13
d) Cadeia respiratória
15
1.7-
Fármacos de escolha para o tratamento das leishmanioses
15
1.8-
Zidovudina (AZT)
17
1.9-
Toxicidade mitocondrial da zidovudina (AZT)
19
2 JUSTIFICATIVA
21
3 OBJETIVOS
22
4 MÉTODOS
23
4.1- Cultivo de formas promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis
23
4.2- Atividade anti-Leishmania
23
4.3-Análise espectrofotométrica
24
4.4- Análise cromatográfica da concentração de ácidos orgânicos
24
4.5- Análise estatística
25
5 MANUSCRITOS
26
Manuscrito 1– EFEITO DA ZIDOVUDINA (AZT) NAS TAXAS DE
CRESCIMENTO DE FORMAS PROMASTIGOTAS DE Leishmania
27
(Viannia) braziliensis.
Manuscrito 2 – EFEITO DA ZIDOVUDINA (AZT) NAS VIAS
METABÓLICAS DE FORMAS PROMASTIGOTAS DE Leishmania Viannia
35
braziliensis
vi
6 DISCUSSÃO
50
7 CONCLUSÕES
53
8 REFERÊNCIAS
54
ANEXOS
65
vii
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS
Pág.
Figura 1: Ciclo Biológico da Leishmania sp
3
Figura 2: Distribuição de espécies de Leishmania responsáveis pela
transmissão da leishmaniose tegumentar americana, Brasil – 2005
Figura 3: Metabolismo central do carbono em Leishmania spp.
Figura 4 : Mapa metabólico de Leishmania sp para geração de
acetil Co-A a partir dos ácidos graxos.
Figura 5: Estrutura química da zidovudina (3’-azido-2’,3’deoxitimidina)
7
13
14
17
MANUSCRITO 1
Figura 1: Crescimento in vitro de formas promastigotas de
Leishmania
(Viannia)
braziliensis
submetidas
a
diferentes
31
concentrações de AZT.
Figura 2: Crescimento in vitro de formas promastigotas de
Leishmania (Viannia) braziliensis submetidas a 10µM e 30 µM de
31
AZT.
MANUSCRITO 2
Tabela 1: Concentração de ácidos orgânicos (nM/105 leishmanias)
secretados/excretados por formas promastigotas de Leishmania
(Viannia) braziliensis in vitro, submetidas a diferentes concentrações
40
de AZT (µM).
Tabela 2: Concentração de glicose e uréia (g/dL/ 105 leishmanias)
secretados/excretados por promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis in vitro, submetidas a diferentes concentrações de AZT
41
(µM).
viii
ANEXOS
Cromatograma 1: Cromatograma de ácidos orgânicos de
promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis M2903,
65
controle de leishmanias do 3º dia da curva de crescimento
Cromatograma 2: Cromatograma de ácidos orgânicos de
promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis M2903,
65
controle de leishmanias do 6º dia da curva de crescimento
Cromatograma 3: Cromatograma de ácidos orgânicos de
promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis M2903,
promastigotas submetidas a 1µM de AZT, 3º dia da curva de
66
crescimento
Cromatograma 4: Cromatograma de ácidos orgânicos de
promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis M2903,
promastigotas submetidas a 1µM de AZT, 6º dia da curva de
66
crescimento
Cromatograma 5: Cromatograma de ácidos orgânicos de
promastigotas de Leishmania (Viannia.) braziliensis M2903,
promastigotas submetidas a 10µM de AZT, 3º dia da curva de
67
crescimento
Cromatograma 6: Cromatograma de ácidos orgânicos de
promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis M2903,
promastigotas submetidas a 10µM de AZT, 6º dia da curva de
67
crescimento
Cromatograma 7: Cromatograma de ácidos orgânicos de
promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis M2903,
promastigotas submetidas a 20µM de AZT, 3º dia da curva de
68
crescimento
ix
Cromatograma 8: Cromatograma de ácidos orgânicos de
promastigotas de Leishmania (Viannia.) braziliensis M2903,
promastigotas submetidas a 20µM de AZT, 6º dia da curva de
68
crescimento
Cromatograma 9: Cromatograma de ácidos orgânicos de
promastigotas de Leishmania (Viannia.) braziliensis M2903,
promastigotas submetidas a 30µM de AZT, 3º dia da curva de
69
crescimento
Cromatograma 10: Cromatograma de ácidos orgânicos de
promastigotas
de
Leishmania
(V.)
braziliensis
M2903,
promastigotas submetidas a 30µM de AZT, 6º dia da curva de
69
crescimento
Cromatograma 11: Cromatograma de ácidos orgânicos de
promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis M2903,
promastigotas submetidas a 40µM de AZT, 3º dia da curva de
70
crescimento
Cromatograma 12: Cromatograma de ácidos orgânicos de
promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis M2903,
promastigotas submetidas a 40µM de AZT, 6º dia da curva de
70
crescimento
Cromatograma 13: Cromatograma de ácidos orgânicos de
promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis M2903,
promastigotas submetidas a 50µM de AZT, 3º dia da curva de
71
crescimento
Cromatograma 14: Cromatograma de ácidos orgânicos de
promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis M2903,
promastigotas submetidas a 50µM de AZT, 6º dia da curva de
71
crescimento
x
Cromatograma 15: Cromatograma de ácidos orgânicos, controle
do meio
Carta de submissão de artigo
72
73
xi
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
Acetil-CoA
Acetil coenzima A
ADP
Adenosina difosfato
AIDS
Acquired immunodeficiency syndrome (Síndrome da
imunodeficiência adquirida)
ATP
Adenosina trifosfato
AZT
3’ azido-2’-3’ – dideoxitimidina, zidovudina
Ciclo
do Ciclo do ácido tricarboxílico
ATC
CLAE
Cromatografia líquida de alta eficiência
CO2
Dióxido de carbono
DHAP
Dihidroxiacetona fosfato
DL
Dose letal
e-
Elétrons
FAD
Flavina adenina dinucleotídeo
FADH2
Flavina adenina dinucleotídeo reduzida
GPDH
Glicerolfosfato desidrogenase
HAART
Highly active antiretroviral therapy (Terapia antirretroviral
altamente ativa)
Human immunodeficiency vírus (Vírus da imunodeficiência
HIV
humana)
IPTSP
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
kDNA
Kinetoplast desoxyribonucleic acid (DNA do cinetoplasto)
LC
Leishmaniose cutânea
LCD
Leishmaniose cutâneo-difusa
LMC
Leishmaniose muco-cutânea
LV
Leishmaniose visceral
mt-DNA
Mithocondrial desoxyribonucleic acid (DNA mitocondrial)
NAD
Nicotinamida dinucleotídeo
+
NAD
Nicotinamida dinucleotídeo oxidada
NADH
Nicotinamida dinucleotídeo reduzida
NADP
Nicotinamida dinucleotídeo fosfato
xii
O2
Oxigênio
OMS
Organização Mundial de Saúde
PEP
Fosfoenolpiruvato
S/E
Secretado e/ou excretado
Succinil-CoA Succinil Coenzima A
xiii
RESUMO
As leishmanioses são um grande problema de saúde pública, representando um
complexo de doenças com importante espectro clínico e diversidade epidemiológica.
São causadas por protozoários do gênero Leishmania e, no Brasil, são transmitidas pela
picada de vetores infectados do gênero Lutzomya. As leishmanioses visceral e
tegumentar vêm surgindo como coinfecções com o vírus da imunodeficiência humana/
síndrome da imunodeficiência adquirida (HIV/AIDS). A zidovudina (AZT) que é um
análogo nucleosídico, vem sendo utilizado no tratamento de HIV-positivos inibindo a
transcriptase reversa em competição com o trifosfato de timidina, com grande
seletividade antiviral. É descrito, em diversos tipos celulares, que o AZT promove lesão
mitocondrial e estudos prévios realizados têm demonstrado atividade antileishmania
deste fármaco e de outros derivados nucleosídicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar
a sobrevivência e metabolismo in vitro de formas promastigotas de Leishmania
(Viannia) braziliensis expostas a diferentes concentrações de AZT. A avaliação da
sobrevivência foi realizada por análise quantitativa das formas promastigotas de L. (V.)
braziliensis cepa M2903 ao microscópio óptico após exposição a diferentes
concentrações de AZT (1µM, 10µM, 20µM, 30µM, 40µM e 50µM) mostrando
diferença na taxa de crescimento nas concentrações de 10µM e 30µM na fase
proliferativa do parasito comparado aos grupos controle. A avaliação do metabolismo
foi realizada pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE),
quantificando-se a presença de ácidos orgânicos como: piruvato, lactato, citrato, αcetoglutarato, succinato, fumarato, malato, oxaloacetato, β-hidroxibutirato, acetoacetato,
acetato e propionato. Foi demonstrada a redução na secreção/excreção (S/E) de
fumarato e aumento da S/E de piruvato em grupos expostos ao AZT na fase estacionária
de crescimento das formas promastigotas. Em seguida foi realizada a dosagem
espectrofotométrica de glicose e uréia nas promastigotas de 3º e 6º dias de crescimento,
submetidas ao AZT. A concentração de glicose aumentou no 6º dia de crescimento. O
fármaco testado demonstrou ter atividade sobre as vias mitocondriais do parasito.
Portanto, observou-se que as promastigotas utilizam como principal fonte de energia o
catabolismo de proteínas e ácidos graxos, vias que não foram alteradas devido a
presença do fármaco.
Palavras chave: Leishmania (Viannia) braziliensis, metabolismo energético, AZT
xiv
ABSTRACT
Leishmaniasis are a great public health problem and represent a complex of diseases
with an important clinical spectrum and with epidemiological diversity. They are caused
by protozoans from the Leishmania genus and in Brazil are transmitted through the bite
of infected vectors from the Lutzomya genus. The visceral and tegumentar
Leishmaniasis have acquired an important role as co-infections with the human
immunodeficiency virus/ acquired immunodeficiency syndrome. Zidovudine (AZT)
which is a nucleosidic analogue and has been used in the HIV-positive treatment. AZT
inhibits the reverse transcriptase acting as a competitor with the timidine triphosphate
with great antiviral selectivity. It has been described that several types of cells are
affected by AZT resulting in mitochondrial injury. Also, previous studies have shown
that this drug has an anti-leishmania activity. The aim of this study was to in vitro
evaluate the survival and the metabolic alterations of promastigotes from Leishmania
(Viannia) braziliensis exposed to different concentrations of AZT. The evaluation of
survival was performed through the quantitative analysis of the promastigotes forms of
L. (V.) braziliensis M2903 strain under the optic microscope and which were exposed to
different concentrations of AZT (1µM, 10µM, 20µM, 30µM, 40µM and 50µM) which
demonstrated significant difference on the concentrations of 10µM and 30µM in the
proliferative phase of growth when compared to the control group. The evaluation of the
metabolism was performed through chromatographic (HPLC) and spectrophotometric
methods which allowed the quantification of the following organic acids: pyruvate,
lactate, citrate, α-ketoglutarate, succinate, fumarate, malate, oxaloacetate, βhidroxybutyrate, acetoacetate, acetate and propionate. It was possible to observe the
decrease in the secretion/excretion (S/E) of fumarate and increase in the S/E of pyruvate
in the groups exposed to AZT in the stationary phase of growth. Afterwards, the
spectrophotometric analysis of glucose and urea showed an increase in the glucose
concentrations on the 6th day of growth. This drug presented a mitochondrial activity on
the parasite therefore the glycossomal and cytosolica metabolic pathways were not
disturbed. It was possible to determine that promastigotes preferentially use the
catabolism of proteins and fatty acids as primary energy sources.
Key words: Leishmania (Viannia) braziliensis, energetic metabolism, AZT
xv
1 INTRODUÇÃO
1.1. Leishmania sp
Os agentes etiológicos das diferentes formas clínicas da leishmaniose são os
protozoários parasitos intracelulares obrigatórios pertencentes ao gênero Leishmania.
Descrito em 1903 por Leishman e Donovan na Índia e simultaneamente por Wright,
como um protozoário flagelado pertencente à classe Zoomastigophora, filo
Sarcomastigophora, ordem Kinetoplastida e família Trypanosomatidae. Como todos os
pertencentes à ordem Kinetoplastida, este parasito apresenta cinetoplasto, uma estrutura
especializada que contém grande quantidade de material genético, essencial para a
sobrevivência do parasito (Blum et al. 2004; Garcia-Almagro 2005; Souza et al. 2009).
Os parasitos do gênero Leishmania têm ciclo de vida heteroxeno, necessitando
de hospedeiros invertebrado e vertebrado para completar seu desenvolvimento e
apresentando duas formas evolutivas: a forma amastigota, que é intracelular e sem
movimentos e a promastigota, que é flagelada e extracelular (Rey 2008).
Formas amastigotas se multiplicam dentro dos fagolisossomos de macrófagos de
vertebrados. Enquanto que as formas promastigotas, flageladas e móveis, se
multiplicam extracelularmente no trato alimentar (intestinal) do vetor invertebrado e em
culturas axênicas (Shaw 1982; Sacks 1985; Alexander 1999).
A forma amastigota têm corpo ovóide, medindo entre 2 a 6 µm de comprimento
por 1,5 a 3 µm de largura, flagelo interno em uma invaginação da membrana chamada
bolso flagelar e cinetoplasto próximo ao núcleo. Por outro lado, a forma promastigota
apresenta corpo alongado, medindo entre 14 e 20 µm de comprimento por 1,5 a 4 µm de
largura, flagelo livre, núcleo no terço médio da célula e cinetoplasto em forma de
bastonete curvo situado anteriormente ao núcleo (Rey 2008).
Existem formas distintas de promastigotas, que são as formas infectantes aos
mamíferos, na qual a promastigota metacíclica é a fase final de desenvolvimento no
vetor com diferenças morfológicas e bioquímicas que determinam a capacidade
infectante (Gossage 2003).
A transformação da forma promastigota procíclica, que é pouco infectante, em
promastigota metacíclica, altamente infectante, ocorre em um processo denominado
metaciclogênese, que dura aproximadamente 6 a 10 dias. Na natureza, a
metaciclogênese, ocorre no inseto vetor. Esta transformação é acompanhada por um
1
aumento na capacidade de infectar e sobreviver no hospedeiro vertebrado, onde o
parasito é atacado pelo sistema imune do hospedeiro (Sacks 1989; Zakai 1998; GarciaAlmagro 2005).
As promastigotas crescem em meio de cultura em duas fases, logarítmica
(crescimento exponencial) e estacionária. As promastigotas de fase estacionária
apresentam maior concentração de formas metacíclicas e maior virulência do que as que
crescem progressivamente (Gossage 2003).
No subgênero Leishmania (Viannia) as formas promastigotas se desenvolvem no
intestino posterior do hospedeiro invertebrado (desenvolvimento peripilário) (Gossage
2003).
1.2. Ciclo biológico
As fêmeas do gênero Lutzomya e/ou Phlebotomus, realizam o repasto sanguíneo
no hospedeiro humano ou mamífero a fim de obter proteínas necessárias para o
desenvolvimento de seus ovos. Cerca de 30 espécies conhecidas foram positivamente
identificadas como vetores da doença (CDC 2013; WHO 2013).
Os hospedeiros invertebrados podem ser infectados pela ingestão de células
repletas de amastigotas durante o repasto sanguíneo. No vetor, as amastigotas
transformam-se em promastigotas, desenvolvem-se no trato intestinal pelo processo de
metaciclogênese e migram para a probóscide (CDC 2013; WHO 2013).
O vetor infectado apresenta uma obstrução de seu proventrículo, levando à
regurgitação das formas infectantes (ou seja, promastigotas metacíclicas) durante o
repasto sanguíneo. No hospedeiro vertebrado, as formas promastigotas inoculadas no
local da picada são fagocitadas pelos macrófagos e outros tipos de células
mononucleares fagocitárias. Após a internalização, a promastigota metacíclica é
localizada em um vacúolo parasitóforo. Os vacúolos parasitóforos de Leishmania são
acidificados, ricos em enzimas lisossomais e suas membranas mostram os marcadores
fagolisossomais. A promastigota transforma-se em amastigota, capaz de se desenvolver
e multiplicar no meio ácido encontrado no vacúolo digestivo (Neves 2005). As
amastigotas são uma fase tissular do parasito que se multiplicam até romperem a célula
hospedeira, quando apresentam a capacidade de continuar a infectar outras células
mononucleares fagocitárias (Figura 1) (CDC 2013; Real 2008; WHO 2013).
2
Figura 1: Ciclo Biológico da Leishmania sp (Adaptado de CDC 2013).
1.3-
Fatores epidemiológicos
A leishmaniose é classificada pelo Ministério da Saúde do Brasil e pela
Organização Mundial da Saúde (OMS) como uma doença negligenciada, caracterizada
por possuir diferentes formas clínicas: Leishmaniose Tegumentar Americana que inclui
a Leishmaniose Cutânea, Leishmaniose Cutâneo-difusa e Leishmaniose Mucocutânea; e
Leishmaniose Visceral (Desjeux 2004; Ngure et al. 2009; Hiro Goto & Lindoso 2012).
As leishmanioses são um grande problema de saúde pública, representando um
complexo de doenças com importante espectro clinico e diversidade epidemiológica. A
OMS estima que 350 milhões de pessoas estejam expostas ao risco de infecção com
registro aproximado de dois milhões de novos casos da doença em suas diferentes
formas clínicas ao ano (Ministério da Saúde 2007).
A leishmaniose é uma zoonose de distribuição mundial, atingindo 88 países, dos
quais 72 são países em desenvolvimento e 13 são países desenvolvidos. A incidência
3
anual está estimada em 1 a 1,5 milhão de casos de leishmaniose cutânea (LC) e 500.000
de leishmaniose visceral (LV). Grande parte dos casos não é diagnosticada ou não
notificada, em especial nos casos em que os pacientes não possuem acesso aos serviços
de saúde, em apenas 33 dos 88 países é considerada uma doença endêmica (Desjeux
2004; Ministério da Saúde 2007).
Em muitas áreas do mundo, ocorre um aumento no número de casos de
leishmaniose. A estimativa é de que a incidência de leishmaniose do tipo tegumentar é
de 1,5 milhões de casos por ano sendo que 90% dos casos ocorrem no Afeganistão,
Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita e Síria (Desjeux 2004; Hiro Goto & Lindoso 2012).
Outro fator epidemiológico importante é que as leishmanioses visceral e
tegumentar vêm surgindo como coinfecções com o vírus da imunodeficiência humana/
síndrome da imunodeficiência adquirida (HIV/AIDS), adquirindo um caráter de doença
oportunista (Desjeux 2004). Na África, principalmente Etiópia e Sudão, estima-se que
70% dos adultos com leishmaniose visceral também têm a infecção pelo HIV (Ngure et
al. 2009)
As perspectivas de controle das leishmanioses são altamente dependentes do
progresso científico, para obtenção de melhorias das ferramentas que as controlem e
uma melhor estratégia de custo efetivo para manejo e controle de vetores (Desjeux
2004).
1.4-
Leishmanioses
A leishmaniose é uma doença grave que envolve a inter-relação entre três
participantes centrais do ponto de vista biológico: o parasito, o inseto (hospedeiro
invertebrado) e o ser humano (hospedeiro vertebrado) (Almeida 2003).
Os dípteros da subfamília Phlebotominae são os únicos vetores das várias
espécies de Leishmania, sendo os gêneros Phlebotomus vetor das espécies no Velho
mundo (Europa e Ásia) e Lutzomyia vetor das espécies de Leishmania nas Américas.
Ambos são conhecidos por preferirem viver em florestas e áreas de rochas calcárias.
Suas adaptações em proximidades de habitações têm facilitado a transmissão da doença
e provocado a sua urbanização (Almeida 2003; Amóra 2009).
No Brasil as espécies de vetores mais encontradas são: Lutzomyia (Lutzomyia)
Longipalpis, L. (Ny.) whitmani, L. (Trichophoromyia) ubiquitalis, L. (Pf.) nuneztovari,
L. (Ps.) ayrozai (Ready 2013).
4
No Brasil, a leishmaniose é uma doença endêmica e mostra um padrão de
transmissão peridomiciliar principalmente porque algumas espécies de vetores se
adaptaram às alterações ambientais. Além disso, a ocupação humana desordenada de
áreas florestais possibilita a disseminação da doença em um ciclo extra-florestal. Essa
redução do espaço ecológico dos vetores facilita a ocorrência das epidemias (Amóra
2009).
Os flebotomíneos têm hábitos crepusculares e noturnos permanecendo abrigados
em seus nichos durante o dia. A sua ocorrência em algumas áreas também pode estar
relacionadas a fatores climáticos como temperatura, precipitação e umidade relativa.
Estes dípteros se beneficiam de moderada precipitação durante a estação chuvosa, mas
inundações são prejudiciais, porque destroem suas áreas reprodutoras e matam a pupa
no solo. Além disso, as temperaturas mais baixas e maior disponibilidade alimentar para
as larvas, como as folhas caídas no outono, podem estimular pupação em massa (Amóra
2009).
No Brasil, os vetores participam do ciclo de transmissão das leishmanioses
humanas principalmente em zonas rurais, peridomicílios, incluindo os subúrbios, áreas
silvestres e arbóreas (Ready 2013).
A leishmaniose humana pode ser totalmente inaparente ou subclínica ou pode
apresentar um espectro de manifestações de envolvimento cutâneo, das mucosas até
destruição generalizada sistêmica na forma visceral da doença com evolução fatal
(Balaña-Fouce 1998).
As leishmanioses são divididas em dois grupos de doenças: leishmaniose
visceral (LV) e leishmaniose tegumentar americana (LTA) que ocorre somente nas
Américas.
A LV pode ser fatal se não tratada e existem aproximadamente 500.000 casos de
LV por ano em todo o mundo. A falta de sistemas de vigilância e o frequente
subdiagnóstico tornam difícil estimar a real incidência e a taxa de letalidade da LV
(Desjeux 2004).
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) distribui-se amplamente no
continente americano, estendendo-se desde o sul dos Estados Unidos até o norte da
Argentina. No Brasil tem sido assinalada em todos os estados, constituindo, portanto,
uma das afecções dermatológicas de causa parasitária que merece maior atenção, devido
ao risco de ocorrência de deformidades, como também pelo envolvimento psicológico
5
do doente, com reflexos no campo social e econômico, uma vez que, na maioria dos
casos, pode ser considerada uma doença ocupacional (Ministério da Saúde 2007).
A LTA inclui várias formas clínico-epidemiológicas relacionadas a diferentes
subgêneros e espécies de Leishmania :
1-
Leishmaniose cutânea (LC): As espécies relacionadas no Novo Mundo são
principalmente do complexo L. (Leishmania) mexicana (L. amazonensis, L.
mexicana e L. venezuelensis) e do subgênero Viannia (L. (V.) braziliensis, L. (V.)
panamensis, L. (V.) peruviana e L. (V.) guyanensis). As manifestações clínicas
são caracterizada por úlceras crônicas na pele, desenvolvidas no local da picada
do inseto vetor e que podem levar meses para cicatrizar. É geralmente autoresolutiva, mas que se apresenta como uma forma grave quando há lesões
múltiplas (Desjeux 2004; Rey 2008).
2-
Leishmaniose cutâneo-difusa (LCD): relacionada com o complexo L. mexicana,
no Novo Mundo. É caracterizada como uma doença crônica e poliparasitária, por
lesões não ulcerativas, resistência a quimioterapia e anergia das células T
Leishmania específicas. Não possui cura espontânea e é uma doença que surge
devido à deficiência na resposta imune mediada por células. As lesões
disseminadas se assemelham macroscopicamente à hanseníase (Desjeux 2004;
Azeredo-Coutinho 2007; Rey 2008).
3-
Leishmaniose muco-cutânea (LMC): causada pelo subgênero Viannia, sendo as
principais espécies representadas por L. (V.) braziliensis e L. (V.) guyanensis.
Caracterizada, no início, por úlceras na pele que, entretanto, cicatrizam para
depois reaparecerem, principalmente, nas mucosas do nariz e da boca,
geralmente esta forma é acompanhada por infecções secundárias. Provoca a
destruição das cartilagens e mucosas oro-nasal e faríngea se apresentando de
forma mutilante (Desjeux 2004; Rey 2008).
Segundo o Ministério da Saúde em 2007, no Brasil, as espécies de Leishmania
responsáveis pela transmissão da leishmaniose tegumentar americana são: L. (V.)
braziliensis, L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi, L. (V.) shawi, L. (V.) guyanensis, L. (L.)
amazonensis, L. (V.) lindenberg (Figura 2).
A leishmaniose visceral (LV) possui a L. donovani como a principal espécie
causadora desta doença na Índia e Leste da África. A L. (L.) infantum chagasi é
responsável pelos casos de LV na região mediterrânica e L. chagasi nas Américas. Esta
é forma mais grave da leishmaniose, sendo freqüentemente fatal na ausência de
6
tratamento. Os sintomas começam após um período longo de incubação (1-3 meses). O
conjunto da doença é geralmente insidioso, caracterizada por febre irregular,
acompanhada de sudorese, fraqueza e perda de peso gradual e perceptível. Em casos
avançados podem desenvolver esplenomegalia, hepatomegalia, linfoadenopatia e
anemia. Edema e ascite podem desenvolver-se e, em casos não tratados, as mortes são
comuns devido a doenças causadas por infecções bacterianas secundárias, como
pneumonia, tuberculose ou disenteria (Balaña-Fouce 1998; Desjeux 2004).
No Brasil, a L. chagasi é a espécie mais comumente implicada em casos de
leishmaniose visceral. A L. amazonensis é amplamente reconhecida como agente
causador da leishmaniose cutânea na América Latina, mas também pode promover a
leishmaniose visceral atípica com hepatite e linfadenopatia
em indivíduos
imunocomprometidos (Aleixo et al. 2006).
Figura 2: Distribuição de espécies de Leishmania responsáveis pela transmissão da
leishmaniose tegumentar americana, Brasil – 2005 (Ministério da Saúde 2007).
7
1.5-
Coinfecção Leishmania/HIV
Com o advento da Síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), a
ocorrência de leishmaniose visceral em indivíduos infectados com o vírus da
imunodeficiência humana (HIV) aumentou em alguns países africanos, da região do
Mediterrâneo e no Brasil (Matos et al. 1998, Rabello et al. 2003, Ngure et al. 2009). No
Brasil, as espécies identificadas nesses casos foram L.(V.) braziliensis e L.
(V.)guyanensis (Ministério da Saúde 2011).
Após relacionamento dos bancos de dados das leishmanioses e da AIDS no
Brasil em 2006, foi possível identificar 176 casos com coinfecção LV/AIDS e 150 casos
com coinfecção LT/aids, o que representa 1,1% dos casos de LV e 0,1% dos casos de
LT (Ministério da Saúde 2011).
Nessa correlação é possível observar alto risco de desenvolvimento de
leishmaniose visceral, de forma rápida e grave. A coinfecção AIDS/leishmaniose se
inclui num ciclo vicioso de reforço mútuo no qual as enfermidades produzem uma
diminuição sinérgica da resposta imunitária ao destruírem as mesmas células (GarciaAlmagro 2005).
Na associação entre leishmaniose tegumentar e infecção pelo HIV, as lesões
podem ser encontradas em áreas expostas ou não expostas do indivíduo, tal como a
região genital. Também surgem múltiplas lesões cutâneas com maior envolvimento das
mucosas caracterizando o quadro clínico na maioria dos casos (Matos et al. 1998;
Ministério da Saúde 2011).
Nestes casos observam-se manifestações clínicas atípicas da leishmaniose como
consequência da imunodeficiência, variando de casos anérgicos a grande profundidade
das lesões ulcerativas, padrão esporotricóide e envolvimento cutâneo-mucoso, assim
como uma resposta pobre a terapia padrão (Rosatelli et al. 1998; Padovese et al. 2009).
Em pacientes com LV e HIV observa-se maior frequência de recidivas. As
características clínicas incluem a tríade clássica da LV (hepato-esplenomegalia, febre e
pancitopenia) podendo ainda ocorrer manifestações pouco usuais como o encontro de
Leishmania spp em pele íntegra e sobrepondo lesão de sarcoma de Kaposi ou em lesões
de Herpes simplex e Herpes zoster. Pode ainda haver acometimento do trato
gastrointestinal e do trato respiratório para ambas as coinfecções, LV/aids e LT/aids.
(Ministério da Saúde 2011).
8
O uso de agulhas hipodérmicas em usuários de drogas permite a transmissão
direta pessoa a pessoa, constituindo um novo padrão de transmissão da leishmaniose em
um ciclo não convencional em pacientes coinfectados (Garcia-Almagro 2005).
O diagnóstico da coinfecção apresenta dificuldades específicas devido a falsa
negatividade sorológica em pacientes coinfectados com outras doenças como
toxoplasmose e tuberculose e dificuldade em diagnóstico parasitológico (GarciaAlmagro 2005).
O tratamento apresenta as mesmas dificuldades, por redução na eficácia dos
medicamentos, recidivas por resistência ao tratamento e acúmulo de efeitos secundários
(Garcia-Almagro 2005). Daí a grande importância na busca de fármacos com alvos
específicos contra o parasito e com baixa toxicidade para o hospedeiro.
1.6-
Metabolismo de Leishmania spp
Leishmania sp, assim como todos os organismos pertencentes a família
Trypanosomatidae são caracterizados por alta flexibilidade de seu metabolismo
energético. Eles possuem mitocôndria em todas as fases de desenvolvimento e a geração
global de ATP varia significantemente de uma fase de ciclo de vida para outra
(Opperdoes & Coombs 2007).
Estudos em formas promastigotas demonstraram que os aminoácidos e a glicose
podem ser utilizados como fontes de energia. A geração de energia ocorre em níveis
glicossomal, citoplasmático e mitocondrial e o processo de glicólise ocorre inicialmente
no interior dos glicossomos e visa a geração de acetil-CoA, seguida do metabolismo
mitocondrial, o que inclui uma cadeia transportadora de elétrons ativa (Opperdoes &
Coombs 2007).
Durante seu ciclo de vida, os parasitos adaptam seu metabolismo energético de
acordo com o hospedeiro visando à disponibilização de substratos (Cazzulo et al. 1985).
Amastigotas e promastigotas respondem de maneiras diferentes em termos metabólicos
como por exemplo a variação na disponibilidade de oxigênio (O2) e dióxido de carbono
(CO2) e devido a diferenças de ambientes que residem já que a amastigota reside em um
ambiente ácido e as promastigotas em um ambiente mais próximo do neutro
(Burchmore & Barrett 2001; Opperdoes & Coombs 2007).
Na ausência de glicose o crescimento de todos os estágios de Leishmania é
severamente restringido, quando então fontes alternativas de carbono são utilizadas,
como por exemplo lipídeos e proteínas (Saunders et al. 2010).
9
A glicose é metabolizada por parasitos do gênero Leishmania e outros
tripanossomatídeos por meio da via glicolítica e a via da pentose fosfato (Tielens & Van
Hellemond 1998; Maugeri 2003).
Foi demonstrado que L. mexicana possui todas as enzimas da via glicolítica e do
ciclo do ácido tricarboxílico. A maioria dos produtos é parcialmente oxidada, como o
acetato, piruvato e succinato que também são encontrados em análise de produtos de
secreção/excreção do metabolismo da glicose. O piruvato é metabolizado na
mitocôndria, a este processo deu-se o nome de “fermentação aeróbia” (Martin et al.
1976; Cazzulo 1992; Tielens & van Hellemond 1998; Louassini et al. 1999).
Desta maneira, em Leishmania spp, é possível detectar a secreção/excreção
(S/E) de succinato, acetato e pequenas quantidades de piruvato e D-lactato. O CO2
produzido é resultante de vias que produzem acetato e succinato. Alanina, amônia e
uréia também são liberadas (Opperdoes & Coombs 2007; Creek et al. 2012).
a) Via glicolítica
Nos estudos com Trypanosomatidae, a glicólise ocorre por meio da via EmbdenMeyerhoff dos quais as primeiras etapas ocorrem no interior de uma organela: o
glicossomo. A ordem Kinetoplastida, a que a família Trypanosomatidae pertence,
possui organismos em que se encontram esse tipo de compartimentalização (Opperdoes
& Coombs 2007).
As enzimas presentes no glicossomo são: hexoquinase que é a primeira enzima
da via glicolítica ATP-dependente e responsável pela fosforilação dos açúcares
internalizados no glicosssomo, fosfofrutoquinase, frutose-1,6-bifosfatase, gliceraldeido3-fosfato desidrogenase que possui dois tipos de isoenzimas, uma no citosol e uma no
glicossomo que está diretamente envolvida na glicólise, entretanto a função das
isoenzimas citosólicas ainda não está clara. Encontra-se ainda a glicerol-3-fosfato
desidrogenase que é uma enzima NAD-dependente, gliceroquinase, fosfoglicerato
quinase que têm descritas duas isoenzimas para as espécies de Leishmania (Galbraith
1991; Urbina 1994; Verlinde 2001; Opperdoes & Michels 2001).
A Leishmania constitutivamente expressa um número de transportadores de
açúcares
que
medeiam
a
incorporação
de
hexoses
comuns
(glicose,
galactose, manose), açúcares aminados (glucosamina, N-acetilglucosamina) e pentoses
(ribose,
xilose).
estes
transportadores
movem substratos por gradiente de concentração ao invés de usar o transporte ativo
10
Após internalizados, os açúcares são subsequentemente transportados para o interior dos
glicossomos. Em alguns organismos pertencentes à família Trypanosomatidae,
incluindo a Leishmania, pode ocorrer importação do fosfoenolpiruvato (PEP) para
dentro dos glicossomos e sua fermentação para succinato, ou ainda descarboxilação para
piruvato. Como resultado, o succinato é o produto final secretado em maior quantidade
na presença de glicose (Figura 3) (Galbraith 1991; Cazzulo 1992; Lehninger 2006;
Rodriguez-Contreras et al. 2007; Landfear 2008; Saunders et al. 2010).
A enzima glicossomal gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (gGAPDH) exerce
grande controle sobre fluxo glicolítico e tem mostrado ser um bom alvo para o
planejamento de fármacos contra tripanossomatídeos (Cazzulo 1992; Verlinde 2001).
O produto final da glicólise, piruvato, pode também ser secretado depois da
transaminação para alanina ou ser importado para a mitocôndria e ser convertido em
acetil-CoA, participando assim do ciclo do ácido tricarboxílico (Saunders et al. 2010).
b) Ciclo do ácido tricarboxílico
As formas promastigotas e amastigotas de Leishmania expressam todas as
enzimas envolvidas no ciclo do ácido tricarboxílico (ATC) sugerindo que a acetil-CoA
pode ser completamente oxidado na mitocôndria. Entretanto, estudos em estágios
procíclicos de Trypanosoma brucei têm demonstrado que as enzimas do ATC são
primeiramente envolvidas em vias não cíclicas, como na redução do malato a succinato,
com inversão do parcial do ATC, formação do citrato para usar na biossíntese de ácidos
graxos e no catabolismo de aminoácidos (Saunders et al. 2010).
As promastigotas de Leishmania possuem um metabolismo energético no qual
pequena parte do carboidrato é oxidado completamente em CO2, via ciclo do ácido
tricarboxílico, mas grande parte é oxidado em produtos como acetato e succinato. Uma
parte do piruvato é transaminado em alanina que é excretada (Cazzulo 1992; Blum
1993).
No parasito, a NADH fumarato-redutase age sobre o fumarato gerando
succinato, revertendo dessa forma o ciclo do ácido tricarboxílico (Urbina 1994; Turrens
2004). Nas formas promastigotas de Leishmania spp, o succinato é um dos principais
produtos gerado pelo ciclo do ácido tricarboxílico (Tielens & Van Hellemond 1998).
A maioria dos tripanossomatídeos produz lactato a partir da glicose embora
muitas vezes como menor produto final. As formas promastigotas de L. (V.)braziliensis
realizam uma via de desintoxicação celular baseado no sistema glioxalase para proteger
11
a célula dos danos do metilglioxal, um composto citotóxico e mutagênico formado
principalmente como um subproduto da glicólise. Esse sistema é composto de duas
enzimas, glioxalase I e glioxalase II, que convertem o metilglioxal em D-lactato usando
a tripanotiona como cofator (Bringaud et al 2006, Saunders et al 2010, Wyllie &
Fairlamb 2011).
12
Figura 3: Metabolismo central do carbono em Leishmania spp. Os produtos finais
secretados em maior quantidade (succinato, alanina e acetato) são demonstrados em
lilás (adaptado de Saunders et al. 2010).
c) Catabolismo de ácidos graxos
O catabolismo de ácidos graxos, em diversos organismos tem como objetivo a
geração de acetil-CoA que será, consequentemente, utilizada para a produção de corpos
cetônicos (acetato, acetoacetato e β-hidroxibutirato) ou servir como precursor
biossintético do ciclo do ácido tricarboxílico. Portanto, pode-se dizer que a detecção de
corpos cetônicos está intimamente relacionada ao catabolismo de ácidos graxos
(Lehninger, 2006).
13
Os ácidos graxos não são conhecidos como importantes substratos energéticos
usados no metabolismo de indivíduoas da família Trypanosomatidae. No entanto, a
geração de acetil Co-A pode ser proveniente do catabolismo de ácidos graxos (Tielens
& Hellemond 2009; Tielens et al. 2010).
Testes realizados em formas procíclicas de T. brucei demonstraram que a
treonina é convertida em quantidades equimolares de glicina e de acetato e é
considerada como sendo a principal fonte de acetil-CoA para a biossíntese de ácidos
graxos (Riviere et al. 2009; Bringaud et al. 2010).
Em leishmanias, a geração de acetil-CoA pode ser a partir da β-oxidação de
ácidos graxos ou por biossíntese de ácidos graxos via malonil CoA (Figura 4) (Kidnt et
al. 2010).
Figura 4: Mapa metabólico de Leishmania sp para geração de acetil Co-A a partir dos
ácidos graxos. A: β-oxidação de ácidos graxos; B: biossíntese de ácidos graxos.
metabólito. (Adaptado de Kidnt et al. 2010).
14
d) Cadeia respiratória
A Leishmania possui uma cadeia transportadora de elétrons convencional
compreendendo os complexos enzimáticos I,II, III e IV; citocromo C. Esses complexos
reoxidam o NADH e o succinato (Figura 3) (Saunders et al. 2010).
Nas promastigotas, parte dos produtos finais oxidados são resultados do
metabolismo aeróbio envolvendo uma cadeia transportadora de elétrons. O succinato
produzido durante incubações de promastigotas em condições aeróbias é principalmente
produzido pela via oxidativa envolvendo parte do ciclo do ácido tricarboxílico (de
oxalacetato via citrato até succinato) e oxidação de NADH via cadeia respiratória que é
uma via já bem estudada em vertebrados (Van Hellemond & Tielens 1997).
As formas amastigotas são intracelulares e possuem uma mitocôndria reduzida
denominada pró-mitocôndria. Isto sugere um metabolismo aeróbio ou anaeróbio
facultativo, semelhante nas promastigotas, porém ambos os estágios são dependentes da
atividade do ciclo do ácido tricarboxílico e da cadeia respiratória semelhante aos
mamíferos (Hart & Coombs 1982).
1.7-
Fármacos de escolha para o tratamento das leishmanioses
Os antimoniais pentavalentes, estibogluconato de sódio (Pentostam) e
antimoniato de meglumina (Glucantime®) são os fármacos de primeira linha em casos
de diferentes tipos de leishmanioses (visceral e cutânea). A depleção de níveis de ATP
intracelular pela interferência do fluxo glicolítico e β-oxidação dos ácidos-graxos em
amastigotas é o principal modo de ação dos antimoniais pentavalentes. Estes
medicamentos, embora façam parte do tratamento de escolha, apresentam elevada
toxicidade e dificuldade de administração (Balaña-Fouce 1998; Berman 2003; Blum et
al. 2004).
A miltefosina foi estabelecida como o primeiro fármaco de administração oral
contra a leishmaniose visceral. Outros alquil-fosfolípideos, como edelfosina foram
testados contra a Leishmania mostrando uma atividade antiparasitária in vitro. A
atividade in vitro da perifosina tem sido demonstrada previamente contra diferentes
espécies de Leishmania incluindo L. amazonensis, sendo uma grande possibilidade
dentro dos alquil-fosfolipídeos (Cabrera-Serra et al. 2008).
O tratamento da leishmaniose visceral com fármacos convencionais como os
antimoniais, anfotericina B, pentamidina, alopurinol, dão poucos resultados em
pacientes com HIV, visto que mais de 40% deles apresentam persistência das infecções
15
crônicas, demonstrando a importância da resposta imune durante a quimioterapia
(Balaña-Fouce 1998).
O maior avanço na quimioterapia da leishmaniose é o uso das formulações
lipídicas de anfotericina B. Este antifúngico é considerado como segunda linha no
tratamento devido a seus efeitos secundários negativos. Seu mecanismo de ação é
baseado no peculiar metabolismo de esteróis de Leishmania. Em contraste com o
hospedeiro, a 24-ergosterol é o principal esterol sintetizado presente na membrana deste
protozoário. A anfotericina B liga-se a essas moléculas, criam poros que permitem o
vazamento de íons, ou seja, muda a composição do esterol, altera sua permeabilidade e
mata o parasito. É o fármaco de escolha nos casos de resistência aos antimoniais
(Balaña-Fouce 1998; Gontijo & Carvalho 2003; Ouellette et al. 2004; Murray 2005).
A azitromicina é um macrolídeo e foi desenvolvido no final dos anos 80 e é
utilizada no tratamento de infecções bacterianas também utilizada no tratamento de
protozoários como Leishmania sp, Plasmodium sp e Toxoplasma gondii. É uma boa
opção terapêutica no tratamento das leishmanioses, pois é bem tolerada pelos pacientes,
de baixo custo e simples administração, entretanto sua resposta é mais lenta quando
comparada aos antimoniais pentavalentes. Além de processos patológicos presentes,
como a inflamação, fatores como a diminuição do pH, podem interferir na ação da
azitromicina (Prata et al. 2003).
Também é relatado como agente antiparasitário, a aminosidina (paramomicina)
no qual o mecanismo de ação contra protozoários ainda é desconhecido. É de uso
parenteral, podendo ser administrado em associação com os antimoniais (Croft 1997;
Armijos et al. 2004).
A pentamidina e outras diamidinas aromáticas, não são de uso comum no Brasil,
foram sintetizadas como fármacos hipoglicemiantes quando seu perfil terapêutico antiprotozoários foi descoberto. Possuem alta estabilidade química, fácil administração e
baixa toxicidade (Balaña-Fouce 1998). Entram nas formas promastigotas e amastigotas
de Leishmania pelo qual as diamidinas com alta afinidade são reconhecidas. A
mitocôndria é um alvo importante das pentamidinas e este fármaco está envolvido na
ligação e desintegração do DNA do cinetoplasto (kDNA) (Coelho et al. 2008).
O alopurinol atua inibindo a síntese de purinas do parasito, geralmente é
utilizado em associação com outros fármacos (Balaña-Fouce 1998).
A utilização de fármacos simbióticos, que são aqueles capazes de atuar em mais
de um alvo terapêutico têm se mostrado uma alternativa ao tratamento anti-Leishmania,
16
como por exemplo, antibióticos (azitromicina), vasodilatadores (nimodipina), análogos
curcuminóides e antifúngicos (anfotericina B) (Sinagra et al. 2007; Tempone et al.
2009; Changtam et al. 2010).
1.8-
Zidovudina (AZT)
O tratamento de primeira escolha para indivíduos imunocomprometidos
portadores de HIV é baseado na terapia antiretroviral (HAART). O objetivo da terapia
antiretroviral é o de impedir a progressão da doença e, assim, prolongar e melhorar a
qualidade de vida dos indivíduos. Em termos práticos, isto implica a utilização de
esquemas de terapia tripla combinação de fármacos para reduzir a carga viral no plasma
(Montaner et al. 1999)
Os derivados nucleosídicos são fortes aliados para esse tipo de tratamento. A
zidovudina (3’ azido-2’-3’ – dideoxi-timidina; azidotimidina; AZT) é um análogo da
timidina e pertence à classe de fármacos chamada de análogo-nucleosídeo inibidor da
transcriptase reversa e tem sido utilizada no tratamento de indivíduos HIV-positivos nos
últimos anos (figura 5). Ele passa por reações intracelulares de fosforilação e atua
inibindo a enzima transcriptase reversa do HIV que, por sua vez, é antagônico à DNApolimerase humana (Veal 1995; Lynx 2006).
Figura 5: Estrutura química da zidovudina (3’-azido-2’,3’-deoxitimidina) (Retirado de
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=35370 acessado em: 1502-2013).
17
A zidovudina é estruturalmente relacionada com o nucleosídeo endógeno
timidina do qual difere apenas na substituição do grupo hidroxila na posição 3’ do anel
de ribose por um grupo azido não-reativo (Veal 1995).
Quanto à farmacocinética, o AZT é absorvido passivamente e biotransformado
em compostos ativos trifosforilados. Primeiramente, no interior da célula do hospedeiro,
a zidovudina é fosforilada pela timidina quinase. Em seguida é transformada pela
difosfato timidilato cinase, de modo que níveis elevados de monofosfato e níveis muito
mais baixos de difosfato e trifosfato são encontrados nas células. O fármaco não pode
ser administrado na forma fosforilada, porque a fosforilação evita absorção celular.
Uma vez fosforilado, a zidovudina se torna um substrato para a síntese de DNA (Lipsky
1996).
O trifosfato de zidovudina, que tem uma meia-vida intracelular de eliminação de
3-4 horas. É amplamente distribuída e penetra livremente nos tecidos a partir da
circulação sistêmica. O principal caminho metabólico do AZT é a glicuronidação, cerca
de 60 a 70% do fármaco é inativado por essa via. (Souza & Storpirtis 2004; Graham
2009).
A transcriptase reversa transcreve as cadeias infectantes de RNA dos vírus em
moléculas complementares de DNA que se integram no genoma da célula hospedeira.
Esta usa RNA ou DNA como moldes genéticos. A enzima é codificada pelo RNA viral
e se encontra alojada no interior de cada capsídeo viral, durante a produção de novas
partículas virais (Graham 2009).
A seletividade antiviral da zidovudina se deve à sua maior afinidade pela
transcriptase reversa do HIV do que pelas DNA polimerases humanas (Graham 2009).
Como a zidovudina carece do grupo hidroxil na posição 3’, outro nucleotídeo
não pode ser adicionado a ele, porque a ligação fosfodiéster 3’-5’ na cadeia de DNA
não pode ser formada. Assim, são conhecidos como análogos nucleosídicos
terminadores de cadeia, uma vez que a cadeia de DNA é encerrada com a incorporação
do dideoxinucleotídeo. O término da síntese viral impede a replicação do vírus (Lipsky
1996).
Alguns derivados nucleosídicos têm demonstrado propriedades antiparasitárias.
Por exemplo, a sinefugina, um antibiótico nucleosídeo natural produzido por
Streptomyces griseolus, é estruturalmente relacionado para S-adenosil-L-metionina,
exibe forte atividade antifúngica e antiparasitária tanto in vitro quanto in vivo (Peyron et
al.2005).
18
Outro derivado é a 5’-substituido-2’-deoxiuridina que apresenta boa atividade
anti-leishmania in vitro contra formas promastigotas e amastigotas de L. donovani
(Peyron et al.2005).
O AZT demonstrou ter atividade anti leishmania causando alterações
morfológicas em formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis
(Araújo et al. 2011).
No caso da coinfecção Leishmania-HIV, o início do tratamento antirretroviral
está indicado para a maioria dos pacientes adultos com LV, já que a doença constitui um
agravo sugestivo de imunodeficiência. Neste caso, a terapia antirretroviral deve ser
iniciada após o final do tratamento para a leishmaniose e a estabilização clínica e
hematológica do paciente. No entanto, existe a possibilidade de apresentação de LV
como única manifestação em indivíduos que não apresentam imunodeficiência que
justificaria o início imediato do tratamento antirretroviral. A introdução oportuna do
tratamento antirretroviral dependerá de considerações relativas ao comportamento
clínico da LV, à presença de citopenias que limitam a tolerância aos medicamentos e ao
risco de toxicidade das interações medicamentosas. Na LT, a decisão de introdução do
tratamento antirretroviral deverá considerar a presença de outros sinais de
imunodeficiência. A terapêutica antirretroviral deve ser mantida para os pacientes que já
estão em tratamento e a possibilidade de falha terapêutica deve ser considerada
(Ministério da Saúde 2011).
1.9-
Toxicidade mitocondrial da zidovudina (AZT)
Durante as décadas de uso do AZT como fármaco antirretroviral, foi possível
observar sua atividade em diversos tipos celulares que, consequentemente,
demonstraram diferentes sensibilidades às concentrações terapêuticas desse fármaco,
detectando-se na maioria das vezes toxicidade mitocondrial (Ferraresi et al. 2004).
O AZT promove cardiotoxicidade envolvendo múltiplos mecanismos como:
inibição
da
DNA
polimerase
mitocondrial,
alterações
na
pirimidina
deoxirribonucleotídeo por inibição da timidina quinase, aumento do stress oxidativo por
aumento de superóxidos e disfunção mitocondrial (Kohler & Lewis 2007; Kohler et
al.2009; Koczor & Lewis 2010; Yue Gao et al. 2011).
19
Kline et al. 2009 avaliaram o stress oxidativo promovido pelo AZT em células
hepáticas humanas e verificaram que o mesmo provoca disfunção mitocondrial por
depleção do mtDNA e altera o potencial redox.
Este fármaco também induz dano endotelial, impede o crescimento de epitélio
gengival modificando a diferenciação e proliferação celular (Jiang et al. 2006; Jiang et
al. 2007 e Mitchel et al. 2011)
Lund et al 2007, demonstraram que o AZT interage diretamente com o
complexo I da cadeia transportadora de elétrons e pode causar o aumento de lactato
extracelular e superóxido mitocontrial em células hepáticas in vitro. Portanto, a
atividade mitocondrial deste fármaco está comprovada ocasionando lesão por diversos
mecanismos, capazes de levar a morte celular.
20
2 JUSTIFICATIVA
A leishmaniose é uma doença que tem aspectos clínicos agravantes e afeta
muitas pessoas em todo mundo, sendo considerada uma doença negligenciada. Por isso,
é de grande importância o estudo de todas as características do parasitismo causado
pelas espécies do gênero Lesihmania.
Os casos de coinfecção Leishmania-HIV em países da Europa e África estão
cada vez mais frequentes. No Brasil, a concomitância das duas doenças é crescente e
nesse país é importante ressaltar que a terapia antiretroviral é disponível para
distribuição ao público por meio do Sistema Único de Saúde (SUS) desde 1991
(Desjeux 2004; Ngure et al. 2009; Rabello et al. 2003).
Foi demonstrado em trabalhos com outras formas celulares que a zidovudina
promove diversas alterações nas mitocôndrias de vários tipos celulares, pois eles têm
diferentes sensibilidades às concentrações terapêuticas dos fármacos antirretrovirais
(Ferrarezi et al. 2004).
O AZT pode promover, por exemplo, cardiotoxicidade, danos em células
endoteliais, disfunção mitocondrial em células hepáticas, envolvendo múltiplos
mecanismos como: inibição da DNA polimerase-γ-mitocondrial, alterações na
pirimidina deoxiribonucleotídeo por inibição da timidina quinase, aumento do stress
oxidativo e disfunção mitocondrial (Jiang et al. 2006; Jiang et al.2007; Kline et al. 2009;
Liya Wang et al. 2011; Yue Gao et al.2011).
Alguns derivados nucleosídicos têm demonstrado propriedades anti-Leishmania
como, por exemplo, contra formas promastigotas e amastigotas de L. donovani (Peyron
et al. 2005). Além disso, foi demonstrado que o AZT promove alterações morfológicas
em promastigotas de Leishmania Leishmania amazonensis, principlamente na fase de
intensa atividade mitocondrial do parasito (Araújo et al. 2011). Não se sabe, entretanto,
seu efeito sobre o metabolismo energético e respiratório destes parasitos.
Devido a esse novo perfil epidemiológico das leishmanioses, devemos
compreender as suas características, analisando a influência da terapia antiretroviral
(HAART) nas formas parasitárias. Com isso, é proposto neste trabalho avaliar o efeito
do AZT, um dos principais fármacos usados nas HAART, no metabolismo de formas
promastigotas da espécie de maior prevalência no Brasil, Leishmania Viannia
braziliensis.
21
3
3.1.
OBJETIVOS
Objetivo geral
Avaliar o efeito in vitro das diferentes concentrações de zidovudina (AZT) no
metabolismo energético, respiratório e oxidação de ácidos graxos de formas
promastigotas de L. (V.) braziliensis.
3.2.

Objetivos específicos
Avaliar o efeito in vitro das diferentes concentrações de zidovudina
(AZT) nas taxas de crescimento de formas promastigotas de L. (V.) braziliensis.

Avaliar o efeito in vitro das diferentes concentrações de zidovudina
(AZT) no metabolismo da glicose de formas promastigotas de L. (V.) braziliensis.

Avaliar o efeito in vitro das diferentes concentrações de zidovudina
(AZT) no ciclo do ácido tricarboxílico de formas promastigotas de L. (V.)
braziliensis

Avaliar a oxidação de ácidos graxos realizada por formas promastigotas
de L. (V.) braziliensis in vitro submetidas a diferentes concentrações de
zidovudina (AZT).
22
4. MÉTODOS
4.1- Cultivo de formas promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis
As formas promastigotas de L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/1975/M2903)
foram cedidas pelo Leishbank do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás.
O cultivo destes parasitos foi realizado em meio
liquido Grace (Grace’s Insect Medium – Gibco®) acrescido de 20% de soro fetal
bovino estéril e inativado, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL
de estreptomicina (Sigma Chemical Co.) mantidos em placas de poliestireno de 24
poços em estufa de 26ºC. Dessa forma, estas amostras serviram para avaliar as formas
promastigotas sob tensão normal de O2.
4.2- Atividade anti-Leishmania
As formas promastigotas L. (V.) braziliensis foram submetidas às concentrações
de 1; 10; 20; 30; 40 e 50 μM de AZT que foram previamente diluídos em
dimetilsulfóxido (DMSO). O ensaio foi realizado em placas de 24 poços no qual em
cada poço continha leishmanias na concentração de 2 X 105 Leishmania/mL e as
concentração de AZT a serem testadas bem como um grupo controle contendo somente
os parasitos e outro grupo contendo leishmanias e DMSO, nas concentrações utilizadas
para diluição do fármaco.
As placas foram mantidas nas condições descritas anteriormente e realizada a
contagem de leishmanias presentes em cada poço diariamente, separando amostras no 3º
dia (fase logarítmica) e 6ºdia (fase estacionária) para realização de testes bioquímicos.
Para a contagem, as amostras foram diluídas em formaldeído tamponado a 0,2%
(diluição 1:10) e então realizada a contagem em câmara de Newbauer. A curva foi
realizada em oito vezes e o crescimento das formas promastigotas foi acompanhado
diariamente durante 7 dias consecutivos. As amostras do 3º e 6º dias de crescimento
foram coletadas para análise espectrofotométrica e análise cromatográfica.
23
4.3- Análise espectrofotométrica
As amostras coletadas nas fases logarítmica e estacionária de crescimento de
formas promastigotas de L. (V.) braziliensis foram analisadas por meio de métodos de
espectrofotometria enzimática e colorimétrica no aparelho Architect plus C8000
Abbott® para as dosagens de: glicose pela metodologia da hexoquinase (340-380 nm);
uréia pelo ensaio cinético de uréia nitrogenada (340 nm).
4.4- Análise cromatográfica da concentração de ácidos orgânicos
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) foi realizada para avaliar a
concentração dos ácidos orgânicos excretados ou secretados ou consumidos no cultivo
das formas promastigotas de Leishmania (V.) braziliensis.As amostras do meio de
cultura foram coletadas no 3º e 6º dia da curva de crescimento, com pipetas automáticas
no volume de 1 mL, foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -8ºC.
Posteriormente, submetidas a cromatografia líquida (HPLC – Varian ProStar) com uma
coluna de exclusão BIORAD-Aminex ion exclusion HPX – 87H (300 X 7,8 mm). A
coluna de separação é protegida por uma coluna de proteção BIORAD Aminex HPX –
85. O eluente utilizado na fase móvel foi o ácido sulfúrico (5 mMol/L) à temperatura de
30ºC, com vazão de 0,6 mL/min, acoplado a um detector UV/visível em comprimento
de onda de 210nm. Cada amostra injetada corresponde a um volume de 50µL (Bezerra
et al. 1999, Vinaud et al. 2007). O tempo de retenção dos ácidos orgânicos e as áreas
dos picos das substâncias detectadas foram calculadas por um programa
computadorizado acoplado ao cromatógrafo: Star Chromatography Workstation 5.0
Varian, fornecendo sua concentração nas amostras. Os ácidos orgânicos foram
identificados de acordo com o tempo de retenção e com calibração previamente
realizada no CLAE para piruvato e lactato, indicadores da glicólise, citrato, αcetoglutarato, succinato, fumarato, malato e oxaloacetato, substâncias do ciclo do ácido
tricarboxílico; β-hidroxibutirato, acetoacetato, acetato e propionato, relacionados ao
catabolismo de ácidos graxos (Bezerra et al. 1999; Vinaud et al. 2007).
24
4.5- Análise estatística
Foi realizada por meio do programa Sigma Stat 3.2. Todas as variáveis foram
testadas quanto à distribuição normal e variância homogênea. Quando a distribuição foi
considerada normal e com variância homogênea foram utilizados testes paramétricos.
Em casos em que a distribuição não foi normal ou que a variância não foi homogênea
foram utilizados testes não paramétricos. As proporções e as correlações também foram
avaliadas. As diferenças observadas foram consideradas significantes quando p<0,05.
25
5.MANUSCRITOS
Manuscrito
1–
EFEITO
DA
ZIDOVUDINA
(AZT)
NAS
TAXAS
DE
CRESCIMENTO DE FORMAS PROMASTIGOTAS DE Leishmania (Viannia)
braziliensis.
Manuscrito 2 – EFEITO DA ZIDOVUDINA (AZT) NAS VIAS METABÓLICAS DE
FORMAS PROMASTIGOTAS DE Leishmania (Viannia) braziliensis.
26
Manuscrito 1
EFEITO DA ZIDOVUDINA (AZT) NAS TAXAS DE CRESCIMENTO DE FORMAS
PROMASTIGOTAS DE Leishmania (Viannia) braziliensis
Resumo
Nas últimas décadas é crescente o número de casos de coinfecção
Leishmania/HIV em vários países incluindo o Brasil. O tratamento de primeira escolha
para indivíduos imunocomprometidos portadores de HIV é baseado na terapia
antirretroviral (HAART). O AZT é um derivado nucleosídico importante no tratamento
desses indivíduos. Este trabalho teve por objetivo avaliar a ação do AZT em formas
promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis, espécie mais prevalente no Brasil.
Após exposição das formas promastigotas in vitro à diferentes concentrações de AZT,
foi possível verificar que o fármaco atua principalmente na fase logarítmica de
crescimento do parasito. Tal fase de crescimento é conhecida por ser uma fase de
intensa atividade mitocondrial, sendo a mitocôndria o provável alvo deste fármaco em
relação às formas promastigotas.
Palavras-chave: Leishmania (V.) braziliensis, zidovudina, inibição do crescimento
Abstract
In the last decades it is crescent the number of Leishmania/HIV co-infection in
several countries throughout the world including Brazil. The first choice treatment for
the immunocompromised patients carriers of HIV is based upon a antiretroviral therapy
(HAART). AZT is one of the most important nucleosidic derivative used in this
treatment. This study aimed the evaluation of the effect of AZT on promastigotes forms
Leishmania (Viannia) braziliensis the most prevalent species in Brazil. After the in vitro
exposure of the promastigotes to the different concentrations of AZT it was possible to
observe the decrease in the growth rate of the parasites, especially on the logarithmic.
This phase of growth is known to have an intense mitochondrial activity which explains
the observed effect of the drug on the parasites as the mitochondria is its target of
action.
Key words: Leishmania Viannia braziliensis, zidovudine, inhibition of growth
27
Introdução
Com o aumento do número de casos de AIDS no mundo e a crescente
urbanização das leishmanioses nas últimas décadas, observou-se o surgimento de um
novo perfil epidemiológico, a coinfecção Leishmania/HIV, a maioria dos casos ocorre
em alguns países africanos, na região do Mediterrâneo e no Brasil (Matos et al. 1998,
Rabello et al. 2003, Ngure et al. 2009).
Na coinfecção Leishmania/HIV, independente da espécie de Leishmania em
questão, é possível observar alto risco de desenvolvimento de leishmaniose visceral de
forma rápida e grave. Nessa correlação as enfermidades produzem uma diminuição
sinérgica da resposta imunitária (Garcia-Almagro 2005). Wolday et al. (1998) relataram
que a presença do HIV em cultura com L. donovani induziu um aumento da quantidade
de parasitos, indicando que a interação dos dois microorganismos pode intensificar os
quadros provocados por ambos.
Na associação entre leishmaniose tegumentar e infecção pelo HIV, nos pacientes
coinfectados com imunossupressão severa, as lesões podem ser encontradas não só em
áreas expostas, mas também em áreas não expostas, tal como a região genital. Também
surgem múltiplas lesões cutâneas com maior envolvimento das mucosas caracterizando
o quadro clínico na maioria dos casos (Matos et al. 1998, Ministério da Saúde 2011).
Manifestações atípicas variando de casos anérgicos paradoxais, profundidade das lesões
ulcerativas, padrão esporotricóide e envolvimento cutâneo-mucoso, assim como uma
resposta pobre a terapia padrão é observado como consequência da imunodeficiência
em vários casos (Rosatelli et al. 1998; Padovese et al. 2009).
O tratamento de primeira escolha para indivíduos imunocomprometidos
portadores de HIV é baseado na terapia antiretroviral (HAART). O objetivo da HAART
é o de impedir a progressão da doença e, assim, prolongar e melhorar a qualidade de
vida dos indivíduos. Em termos práticos, isto implica a utilização de esquemas de
terapia tripla combinação de fármacos para reduzir a carga viral no plasma (Montaner
et al. 1999)
Os derivados nucleosídicos são fortes aliados para esse tipo de tratamento. A
zidovudina (3’ azido-2’-3’ – dideoxi-timidina; azidotimidina; AZT) é um análogo da
timidina e pertence à classe de fármacos chamada de análogo-nucleosídeo inibidor da
transcriptase reversa e tem sido utilizada no tratamento de indivíduos HIV-positivos nos
últimos anos. (Veal 1995; Lynx 2006).
28
Para compreender melhor a ação de um derivado nucleosídico em parasitos, foi
proposto neste trabalho avaliar o efeito do AZT nas taxas de crescimento de formas
promastigotas na espécie de maior prevalência no Brasil: L. (V.)braziliensis.
Material e métodos
Cultivo de formas promastigotas
As formas promastigotas de L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/1975/M2903)
foram cedidas pelo Leishbank do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás. O cultivo destes parasitos foi realizado em meio liquido
Grace (Grace’s Insect Medium – Gibco®) acrescido de 20% de soro fetal bovino estéril
e inativado, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de
estreptomicina (Sigma Chemical Co.) mantidos em placas de poliestireno de 24 poços
em estufa de 26ºC. Dessa forma, estas amostras serviram para avaliar as formas
promastigotas sob tensão normal de O2.
Atividade anti-Leishmania
As formas promastigotas de L. (V.) braziliensis foram submetidas às
concentrações de 1; 10; 20; 30; 40 e 50 μM de AZT que foram previamente diluídos em
dimetilsulfóxido (DMSO). O ensaio foi realizado em placas de 24 poços no qual em
cada poço continha leishmanias na concentração de 2 X 105 Leishmania/mL e as
concentração de AZT a serem testadas bem como um grupo controle contendo somente
os parasitos e outro grupo contendo leishmanias e DMSO, nas concentrações utilizadas
para diluição do fármaco.
As placas foram mantidas nas condições descritas anteriormente e realizada a
contagem de leishmanias presentes em cada poço diariamente. Para a contagem, as
amostras foram diluídas em formaldeído tamponado a 0,2% (diluição 1:10) e então
realizada a contagem em câmara de Newbauer. A curva foi realizada em cinco
repetições e o crescimento das formas promastigotas foi acompanhado diariamente
durante 7 dias consecutivos.
Análise estatística
Foi realizada por meio do programa Sigma Stat 3.2. Todas as variáveis foram
testadas quanto à distribuição normal e variância homogênea. Quando a distribuição foi
29
considerada normal e com variância homogênea foram utilizados testes paramétricos.
Em casos em que a distribuição não foi normal ou que a variância não foi homogênea
foram utilizados testes não paramétricos. As proporções e as correlações também foram
avaliadas. As diferenças observadas foram consideradas significantes quando p<0,05.
Resultados
Foram estabelecidos dois grupos controle, o primeiro somente com formas
promastigotas em meio de cultura e o segundo com esses parasitos acrescidos de DMSO
na maior concentração de diluição dos fármacos em meio de cultura. O DMSO utilizado
para a diluição das concentrações de AZT não teve influência no crescimento das
formas promastigotas.
Não se observou diferença no crescimento das formas promastigotas entre os
grupos controles, ou seja, não expostos ao fármaco. Quando se comparou o grupo
controle das curvas de crescimento de formas promastigotas de L. (V.) braziliensis com
os testes sob ação das diferentes concentrações de zidovudina foi possível observar que
houve diferença nas taxas de crescimento dos seguintes grupos teste: dia 1 AZT 40 µM
e 50 µM; dia 2 AZT 10 µM e 40 µM; dia 3 AZT 30 µM e 50 µM; dia 4 AZT 30 µM e
40 µM; dias 5,6 e 7 AZT 40 µM e 50 µM (Figura 1 e 2).
30
100000000
10000000
Controle
Leishmanias
AZT 1 µM
AZT 10 µM
AZT 20 µM
1000000
AZT 30 µM
AZT 40 µM
AZT 50 µM
100000
Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7
Figura 1: Crescimento in vitro de formas promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis submetidas a diferentes concentrações de AZT(µM).
Figura 2: Crescimento in vitro de promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis
submetidas a 10µM e 30 µM de AZT.
* diferença estatística (p<0,05; ANOVA)
31
Discussão
Foi demonstrado por Araújo et al. (2011), que a DL50 de zidovudina para
células humanas é de 30 µM , isso pode ser claramente observado nas curvas teste
realizadas em formas promastigotas de L. (V.) braziliensis em nosso estudo.
A curva de crescimento de promastigotas é marcada pela fase proliferativa ou
logarítmica e fase estacionária. Na fase proliferativa há um crescimento exponencial da
quantidade de parasitos e intensa atividade metabólica. Foi possível observar que há
uma redução da taxa de crescimento de formas promastigotas na fase logarítmica
(Figuras 1 e 2).
Alguns trabalhos indicam que o AZT induz significantemente possíveis
alterações na membrana mitocondrial isoladas, atuando na biogênese do DNA
mitocondrial (mtDNA) causando alterações morfológicas e depleção do mt DNA em
tratamentos a longo prazo ou em testes in vitro e também na translocação do ATP
mitocondrial (Cazzalini 2001; Dias 2005).
O AZT pode causar insuficiência no metabolismo do mtDNA levando a uma
redução dele a nível celular e citotoxidade. Alguns análogos nucleosídicos (similares ao
AZT) são capazes de reduzir o mtDNA através da inibição da síntese DNA polimerase
δ mitocondrial e da replicação do mtDNA. Embora estes análogos nucleosidicos tenham
propriedades in vitro em células de mamíferos esgotando mtDNA levando à perda,
retardamento do crescimento e viabilidade celular, o exato papel da mitocôndria no
mecanismo de ação dessas fármacos deve ser esclarecido. Além de prejudicar a função
da mtDNA polimerase δ, o AZT também é conhecido por inibir a telomerase, o
translocador das atividades ADP / ATP mitocondrial e enzimas da fosforilação
oxidativa (Dias 2005). Esta atividade do fármaco no funcionamento mitocondrial pode
explicar a baixa sobrevivência de promastigotas em fase logarítmica expostas ao AZT.
Em testes realizados com promastigotas, na fase proliferativa de L. (L.)
amazonensis submetidas a diferentes concentrações de AZT, foram descritas alterações
morfológicas como por exemplo, formação de vacúolos na região citoplasmática
(Araújo et al. 2011).
Com este trabalho concluimos que devido ao processo de intensa multiplicação
das formas promastigotas de L.(V.)braziliensis no terceiro dia de cultivo e à sua grande
atividade celular decorrente desse processo o fármaco se mostrou mais ativo nesta fase.
32
Referências Bibliográficas
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donovani in monocyte-derived cells. Scand J Infect Dis 30(1):29-34.
34
Manuscrito 2
EFEITO DA ZIDOVUDINA (AZT) NAS VIAS METABÓLICAS DE FORMAS
PROMASTIGOTAS DE Leishmania Viannia braziliensis
Resumo
A situação das leishmanioses têm se agravado cada vez mais, pois, têm crescido o
número de casos de coinfecção Leishmania-HIV, não havendo um perfil
clínico
característico desta coinfecção. A Leishmania (Viannia) braziliensis é a espécie de
maior prevalência no Brasil e este parasito possui alta flexibilidade do seu metabolismo
energético e respiratório. Devido à ampla utilização de derivados nucleosídicos, como a
zidovudina (AZT), nas terapias antiretrovirais este estudo teve como objetivo avaliar a
ação desse fármaco no metabolismo de promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis nas duas fases de crescimento (logarítmica e estacionárias). As
promatigotas de L. (V.) brasiliensis (MHOM/BR/1975/M2903) foram cultivadas em
meio líquido de Grace com 1,10, 20, 30, 40, e 50 μM de AZT. Os grupos controle foram
feitos com promastigotas sem o fármaco. As amostras do meio de cultura foram
coletadas no 3º e 6º dia da curva de crescimento e em seguida a Cromatografia Líquida
de Alta Eficiência (CLAE) foi realizada para avaliar a concentração dos seguintes
ácidos orgânicos excretados ou consumidos no cultivo das formas promastigotas:
piruvato, lactato, citrato, α-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato, oxaloacetato, βhidroxibutirato, acetoacetato, acetato e propionato. Foi demonstrada a redução na
secreção/excreção (S/E) de fumarato e aumento da S/E de piruvato em grupos expostos
ao AZT na fase estacionária de crescimento das formas promastigotas. Em seguida foi
realizada a dosagem espectrofotométrica de glicose e uréia nas promastigotas de 3º e 6º
dias de crescimento, submetidas ao AZT. A concentração de glicose aumentou no 6º dia
de crescimento. O fármaco testado demonstrou ter atividade sobre as vias mitocondriais
do parasito. Portanto, observou-se que as promastigotas utilizam como principal fonte
de energia o catabolismo de proteínas e ácidos graxos, vias que não foram alteradas
devido a presença do fármaco.
Palavras chave: Leishmania (Viannia) braziliensis, metabolismo energético, AZT
35
Introdução
Os parasitos pertencentes ao gênero Leishmania, assim como os outros
Trypanosomatidae, são caracterizados por possuírem alta flexibilidade do seu
metabolismo energético, respiratório e por realizarem parte da glicólise nos glicossomos
(Opperdoes & Coombs 2007; Gualdrón-López et al. 2012). Foi demonstrado que L.
mexicana possui todas as enzimas da via glicolítica e do ciclo do ácido tricarboxílico. A
maioria dos produtos é parcialmente oxidada, como o acetato, piruvato e succinato que
são produtos finais do metabolismo da glicose (Martin et al. 1976; Cazzulo 1992;
Tielens e van Hellemond 1998; Louassini et al. 1999; Bringaud et al. 2010).
Formas promastigotas também podem realizar o catabolismo de ácidos graxos,
como via alternativa de geração de energia. A acetil-CoA, importante precursor das
principais vias metabólicas, também pode ser gerada a partir da β-oxidação de ácidos
graxos ou por biossíntese de ácidos graxos via malonil CoA (Kidnt et al. 2010).
A treonina pode ser convertida em quantidades equimolares de glicina e de
acetato e é considerada como sendo a principal fonte de acetil-CoA para a biossíntese de
ácidos graxos em Leishmania spp (Bringaud et al. 2010).
Com o aumento gradativo do número de casos coinfecção Leishmania-HIV nos
últimos anos percebeu-se uma nova situação epidemiológica, não havendo um perfil
clínico característico desta coinfecção, pois a imunodepressão causada pelo HIV facilita
a progressão tanto da forma visceral quanto da tegumentar da leishmaniose (Catorze et
al. 2006; Jawhar 2011; Ministério da Saúde 2011).
O sucesso do programa brasileiro de distribuição gratuita e universal de
medicamentos anti-retrovirais, diminuiu a prevalência das infecções oportunistas mais
comuns entre os HIV-positivos (Rabello et al. 2003).
Alguns derivados nucleosídicos, utilizados na terapia antirretroviral (HAART), têm
demonstrado propriedades anti-Leishmania como, por exemplo, contra formas
promastigotas e amastigotas de Leishmania donovani (Peyron et al. 2005). Segundo
Araújo et al.2011 o AZT tem efeitos em promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis
promovendo alterações morfológicas neste protozoário.
Devido a esse novo perfil epidemiológico das leishmanioses, devemos
compreender melhor as suas características, analisando a influência da terapia
antiretroviral (HAART) nas formas parasitárias. É necessário compreender a
diversidade metabólica dessa população patogênica para maior entendimento da relação
parasito-hospedeiro.
36
Por isso é proposto neste trabalho avaliar a ação do AZT em formas
promastigotas da espécie de maior prevalência no Brasil, L. (V.) braziliensis. Avaliando
o efeito das concentrações de AZT no catabolismo da glicose, ciclo do ácido
tricarboxílico e metabolismo de ácidos graxos das formas promastigotas.
Material e métodos
Cultivo de formas promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis
As formas promastigotas de L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/1975/M2903)
foram cedidas pelo Leishbank do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás.
O cultivo destes parasitos foi realizado em meio
liquido Grace (Grace’s Insect Medium – Gibco®) acrescido de 20% de soro fetal
bovino estéril e inativado, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL
de estreptomicina (Sigma Chemical Co.) mantidos em placas de poliestireno de 24
poços em estufa de 26ºC. Dessa forma, estas amostras serviram para avaliar as formas
promastigotas sob tensão normal de O2.
Atividade anti-Leishmania
As formas promastigotas L. (V.) braziliensis foram submetidas às concentrações
de 1; 10; 20; 30; 40 e 50 μM de AZT que foram previamente diluídos em
dimetilsulfóxido (DMSO). O ensaio foi realizado em placas de 24 poços no qual em
cada poço continha leishmanias na concentração de 2 X 105 Leishmania/mL e as
concentração de AZT a serem testadas bem como um grupo controle contendo somente
os parasitos e outro grupo contendo leishmanias e DMSO, nas concentrações utilizadas
para diluição do fármaco.
As placas foram mantidas nas condições descritas anteriormente e realizada a
contagem de leishmanias presentes em cada poço diariamente, separando amostras no 3º
dia (fase logarítmica) e 6ºdia (fase estacionária) para realização de testes bioquímicos..
As amostras do 3º e 6º dias de crescimento foram coletadas para análise
espectrofotométrica e análise cromatográfica. Os testes foram realizados em oito
repetições.
37
Análise espectrofotométrica
As amostras coletadas nas fases logarítmica e estacionária de crescimento de
formas promastigotas de L. (V.) braziliensis foram analisadas por meio de métodos de
espectrofotometria enzimática e colorimétrica no aparelho Architect plus C8000
Abbott® para as dosagens de: glicose pela metodologia da hexoquinase (340-380 nm);
uréia pelo ensaio cinético de uréia nitrogenada (340 nm).
Análise cromatográfica da concentração de ácidos orgânicos
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) foi realizada para avaliar a
concentração dos ácidos orgânicos excretados ou secretados ou consumidos no cultivo
das formas promastigotas de Leishmania (V.) braziliensis.As amostras do meio de
cultura foram coletadas no 3º e 6º dia da curva de crescimento, com pipetas automáticas
no volume de 1 mL, foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -8ºC.
Posteriormente, submetidas a cromatografia líquida (HPLC – Varian ProStar) com uma
coluna de exclusão BIORAD-Aminex ion exclusion HPX – 87H (300 X 7,8 mm). A
coluna de separação é protegida por uma coluna de proteção BIORAD Aminex HPX –
85. O eluente utilizado na fase móvel foi o ácido sulfúrico (5 mMol/L) à temperatura de
30ºC, com vazão de 0,6 mL/min, acoplado a um detector UV/visível em comprimento
de onda de 210nm. Cada amostra injetada corresponde a um volume de 50µL (Bezerra
et al. 1999, Vinaud et al. 2007). O tempo de retenção dos ácidos orgânicos e as áreas
dos picos das substâncias detectadas foram calculadas por um programa
computadorizado acoplado ao cromatógrafo: Star Chromatography Workstation 5.0
Varian, fornecendo sua concentração nas amostras. Os ácidos orgânicos foram
identificados de acordo com o tempo de retenção e com calibração previamente
realizada no CLAE para piruvato e lactato, indicadores da glicólise, citrato, αcetoglutarato, succinato, fumarato, malato e oxaloacetato, substâncias do ciclo do ácido
tricarboxílico; β-hidroxibutirato, acetoacetato, acetato e propionato, relacionados ao
catabolismo de ácidos graxos (Bezerra et al. 1999, Vinaud et al. 2007).
Análise estatística
Foi realizada por meio do programa Sigma Stat 3.2. Todas as variáveis foram
testadas quanto à distribuição normal e variância homogênea. Quando a distribuição foi
considerada normal e com variância homogênea foram utilizados testes paramétricos.
Em casos em que a distribuição não foi normal ou que a variância não foi homogênea
38
foram utilizados testes não paramétricos. As proporções e as correlações também foram
avaliadas. As diferenças observadas foram consideradas significantes quando p<0,05.
Resultados:
Ao analisar a secreção/excreção (S/E) dos ácidos orgânicos, por CLAE,
observou-se que o controle de DMSO, utilizado para diluir o fármaco, não teve
diferença estatística na S/E dos ácidos comparado com o controle de formas
promastigotas.
Observou-se que o oxalato, α-cetoglutarato, acetato e propionato não foram
detectados em nenhuma das amostras analisadas.
Em relação a S/E de citrato, não houve diferença estatística entre os grupos
controle, somente nas promastigotas expostas a 30µM de AZT de terceiro dia de
crescimento.
A dosagem de oxaloacetato do controle contendo somente o meio Grace’s foi
menor do que a S/E nos controles de formas promastigotas de ambos dias.
O piruvato foi detectado no meio de cultura sem a presença de parasitos
entretato não foi detectado no grupo controle de terceiro dia de crescimento, no sexto
dia de cultivo o piruvato voltou a ser detectado em concentração estatisticamente
superior ao controle de meio Grace ‘s.
No meio Grace’s não foi detectado malato e nos grupos controle houve a S/E
deste ácido orgânico somente no terceiro dia de crescimento.
Os grupos controle de promastigotas tiveram maior concentração de succinato
do que havia no meio de cultura.
O lactato foi detectado no meio de cultura e permaneceu sendo detectado no
grupo controle de promastigotas de terceiro dia sem diferença estatística entre eles e não
foi detectado no controle de sexto dia.
No meio de cultura e nos grupos controle de promastigotas foram detectados
concentrações de β-hidroxibutirato entretanto não houve diferença estatística entre
esses grupos.
O fumarato foi detectado em meio Grace’s em menor concentração que as
secretadas e excretadas pelas formas promastigotas sem exposição ao AZT.
As diferenças estatísticas na S/E dos ácidos orgânicos analisados podem ser
vistas na Tabela 1.
39
Tabela
1:
Concentração
de
ácidos
orgânicos
(nM/105
leishmanias)
secretados/excretados por formas promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis in vitro, submetidas a diferentes concentrações de AZT (µM).
3º dia
Citrato
6º dia
3º dia
Oxaloacetato
6º dia
3º dia
Piruvato
6º dia
3º dia
Controle
AZT
AZT
AZT
AZT
AZT
AZT
promastigotas
1µM
10µM
20µM
30µM
40µM
50µM
0,06
0,10
± 0,05
± 0,05
0,07
0,10
0,05
0,06
0,05
0,05
0,09
± 0,04
± 0,05
± 0,03
± 0,03
± 0,06
3º dia
Succinato
6º dia
3º dia
0,04
0,02
0,02
0,03
± 0,07
± 0,02
± 0,01
± 0,01
± 0,01
± 0,04
± 0,04
0,11
0,14
0,09
0,12
0,40
0,23
0,25
± 0,09
± 0,11
± 0,08
± 0,10
±0,35
± 0,21
± 0,22
b
b
b
0,15
0,27 b
± 0,15
± 0,16
0,10
0,07
± 0,09
± 0,08
N.D.
3º dia
β-hidroxibutirato
6º dia
3º dia
Fumarato
6º dia
0,02
± 0,01
0,04
± 0,04
0,07
± 0,06
a
0,10
0,16
0,15
0,15
0,03
± 0,07
± 0,09
± 0,11
± 0,09
± 0,05
a
± 0,16
0,17
0,15
0,12
0,14
± 0,06
± 0,07
± 0,06
±0,05
± 0,10
± 0,04
a
a,b
15,67 b
7,07
6,46
5,77
±2,35
± 2,4
± 3,14
N.D.
a,b
7,04
±0,13
± 3,30
± 8,54
± 2,28
± 2,27
a
a
a
12,03
6,49
1,35
± 3,26
± 5,57
± 1,19
± 2,20
± 2,09
± 4,14
0,34
0,33
0,44
0,30
0,24
± 0,24
± 0,17
± 0,31
± 0,23
± 0,06
0,48
0,30
0,29
0,28
0,23
± 0,18
± 0,17
± 0,07
0,40
0,73 a
±0,54
±0,17
± 0,3
a
b
a
0,31
± 0,15
± 0,22
a
0,64
0,58
± 0,31
± 0,15
± 0,14
± 0,15
b
b
b
a
±0,06
8,81
0,15
8,46
0,24
0,19
18,59
0,33
0,35
0,24
Lactato
6º dia
a
0,08
Malato
6º dia
a
0,31
± 0,22
0,27
± 0,08
0,40
± 0,24
0,94
a, b
± 0,14
± 0,12
± 0,05
± 0,15
± 0,23
±0,06
0,14
0,18
0,08
0,20
0,16
0,24
0,19
± 0,11
± 0,13
± 0,09
± 0,19
± 0,21
± 0,20
± 0,29
0,06
0,13
0,001 b
± 0,16
± 0,21
0,09
0,16
± 0,04
± 0,04
0,13
0,10
0,03
± 0,11
± 0,09
± 0,04
± 0,04
± 0,06
a
a
a
a
0,06
0,07
± 0,01
± 0,01
± 0,01
± 0,01
± 0,06
a
a
a
a
0,07
0,06
± 0,01
± 0,01
0,07
0,04
0,05
± 0,01
0,08
0,04
± 0,01
0,23
0,07
± 0,01
0,49
0,46 a, b
0,24
b
0,29
13,45
0,25
N.D.
0,15
a, b
4,48
0,12
0,11
± 0,03
± 0,05
a- diferença estatística, em promastigotas de dias diferentes submetidas à
mesma concentração de AZT (p<0,05; ANOVA)
b- diferença estatística, em promastigotas do mesmo dia submetidas às
diferentes concentrações de AZT (p<0,05; ANOVA)
40
Ao realizarmos as dosagens espectrofotométricas de glicose e uréia observamos
os resultados descritos na Tabela 2.
Tabela
2:
Concentração
de
glicose
e
uréia
105
(mg/dL/
leishmanias)
secretados/excretados por promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis in
vitro, submetidas a diferentes concentrações de AZT (µM).
3º dia
Glicose
6º dia
3º dia
Uréia
6º dia
Controle
AZT
AZT
AZT
AZT
AZT
AZT
promastigotas
1µM
10µM
20µM
30µM
40µM
50µM
a
b
1,06
0,99 ±
1,29
1,28
3,08
± 0,82
0,65
± 0,85
± 1,0
± 2,78
3,6
b
3,41
a, b
1,79
2,63
± 1,43
± 1,72
±1,70
± 1,69
± 1,01
b
b
0,07
± 0,01
± 0,01
± 0,02
b
b
b
0,07
± 0,02
0,07
± 0,01
a
2,95
b
0,06
± 0,54
3,23
± 1,79
0,07
1,09
a, b
0,06
± 0,01
0,09
a, b
± 0,03
0,05
a, b
± 0,01
0,24
a, b
± 0,11
0,07
a
± 0,01
0,09
a,
± 0,01
0,13
a, b
± 0,01
1,23
± 0,30
1b
± 0,21
0,13 a, b
± 0,01
0,11 a, b
± 0,01
a- diferença estatística, em promastigotas de dias diferentes submetidas à
mesma concentração de AZT (p<0,05; ANOVA)
b- diferença estatística, em promastigotas do mesmo dia submetidas às
diferentes concentrações de AZT (p<0,05; ANOVA)
Em relação às dosagens espectrofotométricas de glicose o grupo controle de
meio Grace’s teve menor concentração que o controle de promastigotas no terceiro e no
sexto dia e não foi detectado uréia no meio de cultivo.
Discussão
Apesar do acetato ser considerado um importante produto final da degradação de
glicose em formas amastigotas e promastigotas de várias espécies de Leishmania,
como: L. pifanoi, L. mexicana, L. donovani e L. major (Hart & Coombs 1982; Rainey &
Mackenzie 1991; Van Hellemond & Tielens 1998; Opperdoes & Coombs 2007;
Rosenzweig et al. 2008; Tielens & Hellemond 2009, Tielens et al. 2010) em nosso
trabalho não foi possivel detectar a produção de acetato. Nossos resultados estão de
acordo com os trabalhos de Costa et al.(2011) que também analisou o metabolismo de
formas promastigotas de L. (V.) braziliensis da cepa M2903.
41
O mecanismo de ação do AZT está relacionado ao controle da proliferação
celular, foi demonstrado em trabalhos com outras formas celulares que a zidovudina
promove diversas alterações nas mitocôndrias de vários tipos celulares, pois eles têm
diferentes sensibilidades às concentrações terapêuticas dos fármacos antirretrovirais
(Ferrarezi et al. 2004).
O AZT pode promover, por exemplo, cardiotoxicidade, danos em células
endoteliais, disfunção mitocondrial em células hepáticas, envolvendo múltiplos
mecanismos como: inibição da DNA polimerase-γ-mitocondrial, alterações na
pirimidina deoxiribonucleotídeo por inibição da timidina quinase, aumento do stress
oxidativo e disfunção mitocondrial (Cazzalini et al. 2001; Dias & Bailly 2005; Jiang et
al. 2006 ; Jiang et al. 2007; Kline et al. 2009; Liya Wang et al. 2011; Yue Gao et
al.2011).
Analisando queratinócitos gengivais in vitro expostos ao AZT, Mitchel et
al.2011 verificaram que o fármaco modificou a diferenciação e proliferação dessas
células.
Kohler et al. 2009 estudando cardiomiócitos verificaram que o AZT induz a
redução na respiração mitocondrial, reduz a biogênese
mitocondrial e promove
anomalias na morfologia mitocondrial.
Ferraresi et al. 2004 avaliaram a toxicidade mitocondrial dos HAART por
citometria de fluxo para avaliar o potencial de membrana mitocondrial e verificaram
danos mitocondriais promovidos pelo fármaco.
Em testes realizados com formas promastigotas, na fase proliferativa po de L.
(L.) amazonensis submetidas a diferentes concentrações de AZT, foram descritas
alterações morfológicas como por exemplo, formação de vacúolos na região
citoplasmática, tal fase de crescimento é conhecida por ter alta atividade mitocondrial
(Araújo et al. 2011).
O piruvato, é produzido no citosol a partir do fosfoenolpiruvato (PEP) e entra na
mitocôndria para ser convertido em acetil CoA (Van Hellemond et al.1998; Tielens &
Van hellemond 2009). Em nossos testes, com as formas promastigotas, a S/E de
piruvato não foi detectada no terceiro dia mostrando que este ácido é consumido para
gerar energia na fase logarítmica. As concentrações do AZT podem induzir lesão
mitocondrial fazendo com que o piruvato que estava na mitocôndria fosse excretado,
resultando na detecção deste ácido orgânico nos grupos teste. Em relação ao grupo
42
controle do sexto dia, devido ao aumento de glicose provavelmente ocorreu maior
produção de PEP e, consequentemente, de piruvato, sendo possivel a sua detecção.
Nos grupos controle e testes submetidos às concentrações do AZT observou-se
que formas promastigotas apresentam uma tendência ao maior aproveitamento
energético, o que resulta em maior S/E de succinato.
O succinato, além de metabólito intermediário do ciclo do ATC é o produto final
do glicossomo (Saunders et al.2010) este ácido orgânico e seu precursor fumarato,
foram detectados em todos os grupos teste.
Sabe-se que o succinato pode ser produzido tanto por uma via mitocondrial
quanto por uma glicossomal, da seguinte maneira: o PEP é produzido no citosol onde
fica localizado em um ponto de ramificação da via metabólica, ele pode tanto voltar aos
glicossomo quanto ir para a mitocôndria e em ambos ser convertido a succinato
(Besteiro et al.2002; Bringaud et al.2010).
Portanto, nas formas promastigotas submetidas às concentrações do fármaco a
produção do succinato e fumarato detectados provavelmente é proveniente dos
glicossomos, visto que o AZT atua lesando a mitocôndria.
O fumarato tendeu a ter maior S/E no terceiro dia de crescimento das formas
promastigotas nos grupos testes expostos ao AZT, nas concentrações até de 30µM, tal
concetração foi descrita por Araújo et al. 2011 como sendo a DL 50 do AZT. O
Aumento na S/E de fumarato também pode ter ocorrido devido ao ciclo da uréia, onde
se observa consumo de aminoácidos com produção de fumarato e uréia como produtos
finais (Lehninger 2006). Foi possivel observar resultados semelhantes na S/E de uréia e
fumarato quando as promastigotas foram expostas às diferentes concentrações de AZT.
É importante ressaltar que não foi detectada a presença da uréia no controle do meio de
cultura.
Com a lesão mitocondrial causada pelo fármaco o citrato que estava presente na
mitocôndria foi liberado para o citoplasma sendo possível a sua detecção por CLAE nos
grupos expostos ao AZT. De acordo com os resultados obtidos por Costa et al. (2011)
que detectou citrato em promastigotas de L. (V.) braziliensis.
O oxaloacetato e o malato foram detectados em todas as amostras e estão de
acordo com os achados de Costa et al. (2011), mesmos expostos ao fármaco
continuaram sendo detectados.
Nas promastigotas de Leishmania spp em meios de cultura ricos em glicose, o
lactato pode ser proveniente da dihidroxiacetona fosfato (DHAP) que é um metabólito
43
da glicólise, o DHAP sai do glicossomo e, no citosol, se converte em lactato via
metilglioxal (Saunders et al.2010). Como o lactato está no citosol, não sofreu quaisquer
influência do AZT na fase logarítmica, por isso foi detectado em todas as amostras e os
grupos testes de terceito dia de crescimento das promastigotas tiveram maior S/E que os
grupos de sexto dia. Provavelmente a não detecção de S/E de lactato no grupo controle
de sexto dia ocorreu devido a menor produção de DHAP com desvio da via metabólica
para síntese de piruvato, que é energeticamente mais rentável.
A S/E de oxalato e α-cetoglutarato não foi detectada em nenhuma das amostras
analisadas pela técnica de CLAE. O α-cetoglutarato além de fazer parte do ciclo do
ATC também pode ser produzido a partir do catabolismo protéico (Lehninger 2006).
Provavelmente, estes dois ácidos orgânicos estão sendo utilizados intracelularmente,
não sendo portanto secretados o que justifica a sua ausência em nossas análises.
Os ácidos graxos não são conhecidos como importantes substratos energéticos
do metabolismo de indivíduos pertencentes à família Trypanosomatidae, com exceção
em amastigotas de L. donovani e T. cruzi (Opperdoes &Coombs 2007; Tielens &
Hellemond 2009; Tielens et al. 2010).
Nas formas promastigotas em meio de cultura, a Leishmania utiliza
preferencialmente hexoses (glicose, galactose e manose) para a geração de energia. Ela
expressa numerosos transportadores de hexoses, amino açúcares (glicosamina, Nacetilglicosamina) e pentoses (ribose e xilose). Os açúcares internalizados são
transportados ao glicossomos até a geração de glicose-6-fosfato por meio da via
glicolítica e a fase final é realizada no citosol (Saunders et al.2010). Durante o período
de proliferação parasitária a glicose é metabolizada no glicossomo e o excesso de
hexoses pode ser exportado ao citoplasma e catabolizado em manógenos, esses são
acumulados extracelularmente durante a fase estacionária de crescimento (Costa et
al.2011).
Também foi possível observar que esses parasitos são capazes de utilizar de
outras fontes energéticas como proteínas e lipídios, visto que foi possível detectar seus
produtos finais, como uréia e β-hidroxibutirato.
Em nossos estudos com formas promastigotas de L. (V.) braziliensis não foi
detectado por CLAE a S/E de acetato nos grupos controle e nem nos grupos submetidos
ao AZT. Costa et al.(2011) ao estudar as formas promastigotas in vitro de L. (V.)
braziliensis cepa M2903 verificou que não houve detecção do referido ácido orgânico.
44
O β-hidroxibutirato e o acetoacetato foram detectados em todas as amostras e o
fármaco não influenciou na S/E desses ácidos orgânicos. Em estudos in vitro com
promastigotas de L.(V.) braziliensis da cepa M2903 realizados por Costa et al. 2011 o βhidroxibutirato também foi detectado por CLAE.
O propionato, que pode ser produzido via succinato ou via acetil Co-A, não foi
detectado em nenhum dos grupos testados nem nos grupos controle.
Com base nos ácidos orgânicos analisados, provavelmente, os parasitos não
utilizam glicose como fonte energética, fazendo uso de vias catabólicas de proteínas e
de ácidos graxos que não foram influenciadas pela exposição ao AZT.
Concluimos que o AZT ao promover lesão mitocondrial altera as vias
metabólicas da mitocôndria mas não causa nenhuma influência nos outros mecanismos
de geração de energia como as vias glicossomais, citosólicas ou vias alternativas de
produção de energia de formas promastigotas de L. (V.) braziliensis.
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49
6 DISCUSSÃO
A mitocôndria é uma organela de importância vital para a sobrevivência de
protozoários e nela se encontram muitos alvos terapêuticos (Fidalgo et al. 2011). Os
testes realizados são um indicativo de que o AZT promove alterações na mitocôndria de
formas promastigotas de L. (V.) braziliensis. Primeiramente no estudo da proliferação
parasitária, em seguida analisando as vias metabólicas mitocondriais.
Estudos com outros tipos celulares demonstraram que a exposição à zidovudina
causa alterações nas mitocôndrias (Cazzalini et al. 2001; Dias e Bailly 2005, Jiang et al.
2006; Jiang et al. 2007; Kline et al. 2009; Liya Wang et al. 2011; Yue Gao et al.2011;
Mitchell et al. 2012). Também em ensaios realizados com promastigotas na fase
proliferativa de L. (L.) amazonensis submetidas a diferentes concentrações de AZT
foram descritas alterações morfológicas como por exemplo, formação de vacúolos na
região citoplasmática (Araújo et al. 2011).
Neste estudo foi possível observar uma redução da taxa de crescimento de
promastigotas no segundo dia da curva, na concentração de 10 µM de AZT,
demonstrando ação do fármaco na fase de intensa atividade mitocondrial da célula
parasitária .
Quando o fármaco lesa a mitocôndria, o parasito passa a utilizar de outros
mecanismos para preservar a geração de energia e a secreção/excreção de ácidos
orgânicos que estão em outros locais, além da mitocôndria, permanece bem estabelecida
quando as promastigotas in vitro são expostas às diferentes concentrações de AZT .
Depois de observarmosa atividade do AZT na proliferação de formas
promastigotas, analisamos por CLAE, a S/E de: piruvato, lactato, succinato, fumarato,
malato, oxaloacetato, β-hidroxibutirato, acetoacetato, acetato, propionato e oxalato.
Também foram dosados, por espectrofotometria, as concentrações de glicose e uréia das
formas promastigotas de fase logarítmica e estacionária.
Em nosso estudo, assim como os trabalhos de Costa et al.(2011) que também
analisaram o metabolismo de formas promastigotas de L. (V.) braziliensis da cepa
M2903, não foi possível detectar o acetato por CLAE. O acetato é considerado um
importante produto final da degradação da glicose em amastigotas e promastigotas de de
várias espécies de Leishmania, como: L. pifanoi, L. mexicana, L. donovani e L. major
(Hart & Coombs 1982; Rainey & Mackenzie 1991; Van Hellemond & Tielens 1998;
50
Opperdoes & Coombs 2007; Rosenzweig et al.2008; Tielens & Hellemond 2009,
Tielens et al. 2010).
O piruvato em nossos testes com as formas promastigotas teve a S/E não
detectada no terceiro dia mostrando que ele pode ter sido consumido para gerar energia
nessa fase de intensa multiplicação parasitária, no sexto dia como houve aumento de
glicose no meio de cultura, provelmente ocorreu aumento na produção de
fosfoenolpiruvato (PEP) que é o precursor do piruvato resultando em sua detenção pela
técnica de CLAE (Van Hellemond et al.1998; Tielens & Van hellemond 2009).
O succinato é um metabólito do ciclo do ATC e também um produto final do
glicossomo como descrito por Saunders et al.2010, este ácido orgânico e seu precursor
fumarato, foram detectados em todos os grupos teste e grupos controle. Nas formas
promastigotas submetidas às concentrações do fármaco a produção do succinato e
fumarato detectados provavelmente é proveniente dos glicossomos, visto que o AZT
atua lesando a mitocôndria.
O aumento na S/E de fumarato na fase estacionária, também pode ter ocorrido
devido ao ciclo da uréia, onde se observa consumo de aminoácidos com produção de
fumarato e uréia como produtos finais (Lehninguer 2006). Foi possivel observar
resultados semelhantes na S/E de uréia e fumarato quando as promastigotas foram
expostas às diferentes concentrações de AZT. É importante ressaltar que não foi
detectada a presença da uréia no controle do meio de cultura.
Com a lesão mitocondrial causada pelo fármaco o citrato que estava presente na
mitocôndria foi liberado para o citoplasma sendo possível a sua detecção por CLAE nos
grupos expostos ao AZT. De acordo com os resultados obtidos por Costa et al. (2011)
que detectou citrato em promastigotas de L. (V.) braziliensis.
O oxaloacetato e o malato foram detectados em todas as amostras e estão de
acordo com os achados de Costa et al. (2011), mesmos expostos ao fármaco
continuaram sendo detectados.
Nas promastigotas de Leishmania spp em meios de cultura ricos em glicose, o
lactato pode ser proveniente da dihidroxiacetona fosfato (DHAP) que é um metabólito
da glicólise, o DHAP sai do glicossomo e, no citosol, se converte em lactato via
metilglioxal (Saunders et al.2010). Como o lactato está no citosol, não sofreu quaisquer
influência do AZT na fase logarítmica, por isso foi detectado em todas as amostras e os
grupos testes de terceito dia de crescimento das promastigotas tiveram maior S/E que os
grupos de sexto dia. Provavelmente a não detecção de S/E de lactato no grupo controle
51
de sexto dia ocorreu devido a menor produção de DHAP com desvio da via metabólica
para síntese de piruvato, que é energeticamente mais rentável.
A S/E de oxalato e α-cetoglutarato não foi detectada em nenhuma das amostras
analisadas pela técnica de CLAE. O α-cetoglutarato além de fazer parte do ciclo do
ATC também pode ser produzido a partir do catabolismo protéico (Lehninger 2006).
Provavelmente, estes dois ácidos orgânicos estão sendo utilizados intracelularmente,
não sendo portanto secretados o que justifica a sua ausência em nossas análises.
Os ácidos graxos não são conhecidos como importantes substratos energéticos
do metabolismo de indivíduos pertencentes à família Trypanosomatidae, com exceção
em amastigotas de L. donovani e T. cruzi (Opperdoes &Coombs 2007; Tielens &
Hellemond 2009; Tielens et al. 2010).
Em nossos testes observou-se um aumento da S/E de glicose no meio de cultura
das formas promastigotas no sexto dia de crescimento, isso é explicado pois a
Leishmania sp quando cultivada utiliza preferencialmente hexoses (glicose, galactose e
manose) para a geração de energia
(Saunders et al.2010). Durante o período de
proliferação parasitária a glicose é metabolizada no glicossomo e o excesso de hexoses
pode ser exportado ao citoplasma e catabolizado em manógenos, esses são acumulados
extracelularmente durante a fase estacionária de crescimento (Costa et al.2011).
Foi possível detectar uréia e β-hidroxibutirato indicando que os parasitos podem
utilizar de outras fontes energéticas como proteínas e lipídios.
O β-hidroxibutirato e o acetoacetato foram detectados em todas as amostras e o
fármaco não influenciou na S/E desses ácidos orgânicos. Em estudos in vitro com
promastigotas de L.(V.) braziliensis da cepa M2903 realizados por Costa et al. 2011 o βhidroxibutirato também foi detectado por CLAE.
O propionato, que pode ser produzido via succinato ou via acetil Co-A, não foi
detectado em nenhum dos grupos testados nem nos grupos controle.
Com este trabalho observamos que as vias glicossomais e vias alternativas de
produção de energia estão bem conservadas permitindo que o parasito continue gerando
energia para sua sobrevivência apesar de exposto ao fármaco.
52
7.CONCLUSÕES
Neste trabalho foi possível avaliar o efeito in vitro das diferentes concentrações
de zidovudina (AZT) no metabolismo energético, respiratório e oxidação de ácidos
graxos de promastigotas de L. (V.) braziliensis.
O AZT, ao promover lesão mitocondrial, alterou as taxas de crescimento in vitro
de promastigotas em fase proliferativa de L. (V.) braziliensis, especialmente nas
concentrações de 10 e 30 µM.
Os ácidos orgânicos que fazem parte do metabolismo da glicose que se localizam
no glicossomo e citosol das promastigotas: succinato, piruvato, lactato de L. (V.)
braziliensis permanecem sendo secretados e excretados nos grupos teste submetidos às
diferentes concentrações de zidovudina. A secreção/excreção de acetato não foi
detectada nas amostras analisadas.
Com base nos achados dos ácidos orgânicos pertentes às vias mitocondriais,
podemos concluir que o AZT tem influência na mitocôndria de promastigotas de L. (V.)
braziliensis, os achados nas concentrações de citrato, succinato, fumarato, malato e
oxaloacetato são indicativos que o fármaco atua nestas vias.
Com base nos ácidos orgânicos analisados, as formas promastigotas
provavelmente fazem uso de vias catabólicas de proteínas e de ácidos graxos que não
foram influenciadas pela exposição ao AZT.
53
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ANEXOS
Cromatogramas
Cromatograma 1: Cromatograma de ácidos orgânicos de promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis M2903, controle de leishmanias do 3º dia da curva de crescimento (HPLC, fluxo de 0,6
mL/min, fase líquida H2SO4)
Cromatograma 2: Cromatograma de ácidos orgânicos de promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis M2903, controle de leishmanias do 6º dia da curva de crescimento (HPLC, fluxo de 0,6
mL/min, fase líquida H2SO4).
65
Cromatograma 3: Cromatograma de ácidos orgânicos de promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis M2903, promastigotas submetidas a 1µM de AZT, 3º dia da curva de crescimento
(HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H 2SO4).
Cromatograma 4: Cromatograma de ácidos orgânicos de promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis M2903, promastigotas submetidas a 1µM de AZT, 6º dia da curva de crescimento
(HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H 2SO4).
66
Cromatograma 5: Cromatograma de ácidos orgânicos de promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis M2903, promastigotas submetidas a 10µM de AZT, 3º dia da curva de crescimento
(HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H 2SO4).
Cromatograma 6: Cromatograma de ácidos orgânicos de promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis M2903, promastigotas submetidas a 10µM de AZT, 6º dia da curva de crescimento
(HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H 2SO4).
67
Cromatograma 7: Cromatograma de ácidos orgânicos de promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis M2903, promastigotas submetidas a 20µM de AZT, 3º dia da curva de crescimento
(HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H 2SO4).
Cromatograma 8: Cromatograma de ácidos orgânicos de promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis M2903, promastigotas submetidas a 20µM de AZT, 6º dia da curva de crescimento
(HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H 2SO4).
68
Cromatograma 9: Cromatograma de ácidos orgânicos de promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis M2903, promastigotas submetidas a 30µM de AZT, 3º dia da curva de crescimento
(HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H 2SO4).
Cromatograma 10: Cromatograma de ácidos orgânicos de promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis M2903, promastigotas submetidas a 30µM de AZT, 6º dia da curva de crescimento
(HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H 2SO4).
69
Cromatograma 11: Cromatograma de ácidos orgânicos de promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis M2903, promastigotas submetidas a 40µM de AZT, 3º dia da curva de crescimento
(HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H 2SO4).
Cromatograma 12: Cromatograma de ácidos orgânicos de promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis M2903, promastigotas submetidas a 40µM de AZT, 6º dia da curva de crescimento
(HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H 2SO4).
70
Cromatograma 13 : Cromatograma de ácidos orgânicos de promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis M2903, promastigotas submetidas a 50µM de AZT, 3º dia da curva de crescimento
(HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H 2SO4).
Cromatograma 14: Cromatograma de ácidos orgânicos de promastigotas de Leishmania (Viannia)
braziliensis M2903, promastigotas submetidas a 50µM de AZT, 6º dia da curva de crescimento
(HPLC, fluxo de 0,6 mL/min, fase líquida H 2SO4).
71
Cromatograma 15: Cromatograma de ácidos orgânicos, controle do meio Grace’s (HPLC, fluxo de
0,6 mL/min, fase líquida H2SO4)
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