eletroforese de proteínas e imunofixação

imunologia
biologia molecular
CITOMEGALOVÍRUS
Antigenemia pp65
PCR qualitativa
1. Introdução
O Citomegalovírus (CMV) é um vírus DNA, que pertence à família dos herpesvírus e
infecta indivíduos em qualquer idade, em todo o mundo, independentemente das condições
sociais e culturais. Estudos soroepidemiológicos demonstram que, no Brasil, mais de 70% da
população adulta já foi infectada pelo CMV (1).
É encontrado na saliva, leite materno, urina e outros fluidos corpóreos como o sêmen,
secreções vaginais, podendo, portanto, ser transmitido pelas vias aéreas superiores e nas
relações sexuais. Embora raramente, transfusão sangüínea também é implicada como forma de
transmissão (2).
2. Importância clínica
Em adultos saudáveis, o CMV normalmente não produz nenhum sintoma ou sinal. Às
vezes, a infecção pode determinar quadro clínico auto-limitado semelhante à mononucleose
infecciosa. Como os outros herpesvírus, o CMV, após a infecção, permanece em estado inativo,
podendo ser reativado em determinadas situações. A importância da infecção pelo CMV é maior
nas seguintes situações:
1- Transmissão vertical do CMV: a transmissão da gestante para o feto pode interferir na
formação de órgãos e tecidos fetais. O CMV é considerado a principal causa de infecção
congênita, ocorrendo em 0,3 a 2% dos nascimentos. Dos infectados, 15% têm sinais e
sintomas
ao
nascimento
(calcificações
cerebrais,
microcefalia,
corioretinite,
hepatoesplenomegalia e icterícia), sendo que a maioria se desenvolve com retardamento
mental, cegueira, surdez, paralisia cerebral ou epilepsia. Mais de 15% das crianças
assintomáticas ao nascimento desenvolverão seqüelas tardiamente, geralmente deficiências
neurológicas ou auditivas (4,5).
2- Pacientes imunocomprometidos: a grande expansão da técnica de transplante de órgãos
(rim, coração, fígado, medula óssea), a introdução de novos quimioterápicos para tratamento
de neoplasias, bem como o advento da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA/AIDS),
tiveram como conseqüência o aumento do número de pacientes imunodeprimidos passíveis
de sofrerem infecções oportunistas, como é o caso do CMV. Em imunodeprimidos o quadro
pode advir de infecção primária, entretanto, mais comumente decorre de reativação de
infecção latente. Pode se manifestar como (3,6):
‰ quadros febris prolongados com hepatoesplenomegalia, febre, mialgia, artralgia e
alterações hematológicas que configuram a “Síndrome do CMV”, de grande
incidência em transplantados renais;
‰ pneumonia intersticial (comum em receptores de transplante de medula);
‰ retinite; ulcerações gastrointestinais e neuropatia (comum em aidéticos);
‰ hepatite (complica transplantes hepáticos).
ANTIGENEMIA pp65
Detecção do antígeno do CMV
A disseminação do CMV no sangue é importante fator na patogênese da doença durante
infecção primária e reativação. Durante infecção ativa, a disseminação no sangue ocorre na
maioria dos imunodeprimidos. Atualmente, encontra-se definido que a disseminação do CMV
(grau de viremia) no sangue é fator de risco de progressão à doença invasiva pelo CMV.
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imunologia
biologia molecular
Embora a profilaxia anti-viral tenha levado à redução na mortalidade e morbidade do CMV em
imunossuprimidos, a toxicidade do tratamento permanece como um problema. Assim, esforços
são realizados para a identificação dos pacientes que apresentam risco de aquisição da doença
para que se possa dirigir o tratamento a estes. Com esse fim são utilizados a detecção da
antígeno do CMV e a Reação em cadeia da polimerase (PCR). Níveis elevados de antigenemia
têm valor preditivo positivo alto para doença invasiva pelo CMV. Estudos mostram que
antigenemia apresenta sensibilidade superior à cultura e comparável à PCR quantitativa
(7,8,9,10,11,12,13).
1. Método
Detecção rápida do CMV, presente no núcleo dos neutrófilos do sangue periférico que
fagocitaram o vírus. São utilizados anticorpos monoclonais para a proteína pp65 do CMV, que é
um marcador precoce e específico de infecção ativa. A coloração da lâmina é realizada pela
técnica de imunofluorescência e o resultado liberado como número de células positivas em 2 x 106
neutrófilos analisados. A modificação do ensaio inicialmente utilizado para determinação da
antigenemia, permitiu diminuição do tempo de realização do exame, mantendo-se a eficiência do
teste (7,9,10,14,15,16,17).
2. Amostra
Utiliza-se 5 ml de sangue total em EDTA. O exame deve ser realizado até 6 horas após
a coleta. O processamento das amostras após esse período resulta na diminuição da
sensibilidade do teste. Em casos de neutropenia (contagem de neutrófilos < 500/mm3) enviar 10
ml de sangue total. O valor de referência é a ausência de células positivas (ou de núcleos
corados) para o CMV por 2 x 106 neutrófilos analisados (7-13).
3. Indicações da Antigenemia para CMV
‰ Identificar, entre os pacientes imunodeprimidos, quais seriam aqueles com maior risco de
desenvolver doença por CMV. Esse teste positivo aponta para o início do tratamento
preemptivo, ou seja, uso de terapêutica estratégica para eliminar a possibilidade de doença
nos indivíduos de risco. Geralmente, a antigenemia torna-se positiva com 7 a 14 dias antes do
início das manifestações da doença. Em geral, quanto maior o nível de antigenemia, maior o
valor preditivo positivo do teste (15,16,17,18).
‰ Útil para avaliar a resposta ao tratamento anti-viral. O nível da antigenemia diminui logo após o
início da terapia, porém aumentos intermitentes podem ocorrer (7,8,9,10).
4. Limitações do teste:
Pacientes podem desenvolver doença por CMV com antigenemia negativa e nem todos
pacientes com teste positivo irão apresentá-la (13).
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biologia molecular
‰
‰
Em pacientes com supressão medular importante, o resultado pode ser falsamente negativo
devido à ausência de neutrófilos no sangue periférico. Nesta situação, o ideal é realizar a
reação em cadeia da polimerase (PCR) para o CMV. Em transplantados de medula, estudo
mostrou que em 2,8% de 570 amostras não foi possível realizar a antigenemia devido à baixa
contagem de granulócitos. Estes resultados negativos, entretanto, ocorrem principalmente nas
primeiras três semanas após o transplante, quando o risco de reativação do CMV é baixo (713).
Ressalta-se que a comparação de resultados, ao longo do tempo, deve ser idealmente
realizada apenas com ensaios realizados em um mesmo laboratório, e que as amostras
devem ser preparadas até 6 horas após a coleta (14,15, 16).
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE QUALITATIVA DO CMV
Pesquisa do DNA viral
O CMV pode ser detectado através de métodos de biologia molecular como a reação em
cadeia da polimerase (PCR). Para atribuir ao CMV uma determinada manifestação é fundamental
a detecção do DNA viral no órgão acometido. A PCR é uma técnica rápida com alta sensibilidade
e especificidade para a detecção do CMV em fluidos biológicos e tecidos (19-22).
1. Método
Reação em Cadeia da Polimerase aninhada (Nested PCR) – são realizadas duas PCRs,
sendo que a segunda reação se dá em uma região interna à primeira, o que aumenta a
sensibilidade desse procedimento. A região do DNA amplificada é o gene IE, que dá origem a
proteína imediatamente precoce (1,19,20).
2. Amostra
Pode ser realizada em diversos materiais: urina, sangue total, plasma, líquor, líquido
amniótico, material de biópsia, outros fluidos orgânicos. Deve-se enviar o material congelado ao
laboratório em 24 horas (exceto o sangue total: 4 dias).
3. Indicações da PCR
Meningoencefalite ou outras alterações neurológicas: raras em indivíduos sadios. O
acometimento neurológico pode atingir mais de 50% dos casos de SIDA, sendo responsável
pelo complexo de demência, neuropatia periférica dolorosa, paralisia ascendente devido à
mielite e quadro similar à síndrome de Guillain-Barré. A PCR pode ser realizada no líquor com
sensibilidade de 80 a 92% e especificidade de 98% (19).
‰ Infecção congênita - diagnóstico pré-natal: útil quando a gestante apresenta um quadro de
infecção aguda e se pretende afastar a possibilidade de infecção intra-uterina. A PCR pode
ser realizada no líquido amniótico e é mais sensível que os métodos convencionais (21).
‰ Infecção congênita - diagnóstico pós-natal: detecção do CMV na urina ou no sangue de
recém nascido nas três primeiras semanas de vida define a infecção congênita. Nas crianças
com PCR-CMV negativas ao nascimento que tornam-se positivas entre a 4ª e 12ª semana de
vida, é caracterizado o diagnóstico de infecção perinatal. A sensibilidade e especificidade são
de 98% e 100%, respectivamente (21).
‰ Infecção localizada em órgão-alvo: a PCR-CMV pode ser realizada em líquidos corporais ou
material de biópsia de lesões ou órgãos suspeitos (20).
‰
4. Limitações do teste
Por ser um método qualitativo, não há distinção entre infecção aguda ou reativação de uma
forma latente. A presença de pequenas quantidades de DNA do CMV no sangue periférico
(após o período neonatal) não está associado à presença de doença. Para essa finalidade,
recomenda-se a antigenemia (19-22).
‰ Reações falso-negativas ocorrem quando a quantidade de DNA está abaixo da sensibilidade
de detecção do teste ou na presença de inibidores da PCR na amostra (19-22).
‰
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imunologia
biologia molecular
O Instituto de Patologia Clínica Hermes Pardini disponibiliza
para diagnóstico da infecção pelo CMV:
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‰
‰
‰
‰
IgM CMV - métodos:
Imunoensaio enzimático
ELFA (enzyme linked fluorescent assay) - captura
IgG CMV - métodos:
Imunoensaio enzimático
ELFA (enzyme linked fluorescent assay)
IgG avidez CMV – método:
ELFA (enzyme linked fluorescent assay)
Antigenemia para CMV - método:
Imunofluorescência
PCR qualitativo do CMV
Pesquisa de Células de Inclusão Citomegálica em urina
IgM CMV Neonatal: imunoensaio enzimático (em papel filtro)
5. Referências:
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