universidade federal do rio grande do norte

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE SISTEMAS EMULSIONADOS
LIPÍDICOS CONTENDO PRAZIQUANTEL
AUTOR DISCENTE: MARGARETE MORENO DE ARAUJO
Natal – RN
2013
Margarete Moreno de Araujo
PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE SISTEMAS EMULSIONADOS
LIPÍDICOS CONTENDO PRAZIQUANTEL
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da UFRN como parte dos
requisitos para obtenção do Título de Mestre
em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Arnóbio Antônio da
Silva Júnior
Coorientadora: Dra. Ana Luiza Porpino
Fernandes Caroni
Natal – RN
2013
MARGARETE MORENO DE ARAUJO
PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE SISTEMAS EMULSIONADOS
LIPÍDICOS CONTENDO PRAZIQUANTEL
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da UFRN como parte dos
requisitos para obtenção do Título de Mestre
em Ciências Farmacêuticas.
Comissão Examinadora:
______________________________________________________
Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior (Orientador) - UFRN
______________________________________________________
Prof. Dr. José Luís Cardozo Fonseca - UFRN
______________________________________________________
Prof. Dr. Victor Hugo Vitorino Sarmento – UFS
Dedico esse trabalho aos meus pais
Daniel e Lurdinha, e às minhas irmãs,
Magnollya, Magda e Magally. Amo muito
vocês, esse trabalho é fruto de tudo que
me ofereceram.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente ao meu bom Deus que nunca me abandonou e
sempre me deu forças nos momentos mais difíceis.
Aos meus pais, Daniel e Lurdinha, que nunca mediram esforços em
oferecer a mim e a minhas irmãs segurança, apoio, carinho e todo empenho em
nos garantir a melhor educação, tanto acadêmica como moral. Não há como
expressar toda minha felicidade e orgulho em dedicar este trabalho a vocês, como
forma de agradecimento a todo o amor dado. Agradeço às minhas irmãs queridas,
Magnollya, Magda e Magally, por sempre estarem comigo, apesar da distância,
dando-me toda força e apoio que precisei. À minha família agradeço por toda
confiança depositada. A vocês meu eterno agradecimento e amor.
Ao meu orientador Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior, por me
orientar sempre com dedicação, paciência, incentivo, contribuição na ampliação
dos meus conhecimentos, tanto no profissional, como no pessoal. Por valiosas
lições que ultrapassaram as barreiras do laboratório e certamente me
acompanharão para toda a vida.
Às minhas amigas do Programa de Pós-graduação, principalmente as que
convivi diariamente no laboratório, Edilene (pelas boas risadas e almoços no RU),
Polyanne (por ser minha confidente), Letícia (por compartilhar angústias do
mesmo sistema emulsionado), Alice e Lilia (pelo incentivo em expandir meus
horizontes), Karlinha e Ednara (por dividir as tarefas no liofilizador), Mayra,
Ednara, Yamara, Ana Luiza e Mariana. Cada item deste trabalho tem a
contribuição e ajuda de cada uma de vocês. Obrigada pelos momentos de alegria,
e por tornarem o convívio no laboratório momentos de prazer e descontração.
À minha querida aluna de iniciação científica, Izadora, por nunca dizer não
para me ajudar em todos os experimentos, fossem eles durante a madrugada ou
no final de semana. Muito obrigada Iza!
Às minhas amigas, irmãs de coração, Carol e Hiala. Obrigada pelo silêncio
que faziam quando precisava discutir algum resultado em casa, obrigada pela
distração nos momentos em que precisava pensar em outra coisa que não
mestrado, obrigada pela paciência e compreensão quando me encontravam
estressada. E a Carol, principalmente, por ter me dado forças e mostrado que eu
era capaz de continuar. Obrigada meninas!
Ao Núcleo de Processamento Primário e Reúso de Água Produzida e
Residuos (NUPRAR - UFRN) pelas analises reológicas.
Ao Núcleo de Pesquisa em Petróleo e Gás (NUPEG - UFRN) pelas
analises de espalhamento de luz e potencial Zeta.
Aos professores componentes da banca de qualificação Márcio Ferrari,
Márcia Rodrigues e Alcides de Oliveira; e aos professores componentes da banca
de defesa da dissertação, pelas contribuições dadas ao nosso trabalho.
À secretaria de Pós-graduação, aos funcionários, à Faculdade de Ciências
Farmacêuticas e a CAPES pelo suporte financeiro.
Meus sinceros agradecimentos a todos que participaram da minha jornada
e que de muitas formas contribuíram para a realização desta dissertação.
“Eu acredito demais na sorte. E tenho constatado que, quanto mais duro eu
trabalho, mais sorte eu tenho.”
Thomas Jefferson
RESUMO
O
praziquantel
(PRZ)
é
o
fármaco
de
escolha
para
tratamento
da
esquistossomose no Brasil e está disponível comercialmente para administração
oral na forma de comprimidos. No entanto, possui baixa solubilidade aquosa, o
que limita o sucesso terapêutico desta forma farmacêutica e a disponibilização de
formas líquidas. Os sistemas emulsionados lipídicos têm grande potencial para
aumento da solubilização de fármacos lipofílicos, sendo, então, uma estratégia
interessante para tal finalidade. O objetivo do presente estudo foi o
desenvolvimento e a caracterização de sistemas líquidos emulsionados lipídicos
do tipo óleo em água (O/A), a base de óleo de soja como fase interna estabilizada
pelo par de tensoativos Tween® 80 e Span® 80, para melhorar a fase
biofarmacêutica do PRZ. Depois de selecionar o melhor valor do Equilíbrio
Hidrófilo-Lipófilo (EHL=11), os parâmetros de preparação das formulações pela
técnica de emulsificação foram otimizados. As emulsões foram obtidas com
sucesso, as formas líquidas apresentaram comportamento newtoniano e
proporcionaram um aumento de solubilidade do PRZ superior a 20 vezes. O
estudo de estabilidade acelerada demonstrou a estabilidade das emulsões e o
efeito dos cotensoativos investigados. O estudo da dinâmica de interação entre os
componentes pelo diagrama pseudoternário de fase demonstrou regiões de
obtenção de emulsões do tipo O/A, enquanto que o estudo da interação dos
componentes e o seu efeito na estrutura dos sistemas e na eficiência de
incorporação do fármaco levaram a obtenção de sistemas com uma quantidade
de fármaco solúvel ainda maior (cerca de 1,5%), o que demonstra o potencial
deste novo insumo para o tratamento principalmente da esquistossomose, o qual
resultou em um depósito de patente BR 10 2013 000455 3.
Palavras-chave: praziquantel, estabilidade, reologia, esquistossomose, sistema
emulsionado O/A.
ABSTRACT
Praziquantel (PRZ) is the main drug used for treatment of schistosomiasis in
Brazil. It is administered by oral rout as tablets. However, has low aqueous
solubility which limits this therapeutic success dosage form and availability of liquid
forms. The emulsion systems have great potential and represent an interesting
strategy to increase the solubility of drugs. The aim of study was the development
and characterization of lipid-emulsified liquid systems of the type oil in water (O /
W), the base of soybean oil as the internal phase stabilized by surfactants pair
Tween® 80 and Span® 80, for improving the phase biopharmaceutical of PRZ.
After selecting the best value of Hydrophilic-Lipophilic Balance (HLB = 11), the
parameters of the preparation of the formulations were optimized emulsification
technique. The emulsions were successfully obtained; the liquid forms provided
exhibited Newtonian behavior and an increase in solubility of PRZ higher than 20
times. The accelerated stability study demonstrated the stability of the emulsions
and the effect of cosurfactants investigated. The study of the dynamics of
interaction between components in the diagram showed pseudoternary phase
regions to obtain O/W emulsions, whereas the study of the interaction of the
components and their effect on system structure and the efficiency of incorporation
of the drug led to systems with an amount of soluble drug even higher (about
1.5%), which demonstrates the potential of this new input mainly for the treatment
of schistosomiasis, which resulted in the filing of patent BR 10 2013 0004 55 3.
Keywords: praziquantel, stability, rheology, schistosomiasis, emulsified system.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 - Áreas endêmicas e focais da esquistossomose mansoni. Fonte: SVS/MS, Brasil 2009.
.......................................................................................................................................................... 19
FIGURA 2 - Representação esquemática da estrutura química do PRZ. ....................................... 21
FIGURA 3 - Representação esquemática de emulsões do tipo O/A (a) e A/O (b). Adaptado de
Oliveira et al., 2004. ......................................................................................................................... 24
FIGURA 4 - Representação esquemática do processo de instabilidade física de emulsões do tipo
O/A. Sendo a – floculação, b – cremagem, c – acomodação de Ostwald, d – coalescência.
Adaptado de Taylor, 1998. ............................................................................................................... 27
®
®
FIGURA 5 – Estruturas químicas do Tween 80 (a) e Span 80 (b). .............................................. 29
FIGURA 6 – Estruturas químicas do álcool etílico (a) e álcool benzílico (b). .................................. 31
FIGURA 7 - Representação do Diagrama Ternário. O ponto M representa a concentração de 50%
de fase aquosa, 20% de fase oleosa e 30% de tensoativos. .......................................................... 32
FIGURA 8 - Esquematização do ciclo tempo versus temperatura, o qual as emulsões foram
submetidas. ...................................................................................................................................... 40
FIGURA 9 - Espectros de ultravioleta obtidos na região de 200 - 400nm. Sendo: azul = PRZ,
®
®
vermelho = Tween 80 + Span 80, verde = tween + span + PRZ, laranja = FS + OS + PRZ, lilás =
FS + OS. ........................................................................................................................................... 49
FIGURA 10 - Curva padrão de PRZ em solução alcoólica obtida por espectrofotometria UV-vis em
264 nm.............................................................................................................................................. 50
FIGURA 11 - Diagrama pseudoternário contendo água purificada como FA, óleo de soja como FO
®
e a associação dos tensoativos Tween 80 + Span
®
80 (Tw80 + Sp80). As áreas delimitadas
representam: SEOB (Sistema Emulsionado Opaco Branco), ST (Sistema Translúcido), SEOA
(Sistema Emulsionado Opaco Amarelo) e SF (Separação de Fases)............................................. 57
FIGURA 12 – Pontos selecionados na região SEOB do diagrama pseudoternário. ....................... 58
FIGURA 13 - Gráficos correspondentes aos valores obtidos de IC e turbidez das emulsões durante
30 dias de estudo utilizando álcool etílico (A e A’) e álcool benzílico (B e B’) como cotensoativos.
Sendo que ○ corresponde à emulsão 0:1 (razão de cotensoativo : tensoativo), ● 0,05:1, ▲ 0,1:1, e
■ 0,15:1. ........................................................................................................................................... 60
FIGURA 14 - Gráficos correspondentes aos valores obtidos de pH e condutividade das emulsões
durante 30 dias de estudo utilizando álcool etílico (A e A’) e álcool benzílico (B e B’) como
cotensoativos. Sendo que ○ corresponde à emulsão 0:1 (razão de cotensoativo : tensoativo), ●
0,05:1, ▲ 0,1:1, e ■ 0,15:1. .............................................................................................................. 63
FIGURA 15 - Diâmetro das gotículas, turbidez e índice de refração em função da concentração de
óleo de soja (FO) no meio. ............................................................................................................... 69
FIGURA 16 - Fotomicrografias dos sistemas emulsionados em função da concentração de óleo de
soja (FO) no meio (aumento de 400x). ............................................................................................ 70
FIGURA 17 - Potencial zeta, condutividade elétrica e pH em função da concentração de óleo de
soja (FO) no meio ............................................................................................................................. 71
FIGURA 18 - Quantidade de PRZ incorporado nas emulsões em função da concentração de óleo
de soja (FO) no meio. ....................................................................................................................... 73
FIGURA 19 - Diâmetro das gotículas, turbidez e índice de refração em função da concentração de
tensoativos no meio. ........................................................................................................................ 74
FIGURA 20 – Fotomicrografias dos sistemas emulsionados em função da concentração de
tensoativos no meio (aumento de 400x). ......................................................................................... 75
FIGURA 21 - Potencial zeta, condutividade elétrica e pH em função da concentração de
tensoativos no meio. ........................................................................................................................ 76
FIGURA 22 - Quantidade de PRZ incorporado nas emulsões em função da concentração de
tensoativos no meio. ........................................................................................................................ 77
FIGURA 23 - Diâmetro das gotículas, turbidez e índice de refração em função da concentração de
PRZ no meio..................................................................................................................................... 78
FIGURA 24 - Fotomicrografias dos sistemas emulsionados em função da concentração de PRZ no
meio (aumento de 400x). ................................................................................................................. 79
FIGURA 25 - Valores correspondentes ao potencial zeta, à condutividade elétrica e ao pH versus à
variação de PRZ no meio. ................................................................................................................ 79
FIGURA 26 - Reogramas da tensão de cisalhamento versus taxa de cisalhamento (A e B) e
viscosidade versus taxa de cisalhamento dos sistemas (A’ e B’). ................................................... 83
FIGURA 27 - Reogramas da tensão de cisalhamento versus taxa de cisalhamento (A) e
viscosidade versus taxa de cisalhamento dos sistemas (B) para as emulsões onde houve adição
de PRZ. ............................................................................................................................................ 84
FIGURA 28 - Evolução dos módulos de armazenagem G’e de perda G” das emulsões contendo
0,75 e 1% de PRZ. ........................................................................................................................... 86
FIGURA 29 - Gráficos do efeito do fármaco na estabilidade das emulsões Sendo emulsões: (○)
com 5% de T, sem PRZ; (●) com 1% de T + PRZ, (▲) com 2,5% de T + PRZ, (■) com 5% de T +
PRZ. ................................................................................................................................................. 87
FIGURA 30 - Gráficos do efeito do fármaco na estabilidade das emulsões Sendo emulsões: (○)
com 5% de T, sem PRZ; (●) com 1% de T + PRZ, (▲) com 2,5% de T + PRZ, (■) com 5% de T +
PRZ. ................................................................................................................................................. 89
FIGURA 31 - Fotomicrografia das emulsões contendo 1% de PRZ e 1; 2,5 e 5% de tensoativos
durante os 30 dias de estudo de estabilidade. Aumento de 400x. .................................................. 90
FIGURA 32 - Gráfico para determinação do teor de fármaco nas emulsões em 30 dias de estudo.
Sendo emulsões: (○) com 5% de T, sem PRZ; (●) com 1% de T + PRZ, (▲) com 2,5% de T + PRZ,
(■) com 5% de T + PRZ. .................................................................................................................. 91
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Proporção entre mistura de tensoativos e fase oleosa para determinação do
diagrama de fases. ..........................................................................................................39
TABELA 2 - Quantidade em % dos constituintes para formulação. ..................................43
TABELA 3 - Equações de modelos matemáticos para determinação do comportamento
reológico. .........................................................................................................................46
TABELA 4 - Resultados dos parâmetros analisados na validação da metodologia analítica
do PRZ. ...........................................................................................................................51
TABELA 5 - Valores encontrados para as médias do índice de cremagem (IC) medido
24h (antes e após centrifugação) e 7 dias após o preparo das emulsões. .......................55
TABELA 6 – Porcentagem de PRZ incorporado em emulsão por dois métodos diferentes.
........................................................................................................................................65
TABELA 7 - Resultado do teste para incorporação do PRZ em emulsões diferentes.......66
TABELA 8 – Valores correspondentes aos índices de polidispersão das diferentes
emulsões em estudo. .......................................................................................................80
TABELA 9 - Valores correspondentes ao índice de comportamento (n), coeficiente de
correlação linear (r), tensão de cisalhamento inicial (τ0) e o índice de consistência (K) para
cada sistema emulsionado...............................................................................................81
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CV
Coeficiente de variação
DP
Desvio padrão
EHL
Equilíbrio hidrófilo-lipófilo
EF
Incoporação do PRZ na emulsão
formada
EM
Emulsões
FA
Fase aquosa
FO
Fase oleosa
FS
Fosfatidilcolina de soja
IC
Índice de cremagem
O/A
Óleo em água
OS
Oleato de sódio
PRZ
Praziquantel
T
Tensoativos
TA
Temperatura ambiente
TIF
TA
Incorporação de PRZ na fase oleosa da
emulsão
Temperatura ambiente
LISTA DE SÍMBOLOS
Tensão de cisalhamento
Taxa de cisalhamento
Viscosidade
K
Índice de consistência
N
Índice de comportamento ou de fluxo
®
Marca registrada
Ζ
Potencial zeta
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...............................................................................................16
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................18
2.1. ESQUISTOSSOME MANSÔNICA ............................................................. 18
2.2. PRAZIQUANTEL........................................................................................ 20
2.3. EMULSÕES ............................................................................................... 23
2.3.1 Estabilidade de emulsões ..................................................................... 26
2.3.2 Componentes ....................................................................................... 28
2.3.3 Diagrama de fases ................................................................................ 31
3. OBJETIVOS ...................................................................................................33
3.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................... 33
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................... 33
4. MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................34
4.1.
REAGENTES E SOLVENTES ................................................................ 34
4.2. EQUIPAMENTOS E ACESSÓRIOS ......................................................... 34
4.3. DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE ANÁLISE
QUANTITATIVA DO PRZ ................................................................................. 35
4.3.1 Especificidade ....................................................................................... 35
4.3.2 Curva padrão ........................................................................................ 35
4.3.3 Linearidade e Intervalo ......................................................................... 36
4.3.4 Precisão ................................................................................................ 36
4.3.5 Exatidão ................................................................................................ 36
4.3.6 Robustez aparente................................................................................ 37
4.4. ESTUDO DA OBTENÇÃO E ESTABILIDADE DE EMULSÃO TIPO O/A
COM ÓLEO DE SOJA ...................................................................................... 37
4.4.1 Construção do diagrama de fases ........................................................ 37
4.4.2 Efeito dos cotensoativos na estabilidade acelerada da emulsão .......... 40
4.5. ESTUDO DE INCORPORAÇÃO DO PRZ NA EMULSÃO ÓLEO DE
SOJA/ÁGUA ..................................................................................................... 41
4.6.
ESTUDO DA INTERAÇÃO DO PRZ COM OS COMPONENTES DA
EMULSÃO ........................................................................................................ 42
4.6.1 Interação fármaco-componentes nas propriedades dos sistemas
emulsionados................................................................................................. 42
4.6.2 Efeito do fármaco na estabilidade da emulsão ..................................... 47
4.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................ 47
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .....................................................................49
5.1. DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA ANÁLISE
QUANTITATIVA DO FÁRMACO ....................................................................... 49
5.2.
ESTUDO
DA
OBTENÇÃO
E
ESTABILIDADE
DO
SISTEMA
EMULSIONADO ÓLEO DE SOJA/ÁGUA ......................................................... 53
5.2.1 Construção do diagrama de fases ........................................................ 53
5.2.2 Efeito dos cotensoativos na estabilidade acelerada da emulsão óleo de
soja/água ....................................................................................................... 59
5.3. ESTUDO DE INCORPORAÇÃO DO FÁRMACO ..................................... 64
5.3.1 Escolha do método de incorporação..................................................... 64
5.3.2 Efeito do etanol na incorporação do PRZ na emulsão .......................... 66
5.4. ESTUDO DA INTERAÇÃO DO PRZ COM OS COMPONENTES DA
EMULSÃO ........................................................................................................ 67
5.4.1 Efeito do fármaco nas propriedades físico-químicas dos sistemas ...... 67
5.4.2 Efeito do fármaco na estabilidade da emulsão ..................................... 87
6. CONCLUSÃO ...................................................................................................92
PERSPECTIVAS...................................................................................................94
ANEXOS .............................................................................................................108
ANEXO I ......................................................................................................... 109
Introdução
_________________________________________________________________
1.
INTRODUÇÃO
Considerada uma importante doença no contexto da saúde pública
brasileira, a esquistossomose mansônica é uma enfermidade parasitária tropical
desencadeada pelo helminto Schistosoma mansoni (VITORINO et al., 2012). As
formas adultas deste verme habitam nos vasos mesentéricos do hospedeiro
definitivo, no caso, um hospedeiro vertebrado (homem ou outro animal
suscetível), e as formas intermediárias se desenvolvem em caramujos aquáticos
do gênero Biomphalaria (CLERINX, GOMPEL, 2011). O Ministério da Saúde
estima que cerca de 25 milhões de pessoas vivem em áreas sob o risco de
contrair a doença (SVS – MS, BRASIL, 2009).
O tratamento da esquistossomose consiste na utilização de medicamentos
específicos, para a cura da infecção. Dentre as alternativas terapêuticas
disponíveis, o praziquantel (PRZ) é o fármaco de primeira escolha, sendo
administrado por via oral na forma de comprimido de 600 mg em dose única de 50
mg/kg para adultos e 60 mg/kg para crianças (BRASIL, 2009). Entretanto, por ser
um fármaco de classe biofarmacêutica II, o PRZ apresenta uma baixa solubilidade
em água (0,4 mg/mL) (LINDENBERG, KOPP, DRESSMAN, 2004), limitando
assim, seu sucesso terapêutico, uma vez que o paciente deve ingerir uma alta
dose de fármaco para alcance de efeito farmacológico (MOURÃO et al., 2005).
Os fármacos pouco solúveis em água em especial aqueles enquadrados na
Classe II do Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SBC), para os quais a
dissolução é um fator limitante da absorção, representam um grande desafio para
o farmacêutico e, nesse sentido, a utilização de recursos capazes de promover a
maior solubilização do agente terapêutico e, consequentemente, melhorar a sua
dissolução e biodisponibilidade, representa uma alternativa bastante viável. Tais
recursos envolvem uma vasta gama de tecnologias; os sistemas emulsionados
lipídicos, por exemplo, são amplamente utilizados com esse propósito.
As emulsões lipídicas são sistemas potencialmente interessantes para
liberação de fármacos, devido a sua habilidade para incorporar agentes
terapêuticos de baixa solubilidade aquosa dentro da fase dispersa hidrossolúvel.
Com o uso dessas emulsões, o contato direto do fármaco com os fluidos e tecidos
16
Introdução
_________________________________________________________________
corporais podem ser evitados, minimizando os possíveis efeitos adversos, além
de que, quando comparadas com as formulações convencionais, são bem
aceitáveis por aumentar a biodisponibilidade de fármacos e por prolongar o efeito
farmacológico, (WANG et al., 2006; HUNG et al., 2007).
O presente trabalho buscou o desenvolvimento e a caracterização físicoquímica de sistemas emulsionados lipídicos (emulsões) para administração do
praziquantel na forma líquida, levando a obtenção de um novo insumo.
17
Fundamentação teórica
_________________________________________________________________
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1. ESQUISTOSSOME MANSÔNICA
A humanidade convive com a esquistossomose desde a antiguidade, pois
estudos verificaram a presença de ovos de Schistosoma em múmias egípcias de
3.500 a.C. Apesar de estudos destacarem que no Brasil a esquistossomose se
estabeleceu durante o período colonial, seu primeiro relato só foi descrito entre os
anos de 1907 e 1908, por Pirajá da Silva, no Estado da Bahia, que supriu as
incertezas taxonômicas quanto ao parasita. A partir de então surgiram as
investigações sobre a distribuição geográfica e dados parasitológicos da doença.
Todavia, sua importância só foi evidenciada na década de 50 com a realização,
por Pellon & Teixeira (1950), do grande inquérito coproscópico nacional de
prevalência, inicialmente no nordeste do país e, posteriormente, em áreas
supostamente não endêmicas do sul e sudeste. Desde então, houve um
crescimento exponencial nas pesquisas sobre o Schistosoma mansoni e a doença
por ele provocada (KATZ & PEIXOTO, 2000; ANDRADE, 2002; COURA &
AMARAL, 2004; SOUZA et al., 2008).
A esquistossomose mansônica é causada pelo trematódeo Schistosoma
mansoni e constitui uma das doenças parasitárias mais importantes com elevada
prevalência nos países em desenvolvimento. Apesar dos esforços de inúmeros
países, estima-se que cerca de 200 milhões de pessoas estejam infectadas, onde
120 milhões são sintomáticos e 20 milhões sofrem severamente com a doença
(OPAS, 2011). Esta doença é um grande problema de saúde pública, afetando
principalmente as zonas rurais, estando associada à pobreza e a falta de
saneamento devido ao baixo desenvolvimento econômico (MUNIZ-JUNQUEIRA,
TOSTA & PRATA, 2009; PALMEIRA et al. 2010; TIBIRIÇA et al. 2011).
No Brasil, a esquistossomose mansônica afeta mais de 6 milhões de
pessoas e está presente, de forma endêmica, do Maranhão até Minas Gerais,
com focos no Pará, Piauí, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina,
Goiás, Distrito Federal e Rio Grande do Sul (Figura 1). As principais causas de
óbito estão relacionadas às formas clínicas graves. Estima-se que cerca de 25
18
Fundamentação teórica
_________________________________________________________________
milhões de pessoas vivem em áreas sob o risco de contrair essa doença (SVS –
MS, BRASIL, 2009; WHO, 2010; OPAS, 2011).
FIGURA 1 - Áreas endêmicas e focais da esquistossomose mansoni. Fonte: SVS/MS, Brasil 2009.
O ciclo de vida do Schistosoma mansoni é complexo, envolvendo uma fase
de reprodução sexuada no hospedeiro definitivo, no caso, um hospedeiro
vertebrado (homem ou outro animal suscetível), e uma fase assexuada no
hospedeiro intermediário, este representado pelos moluscos aquáticos do gênero
Biomphalaria. Em humanos infectados, os parasitas na fase adulta se
desenvolvem na luz dos vasos sanguíneos habitando, preferencialmente, as
vênulas do plexo hemorroidário superior e as ramificações mais finas das veias
mesentéricas, onde põem seus ovos. Depois de atravessarem a mucosa
intestinal, os ovos são eliminados com as fezes. Em contato com águas
superficiais, os ovos eclodem e libertam os miracídios, que nadam até encontrar o
hospedeiro intermediário, onde se alojam (SOUZA et al., 2011).
Posteriormente, os moluscos contaminados liberam as cercárias, que
voltam ao meio aquático e infectam um hospedeiro vertebrado. Ao penetrar na
19
Fundamentação teórica
_________________________________________________________________
pele ou mucosas deste hospedeiro, as cercárias perdem sua cauda bifurcada,
transformando-se em esquistossômulos. Estes atingem a circulação sanguínea e,
posteriormente, o sistema porta intra-hepático, onde se desenvolvem, alcançam a
fase adulta, reproduzem e eliminam seus ovos, reiniciando o ciclo. Devido à sua
localização no corpo humano, o parasita ocasiona obstrução das veias do
intestino e fígado, sendo esta a causa da maioria dos sintomas da doença que
podem tornar-se crônicos e levar à morte (SOUZA et al., 2011).
A fase inicial da doença pode ser assintomática ou sintomática
caracterizada por dermatite cercariana. A fase tardia, caracterizada pelas formas
crônicas, inicia-se a partir dos seis meses após a infecção, podendo durar vários
anos. Podem surgir os sinais de progressão da doença para diversos órgãos,
chegando a atingir graus extremos de severidade, como hipertensão pulmonar e
portal, ascite e ruptura de varizes do esôfago (SVS – MS, BRASIL, 2009).
Atualmente, no Brasil, apenas dois fármacos esquistossomicidas são
utilizados: a oxamniquina e o praziquantel. A oxamniquina apresenta efeitos
colaterais no sistema nervoso central, efeitos mutagênicos e carcinogênicos. A
distribuição deste fármaco não é adequada, uma vez que a única indústria
farmacêutica que o produz e comercializa mantém sua produção reduzida. Assim,
o praziquantel é atualmente o fármaco de escolha para o tratamento da
esquistossomose no Brasil, devido ser altamente efetivo contra esta patologia,
apresenta pouco ou nenhum efeito adverso e, nos últimos anos, seu preço tem
sido reduzido substancialmente.
2.2. PRAZIQUANTEL
O praziquantel (PRZ) foi desenvolvido no início da década de 70, como
resultado de um trabalho cooperativo entre as indústrias farmacêuticas Bayer AG
e a Merck. O medicamento ficou disponível no mercado internacional a partir da
década de 80, e segundo a publicação Tropical Disease Report (Twelfth
Programme for Research and Training in Tropical Diseases, 1995) foi
demonstrada, em pouco tempo, sua maior eficácia e menor toxicidade em relação
aos demais fármacos esquistossomicidas (WHO, 1998; BERGE et al., 2011). É
20
Fundamentação teórica
_________________________________________________________________
também o único agente ativo contra todas as cinco espécies de esquistossomo,
além de atuar frente a outros helmintos patogênicos ao homem, sendo altamente
eficaz contra as formas adultas e larvares de cestóides tais como Taenia solium,
Taenia saginata e Himenolepis nana (ARAGON et al, 2009).
Conforme visto, o PRZ é a principal forma de tratamento para a
esquistossomose no Brasil. Sua ação anti-helmíntica ocorre, provavelmente,
devido à inibição da bomba de Na+ e K+ dos esquistossomos, aumentando a
permeabilidade da membrana do helminto a certos cátions monovalentes e
bivalentes, principalmente o cálcio que leva à intensificação da atividade
muscular, seguida por contração e paralisia espástica. Como consequência, os
helmintos se separam dos tecidos do hospedeiro e são rapidamente deslocados
das veias mesentéricas para o fígado, ao passo que os helmintos intestinais são
expelidos (LACY et al., 2010; VITORINO et al., 2012).
O PRZ também compromete o tegumento do parasita, disponibilizando
novos antígenos, e como resultado, ele pode torna-se mais suscetível às
respostas imunológicas normais do hospedeiro (GREENBERG, 2005; ARAGON
et al., 2009).
O PRZ [(±)-2ciclo-hexilcarbonil-1, 2, 3, 6, 7,11b-hexa-hidro-4H-pirazino
(2,1-a) isoquinolin-4-ona, C19H24N2O2] (Figura 2), pertence ao grupo químico
isoquinolino-pirazino (VITORINO et al., 2012), apresenta-se como um pó fino
branco, inodoro, solúvel em etanol, facilmente solúvel em clorofórmio e
diclorometano; com faixa de fusão entre 136 °C e 140 °C (FARMACOPÉIA
BRASILEIRA, 2010).
O
H
N
N
O
FIGURA 2 - Representação esquemática da estrutura química do PRZ.
No entanto, este fármaco é pouco solúvel em água (0,4 mg/mL), o que
limita a utilização na forma líquida e constitui um desafio para a formulação de
comprimidos (MOURÃO et al., 2005). Isto ocorre devido às suas propriedades
21
Fundamentação teórica
_________________________________________________________________
biofarmacêuticas (classe II no Sistema de Classificação Biofarmacêutico)
(LINDENBERG, KOPP & DRESSMAN, 2004; SOUZA, FREITAS & STORPIRTS,
2007), o qual possui baixa solubilidade em água e alta permeabilidade; sendo
rapidamente absorvido pelo trato gastrintestinal e também rapidamente excretado
(SILVA, 2006). Estas características tornam necessária a administração de uma
maior dose de fármaco para alcance do efeito terapêutico.
O PRZ, na apresentação de comprimidos de 600 mg, é administrado por
via oral na forma de 20 mg/kg, três vezes em um dia de tratamento com intervalos
de, no mínimo, 4 h e, no máximo, 6 h, ou dose única de 40-60 mg/kg
(KOROLKOVAS, 2000; REY, 2001; MONTRESOR et al., 2002; CINERMAN,
2005; SILVA, 2006; BRASIL, 2009; LACY, 2010), o que potencialmente promove
maior possibilidade de reações adversas.
A pesquisa crescente em sistemas de liberação de fármacos é
impulsionada pelo aumento na quantidade de fármacos lipofílicos e por novas
oportunidades de simplificar o perfil de carreadores provenientes da inovação
tecnológica (CHUAN et al., 2012). Os sistemas de liberação de fármacos e a
nanotecnologia farmacêutica apresentam algumas estratégias para o aumento da
solubilidade aparente ou da velocidade de dissolução do PRZ. Algumas dessas
estratégias já estão descritas na literatura, como: os complexos de inclusão com
ciclodextrinas (BECKET, SCHEP & TAN, 1999; JESUS et al., 2006); as
dispersões sólidas, lipossomas (AMMAR et al., 1994; MOURÃO et al., 2005;
FREZZA et al., 2007); os sistemas micro/nanoparticulados (MAINARDES et al.,
2006; PASSERINI et al., 2006); e, até mesmo, os implantes poliméricos de uso
subcutâneo (CHENG, LEI e GUO, 2010). Além disso, o PRZ também é um
fármaco amplamente utilizado em medicina veterinária.
Recentemente foi aprovada, nos testes clínicos de fase I, a primeira vacina
para prevenção da esquistossomose, mostrando ser segura e capaz de induzir
imunidade à doença (FIOCRUZ, 2012). No entanto, ainda há muito a se fazer
para a completa imunização de todos os habitantes, principalmente das áreas
endêmicas, e eliminação desta doença, o que ainda torna necessário a
disponibilidade de formulações mais efetivas para tratamento dos pacientes
infectados.
22
Fundamentação teórica
_________________________________________________________________
Na literatura não foi encontrado até o presente, trabalho que envolva
incorporação do PRZ em sistemas emulsionados lipídicos, o que configura
claramente a inovação desta proposta.
2.3. EMULSÕES
A palavra emulsão (EM) deriva do verbo latino emulgeo, que significa
mungir, aplicando-se, de um modo geral, a todas as preparações de aspecto
leitoso com as características de um sistema disperso de duas fases liquidas.
Atribui-se a Grew a obtenção das primeiras emulsões para uso medicinal
(PRISTA et al., 1995).
Uma emulsão é um sistema constituído basicamente por uma fase líquida
dividida na forma de gotículas no interior de outro líquido imiscível, estabilizada
por tensoativos associados ou não a cotensoativos (OLIVEIRA et al., 2004;
MCCLEMENTS, 2012; TANG et al., 2013). Correspondem a sistemas de
liberação convenientes para incorporação, proteção e liberação de fármacos
pouco solúveis em água (LI et al., 2012). Apresentam-se como sistemas
termodinamicamente instáveis cineticamente dependentes da formulação e
técnica de obtenção (FERNANDEZ et al., 2004). Assim, não se formam
espontaneamente e suas propriedades dependem não apenas de condições
termodinâmicas como também do método de preparo, das características de cada
componente e da ordem de adição dos mesmos (LIN, KURIHARA & OHTA, 1975;
SAJJADI, 2006a; MCCLEMENTES, 2012; ZHANG, LIU & FAN, 2013).
A fase que está presente como gotículas nas emulsões é geralmente
chamada de fase interna, descontínua ou dispersa, enquanto a fase na qual as
gotículas encontram-se dispersas é denominada de fase externa, dispersante ou
contínua. A maioria das emulsões tem gotículas com diâmetros de 0,1 a 100 µm e
consiste em sistemas inerentemente instáveis (CONSTANTINIDES, TUSTIAN &
KESSLER, 2004; AULTON, 2005; MCCLEMENTES, 2012).
As emulsões simples são compostas basicamente de três componentes:
água, óleo e tensoativo, sendo que as propriedades físico-químicas destes
influenciam consideravelmente o comportamento do sistema (SAJJADI, ZERFA,
23
Fundamentação teórica
_________________________________________________________________
BROOKS, 2003). Podem ser classificadas em dois tipos distintos, de acordo com
a natureza da respectiva fase dispersa, como emulsão óleo em água (O/A), no
caso da fase orgânica imiscível dividida no interior da água ou solução aquosa. O
inverso corresponde às emulsões do tipo água em óleo (A/O) (AULTON, 2005;
USHIKUBO & CUNHA, 2012), conforme Figura 3. Nas emulsões lipídicas, a fase
orgânica consiste em um tipo de óleo de origem mineral, vegetal ou sintético.
FIGURA 3 - Representação esquemática de emulsões do tipo O/A (a) e A/O (b). Adaptado de
Oliveira et al., 2004.
A administração parenteral de fármacos lipofílicos é o problema principal no
desenvolvimento de formulações farmacêuticas. As emulsões lipídicas são
sistemas potencialmente interessantes para liberação de fármacos devido a sua
habilidade para incorporar farmacos de baixa solubilidade aquosa dentro da fase
dispersa. Com o uso de emulsões lipídicas, o contato direto do fármaco com os
fluidos e tecidos corporais pode ser evitado minimizando os possíveis efeitos
adversos, além de que são bem aceitáveis por aumentar a biodisponibilidade de
fármacos e por prolongar o efeito farmacológico em comparação com as
formulações convencionais (WANG et al., 2006; HUNG et al., 2007; SCHMIDTS
et al., 2010).
As emulsões lipídicas são usualmente utilizadas como meio para
administração de fármacos insolúveis em água, por dissolução da substância na
fase oleosa de emulsões O/A para prevenir hidrólise, aumentar a fração solúvel
do fármaco ou para a captura do mesmo por infusão (FORMARIZ et al., 2004;
HUNG et al., 2007).
24
Fundamentação teórica
_________________________________________________________________
Para obtenção destes sistemas emulsionados, as propriedades físicoquímicas e a concentração do tensoativo são fatores relevantes para determinar o
tipo de estruturas e as propriedades reológicas do sistema (FORMARIZ et al.,
2010). Outra variável importante é a escolha da fase oleosa, pois, além de
garantir a biocompatibilidade do sistema, deve levar a obtenção de sistemas
cineticamente estáveis.
Os tensoativos são essenciais para estabilizar os sistemas emulsionados.
Geralmente, estas moléculas se auto-arranjam em água ou em óleo, levando à
formação de microestruturas bem definidas como micelas, cristais líquidos ou
sistemas emulsionados (FORMARIZ et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2004; URBAN,
MAINARDES & GREMIÃO, 2009; YANG et al., 2013; XIN et al., 2013).
Os agentes emulsionantes são moléculas constituidas por uma parte polar
(hidrofílica)
e
uma
parte
apolar
(lipofílica)
razoavelmente
equilibradas,
denominados de anfífilicos, atuando na redução da tensão interfacial. Como
resultado desta estrutura anfifílica, na presença de água e óleo, atraem as partes
oleosa e aquosa do sistema, residindo preferencialmente na interface com seus
grupos orientados para as respectivas fases nas quais é solúvel (SILVA &
SOARES, 1996; AZZINI, 1999; RIBEIRO, 2002; PICHOT et al., 2010;
MAINDARKAR et al., 2013).
Os tensoativos atuam na formação de emulsões por meio de diferentes
mecanismos, como redução da tensão interfacial favorecendo a estabilização
termodinâmica; formação de um filme rígido interfacial, favorecimento da
permanência de barreira mecânica que se opõe a coalescência; formação de uma
dupla camada elétrica na superfície dos glóbulos, o que apresenta barreira
elétrica que evitará a aproximação das partículas (SILVA & SOARES, 1996;
YANG et al., 2013; ZÜGE et al., 2013).
Segundo Azzini (1999), a natureza da interface é fator decisivo na
estabilidade da emulsão, e por isso, a escolha adequada dos tensoativos é muito
importante.
Na tentativa de sistematizar a seleção de tensoativos, Griffin em 1947
desenvolveu um método empírico, conhecido como sistema do Equilíbrio
Hidrófilo-Lipófilo (EHL), que reflete a relação entre as propriedades lipofílicas e
hidrofílicas dos mesmos em escala numérica, atribuindo valores de 1 a 20 para
25
Fundamentação teórica
_________________________________________________________________
aqueles não iônicos. Quanto maior o valor de EHL, maior a hidrofilicidade da
substância. A aplicação de cada tensoativo está relacionada com o valor
calculado para seu EHL: aqueles com valor de EHL baixo tendem a formar
emulsões A/O, enquanto os de valor de EHL alto predispõem a formação de
emulsões O/A. No valor de EHL requerido, o tamanho do glóbulo é mínimo, o que
explica a estabilidade do sistema. Cada matéria prima oleosa possui valor de EHL
requerido para a formação de emulsões estáveis (PRISTA, 1995; LACHMAN,
LIEBERMAN & KANIG, 2001; FLORENCE & ATTWOOD, 2003; AULTON, 2005;
PICHOT et al., 2010; LOSADA-BARREIRO et al., 2013).
2.3.1 Estabilidade de emulsões
Uma emulsão estável pode ser definida como um sistema no qual os
glóbulos
dispersos
mantêm
suas
características
iniciais,
permanecendo
uniformemente distribuídos pela fase contínua (AULTON, 2005; HUCK-IRIART et
al., 2011). A não ser que a tensão interfacial seja zero, os glóbulos tendem a se
aproximar reduzindo a área de contato entre os dois líquidos, favorecendo um
estado de menor energia livre, ou seja, termodinamicamente mais estável
(CAPEK, 2004). Para as emulsões o estado de maior estabilidade termodinâmica
ocorre quando uma camada de óleo está sobre a água. Se as modificações que o
sistema sofre durante o período de análise são mínimas, este sistema pode ser
considerado como cineticamente estável, mesmo que se torne instável num
período de tempo mais prolongado (LACHMAN, LIEBERMAN, KANIG, 2001;
ZHANG, LIU & FAN, 2013).
A instabilidade física de um sistema disperso, em particular, das emulsões,
é causada pela separação de fases, promovendo mudança considerável na
aparência, na consistência, na redispersibilidade e na “performance” do produto
(IDSON, 1993a). Este tipo de instabilidade pode apresentar-se sob vários
mecanismos, tais como, a cremagem (creaming), a floculação, a coalescência ou
a inversão de fases (Figura 4) (HUCK-IRIART et al., 2011; ZHANG, LIU & FAN,
2013). Pode resultar ainda, da instabilidade química como, alteração dos valores
26
Fundamentação teórica
_________________________________________________________________
de pH, hidrólise de tensoativos, contaminação microbiana e processos
fotoquímicos (AZZINI, 1999).
FIGURA 4 - Representação esquemática do processo de instabilidade física de emulsões do tipo
O/A. Sendo a – floculação, b – cremagem, c – acomodação de Ostwald, d – coalescência.
Adaptado de Taylor, 1998.
A floculação, representado pela letra a da Figura 4 pode ocorrer quando as
gotículas se agregam em aglomerados que mantém o filme da fase contínua,
dentro da emulsão, conservando sua identidade individual, mas cada aglomerado
comporta-se fisicamente como uma unidade única. Os glóbulos não coalescem e
podem ser redispersos por agitação. (AULTON, 2005; FRANGE & GARCIA, 2009;
HUCK-IRIART et al., 2011). Acontece em emulsões quando a energia de atração
de Van der Waals excede a energia de repulsão entre as micelas, fazendo com
que essas se aproximem. A floculação pode ser reduzida ou eliminada pela
criação de uma barreira de energia entre as gotículas, prevenindo sua
aproximação (TRADOS, 2004; XIN et al., 2013).
A cremagem (creaming) e a sedimentação (letra b da Figura 4) são
processos ocasionados pela ação da gravidade quando a fase dispersa, conforme
sua densidade relativa à fase contínua, sobe até à superfície ou desce até o fundo
27
Fundamentação teórica
_________________________________________________________________
da emulsão, formando uma camada de emulsão mais concentrada. A floculação
pode ocorrer de modo concomitante ao creaming, mas não necessariamente
(LIEBERMAN et al., 1988; AULTON, 2005).
A acomodação de Ostwald (Ostwald ripening), letra c da Figura 4, acontece
quando as partículas maiores crescem de tamanho devido à dissolução das
partículas menores (WELIN-BERGER & BERGENSTÅHL, 2000; FRANGE &
GARCIA, 2009). A acomodação de Ostwald ocorre devido à diferença de
solubilidade entre pequenas e grandes partículas, ou seja, as gotículas menores,
devido a sua maior solubilidade, tendem a se dissolver durante o armazenamento
e
tornam-se
depositadas
sobre
as
maiores
(TAYLOR,
1998;
WEISS,
CANCELIERE & MCCLEMENTS, 2000; TADROS, 2004; LIM et al., 2011; XIN et
al., 2013).
A coalescência, letra d da Figura 4, resulta da redução da espessura e
ruptura do filme líquido entre as gotículas, ocasionando junção dessas gotículas
e, finalmente, separação da fase oleosa. A coalescência é caracterizada por uma
larga distribuição de tamanho das gotículas, resultando na separação de fases de
forma visível ao olho nu (ZÜGE et al., 2013).
A inversão de fases é resultante da troca de posição entre a fase dispersa
e o meio, ou seja, o meio dispersante forma as gotículas, e as gotículas dispersas
formam a fase contínua (por exemplo, uma emulsão O/A revertendo para emulsão
A/O). A instabilidade física desses processos é bastante complexa e pode ocorrer
simultaneamente ao invés de ocorrer consecutivamente. Dois processos de
inversão de fases podem ser distinguidos: indução pelo aumento do volume da
fração da fase dispersa, e transição produzida por alteração de temperatura e/ou
adição de eletrólitos (TRADOS, 2004; AULTON, 2005; ZÜGUE et al., 2013).
2.3.2 Componentes
Embora muitas emulsões tenham sido descritas na literatura, um grande
desafio para o pesquisador farmacêutico é predizer quais os óleos e tensoativos
são os mais adequados para uma determinada aplicação, levando em conta sua
aceitabilidade e o seu potencial tóxico.
28
Fundamentação teórica
_________________________________________________________________
Os tensoativos não-iônicos são os mais aplicados no desenvolvimento de
sistemas de liberação de fármacos, pois sua concentração micelar crítica é
geralmente muito menor que a dos tensoativos ionicamente carregados, e por
isso são menos irritantes e mais tolerados, apresentam menos problemas de
compatibilidade e são menos sensíveis a mudanças de pH ou à adição de
eletrólitos. Trata-se de um grupo bastante numeroso e integra compostos tanto
hidrossolúveis como lipossolúveis, o que permite obter emulsões A/O ou O/A. É
possível utilizar uma combinação de ambos com o objetivo de obter uma película
interfacial densa, necessário para a formação de emulsões mais estáveis
(MALMSTEN, 1999; AULTON; 2005; ZÜGUE et al., 2013).
Os ésteres de sorbitano também conhecidos como a série Span® (Figura
5), nome como são comercializados, exibem propriedades lipofílicas e tendem a
formar emulsões A/O. Na prática, o mais frequente é utilizá-los em combinação
com polissorbatos para obter emulsões O/A e A/O. Os polissorbatos são
derivados
polietilenoglicólicos
dos
ésteres
de
sorbitano
correspondendo
comercialmente a série dos Tween® (Figura 5). Estes compostos dão melhor
estabilidade à emulsão, assegurando melhor incorporação e liberação controlada
da espécie encapsulada quando comparados com os tensoativos de menor
massa molar (JATO, 1997; BONNET et al., 2010b; ZÜGUE et al., 2013).
(a)
(b)
®
®
FIGURA 5 – Estruturas químicas do Tween 80 (a) e Span 80 (b).
29
Fundamentação teórica
_________________________________________________________________
Os polissorbatos além de apresentarem baixa toxicidade, são compatíveis
com praticamente todos os outros tipos de tensoativos, sendo também solúveis
em água. Possuem, por outro lado, um pH neutro e são estáveis ao calor, às
variações de pH e às elevadas concentrações de eletrólitos (JATO, 1997;
AULTON, 2005; HUCK-IRIART et al., 2011).
Entre os principais óleos estudados, o triglicerídeo de cadeia longa de
origem vegetal e os triglicerídeos de cadeia média têm sido utilizados, assim
como o miristato de isopropila e o óleo de soja (TROTTA et al., 2002; POYATO et
al., 2013). O grau de pureza destes óleos deve ser elevado, no sentido de
prevenir a ocorrência de irritação que pode ser provocada pelos contaminantes
presentes em óleos com baixa pureza (CONSTANTINIDES, TUSTIAN &
KESSLER, 2004).
Os óleos tipicamente utilizados para emulsões farmacêuticas consistem de
óleos digeríveis a partir de fontes naturais, incluindo o óleo de soja, óleo da
semente
de
sésamo,
óleo
da
semente
de
algodão
e
semelhantes
(CONSTANTINIDES, TUSTIAN & KESSLER, 2004). Existe uma necessidade
para surgimento de novas formulações que sejam biocompatíveis, não irritantes, e
susceptíveis de serem esterilizadas antes da aplicação (HUNG et al., 2007).
O óleo de soja é um óleo vegetal bastante popular sendo o segundo mais
consumido mundialmente, atrás apenas do óleo de palma. Esse óleo vegetal é
altamente poli-insaturado, sendo particularmente rico em ácidos graxos ômega 3,
portanto possui boa aceitabilidade por suas propriedades nutricionais. No entanto,
esse atributo é simultaneamente a principal causa da baixa estabilidade oxidativa
do óleo (RODRIGUES et al., 2012). A típica composição de soja é principalmente
de ácidos graxos poliinsaturados, incluindo ácido oléico (C18:1), ácido linoléico
(C18:2) e ácido linolênico (C18:3) (WANG et al., 2006).
A função do cotensoativo é diminuir a tensão interfacial para valores abaixo
dos limites proporcionados pelo agente emulsivo comum (tensoativo). No entanto,
nos casos em que os tensoativos são capazes de cumprir integralmente essa
função, a presença dos cotensoativos não é necessária e a composição da
microemulsão restringe-se aos outros três componentes (OLIVEIRA et al., 2004).
30
Fundamentação teórica
_________________________________________________________________
O álcool etílico e o álcool benzílico (Figura 6) são amplamente utilizados
em várias formulações farmacêuticas e industriais e são largamente usados como
solventes orgânicos.
(a)
(b)
FIGURA 6 – Estruturas químicas do álcool etílico (a) e álcool benzílico (b).
Devido à sua polaridade e baixa toxicidade, o álcool benzílico é usado
como um solvente geral e como um diluente para substâncias aromatizantes em
alguns alimentos e bebidas (MAULA, WESTERLUND & SLOTTE, 2009). O álcool
etílico é amplamente utilizado em formulações farmacêuticas e cosméticas devido
à baixa toxicidade tópica e a propriedade de se combinar facilmente em
proporções variadas com tensoativos para formar misturas com alto poder de
dissolução (RESENDE et al., 2008).
2.3.3 Diagrama de fases
Na preparação das emulsões, a construção de diagramas de fase (Figura
7) pode ser uma ferramenta fundamental para caracterizar em que condições
experimentais as EM existem e em que proporções dos componentes outras
estruturas tais como microemulsões e cristais líquidos podem estar presentes.
O diagrama ternário é representado no plano como um triângulo equilátero,
onde os três constituintes são simétricos. Os três vértices do triângulo
correspondem a 100% dos constituintes: óleo, tensoativos e água. Na Figura 7,
para determinar as concentrações de cada constituinte no ponto M, deve-se traçar
sucessivamente por este ponto as paralelas aos lados opostos aos vértices 100%
de cada constituinte.
31
Fundamentação teórica
_________________________________________________________________
FIGURA 7 - Representação do Diagrama Ternário. O ponto M representa a concentração de 50%
de fase aquosa, 20% de fase oleosa e 30% de tensoativos.
Os diagramas pseudoternários podem ser obtidos a partir de dados de
titulação ou pela preparação de amplo número de amostras com diferentes
proporções dos componentes. A vantagem do primeiro método é que este pode
ser usado para estudar amplo número de amostras de diferentes composições de
maneira rápida (BHARGAVA et al., 1987; LAWRENCE e REES, 2000).
O presente trabalho propõe um estudo sistemático na busca dos
componentes e técnica de preparo ideal para o desenvolvimento e a
caracterização físico-quimica de um sistema emulsionado lipídico (emulsão do
tipo O/A) para incorporação e aumento da solubilidade aquosa aparente do PRZ,
com a possível administração desse fármaco em uma forma farmacêutica líquida
para tratamento da esquistossomose.
32
Objetivos
_________________________________________________________________
3.
OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Desenvolver um sistema emulsionado lipídico (emulsão do tipo O/A), para
incorporação e aumento da solubilidade aquosa aparente do praziquantel (PRZ),
com a possível administração desse fármaco em uma forma farmacêutica líquida.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obtenção e estudo da estabilidade de emulsão óleo de soja/água,
empregando a associação de tensoativos não iônicos (Tween ® 80 e Span®
80) em diferentes proporções;

Estudo da dinâmica de formação de sistemas coloidais envolvendo os
componentes utilizados, pelo diagrama de fases pseudoternário;

Efeito da adição de cotensoativos na estabilidade do sistema emulsionado;

Validar a metodologia analítica a ser utilizada na quantificação do PRZ;

Avaliar a incorporação do PRZ nos sistemas emulsionados obtidos;

Estudo do efeito da quantidade do PRZ, relação tensoativos/fase oleosa na
estrutura das dispersões coloidais e parâmetros importantes de dispersão
como:

Determinação da distribuição e do tamanho de gotículas
dispersas utilizando a técnica de espalhamento dinâmico da luz
(Dynamic Light Scattering);

Caracterização, através de medidas de potencial zeta, da
superfície das gotículas dispersas;

Determinação
do
comportamento
reológico
dos sistemas
emulsionados.
33
Materiais e métodos
_________________________________________________________________
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1.
REAGENTES E SOLVENTES
 Praziquantel (Roche, Brasil, doado pela Fio Cruz);
 Água obtida por meio de purificador do tipo osmose reversa
(condutividade média:1,25 µS/cm);
 Álcool benzílico absoluto (Fenilmetanol, Synth, Brasil);
 Álcool etílico absoluto (Etanol, 99,5 %, Synth, Brasil);
 Tween® 80 [Monooleato de polioxietileno (20) sorbitano Synth,
Brasil];
 Span® 80 (Monooleato de sorbitano, Sigma Aldrich, EUA);
 Oleato de sódio (Sigma Aldrich, EUA);
 Fosfatidilcolina de soja (Lipóide S®100, Gerbras, Brasil);
 Óleo de soja (Sigma Aldrich, EUA).
4.2. EQUIPAMENTOS E ACESSÓRIOS
 Balança analítica (GEHAKA, modelo: AG-200);
 Espectrofotômetro UV-Vis (Thermo Scientific Evolution 60);
 Condutivímetro Microprocessado de Bancada (TECNOPON, modelo:
MCA 150);
 Banho-Maria de Bocas Microprocessado (QUIMIS, modelo: Q334M28);
 Ultra-turrax (IKA T18 basic);
 pHmetro de bancada (PG1800, Gehaka);
 Centrífuga de Bancada (Excelsa® II modelo 206 BL);
 Vortex Motion II (Logen);
 Estufa de Esterilização e Secagem Línea (Olidef CZ);
 Reômetro (Anton Paar Physica MCR – 301 Rheometer);
 ZetaPlus (Brookhaven Instruments Co., EUA);
34
Materiais e métodos
_________________________________________________________________
 Microscópio óptico Trinocular (DM 500 – Leica);
 Refratômetro Abbe Digital de Bancada (Quimis).
4.3.
DESENVOLVIMENTO
E
VALIDAÇÃO
DO
MÉTODO
DE
ANÁLISE
QUANTITATIVA DO PRZ
O método para análise quantitativa do PRZ, em solução alcoólica foi
validado empregando a técnica de espectrofotometria na região do ultravioleta, de
acordo com os parâmetros estabelecidos na resolução RE 899 da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) 2003 e no Guia do International
Conference on Harmonisation (ICH) 1996. Estes parâmetros compreenderam:
especificidade, linearidade, intervalo, precisão, exatidão e robustez.
4.3.1 Especificidade
A especificidade do método proposto foi avaliada comparando-se os
espectros de absorção obtidos na região de ultravioleta apresentando um
comprimento de onda de 200 a 400 nm da (a) solução do PRZ na concentração
de 0,4 mg/mL, obtida a partir de uma diluição da solução estoque; (b) matriz do
sistema emulsionado com o PRZ incorporado na concentração de 0,4 mg/mL; e,
(c) matriz do sistema emulsionado. Esta matriz era composta por 70% de água,
25% de óleo de soja e 5% de tensoativos. Foram utilizadas duas associações
diferentes de tensoativos: oleato de sódio e fosfatidilcolina de soja; e, Tween® 80
e Span® 80.
4.3.2 Curva padrão
A solução estoque de fármaco foi preparada com 0,05 g de PRZ
dissolvidos em uma quantidade suficiente de álcool etílico PA e, em seguida,
diluída em balão volumétrico de 50,0 mL com álcool etílico para obter a
concentração de 1,00 mg/mL. Diferentes alíquotas desta solução foram
35
Materiais e métodos
_________________________________________________________________
transferidas para balões volumétricos de 10,0 mL e o volume foi completado com
etanol a fim de obter soluções de diferentes concentrações (0,08; 0,16; 0,24; 0,32;
0,40; 0,48; 0,56; 0,64; 0,72 e 0,80 mg/mL). A absorbância das soluções foi
determinada por espectrofotometria na região do ultravioleta em 264 nm, usando
cubeta de quartzo de 1 cm e álcool etílico como branco. A partir da curva padrão
obtida, ou seja, da relação gráfica entre a concentração do fármaco (mg/mL) em
função dos valores de absorbância obtidos, foi realizada uma regressão linear
determinando, assim, a equação da curva e seu coeficiente de correlação. Todas
as concentrações de PRZ utilizadas neste estudo resultaram em valores de
absorbância inferiores a 2, seguindo, desta forma, a Lei de Lambert-Beer.
4.3.3 Linearidade e Intervalo
A linearidade foi determinada por meio da análise do coeficiente de
correlação da curva padrão do PRZ e o intervalo correspondeu à faixa de
concentração compreendida na curva padrão.
4.3.4 Precisão
A precisão foi avaliada para cinco concentrações diferentes de PRZ na
curva padrão (0,16; 0,24; 0,40; 0,56; e, 0,64 mg/mL) e os ensaios foram
realizados em triplicada. Este parâmetro foi estudado em um curto intervalo de
tempo, pelo mesmo analista (precisão intra-corrida) e em dias diferentes (precisão
inter-corrida).
4.3.5 Exatidão
A exatidão foi determinada pelo método do placebo contaminado (Equação
1), avaliando-se a adição e a recuperação do método em cinco níveis de
concentração de PRZ e em quintuplicata (n = 5). Em 1000 mg da matriz do
sistema emulsionado (70% de água + 25% óleo de soja + 5% tensoativos), foram
36
Materiais e métodos
_________________________________________________________________
adicionadas quantidades conhecidas da solução estoque do PRZ a fim de obter
diferentes concentrações deste fármaco (0,16; 0,24; 0,40; 0,56; e, 0,64 mg/mL). A
recuperação do método de análise proposto foi obtida para dois tipos de
associações de tensoativos: oleato de sódio e fosfatidilcolina de soja; e, Tween®
80 e o Span® 80; conforme descrito no ensaio de especificidade.
Exatidão = 100 
Concentração média experimental de PRZ
Concentração teórica de PRZ
(1)
4.3.6 Robustez aparente
Para verificar a robustez do método, foram avaliadas as variações na curva
padrão à medida que também alterava a concentração do PRZ na amostra e a
concentração do álcool etílico utilizado como solvente das soluções analíticas. As
análises foram realizadas em quintuplicata para cinco níveis de concentração de
PRZ (0,16; 0,24; 0,40; 0,56 e 0,64 mg/mL) e três níveis de concentração de álcool
etílico (99,5; 90 e 85 % v/v).
4.4. ESTUDO DA OBTENÇÃO E ESTABILIDADE DE EMULSÃO TIPO O/A COM
ÓLEO DE SOJA
4.4.1 Construção do diagrama de fases
Com o intuito de se determinar a melhor proporção de tensoativos para a
construção do diagrama de fases, inicialmente realizou-se o estudo para
determinação do melhor valor de EHL.
Para o presente estudo foram escolhidos dois tensoativos não iônicos, um
hidrofílico Tween® 80 ( EHLTw80  15 ) e um hidrofóbico Span® 80 ( EHLSp80  4,3 ),
(Figura 5). As concentrações dos componentes utilizados foram: 85% de água,
10% de óleo de soja e 5% de tensoativos. Segundo Griffin, emulsões do tipo O/A
37
Materiais e métodos
_________________________________________________________________
são produzidas usando uma combinação de tensoativos com valor de EHL entre 9
e 12.
O estudo da proporção de tensoativos foi determinado anteriormente
dentro do nosso grupo de pesquisa, conforme mudança de valor do EHL, a qual
variou de 4,3 a 15 (STRECK, 2013). Para o presente estudo, foram comparados
apenas os melhores resultados que correspondem aos valores de EHL entre 8 e
11 associando diferentes quantidades de Tween® 80 e Span® 80. O cálculo da
razão de cada tensoativo na mistura foi realizado pela aplicação da Equação 2 e
3:
%Tw80 =
100  ( x  EHLSp80 )
EHLTw80  EHLSp80
,
%Sp80  100  %Tw80 ,
(2)
(3)
sendo %Tw80 a concentração percentual do tensoativo hidrofílico (Tween® 80) e
%Sp80 a concentração porcentual do tensoativo hidrofóbico (Span ® 80) necessários
para obter uma mistura com valor x de EHL (AULTON, 2005).
As emulsões foram preparadas pelo método de inversão de fases a 70 ± 2
ºC, no qual a fase aquosa (água purificada) foi vertida sobre a oleosa contendo os
tensoativos, sob agitação constante em um ultra turrax a 11000 rpm durante um
minuto, seguido por agitação de 7000 rpm por dez minutos. As condições de
temperatura de inversão de fases, a velocidade e o tempo de agitação foram
previamente padronizados em nosso laboratório (STRECK, 2013). O produto foi
deixado em repouso por 24 horas, em um recipiente hermeticamente fechado à
temperatura ambiente.
Para escolha do melhor EHL, as emulsões foram submetidas a ensaios de
estabilidade preliminar utilizando o índice de cremagem como parâmetro. As
analises foram realizadas, 24 horas antes e após a centrifugação [950 (x g) por 30
min] e 7 dias depois da preparação das emulsões. O ensaio foi realizado em
duplicata.
O índice de cremagem (IC) foi mensurado por meio de um paquímetro
digital, sendo calculado de acordo com a Equação 4.
38
Materiais e métodos
_________________________________________________________________
IC  100 
hc
,
ht
(4)
h
sendo IC corresponde ao valor em porcentagem do índice de cremagem, c ao
valor da altura da camada de creme e
ht é o valor total da altura da emulsão
contida no tubo. De acordo com esta equação, é importante notar que um valor
menor de IC é indicativo de uma emulsão mais estável.
Depois de estabelecido o melhor EHL para estudo e consequentemente a
melhor proporção de tensoativos, partiu-se para a construção de um diagrama de
fases para determinação da região de emulsão utilizando-se dos mesmos
constituintes (água, óleo de soja e Tween 80® + Span 80®), sendo que cada
vértice do diagrama indica um destes componentes.
As amostras foram preparadas partindo-se de uma mistura de tensoativos
e fase oleosa variando a proporção entre 1:9 a 9:1 de acordo com a Tabela 1.
TABELA 1 - Proporção entre mistura de tensoativos e fase oleosa para determinação do diagrama
de fases.
Proporção da mistura de tensoativos: fase oleosa
1:9
2:8
3:7
4:6
5:5
6:4
7:3
8:2
9:1
Cada ponto do diagrama foi obtido por titulação com água purificada obtida
em aparelho de osmose reversa a 70 ± 5ºC, utilizando micropipetas automáticas.
Após cada titulação a amostra foi homogeneizada a 7000 rpm em um aparelho
Ultra turrax.
Durante o processo de titulação, os tipos de sistemas formados e suas
fluências foram analisados visualmente. Os volumes de água adicionados às
preparações e que provocaram tais alterações foram anotados.
Após a titulação aquosa foram calculadas as concentrações de cada
componente da formulação obtendo-se pontos os quais foram utilizados na
delimitação das diferentes regiões existentes no diagrama de fases. Dessa forma
delimitaram-se os pontos em que se deu a transição de fases de sistema
emulsionado opaco branco (SEOB), sistema emulsionado opaco amarelo (SEOA),
sistema translúcido (ST) ou separação de fases (SF).
39
Materiais e métodos
_________________________________________________________________
4.4.2 Efeito dos cotensoativos na estabilidade acelerada da emulsão
Depois de selecionado o melhor valor de EHL para a emulsão em estudo,
foi realizada a análise do efeito da adição de cotensoativos (álcool etílico ou álcool
benzilico) na estabilidade preliminar do sistema emulsionado.
O estudo do efeito da presença de álcool etílico e do álcool benzílico
(Figura 6) como cotensoativos na estabilidade aparente da emulsão foi realizado
para cada substância em três diferentes concentrações (5, 10 e 15% m/m) em
relação à concentração de tensoativos. Os ensaios foram realizados em triplicata
e a emulsão sem cotensoativos foi utilizada como controle.
As emulsões foram preparadas de acordo com o item 4.4.1, sendo os
cotensoativos adicionados diretamente na fase oleosa momentos antes da
inversão de fases. Logo após foram acondicionadas em frascos de vidro
hermeticamente fechados.
O ensaio consistiu em submeter as amostras a ciclos de 72 horas (Figura
8), em diferentes condições de temperatura, a fim de avaliar a estabilidade
acelerada das amostras frente a mudanças bruscas de temperatura (ANVISA,
2004).
24 horas
REFRIGERAÇÃO
AQUECIMENTO
4 ± 2ºC
45ºC
Ciclo de 72 horas
24 horas
24 horas
TEMPERATURA AMBIENTE
25 ± 2ºC
FIGURA 8 - Esquematização do ciclo tempo versus temperatura, o qual as emulsões foram
submetidas.
40
Materiais e métodos
_________________________________________________________________
Cada ciclo correspondeu a 24 h sob temperatura ambiente (25 ± 2 °C), 24
h sob aquecimento (45 °C) e 24 h sob refrigeração (4 ± 2 °C), completando assim
um ciclo, de acordo com a Figura 8.
As amostras foram avaliadas em intervalos de tempo pré-determinados: 1º,
7º, 15º e 30º dia. O 1º dia do teste, nesta metodologia, corresponde a vinte e
quatro horas após o preparo das formulações. Os parâmetros avaliados foram pH,
condutividade elétrica, índice de cremagem e turbidez.
O índice de cremagem foi aferido por meio de um paquímetro digital e
calculado conforme a Equação 4.
Para medida da condutividade elétrica, aferiu-se o condutivímetro com uma
solução padrão de KCl 0,1N, em seguida determinou-se a condutividade elétrica
das emulsões inserindo o eletrodo diretamente na amostra à temperatura
ambiente (25 ± 2 °C). Já para medir o pH, as emulsões foram diluídas com água
(1:10 v/v), e as análises foram também realizadas à temperatura ambiente (25 ± 2
°C). Para verificar a turbidez, as emulsões foram diluídas com água purificada
(1:20 v/v) e as medidas foram realizadas em um espectrofotômetro UV-Vis no
comprimento de onda de 860 nm, utilizando cubeta de vidro com caminho óptico
de 1 cm (POLICONTROL, 2006).
4.5. ESTUDO DE INCORPORAÇÃO DO PRZ NA EMULSÃO ÓLEO DE
SOJA/ÁGUA
Neste estudo, o PRZ foi adicionado às emulsões por meio de dois métodos
diferentes. No primeiro, o PRZ foi adicionado diretamente na fase oleosa da
emulsão (TIF) antes da inversão de fases; enquanto que no segundo, o PRZ foi
adicionado diretamente na emulsão formada à temperatura ambiente (EF). Em
ambos os testes, o fármaco foi adicionado em excesso e a emulsão submetida a
uma agitação no vortex periodicamente durante um minuto, seguida de quinze
minutos em banho de ultrassom a cada 12 horas durante um período de 72 horas.
Após essa etapa, as emulsões foram centrifugadas por 30 minutos na velocidade
de 950 (x g) e uma alíquota foi retirada da porção média do tubo. Em seguida,
41
Materiais e métodos
_________________________________________________________________
cada alíquota foi filtrada em uma membrana apresentando um diâmetro de poro
de 0,45 µm para obter 0,5 g do filtrado, o qual foi transferido para um balão
volumétrico de 25,0 mL e o volume completado com álcool etílico. Os valores de
concentração de PRZ foram determinados usando um espectrofotômetro UVvisível, a um comprimento de onda de 264 nm, a partir de uma curva de
calibração, conforme a metodologia analítica validada (item 4.3.).
Em decorrência do resultado obtido no estudo 4.4.2, o efeito da adição de
álcool etílico como cotensoativo na concentração de 15% m/m (em relação à
concentração da associação dos tensoativos Tween® 80 e Span® 80) foi também
avaliado, para verificação do aumento do teor de fármaco incorporado. Neste
estudo, o fármaco foi adicionado na fase oleosa antes da inversão de fases.
Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
4.6.
ESTUDO DA INTERAÇÃO DO PRZ COM OS COMPONENTES DA
EMULSÃO
Ao adicionar o fármaco nos sistemas emulsionados foi observada a
alteração da viscosidade dos sistemas. Um estudo foi realizado para avaliar o
efeito da composição na eficiência de incorporação do PRZ e da sua presença na
estrutura dos sistemas.
4.6.1
Interação
fármaco-componentes
nas
propriedades
dos
sistemas
emulsionados
Preparo das amostras
Com o intuito de verificar o comportamento do fármaco no sistema
emulsionado, diferentes proporções entre os componentes foram estudadas.
Sendo que todas permaneceram na região de emulsão O/A presente no diagrama
de fases obtido (Figura 12).
Primeiramente, a quantidade da associação dos tensoativos Tween ® 80 e
Span® 80 foi fixada em 5% m/m e foi variada a quantidade da fase oleosa em 5%,
10%, 20% e 30% m/m (respectivamente pontos A, B, C e D da Figura 12).
42
Materiais e métodos
_________________________________________________________________
Posteriormente, a quantidade de fase oleosa foi fixada em 10% m/m e foi variada
a concentração da associação dos tensoativos Tween ® 80 e Span® 80 em 1%,
2,5%, 5% e 10% m/m (respectivamente pontos E, F, B, G da Figura 12). Em
seguida, as quantidades de óleo de soja e associação de tensoativos foram
fixadas em 10% e 5% m/m, respectivamente, enquanto que a quantidade de PRZ
incorporada foi variada em 0,125%, 0,250%, 0,500%, 0,750% e 1,0% m/m. Para
melhor ilustração, todas essas formulações estão indicadas na Tabela 2.
Após a preparação das formulações, ensaios de pH, microscopia óptica,
turbidez, condutividade elétrica, índice de refração, potencial Zeta, diâmetro
médio da gotícula por espalhamento de luz dinâmico e comportamento reológico
dos sistemas foram realizados para acessar as características físico-químicas
desses sistemas.
TABELA 2 - Quantidade em % dos constituintes para formulação.
Tensoativos
1º
2º
3º
Fase oleosa
Fármaco
Fase aquosa
(%)
(%)
(%)
Óleo de soja
PRZ
Água purificada
5,0
5,0
0,0
90,0
FO 10%
5,0
10
0,0
85,0
FO 20%
5,0
20
0,0
75,0
FO 30%
5,0
30
0,0
65,0
T 1%
1,0
10
0,0
89,0
T 2,5%
2,5
10
0,0
87,5
T 5%
5,0
10
0,0
85,0
T 10%
10,0
10
0,0
80,0
PRZ 0,125%
5,0
10
0,125
84,87
PRZ 0,25%
5,0
10
0,250
84,75
PRZ 0,5%
5,0
10
0,500
84,50
PRZ 0,75%
5,0
10
0,750
84,25
PRZ 1%
5,0
10
1,000
84,00
Grupo de
(%)
formulações
Tween® 80
+
Span® 80
FO 5%
Adicionalmente, PRZ em excesso foi adicionado ao primeiro e ao segundo
grupo de formulações com o intuito de averiguar a quantidade de fármaco que
43
Materiais e métodos
_________________________________________________________________
essas emulsões foram capazes de incorporar. A metodologia empregada foi a
mesma do item 4.5. (estudo anterior).
Ensaios de pH, condutividade, microscopia óptica, turbidez e índice de
refração
Para os ensaios de condutividade elétrica, índice de refração e microscopia
óptica, não houve necessidade de diluição das emulsões para adequar aos
parâmetros do aparelho.
Para
avaliação
microscópica,
uma
pequena
quantidade
de
cada
formulação foi colocada sobre uma lâmina de vidro e coberta com uma lamínula
sob ligeira pressão, em seguida foi submetida a análise microscópica na lente de
aumento de 400x de um microscópio óptico com câmera acoplada.
O índice de refração foi determinado nas amostras após 24 h de preparo,
utilizando-se de um refratômetro calibrado com água purificada, cujo índice de
refração a 20 °C é de 1,3330 (KOROLKOVAS, 1988). Conforme metodologia
descrita na Farmacopéia Brasileira (2010), as leituras foram realizadas em
triplicata, colocando-se quantidade suficiente de cada amostra individualmente
para cobrir a face do prisma (KOROLKOVAS, 1988).
Para determinação do pH e da turbidez, as amostras foram diluídas com
água purificada na proporção de 1:10 e foram lidas em um pHmetro digital e em
um espectrofotômetro no comprimento de onda de 860 nm (POLICONTROL,
2006).
Ensaios de diâmetro hidrodinâmico médio e potencial zeta
A análise do diâmetro médio das gotículas e do índice de polidispersidade
foi realizada pela técnica de espalhamento dinâmico de luz (Dinamic Light
Scattering), também denominada espectroscopia de correlação de fótons (PCS do
inglês Photon Correlation Spectroscopy), com um feixe de luz de comprimento de
onda de 659 nm, a 25 ºC, com um ângulo de incidência de 90º, por meio do
software 90Plus/BI-MAS. A aquisição e o tratamento de dados foram realizados
44
Materiais e métodos
_________________________________________________________________
através do software ZetaPALS. Todas as medidas foram realizadas a uma
temperatura constante de aproximadamente 25 °C.
Na obtenção do tamanho da gotícula e do potencial zeta (ζ) as amostras
foram diluídas com água purificada na proporção de 1:100, para uma melhor
condição de preparo da amostra, e foram mensuradas em um Zeta Plus. Se o
sistema é concentrado, ou seja, se a fase dispersa está em elevadas
concentrações, a interpretação torna-se dificultada em razão das interações
intergotículas. Para suprimir a interação entre gotículas, a diluição do sistema com
a fase dispersante foi necessária (LAWRENCE, REES, 2000; FORMARIZ et al.,
2005).
Ensaios de reologia
Para determinação do comportamento reológico, a quantidade de amostra
analisada foi cerca de um grama de cada emulsão. Para todas as emulsões com
exceção das emulsões que continham 0,75 e 1% de PRZ, a geometria de medida,
de material aço inox, utilizada foi a do tipo cone placa de 5 centímetros de
diâmetro com o cone apresentando ângulo de curvatura de 1º e distancia entre as
placas de 0,102 mm. A vantagem desta geometria é que não ocorre variação na
tensão de cisalhamento através da amostra, porque à distância entre o cone e a
placa é muito pequena (da ordem de dezenas ou centenas de microns), fazendo
com que a tensão de cisalhamento seja praticamente uniforme por toda a amostra
(TOKUMOTO, 1996).
Para as outras duas emulsões (PRZ 0,75% e PRZ 1%) foi utilizada a
geometria placas paralelas de material aço inox com diâmeto de 3,5 centímetros,
devido a viscosidade dessas amostras ser diferente e, portanto, não haver uma
correta aferição da reologia para os sistemas.
Durante o ensaio, a temperatura foi mantida constante em 25,0 ± 0,1 ºC
com o auxílio de um banho termostatizado. Os dados do segmento ascendente e
descendente do gradiente de cisalhamento foram plotados em um modelo de leis
de potência utilizando o software Rheoplus/32 (dados V3.60 da versão) para
descrever as características de fluxo das EM. As leituras foram feitas no intervalo
de 0 a 100 s-1 (curva ascendente) e 100 s-1 a 0 (curva descendente).
45
Materiais e métodos
_________________________________________________________________
Para os testes de fluxo e escoamento, os modelos matemáticos utilizados
para determinação do comportamento reológico estão apresentados na Tabela 3,
onde
corresponde à tensão de cisalhamento,
à taxa de cisalhamento e
à
viscosidade.
TABELA 3 - Equações de modelos matemáticos para determinação do comportamento reológico.
Modelo matemático
Equação do modelo
Newton
Bingham
Ostwald de Waele
Herschel-Bulkley
Os parâmetros reológicos da lei de potência são o índice de consistência,
K, que indica o grau de resistência do fluido frente ao escoamento, quanto maior o
valor de K mais “consistente” é o fluido, e o índice de comportamento ou de fluxo,
n, que indica fisicamente o afastamento do fluido do modelo newtoniano. O
modelo de potência pode ser usado para representar fluidos pseudoplásticos (n <
1), fluidos newtonianos (n = 1) ou fluidos dilatantes (n > 1) (KELESSIDIS et al.,
2006; KELESSIDIS, POULAKAKIS, CHATZISTAMOU, 2011).
Apenas as formulações que tiveram comportamento pseudoplástico (PRZ
0,75% e PRZ 1%) foram submetidas ao teste de análise oscilatória. Sendo
realizada na temperatura de 25,0 ± 0,1 ºC, utilizando um reômetro no modo
oscilatório, com geometria de placas paralelas de 2,0 cm de diâmetro, separadas
por uma distância fixa de 0,102 mm. O teste de oscilação realizado foi o de
varredura de frequência. As formulações foram estudadas com solicitações
oscilatórias para determinar a evolução dos módulos de armazenagem (G’) e de
perda (G”) em função da frequência (0,1 Hz a 100 Hz) a uma tensão de amplitude
oscilatória fixa (1,00 Pa) obtida a partir da região viscoelástica linear. As amostras
foram cuidadosamente aplicadas à placa inferior, assegurando o mínimo
cisalhamento.
46
Materiais e métodos
_________________________________________________________________
4.6.2 Efeito do fármaco na estabilidade da emulsão
O aspecto dos sistemas após a incorporação do fármaco levou à suspeita
de que o PRZ poderia estar interagindo com os componentes da formulação
como um tensoativo. Assim, um estudo de estabilidade foi realizado modificandose a concentração da associação dos tensoativos Tween ® 80 e Span® 80 na
emulsão na presença de fármaco. Para isto, três diferentes emulsões foram
produzidas alterando a quantidade da associação dos tensoativos (1%, 2,5% e
5% m/m) onde todas possuíam 1% de PRZ. Os ensaios foram realizados em
triplicata.
Depois de acondicionadas em frascos de vidro hermeticamente fechados,
as formulações foram submetidas a ciclos de 24 horas em diferentes condições
de temperatura como esquematizado na Figura 8. Medidas de índice de
cremagem, turbidez, pH, condutividade elétrica, teor do fármaco e análises de
microscopia óptica foram realizadas à temperatura ambiente (25 ± 2 °C) após o
1º, 7º, 15º e 30º dia da preparação. A preparação das amostras para análise nos
parâmetros citados procedeu à mesma metodologia descrita no item 4.4.2 e 4.5.
4.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados experimentais e analíticos foram expressos como os valores
médios acrescidos dos valores de desvio padrão. Para as comparações entre dois
grupos, foi utilizado o teste t Student´s, enquanto que para a comparação entre
mais de três grupos foi realizada a análise de variância com uma entrada
(ANOVA-One Way), sendo os resultados apresentados da seguinte maneira:
[F(x,y)= valor de F; (p= valor de p)], onde “F” corresponde à variância dos
resultados, “x” corresponde ao número de tratamentos menos um (k - 1), “y”
equivale ao resíduo, ou seja, o numero de amostras (n) menos o numero de
tratamentos (n - k) e “p” equivale ao índice de confiança.
Para confronto dos valores médios estatisticamente diferentes foi utilizado
quando apropriado, o teste Student-Newman-Keus (SNK) para comparações
47
Materiais e métodos
_________________________________________________________________
múltiplas e o teste de Dunnet para comparações em relação a um grupo controle,
sendo considerados significativamente diferentes os valores de p < 0,05.
48
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA ANÁLISE
QUANTITATIVA DO FÁRMACO
A validação do método analítico é um passo obrigatório para avaliar a
capacidade do método desenvolvido de fornecer resultados precisos para a sua
aplicação de rotina. A utilidade de um método analítico baseia-se nos valores dos
parâmetros de validação (ROZET et al., 2011). A validação deve garantir, por
meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das
aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto,
deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade,
limite de quantificação, exatidão, adequados à análise (ANVISA - BRASIL, 2003;
ICH, 1996). Dessa forma, iniciou-se a validação do método analítico realizando
uma varredura do comprimento de onda do PRZ com e sem a presença das
matrizes.
A Figura 9 apresenta o espectro de absorção na região do ultravioleta.
264 nm
Absorbancia (A)
0,6
0,4
0,2
0,0
200
225
250
275
300
325
Comprimento de onda (nm)
FIGURA 9 - Espectros de ultravioleta obtidos na região de 200 - 400nm. Sendo: azul = PRZ,
®
®
vermelho = Tween 80 + Span 80, verde = tween + span + PRZ, laranja = FS + OS + PRZ, lilás =
FS + OS.
49
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
Tal espectro foi obtido na faixa de 200-400nm da solução matriz com 1,00
g de emulsão (70% água destilada; 25% óleo de soja; 2,5% fosfatidilcolina de
soja; 2,5% oleato de sódio) e (70% água destilada; 25% óleo de soja; 2,5%
Tween® 80; 2,5% Span® 80), solução de PRZ (0,4 mg/mL) e solução do fármaco
juntamente com as matrizes (PRZ + MATRIZ).
O método de análise proposto mostrou-se seletivo e específico para ambos
os tipos de emulsões, mostrando que a matriz não absorve energia no
comprimento de onda selecionado para a análise quantitativa do PRZ e assim os
componentes da matriz não influenciam na determinação do fármaco.
Depois de observada a especificidade e seletividade do método, a curva
padrão do fármaco em solução alcoólica foi obtida por espectrofotometria na
região ultravioleta. A Figura 10 apresenta a curva padrão do fármaco em solução
alcoolica obtida por espectrofotometria na região ultravioleta.
Absorbancia (A)
1,2
0,8
0,4
0,0
0,0
0,3
0,6
0,9
Concentraçao (mg/mL)
FIGURA 10 - Curva padrão de PRZ em solução alcoólica obtida por espectrofotometria UV-vis em
264 nm.
A equação da reta foi y = 1,1912x + 0,0993 e a análise quantitativa do PRZ,
proposta pelo método de espectrofotometria, mostrou linearidade na faixa de
concentração de trabalho, de 0,08 a 0,80 mg/mL, o coeficiente de correlação
calculado foi r2 > 0,99984, valor que se encontra de acordo com limite adequado
estabelecido (ANVISA - BRASIL, 2003). Os dados foram ainda submetidos à
50
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
análise de variância, a qual demonstrou não haver diferença estatística
significante [F (5,54) = 0,00504, (p = 1)].
Os resultados experimentais para os diferentes parâmetros analisados
estão apresentados na Tabela 4.
TABELA 4 - Resultados dos parâmetros analisados na validação da metodologia analítica do PRZ.
Parâmetros analíticos
Concentração + DP
(CV%)
0,16 mg/mL 0,24 mg/mL 0,4 mg/mL 0,56 mg/mL 0,64 mg/mL
Precisão (mg/mL)
Intra-dia
0,17 + 0,01
(4,9)
0,24 + 0,01
(0,4)
0,40 + 0,01
(1,2)
0,56 + 0,01
(2,5)
0,65 + 0,01
(1,5)
Inter-dia
0,16 + 0,01
(2,8)
0,24 + 0,01
(1,4)
0,40 + 0,01
(2,4)
0,57 + 0,01
(0,9)
0,64 + 0,01
(1,0)
Exatidão (%)
PRZ + FS e OS
91,16 + 1,39 94,47 + 3,10 97,04 + 2,15 96,75 + 2,29 97,68 + 2,90
(1,5)
(3,2)
(2,2)
(2,4)
(3,0)
PRZ + Tween® e Span® 96,58 + 1,69 99,01 + 2,58 99,21 + 1,87 98,45 + 1,70 99,96 + 2,11
(1,8)
(2,6)
(1,8)
(1,7)
(2,1)
Robustez (mg/mL)
etanol 85%
0,16 + 0,01
(0,6)
0,23 + 0,01
(0,6)
0,39 + 0,01
(1,0)
0,55 +0,01
(1,3)
0,62 + 0,01
(1,0)
etanol 90%
0,16 + 0,01
(1,6)
0,23 + 0,01
(1,5)
0,39 + 0,01
(1,1)
0,55 +0,01
(1,0)
0,62 + 0,01
(0,8)
etanol 99,5%
0,17 + 0,01
(4,9)
0,24 + 0,01
(0,4)
0,40 + 0,01
(1,2)
0,56 + 0,01
(2,5)
0,65 + 0,01
(1,5)
DP = Desvio padrão; CV = coeficiente de variação
51
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
A precisão é a concordância entre os resultados dentro de um curto
período de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentação. A
repetibilidade do método é verificada por, no mínimo, 9 determinações,
contemplando o intervalo linear do método, ou seja, 3 concentrações, baixa,
média e alta, com 3 réplicas cada ou mínimo de 6 determinações a 100% da
concentração do teste (ANVISA - BRASIL, 2003). E é normalmente expressa pelo
desvio padrão relativo (coeficiente de variação) (USP, 1990; ICH,1996). O valor
máximo aceitável para o coeficiente de variação (CV) é 5% (ANVISA - BRASIL,
2003).
Os resultados obtidos pelo método espectrofotométrico UV mostraram-se
precisos para análise quantitativa do fármaco, sendo que os valores de CV foram
menores que 5%, encontrando-se dentro do limite especificado pelas normas
(ICH, 1996; ANVISA - BRASIL, 2003). Adicionalmente, os resultados obtidos no
estudo de precisão foram submetidos a uma análise estatística, onde não foi
observado diferença significativa para os valores intra-dia [F (2,12) = 0,00588, (p
= 0,994)] e para os valores inter-dia [F (2,12) = 0,00153, (p = 0,998)].
A exatidão de um método pode ser definida como a proximidade dos
resultados obtidos em relação ao valor verdadeiro (ICH, 1996; ANVISA - BRASIL,
2003). Os compêndios oficiais e a legislação vigente preveem que o ensaio de
determinação da exatidão pode ser realizado para análise quantitativa de
fármacos, formas farmacêuticas e para impurezas (ICH, 1996; ANVISA - BRASIL,
2003).
Para análise quantitativa do fármaco em formas farmacêuticas, o ensaio de
recuperação pode ser realizado pelo método de adição de padrão ou pelo método
do placebo contaminado. O primeiro consiste em analisar uma amostra a qual foi
adicionada quantidade conhecida de fármaco (padrão de referência) à forma
farmacêutica e o segundo consiste em adicionar quantidade conhecida de
fármaco (padrão de referência) a uma mistura dos excipientes da forma
farmacêutica (ICH, 1996; ANVISA - BRASIL, 2003). Dessa forma, nesse estudo a
exatidão foi avaliada pelo método do placebo contaminado, adicionando
concentrações conhecidas da solução padrão do fármaco a uma solução
contendo os componentes da matriz (25% de óleo de soja, 5% de tensoativos e
70% de água destilada).
52
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
De acordo com os valores apresentados na Tabela 4, o método de análise
proposto pode ser considerado exato, para ambos os conjuntos de tensoativos, já
que a recuperação encontrada na totalidade das concentrações estudadas
mostrou-se
adequada
para
análise
quantitativa
do
PRZ
nas
matrizes
emulsionadas. Não houve diferença estatística significante para o uso do OS e FS
[F (2,12) = 0,0113, (p = 0,989)], valor mínimo de 91,16 ± 1,39% e valor máximo de
97,68 ± 2,9%, e nem para Tween® 80 e Span® 80 [F (2,12) = 0,00693, (p = 0,993)]
sendo o valor mínimo de 96,58 ± 1,69% e valor máximo de 99,96 ± 2,11%.
Robustez é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e
deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Durante o desenvolvimento da
metodologia deve-se considerar a avaliação da robustez. Constatando que a
susceptibilidade do método a variações nas condições analíticas, estas deverão
ser controladas e precauções devem ser incluídas no procedimento (ANVISA BRASIL, 2003).
A avaliação da robustez (Tabela 4) foi realizada pela análise do coeficiente
de variação entre as médias das concentrações, observando que não ocorreu
interferência com a variação do grau alcoólico, o coeficiente de variação foi menor
que 5% seguindo os padrões da ANVISA. Os valores não apresentaram
diferenças estatísticas quando comparados entre si [F (2,12) = 0,00440, (p =
0,996)]. Portanto, o método analítico proposto foi considerado robusto frente a
variação do teor alcoólico nos sistemas emulsionados.
O estudo, dos diferentes parâmetros analíticos, confirmou que a
metodologia foi validada com sucesso e pode ser utilizada para a análise
quantitativa do PRZ nos sistemas emulsionados, garantindo a confiabilidade dos
resultados.
5.2. ESTUDO DA OBTENÇÃO E ESTABILIDADE DO SISTEMA EMULSIONADO
ÓLEO DE SOJA/ÁGUA
5.2.1 Construção do diagrama de fases
53
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
Com o intuito de se determinar a melhor proporção de tensoativos para a
construção do diagrama de fases, inicialmente realizou-se o estudo para
determinação do melhor valor de EHL.
Numa fase inicial do processo de desenvolvimento da formulação é de
grande importância avaliar o valor de EHL dos tensoativos utilizados e também o
valor requerido de EHL da fase oleosa, isso caracterizará o tipo de emulsão que
se deseja produzir (A/O ou O/A). Por meio dessas determinações, o número de
experimentos pode ser reduzido precocemente durante a escolha da formulação
(SCHMIDTS et al., 2010).
O valor de EHL necessário para emulsificar um determinado óleo pode ser
determinado empiricamente, isto é, pela preparação de emulsões com tensoativos
de diferentes valores de EHL, e assim determinar em qual destes valores se
obtém a emulsão mais estável (LACHMAN, LIEBERMAN, KANIG, 2001).
Nesse caso, o EHL para a formulação desejada foi escolhido pelo ensaio
de estabilidade preliminar, o qual foi determinado pelo índice de cremagem das
emulsões em estudo. Este parâmetro foi medido 24 h após o preparo, antes e
depois da centrifugação [950 (x g) por 30 min], e após 7 dias.
Foi utilizado como conjunto de tensoativos o Tween® 80 e o Span® 80 para
o sistema em estudo, pois é mais frequente o preparo de emulsões estáveis
recorrendo a uma combinação de um tensoativo lipofílico com um hidrofílico,
especialmente para emulsões O/A. Essas combinações produzem interfaces
mistas revestindo a fase interna devidamente, para conferir ao sistema uma
viscosidade suficiente para evitar a cremagem e assim promover a estabilidade
da emulsão (LACHMAN, LIEBERMAN, KANIG, 2001). Além de que, a
estabilização de emulsões pelo uso de tensoativos não iônicos se faz através de
impedimento estérico e ligações de hidrogênio. A porção não polar do tensoativo
se insere nas partículas do óleo e os grupos de óxido de etileno na fase aquosa.
Os grupos de óxido de etileno causam impedimento estérico que inibe as
partículas de óleo sofrerem colisão e coalescer, além de formarem ligações de
hidrogênio com a água (FOX, 1986; SILVA & SOARES, 1996; GULLAPALLI &
SHETH, 1999).
O processo de cremagem é causado devido à ação da gravidade e pode
ocorrer quando a densidade da fase dispersa é menor do que a fase dispersante.
54
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
A centrifugação pode ser aplicada para acelerar a taxa de cremagem ou
sedimentação e é considerada um método para determinar a estabilidade
preliminar das emulsões baseado no processo de separação acelerada, que
normalmente ocorre sob condições de armazenamento (BRASIL, 2004; CASTELI
2008; SINKO, 2008; BONTORIM 2009).
As emulsões recém-preparadas não devem ser submetidas a testes de
estabilidade, seja pela exposição imediata às condições de tensão ou a
procedimentos de teste, pois esses sistemas podem apresentar uma instabilidade
intrínseca, não adquirindo uma estabilidade logo após a obtenção. É desejável um
período inicial de espera para que ocorra a estabilização, sendo usualmente
aceito um período de 24 a 48 horas após o preparo (RIEGER, 1996; MASSON,
2005). Assim, tanto para este estudo, quanto para os estudos seguintes,
padronizou-se um período de 24 horas, após o preparo, para a realização das
análises nas emulsões.
Neste trabalho, o EHL para a formulação desejada foi escolhido pelo
ensaio de estabilidade preliminar, o qual foi determinado pelo índice de cremagem
(IC) das emulsões em estudo. Este parâmetro foi medido 24 horas após o
preparo, antes e após a centrifugação [950 (x g) por 30 min], e 7 dias após a
obtenção das emulsões. Os valores dos IC encontrados estão apresentados na
Tabela 5.
TABELA 5 - Valores encontrados para as médias do índice de cremagem (IC) medido 24h (antes e
após centrifugação) e 7 dias após o preparo das emulsões.
EHL
Antes da
Após
centrifugação
centrifugação
(24h)
(24h)
7 dias
Média (± DP)
8
13,40 ± 0,00
10,75 ± 0,21
12,15 ± 2,33
9
12,35 ± 1,77
9,95 ± 1,77
11,12 ± 3,80
10
11,00 ± 1,56
9,05 ± 2,19
9,90 ± 5,09
11
6,35 ± 2,05
7,35 ± 2,90
8,95 ± 3,04
Valores semelhantes de IC foram observados para os EHL 8, 9 e 10
durantes os sete dias de estudo, enquanto que a formulação obtida com o EHL 11
55
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
apresentou valores menores de IC, quando comparado aos demais, indicando
maior estabilidade, uma vez que de acordo com a equação para cálculo do índice
de cremagem, quanto menor o valor do IC, menor o valor da porção de creme
(TC) na emulsão.
O presente estudo permitiu estabelecer que a emulsão com EHL 11
apresentou uma maior estabilidade, uma vez que este sistema apresentou um
índice de cremagem significativamente menor, quando comparado aos valores
das amostras com EHL 8, 9 e 10. Sendo o EHL 11, portanto, o valor usado para
realização dos demais estudos.
Após estabelecer o melhor EHL para estudo, deu-se continuidade ao
trabalho com o estudo termodinâmico dos sistemas coloidais.
Quando se modifica progressivamente a composição de uma mistura de
solventes imiscíveis, as mudanças que produzirão na dispersão podem ser
traduzidas por importantes variações nas propriedades termodinâmicas dos
constituintes que a compõe (OLIVEIRA et al., 2004). Normalmente, o diagrama de
fases, representado por um triangulo equilátero, é chamado de diagrama ternário,
pois haverá a mistura de três componentes: fase aquosa, fase oleosa e
tensoativo. Esses diagramas também podem ser chamados de pseudoternários,
pois o ponto, que representa normalmente apenas um tensoativo, passa a ser
representado por uma mistura de tensoativos. Portanto, o diagrama será a
representação da mistura de quatro substâncias no triângulo equilátero
(LAWRENCE & REES, 2000; CORREA et al., 2005; SILVA et al., 2009;
DAMASCENO et al., 2011).
A Figura 11 representa um triângulo equilátero onde cada região contém
pontos cuja composição corresponde a uma mistura pseudoternária (Tween® 80 +
Span® 80, óleo de soja e água purificada) em porcentagem. Cada vértice do
triângulo representa 100% de cada um dos componentes. A construção desse
diagrama teve como objetivo definir a região de emulsão O/A para posterior
caracterização.
56
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
FIGURA 11 - Diagrama pseudoternário contendo água purificada como FA, óleo de soja como FO
®
e a associação dos tensoativos Tween 80 + Span
®
80 (Tw80 + Sp80). As áreas delimitadas
representam: SEOB (Sistema Emulsionado Opaco Branco), ST (Sistema Translúcido), SEOA
(Sistema Emulsionado Opaco Amarelo) e SF (Separação de Fases).
A construção do diagrama de fases é importante, pois com ela é possível
prever o comportamento de fases dos sistemas quando seus constituintes são
alterados. Como observado na Figura 11, cada área demarcada corresponde a
pontos no diagrama que representam uma forma de organização diferente do
sistema, detectada visualmente após cada titulação. A região SEOB corresponde
a área onde houve a formação de sistema opaco branco o que pode indicar,
devido a concentração de cada componente, a formação de sistemas
emulsionados do tipo O/A; a área ST refere-se à presença de sistemas
translúcidos,
o
que
indica
a
possível
formação
de
sistemas
micro/nanoemulsionados; e, a região SF corresponde à área com ocorrência de
separação de fases. Ainda nessa figura, pode ser observado o predomínio da
região SEOA, o que indica a possível formação de sistemas emulsionados do tipo
A/O, devido à alta concentração de FO, e/ou à formação de sistemas
emulsionados do tipo O/A, que foram caracterizados com uma coloração amarela,
devido à alta quantidade de tensoativos.
57
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
No diagrama observou-se que a região de emulsões O/A foi formada em
altas concentrações de água (acima de 45%). A região de ST se encontra em
altas concentrações tensoativos (30 a 75%) e em concentrações intermediárias
de água e óleo. Com o par de tensoativos em estudo, Tween® 80 e Span® 80, foi
possível obter sistemas homogêneos com concentrações de óleo abaixo de 75%.
Foi observada também uma região de separação de fases, onde a proporção dos
tensoativos é baixa, não sendo suficiente para a estabilização do sistema.
Por meio do diagrama, a região SEOB foi estudada selecionando-se pontos
conforme Figura 12.
FIGURA 12 – Pontos selecionados na região SEOB do diagrama pseudoternário.
A construção do diagrama pseudoternário mostrou que é possível se obter
emulsões do tipo O/A com as concentrações de 5% de tensoativos, 10% de óleo
de soja e 85% de água purificada (ponto B, Figura 12). Portanto, essas
concentrações foram as padronizadas para a realização dos demais estudos. Os
demais pontos serão abordados no decorrer da discussão.
Emulsões estáveis são melhor formuladas com tensoativos os quais
possuam valores de EHL próximo ao do chamado EHL requerido da fase oleosa
usada. No entanto, não só o valor EHL, mas também o tipo de emulsionante
químico pode influenciar na estabilidade das emulsões (SCHMIDTS et al., 2010).
Dessa forma, foi realizado o estudo seguinte.
58
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
5.2.2 Efeito dos cotensoativos na estabilidade acelerada da emulsão óleo de
soja/água
Os estudos de estabilidade preliminar consistem na realização dos testes
da fase inicial do desenvolvimento do produto, utilizando diferentes formulações
com durações reduzidas (30 dias). É um estudo planejado para acelerar a
degradação química e/ou mudanças físicas de um produto farmacêutico em
condições forçadas de armazenamento, sendo empregadas condições extremas
de temperatura. Pelas condições em que é conduzido, o estudo não tem
finalidade de estimar a vida útil do produto, mas auxiliar a triagem das
formulações (BRASIL, 2004; CASTELI 2008; BONTORIM, 2009).
Vários fatores podem comprometer a estabilidade físico-química e
microbiológica de um sistema emulsionado: a escolha de constituintes
incompatíveis, tipo e concentração de emulsificantes, velocidade de agitação,
tempo de aquecimento e arrefecimento, quantidades das fases, temperatura e
ambiente de estocagem e contaminação por microrganismos (ALVAREZ et al.
2007; PIANOVSKI et al, 2008).
O ensaio foi realizado em um período de 30 dias avaliando a estabilidade
da emulsão na presença ou ausência de cotensoativos, no caso, álcool etílico e
álcool benzílico. Os parâmetros avaliados foram índice de cremagem, turbidez,
pH e condutividade elétrica. Os valores obtidos para o índice de cremagem e
turbidez estão apresentados na Figura 13.
De acordo com a Figura 13-A, a análise do índice de cremagem das
emulsões obtidas permitiu inferir que não houve mudanças na estabilidade dos
sistemas quando adicionado álcool etílico como cotensoativo em diferentes
concentrações, os valores para tal ficaram entre 10-20%. A análise estatística dos
valores corroborou com os resultados não havendo diferença estatística
significante [F (3,12) = 0,214 (p = 0,885)]. Verificou-se que durante todo o estudo,
as emulsões apresentaram-se branco leitosas.
59
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
A
B
A’
B’
FIGURA 13 - Gráficos correspondentes aos valores obtidos de IC e turbidez das emulsões durante
30 dias de estudo utilizando álcool etílico (A e A’) e álcool benzílico (B e B’) como cotensoativos.
Sendo que ○ corresponde à emulsão 0:1 (razão de cotensoativo : tensoativo), ● 0,05:1, ▲ 0,1:1, e
■ 0,15:1.
Por meio da Figura 13-B, observa-se que houve um ligeiro aumento do
índice de cremagem, com o passar do tempo, nas emulsões onde houve a adição
de
álcool
benzílico
Esses
valores
apresentaram
diferenças
estatísticas
significantes (ANOVA one-way e Dunnet pós-teste). É interessante a análise dos
próximos parâmetros para sugerir se o álcool benzílico interfiriu na estabilidade do
sistema.
Esses resultados podem ser atribuídos à natureza menos polar do etanol
(constante dielétrica em torno de 24) em relação ao álcool benzílico, que favorece
uma possível localização na interface, sendo as interações ocasionadas tanto por
ligações de hidrogênio quanto por interações hidrofóbicas. Indicando que o álcool
etílico favorece a uma maior estabilização da vesícula emulsionada. Este
cotensoativo é organizado com seu grupo OH localizado entre o grupo polar dos
60
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
tensoativos e as moléculas de água e seu grupo apolar localizado entre as
cadeias apolares dos tensoativos. No entanto, todas as moléculas de álcool etílico
não residem apenas dentro da região interfacial, uma fração encontra-se
distribuida entre as fases de óleo e da água de acordo com sua solubilidade
relativa (RESENDE et al., 2008; WIA CEK, 2012).
Sabe-se que um aumento nos valores de índice de cremagem durante um
estudo de estabilidade é ocasionado pelo aumento das forças de interação entre
as gotículas dispersas resultantes da diminuição da repulsão eletrostática, ou
devido à fragilidade do filme interfacial responsável pela estabilização estérica em
emulsões não iônicas (LACHMAN, LIEBERMAN & KANIG, 2001; CAPEK, 2004).
Dessa forma, a análise desse parâmetro indica que o álcool benzílico não
contribuiu para a estabilização do filme interfacial das emulsões.
Além da análise de IC, a estabilidade ao longo do tempo foi também
avaliada pela turbidez, pH e pela condutividade elétrica. Na turbidimetria, também
conhecida por opacimetria, mede-se a intensidade da luz transmitida no mesmo
sentido
da
luz
incidente.
Embora
existam
turbidímetros
destinados
especificamente à medida de turbidez, colorímetros e espectrofotômetros
convencionais são satisfatórios para medida da luz transmitida, desde que
ajustados para comprimento de onda apropriado (FARMACOPÉIA BRASILEIRA,
2010).
Analisando-se os dados obtidos na turbidimetria, observa-se que não
houve modificações dos valores de turbidez para as formulações que utilizaram
álcool etílico como cotensoativo (Figura 13-A’). Sendo que estas não
apresentaram diferenças estatísticas significantes ([F (3,12) = 2,269, (p = 0,133)]),
durante os 30 dias, em diferentes tempos e temperaturas. Este resultado
corrobora com o obtido para índice de cremagem, uma vez que não foi observado
alterações acentuadas nos valores durante os 30 dias de estudo.
Na Figura 13-B’, é possível observar que a adição do álcool benzílico não
alterou o valor da turbidez das emulsões quando adicionado em diferentes
concentrações. Quando analisados estatisticamente não apresentaram diferenças
significantes ([F (3,12) = 1,284, (p = 0,324)]). Para esse parâmetro, permitiu-se
inferir que o cotensoativo em estudo não promoveu modificação na estabilidade
das emulsões. Se as modificações que o sistema sofre durante o período de
61
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
análise são mínimas, este sistema pode ser considerado como cineticamente
estável, mesmo que se torne instável num período de tempo mais prolongado
(LACHMAN, LIEBERMAN & KANIG, 2001).
Por meio das medidas de pH (Figura 14) é possível presumir alterações na
estrutura do sistema, como
oxidação, que nem sempre são visualmente
detectáveis. As avaliações físico-químicas permitem ao detectar futuros
problemas que podem afetar a estabilidade e a qualidade do seu produto
(BRASIL, 2004; BONTORIM, 2009). A diminuição do pH pode representar uma
oxidação da fase de óleo com a formação de hidroperóxidos ou a hidrólise de
triglicéridos que conduz à formação de ácidos graxos (MASMOUDI et al., 2005;
FORMIGA et al., 2007).
O valor de condutividade também foi determinado (Figura 14), pois
alterações em tal valor permitem a detecção de cremagem, sedimentação ou
inversão de fases. Esta técnica é muito utilizada para verificar a integridade da
fase interna, visto que esta é dependente da natureza da fase externa da
formulação (FERRARI, 1998). A condutividade é frequentemente utilizada para
determinar a natureza da emulsão (O/A ou A/O) e para controlar a sua
estabilidade durante o período de armazenagem. Através desse método é
possível avaliar a variação no conteudo de água livre do sistema emulsionado e,
desta maneira, identificar mudanças estruturais que possam ocorrer (CASTELI,
2008; MASMOUDI et al., 2005; MASSON, 2005).
Dessa forma, o pH e a condutividade das quatro diferentes emulsões com
diferentes proporções de cotensoativos foi medido (Figura 14).
Como mostrado na Figura 14-A, o valor de pH, para as emulsões onde
utilizou-se alcool etilico como cotensoativo, permaneceu constante durante os
trinta dias de estudo não apresentando diferenças estatísticas significantes [F
(3,12) = 0,784, (p = 0,526)], indicando que o etanol não promoveu alteração na
estabilidade química da fase oleosa, uma vez que esse álcool encontra-se na
interface da vesícula emulsionada (RESENDE et al., 2008; WIA CEK, 2012).
62
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
A
B
A’
B’
FIGURA 14 - Gráficos correspondentes aos valores obtidos de pH e condutividade das emulsões
durante 30 dias de estudo utilizando álcool etílico (A e A’) e álcool benzílico (B e B’) como
cotensoativos. Sendo que ○ corresponde à emulsão 0:1 (razão de cotensoativo : tensoativo), ●
0,05:1, ▲ 0,1:1, e ■ 0,15:1.
Com a adição do álcool benzílico à formulação (Figura 14-B), houve uma
redução gradativa dos valores do pH, a partir do sétimo dia de estudo. As
diferenças entre os valores de pH para as quatro emulsões da Figura 14-B foram
estatisticamente significantes (ANOVA one-way e Dunnet pós teste) em relação
ao grupo controle.
Tais resultados podem ser atribuídos a uma provável hidrólise parcial do
óleo de soja gerando ácidos graxos na FO. Este fato é comum em sistemas
emulsionados lipídicos (FORMIGA et al., 2007), uma vez que, devido à presença
do anel aromático na estrutura do álcool benzílico, não houve uma boa inserção
deste álcool junto aos tensoativos contribuindo, assim, para uma desestabilização
da vesícula emulsionada e uma provável exposição da FO às moléculas de água
(ZHANG et al., 2000). Atribui-se também, esta diminuição nos valores de pH, a
ocorrência de uma oxidação do álcool benzílico transformando-o em ácido
63
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
benzóico, tanto que esse composto é amplamente utilizado em formulações
farmacêuticas como agente antioxidante (MAULA, WESTERLUND, SLOTTE,
2009).
Os valores para condutividade variaram de 34,98 a 79,69 µS/cm para o
álcool benzílico e 33,58 a 74,56 µS/cm para o álcool etílico. Esses altos valores
encontrados confirmam que as emulsões são do tipo O/A (FUJII, OKADA &
FURUZONO, 2007).
Tanto para as quatro formulações da Figura 14-A’ quanto para as
formulações da Figura 14-B’ não houve diferenças estatisticamente significantes
([F (3,12) = 0,626, (p = 0,608)]) e ([F (3,12) = 1,361, (p = 0,290)]),
respectivamente, durante os 30 dias de estudo, em diferentes tempos e
temperaturas, sugerindo-se que não houve modificações na estruturação dos
sistemas (MASMOUDI et al., 2005; CASTELI, 2008). Masmoudi e colaboradores
(2005) relataram que é dificil avaliar a estabilidade de emulsões somente pela
condutividade elétrica, porque não há uma relação linear entre o aumento da
condutividade elétrica e o fenômeno de instabilidade.
O presente estudo permitiu estabelecer que os cotensoativos escolhidos
não levaram ao aumento na estabilidade física ou química dos sistemas. Ao
contrário do que ocorreu com o álcool benzílico, não ocorreu nenhum efeito
negativo na presença do álcool etílico, quando levado em conta os resultados
obtidos para o índice de cremagem, turbidez, pH e condutividade elétrica, o que
possibilita o seu uso na formulação na tentativa de aumentar a eficiência de
incorporação do fármaco.
5.3. ESTUDO DE INCORPORAÇÃO DO FÁRMACO
5.3.1 Escolha do método de incorporação
De acordo com a metodologia utilizada, o PRZ foi adicionado em excesso
às emulsões por meio de dois métodos diferentes: no primeiro, o fármaco foi
adicionado diretamente na fase oleosa da emulsão (TIF) no momento da inversão
de fases; e, em um segundo método, o fármaco foi adicionado diretamente na
64
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
emulsão pronta (EF). Em seguida, foram feitas soluções com essas emulsões e
submetidas à leitura no espectrofotômetro a 264 nm (comprimento de onda
selecionado e validado para análise quantitativa do PRZ). A solubilidade do
fármaco foi determinada por meio da equação da reta obtida pela análise de
regressão linear da curva de calibração (y = 1,1912x + 0,0993). Os resultados
encontram-se na Tabela 6.
TABELA 6 – Porcentagem de PRZ incorporado em emulsão por dois métodos diferentes.
% do PRZ na emulsão
Tipo de
incorporação
N1
N2
N3
Média ± Desvio
padrão
EF
0,755
0,776
0,769
0,766 ± 0,011
TIF
0,898
0,900
0,887
0,895 ± 0,007*
*Diferença estatística TA x FO: t valor = -17,393; P = < 0,001
O estudo permitiu observar que o método de incorporação do fármaco na
fase oleosa da emulsão (TIF) incorpora uma maior quantidade de fármaco (0,895
± 0,007%) quando comparado ao método de adição do fármaco na emulsão a frio
(EF) (0,766 ± 0,011%). Esse resultado deve-se, provavelmente, ao fato de a
energia necessária para o PRZ ser solubilizado na fase oleosa ser menor do que
a energia necessária para o fármaco ser incorporado nas vesículas emulsionadas,
uma vez que as emulsões comportam-se como sistemas reservatórios, onde as
vesículas emulsionadas encontram-se separadas do meio por uma interface,
assim o fármaco deve transpor essa barreira para então ser solubilizado
(OLIVEIRA et al., 2004). Dessa forma, há uma facilidade maior em solubilizar o
fármaco antes do momento da inversão de fases do que na emulsão pronta, como
já era esperado, uma vez que o PRZ apresenta maior afinidade pela FO.
Pestana e colaboradores (2008), estudando o comportamento da
Anfotericina B em sistemas emulsionados O/A, observaram que fármacos neutros
interagem fortemente com a fase interna do sistema por meio de um efeito
hidrófobo, sendo típico da sua incorporação em agregados supramoleculares
como micelas.
C. Washington (1996), para fins de formulação de emulsão, classificou
fármacos com base em suas características de solubilidade e as suas
propriedades de ionização, as quais não são completamente independentes.
65
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
Fármacos da Classe II do Sistema de Classificação Biofarmacêutica são
predominantemente solúveis em óleo, dessa forma, em uma emulsão O/A seria
particionado preferencialmente para a fase oleosa. Tais materiais são bons
candidatos para serem incorporados em emulsão e pode normalmente ser
formulado por dissolução do fármaco no óleo antes da emulsificação. No entanto,
é interessante destacar que a solubilidade do fármaco na fase interna depende
das interações com este solvente, a qual muitas vezes não está relacionada
apenas com suas propriedades físico-químicas como o coeficiente de partição.
A solubilidade aquosa do PRZ descrito na literatura é 0,4 mg/mL
(LINDENBERG, KOPP & DREESMAN, 2004). No entanto, em nosso laboratório
foi encontrado o valor analítico de 0,2 mg/mL, para tanto o método da TIF
aumentou em 44,75 vezes a fração solúvel do fármaco, enquanto que o método
de incorporação por EF aumentou em 38,3 vezes, o que demonstra o potencial
destes sistemas.
5.3.2 Efeito do etanol na incorporação do PRZ na emulsão
Uma vez que foi demonstrado que o etanol, quando utilizado como
cotensoativo, não afetou a estabilidade da emulsão em estudo, foi proposta a
análise do efeito deste cotensoativo na incorporação do PRZ, ou seja, se tal
álcool influenciaria na quantidade de fármaco solubilizado no sistema.
A Tabela 7 apresenta os valores encontrados para o estudo da
incorporação do fármaco na emulsão simples e na emulsão com adição de etanol
como cotensoativo, utilizando o método de adição de PRZ na fase oleosa da
emulsão (TIF).
TABELA 7 - Resultado do teste para incorporação do PRZ em emulsões diferentes.
Tipo de emulsão
Emulsão simples
Emulsão com
etanol
% do PRZ na emulsão
N1
N2
N3
Média ± Desvio
padrão
0,898
0,900
0,887
0,895 ± 0,007
0,751
0,779
0,807
0,779 ± 0,028
66
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
Como mostrado na Tabela 7, observa-se que houve diferença estatística
significante entre os valores de teor de PRZ entre a emulsão simples e a emulsão
com o cotensoativo (t valor = 6,961; p = 0,002). Por meio desse resultado,
percebe-se que a adição do álcool etílico à emulsão não contribuiu para um
aumento da concentração de fármaco incorporado.
5.4. ESTUDO DA INTERAÇÃO DO PRZ COM OS COMPONENTES DA
EMULSÃO
5.4.1 Efeito do fármaco nas propriedades físico-químicas dos sistemas
Avaliando o aspecto de fluidez vertendo-se os tubos que continham as
emulsões, observou-se que à medida que o PRZ era adicionado ao sistema,
havia um aumento relativo da viscosidade. Dessa forma, um estudo foi planejado
com o objetivo de avaliar a interação do PRZ com os demais componentes da
formulação. Para tanto, o estudo foi baseado nas diferenças de concentração dos
constituintes nas formulações quanto à fase oleosa, quanto à concentração dos
tensoativos (pontos A, B, C, D, E, F e G da Figura 12) e quanto à concentração do
fármaco.
Para todos os grupos de formulações os parâmetros analisados foram pH,
turbidez, condutividade elétrica, índice de refração, diâmetro médio da gotícula e
potencial zeta. Parâmetros esses importantes como técnicas de caracterização
física dos sistemas (CONSTANTINIDES et al., 1995; FORMARIZ, et al., 2005).
Adicionalmente, foi realizada a incorporação de PRZ no primeiro e no segundo
grupo de formulação.
O fenômeno de dispersão da luz pelas emulsões pode ser avaliado de
maneira eficiente através da técnica de espalhamento de luz dinâmico (Dynamic
Light Scattering), a qual fornece informações diretas sobre o movimento
translacional das gotículas da emulsão e permite o cálculo do tamanho da
gotícula através de relações teóricas fundamentadas no movimento Browniano
das gotículas em dispersão, sendo o coeficiente de difusão das gotículas no meio
o principal parâmetro levado em consideração (FORMARIZ et al., 2005). O índice
67
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
de polidispersão fornece informações sobre a homogeneidade da distribuição dos
tamanhos das gotículas (NEMEN & LEMOS-SENNA, 2011). Já a técnica do
índice de refração corresponde a uma relação entre a velocidade da luz no vácuo
pela velocidade da luz no meio, no caso a emulsão.
A maioria das partículas em contato com um líquido adquire uma carga
elétrica na sua superfície, este potencial elétrico é chamado de potencial zeta e é
influenciado pelas mudanças na interface com o meio dispersante, em razão da
dissociação de grupos funcionais na superfície da partícula ou da adsorção de
espécies iônicas presentes no meio aquoso de dispersão (HEURTAULT et al.,
2003; SCHAFFAZICK et al., 2003). A medida de potencial zeta pode ser utilizada
para prever a estabilidade físico-química de suspensões e emulsões coloidais. De
acordo com a teoria DLVO, a fronteira entre emulsões estáveis é considerada
como sendo o valor de potencial zeta de ± 30 mV (WANG et al., 2006). Sendo
assim, emulsões com valores acima de +30 mV, bem como com valores inferiores
a -30 mV são consideradas estáveis. Já emulsões com valores entre -30 e +30
mV são instáveis, sendo o valor de 0 mV como o de maior instabilidade, o
chamado ponto isoelétrico. Evidentemente essa não é uma regra, considerando
que partículas também podem ser preparadas com materiais que proporcionam
um impedimento estérico que desfavorece fenômenos de agregação.
Na Figura 15, encontram-se os resultados para as análises de diâmetro da
gotícula, turbidez e índice de refração para o primeiro grupo de sistema
emulsionado (Tabela 2). A análise do diâmetro médio da gotícula, assim como o
índice de refração foram realizadas em associação com a turbidez, para que as
três metodologias em conjunto pudessem oferecer maiores informações a
respeito da caracterização das emulsões.
68
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
FIGURA 15 - Diâmetro das gotículas, turbidez e índice de refração em função da concentração de
óleo de soja (FO) no meio.
O aumento dos valores da turbidez, do diâmetro hidrodinâmico e do índice
de refração em relação à FO (Figura 15), pode ser explicado pelo fato de que se
elevando a quantidade de fase oleosa para uma quantidade fixa de tensoativos,
haverá um aumento do número e do tamanho dessas gotículas, resultado esse
comprovado pelas fotomicrografias dos sistemas (Figura 16). O aumento no
diâmetro médio das gotículas em função do aumento da FO foi também
observado por Pestana e colaboradores (2008).
Esse resultado deve-se a quantidade de tensoativos para recobrir aquela
gotícula de óleo ser fixa, dessa forma a vesícula emulsionada tende a aumentar
de tamanho para que a área interfacial do meio permaneça a mesma. Assim, se
aumentasse ainda mais a quantidade de FO para uma mesma quantidade de
tensoativos a emulsão provavelmente apresentaria indícios de instabilidade (HSU,
NACU, 2003).
O aumento da quantidade e do tamanho das gotículas ofereceu resistência
à passagem da luz nas análises de turbidez e índice de refração (Figura 15) o que
justifica o aumento progressivo para ambos os valores. Além de que para o índice
de refração, a organização das microgotículas na fase interna da emulsão refrata
69
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
mais luz do que a água destilada, isto pode ser constatado pelo maior índice de
refração do óleo (1,470) do que da água (1,3321) (RESENDE et al., 2008).
Havendo uma redução da quantidade de fase aquosa nas formulações haverá um
aumento do índice de refração, tornado-o mais próximo do índice de refração do
óleo de soja.
A Figura 16 representa a avaliação microscópica de cada emulsão do
primeiro grupo de formulação.
5%
10%
20%
30%
FIGURA 16 - Fotomicrografias dos sistemas emulsionados em função da concentração de óleo de
soja (FO) no meio (aumento de 400x).
A análise microscópica das formulações (Figura 16) revelou um
crescimento do diâmetro dos glóbulos proporcional à quantidade de óleo no
sistema, confirmando o resultado encontrado na determinação do diâmetro da
gotícula encontrado pela técnica de espalhamento de luz. Para as amostras de
10, 20 e 30% de FO os glóbulos encontram-se, floculados, com distribuição
heterogênea de tamanho.
Dessa maneira, para esse primeiro grupo de formulação, os dados das
Figuras (15 e 16) sugerem que com o aumento da proporção de fase oleosa, a
mistura de tensoativos torna-se cada vez mais ineficaz na diminuição da tensão
70
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
interfacial. Assim, a curvatura do filme interfacial não se faz suficiente para
conferir as gotículas da fase interna tamanhos diminutos e as mesmas acabam
por assumir um tamanho maior.
Na Figura 17, encontram-se os resultados dos parâmetros analisados para
o primeiro grupo de formulação: pH, condutividade elétrica e potencial zeta.
FIGURA 17 - Potencial zeta, condutividade elétrica e pH em função da concentração de óleo de
soja (FO) no meio
Analisando a Figura 17 é possível perceber que os valores de pH, potencial
zeta e condutividade diminuíram, o que pode indicar que houve ou uma redução
de cargas no meio ou que houve uma diminuição da condutividade à medida que
houve aumento da FO.
A redução do valor do pH de 7,01 para 5,60 pode ter ocorrido devido a um
aumento proporcional da presença de ácidos graxos solúveis decorrentes da
hidrólise da FO (FORMIGA et al., 2007), uma vez que nas formulações não foi
adicionado agentes antioxidantes (RODRIGUES et al., 2012).
O parâmetro mais influente no potencial zeta é o pH, considerando que o
pH do colóide pode fornecer informações quanto a cargas positivas ou negativas
que irão interagir com as partículas. No caso, o pH diminuiu indicando que houve
um aumento de H
+
no meio promovendo assim uma consequente diminuição do
71
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
potencial zeta de |-33,09| a |-15,01|. O valor negativo significa que as vesículas
apresentam superfície externa com predominância de cargas negativas. Além do
impedimento estérico dos tensoativos, pode-se inferir que esse fator proporciona
uma proteção iônica às partículas e desta forma, quando uma partícula em
difusão encontra outra na emulsão, ambas se auto-repelem devido à carga
superficial.
Os estudos que relacionam análise de potencial zeta e pH de emulsões
demonstram que geralmente, o potencial Zeta tende a se tornar mais negativo
com o aumento do pH (WASHINGTON, 1996; WIACEK & CHIBOWSKI, 1999;
WIACEK & CHIBOWSKI, 2002) o que corresponde ao resultado encontrado para
esses parâmetros.
Avaliando o parâmetro de condutividade elétrica (Figura 17), observou-se
também uma diminuição de 74,60 para 40,51 µS/cm. O óleo de soja não é um
bom condutor de eletricidade (0,5 µS/cm) e se houvesse um aumento da
quantidade de FO na emulsão, esse sistema mudaria de fase interna (CASTELLI,
2008). O mecanismo sugerido para a condução elétrica na água, conforme
proposta de Agmon (1995), é que há transferência de próton entre duas
moléculas de água vizinhas quando uma molécula tem posição que permite que
uma ligação de hidrogênio -O-H
O- se transforme em uma ligação -H
H-O- ,
como houve uma redução da quantidade de fase aquosa à medida que se
aumentou a massa de fase oleosa, contribuiu-se também para uma redução dos
valores de condutividade elétrica (DJORDJEVIC et al., 2004).
A análise da Figura 18, que apresenta os resultados para teor de fármaco
incorporado nesse grupo de formulação, permite inferir que a concentração de
PRZ dissolvido foi notavelmente aumentada pela adição de FO, aumentando
provavelmente até um patamar de alta proporção deste componente. Estas
características demonstram claramente que o PRZ (fármaco da Classe II do
Sistema de Classificação Biofarmacêutica) interage com a fase interna (óleo de
soja) do sistema através de um efeito hidrófobo (WASHINGTON, 1996).
72
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
FIGURA 18 - Quantidade de PRZ incorporado nas emulsões em função da concentração de óleo
de soja (FO) no meio.
A estabilização de emulsões pelo uso de tensoativos não-iônicos se faz
através de impedimento estérico e ligações de hidrogênio. A porção apolar do
tensoativo se insere nas gotículas de óleo e os grupos de óxido de etileno na fase
aquosa. Os grupos de óxido de etileno causam impedimento estérico que inibe as
gotículas de óleo sofrerem colisão e coalescer, além de formarem ligações de
hidrogênio com a água (FOX, 1986; SILVA & SOARES, 1996; GULLAPALLI &
SHETH, 1999). Entretanto, a estabilização de emulsões pode também ser obtida
usando concentração mais elevada de agentes emulsificantes, pois isso resultará
num filme ao redor das gotículas de óleo mais firme e compacto reduzindo a
coalescência (FOX, 1986).
Na Figura 19, encontram-se os resultados das análises de diâmetro
hidrodinâmico, turbidez e índice de refração para o segundo grupo de sistemas
emulsionados (Tabela 2), quando foi variada a quantidade de tensoativos (T).
73
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
FIGURA 19 - Diâmetro das gotículas, turbidez e índice de refração em função da concentração de
tensoativos no meio.
No processo de emulsificação as moléculas do tensoativo interagem com
as gotículas de óleo e entre si durante a etapa de homogeneização de modo a
formar uma interface em torno dos glóbulos que protela processos como
floculação e coalescência (FLORENCE & ATTWOOD, 2003).
Analisando os resultados (Figura 19) encontrados para turbidez, índice de
refração e diâmetro médio hidrodinâmico, sugere-se que o excesso de
tensoativos no meio foi adsorvido na interface óleo-água levando a uma redução
do tamanho da gotícula, devido ao aumento da área interfacial do tensoativo e
diminuição
na
tensão
interfacial
do
sistema
(TADROS
et
al.,
2004).
Consequentemente, elevaram-se os valores do índice de refração e da turbidez
uma vez que se acentuou o numero de gotículas e um crescimento proporcional
da viscosidade das emulsões indicando maior estruturação do sistema.
A Figura 20 representa a avaliação microscópica de cada emulsão do
segundo grupo de formulações.
74
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
1%
2,5%
5%
10%
FIGURA 20 – Fotomicrografias dos sistemas emulsionados em função da concentração de
tensoativos no meio (aumento de 400x).
As fotomicrografias (Figura 20) apresentaram, de maneira geral, diminuição
no tamanho dos glóbulos conforme aumento na concentração de tensoativo,
confirmando o resultado encontrado na determinação do diâmetro da gotícula
encontrado pela técnica de espalhamento de luz. Este foi um resultado esperado
e vastamente descrito na literatura (TADROS et al., 2004; FERNANDEZ et al.,
2004; IZQUIERDO et al., 2005; LIU et al., 2006; PESTANA, et al., 2008). As
amostras de 1, 2,5 e 5% de tensoativos apresentam glóbulos com distribuição
heterogênea de tamanho.
Na Figura 21 encontram-se os resultados encontrados para pH,
condutividade elétrica e potencial zeta do segundo grupo de formulações.
75
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
FIGURA 21 - Potencial zeta, condutividade elétrica e pH em função da concentração de
tensoativos no meio.
Os resultados apresentados na Figura 21, mostram que com um aumento
dos tensoativos no sistema houve uma leve alteração do valor do pH (5,58 a
5,82), um aumento da condutividade (29,51 a 87,35 µS/cm), e uma redução do
potencial zeta. Os valores do pH não apresentaram diferença estatística
significantes [F (3,8) = 1,636 (p = 0,257)], indicando que a quantidade de
tensoativos no meio não influenciou no valor desse parâmetro.
Analisando os resultados encontrados para tais parâmetros, permite-se
inferir que o uso de tensoativo não iônico (Tween® 80 e Span® 80) resulta na
formação da dupla camada elétrica ao redor da gotícula dispersa. Essa maior
estabilização da fase interna pode impedir uma maior interação dos ácidos graxos
na interface com a fase aquosa, o que levou a redução do potencial zeta.
Segundo a literatura, tal observação se deve ao pH e à força iônica da fase
aquosa. A carga elétrica mensurada em emulsões estabilizadas com tensoativos
não iônicos tem sido atribuída à adsorção dos íons H3O+ (em pH baixo) ou OH(em pH alto) da água (FRANGE & GARCIA, 2009), o que pode indicar possíveis
alterações na estruturação do sistema (ZHANG & MICHNIAK-KOHN, 2011).
76
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
A Figura 22 apresenta os resultados encontrados para teor de fármaco
incorporado nesse grupo de formulação.
FIGURA 22 - Quantidade de PRZ incorporado nas emulsões em função da concentração de
tensoativos no meio.
É possível observar, por meio da Figura 22, que à medida que se
aumentou a quantidade de tensoativos no meio, houve um aumento da
quantidade de PRZ incorporado. Isso porque, conforme mostrado nas Figuras 19
e 20, sugere-se que o excesso de tensoativos no meio foi adsorvido na interface
óleo-água levando a um aumento da área interfacial das gotículas (TADROS et
al., 2004), proporcionando assim a possibilidade de se incorporar uma maior
quantidade de fármaco. Isto demonstra que o fármaco possui não somente uma
boa interação com a fase interna, mas também com a interface.
Na Figura 23, encontram-se os resultados do efeito da quantidade de
fármaco nos parâmetros de diâmetro hidrodinâmico, turbidez e índice de refração
para o terceiro grupo de formulações de sistemas emulsionados (Tabela 2).
77
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
FIGURA 23 - Diâmetro das gotículas, turbidez e índice de refração em função da concentração de
PRZ no meio.
Analisando a Figura 23 é possível perceber que à medida que se aumentou
a quantidade de PRZ incorporado às emulsões houve uma diminuição do
diâmetro médio das gotículas e um crescimento dos valores de índice de refração
e de turbidez. Esse resultado pode ter ocorrido devido a alta solubilidade do PRZ
tanto na FO quanto também nos tensoativos o que acarretou com que o fármaco
tivesse uma localização inicialmente no interior da gotícula devido a sua
hidrofobicidade e com o aumento da concentração do PRZ no meio, esse passou
a se localizar na interface da gotícula, competindo com os tensoativos,
acarretando na diminuição do tamanho devido a um aumento da área interfacial
dessas gotículas.
A maior interação do fármaco na interface ficou comprovada com este
resultado. Este fenômeno pode fazer com que o fármaco atue como um
cotensoativo ou atue deslocando as moléculas de tensoativos aumentando assim
a concentração aparente dessas moléculas no meio. Isto explica a diminuição do
tamanho de gotículas.
A Figura 24 representa a avaliação microscópica de cada emulsão do
terceiro grupo de formulação.
78
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
0%
0,125%
0,25%
0,50%
0,75%
1,0%
FIGURA 24 - Fotomicrografias dos sistemas emulsionados em função da concentração de PRZ no
meio (aumento de 400x).
A análise microscópica das formulações (Figura 24) revelou uma
diminuição do diâmetro dos glóbulos proporcional à quantidade de PRZ no
sistema, confirmando o resultado encontrado na determinação do diâmetro da
gotícula encontrado pela técnica de espalhamento de luz (Figura 23).
Na Figura 25, encontram-se os resultados encontrados para pH,
condutividade elétrica e potencial zeta do terceiro grupo de formulação.
FIGURA 25 - Valores correspondentes ao potencial zeta, à condutividade elétrica e ao pH versus à
variação de PRZ no meio.
79
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
Por meio da Figura 25, é possível observar que está havendo uma
mudança de cargas quando a concentração do PRZ está entre 0,125 e 0,5%
sendo, provavelmente, este o intervalo de concentração que o fármaco satura a
FO e parte para a interface da vesícula emulsionada.
Não foi observada uma tendência em toda a faixa de concentração de
fármaco estudada, mas sim uma inflexão depois de 0,5%, o que potencialmente
indica uma mudança relevante da estrutura do sistema coloidal. Para investigar
isso, as amostras foram submetidas ao estudo reológico.
Analisando-se os valores para potencial Zeta observou-se diferenças
estatísticas significantes (ANOVA one-way, Dunnet pós-teste).
Na Tabela 8 encontram-se os resultados encontrados para índice de
polidispersidade das emulsões.
TABELA 8 – Valores correspondentes aos índices de polidispersão das diferentes emulsões em
estudo.
Índice de polidispersão
1º Grupo
2º Grupo
3º Grupo
FO 5%
0,323 ± 0,018
T 1%
0,376 ± 0,006
PRZ 0,125%
0,321 ± 0,018
FO 10%
0,338 ± 0,021
T 2,5%
0,345 ± 0,014
PRZ 0,25%
0,318 ± 0,026
FO 20%
0,315 ± 0,008
T 5%
0,332 ± 0,030
PRZ 0,5%
0,319 ± 0,021
FO 30%
0,291 ± 0,017
T 10%
0,330 ± 0,013
PRZ 0,75%
0,328 ± 0,015
PRZ 1%
0,312 ± 0,037
-
-
-
-
Em geral, os índices de polidispersão observados (Tabela 8) para as
emulsões obtidas (1º, 2º e 3º grupo) foram acima de 0,300, sendo este um
indicativo que as formulações estudadas são sistemas polidispersos (NEMEN &
LEMOS-SENNA, 2011). Esta característica pode também ser observada pelas
fotomicrografias das emulsões (Figuras 16, 20 e 24).
A reologia consiste no estudo do escoamento ou deformação do material
em estudo quando submetido a uma tensão. Este método é aplicável na
caracterização de sistemas emulsionados, pois o comportamento do fluido está
relacionado com o tipo e grau de organização do sistema. Também pode ser
empregado para checar a qualidade durante o processo de produção, além de
permitir o estudo do efeito de aditivos na formulação (MACHADO, 2002;
FORMARIZ et al., 2005).
80
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
Dessa forma, o estudo do comportamento reológico dos sistemas aplicado
ao modelo matemático de Herschel-Bulkley está apresentado na Tabela 9.
TABELA 9 - Valores correspondentes ao índice de comportamento (n), coeficiente de correlação
linear (r), tensão de cisalhamento inicial (τ0) e o índice de consistência (K) para cada sistema
emulsionado.
n
r
τ0
K
FO 5%
1,146
0,991
0,020
0,001
FO 10%
1,020
0,991
0,004
0,002
FO 20%
1,009
0,998
0,004
0,003
FO 30%
0,992
0,999
0,543
0,005
T 1%
1,617
0,943
0,048
0,001
T 2,5%
1,879
0,956
0,059
0,001
T 5%
1,020
0,991
0,004
0,002
T 10%
1,030
0,999
0,011
0,003
PRZ 0,125%
1,167
0,988
0,021
0,001
PRZ 0,250%
1,148
0,991
0,020
0,001
PRZ 0,500%
1,083
0,991
0,011
0,001
PRZ 0,750%
0,747
0,759
0,708
0,056
PRZ 1,0%
0,532
0,907
0,158
0,164
Grupo de formulações
1º
2º
3º
O modelo matemático que mais se adequou ao comportamento dos
sistemas foi a equação de Herschel-Bulkley, isso pode ser notado pelo valor de r
que está próximo a 1. Por meio desse modelo matemático, foi possível extrair os
valores de K (índice de consistência) que indica o grau de resistência do fluido
diante do escoamento. Para todos os sistemas os valores de K estiveram abaixo
de 1, indicando que não há resistência ao fluxo. Foi possível extrair também o
valor de n, que para todas as amostras, está próximo a 1, indicando que os
sistemas possuem comportamento de fluidos newtonianos. No entanto, as
amostras contendo 0,75 e 1,0 % de fármaco apresentaram valores característicos
de fluido pseudoplástico, confirmando a hipótese antes levantada nos resultados
apresentados na Figura 26.
Os dados da Tabela 9 mostram que os valores de n para as EM contendo
PRZ na concentração de 0,75 e 1,0 % são menores do que 1, indicando que
81
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
estes
sistemas
apresentam
comportamento
pseudoplástico.
O
grau
de
“pseudoplasticidade” pode ser medido pelo comportamento de fluxo (n) que
aumenta com a diminuição da pseudoplasticidade. Assim, de maneira geral, à
medida que aumenta a quantidade de PRZ no sistema, o grau de
pseudoplasticidade torna-se maior.
Por meio do modelo matemático utilizado também foi possível extrair o
valor de τ0 que indica a tensão de cisalhamento inicial necessária para que o
escoamento ocorra. Para todos os sistemas o valor da tensão de cisalhamento
ficou abaixo de 1, confirmando que esses sistemas não apresentam resistência
ao fluxo.
Analisando os resultados dos índices de consistência (K) mostrados na
Tabela 9, observa-se que, para os três grupos de formulações, tal parâmetro
apresenta um leve aumento à medida que há um aumento de cada constituinte no
sistema.
Como já era esperado para o primeiro grupo, uma vez aumentando-se a
fase oleosa, aumenta-se também a quantidade e o tamanho das gotículas no
meio. Correa e colaboradores (2005) mostraram que a viscosidade aparente de
sistemas microemulsionados e emulsionados é dependente do volume de fase e
da natureza da fase oleosa, visto que o aumento do volume de fase interna
oleosa provocou aumento da viscosidade aparente. Este comportamento foi
identificado anteriormente nas análises de índice de refração e turbidez (Figura
15), confirmando o aumento na estruturação do sistema.
Para o segundo grupo de formulações, o aumento do valor de K corrobora
com os resultados obtidos para o tamanho da gotícula (Figura 19), indicando que
houve aumento da estruturação do sistema, conforme discutido anteriormente. Já
para o terceiro grupo, o aumento do índice de consistência pode indicar que o
fármaco foi de fato incorporado nas vesículas emulsionadas, modificando, assim,
a estruturação do sistema e, consequentemente, a viscosidade do meio.
A construção de reogramas é útil para caracterizar quaisquer tipos de
emulsões. Neste sentido, realizou-se um estudo mostrando a relação entre a
tensão de cisalhamento e a taxa de cisalhamento (curvas ascendente e
descendente) e a viscosidade versus à taxa de cisalhamento para emulsões onde
82
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
se variou a quantidade de fase oleosa, a quantidade de tensoativos e a
quantidade de fármaco, respectivamente (Figura 26 e 27).
FO 5%
FO 10%
FO 20%
FO 30%
0,4
0,3
0,2
0,1
Ida (simbolo cheio)
Volta (simbolo vazio)
0,0
0
20
FO 5%
FO 10%
FO 20%
FO 30%
0,012
Viscosidade (Pa x s)
Tensao de cisalhamento (Pa)
A’
A
0,5
40
60
80
0,008
0,004
0,000
-0,004
-0,008
100
20
Taxa de cisalhamento (1/s)
60
80
100
B’
B
0,5
T 1%
T 2,5%
T 5%
T 10%
0,4
0,3
0,2
0,1
Ida (simbolo cheio)
Volta (simbolo vazio)
0,0
0
20
T 1%
T 2,5%
T 5%
T 10%
0,012
Viscosidade (Pa x s)
Tensao de cisalhamento (Pa)
40
Taxa de cisalhamento (1/s)
40
60
80
0,008
0,004
0,000
-0,004
-0,008
100
20
Taxa de cisalhamento (1/s)
40
60
80
100
Taxa de cisalhamento (1/s)
FIGURA 26 - Reogramas da tensão de cisalhamento versus taxa de cisalhamento (A e B) e
viscosidade versus taxa de cisalhamento dos sistemas (A’ e B’).
Pode
ser
observado
que
as
amostras
estudadas
apresentaram
comportamento newtoniano, não sofrendo deformação em função da tensão
aplicada. Segundo a lei de Newton, para líquidos ideais a tensão de cisalhamento
é diretamente proporcional à velocidade de cisalhamento (ALMEIDA et al., 2003).
A viscosidade é independente da velocidade de deformação. Sabe-se que as
curvas de líquidos newtonianos são linhas retas que passam através da origem
(SCOTT, 2000).
Por meio da determinação da viscosidade das amostras Figura 26-A’ e B’,
confirma-se que as mesmas são fluidos Newtoniano mantendo a viscosidade
constante com a velocidade de cisalhamento aplicada. Pode-se notar também
que a viscosidade aumentou à medida que se aumentou a concentração dos
83
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
componentes no sistema (Figura 26-A’ e B’). Estes resultados confirmam que o
aumento da fase oleosa provoca um aumento da viscosidade das EM, pois
promove um maior empacotamento das moléculas de tensoativos e induzem a
formação de uma estrutura mais organizada, mais rígida e com menor mobilidade
(TIROSH et al., 1997). Hung e colaboradores (2007) e Wang e colaboradores
(2006) observaram que o aumento do diâmetro da gotícula também acarretava
um aumento da viscosidade de suas emulsões.
Na Figura 27 encontra-se a relação entre a tensão de cisalhamento e a
taxa de cisalhamento e a viscosidade versus à taxa de cisalhamento para
emulsões onde se variou a quantidade de fármaco.
Tens‫م‬o de cisalhamento (Pa)
0,4
4
A
PRZ 0,75%
PRZ 1,0%
3
0,3
0
0
20
40
60
80
100
0,2
0,1
Ida (simbolo cheio)
Volta (simbolo vazio)
0,0
0
20
40
PRZ 0%
PRZ 0,125%
PRZ 0,25%
PRZ 0,5%
0,012
2
1
60
80
Taxa de cisalhamento (1/s)
100
B
1,00
Viscosidade (Pa x s)
PRZ 0%
PRZ 0,125%
PRZ 0,25%
PRZ 0,5%
0,5
0,008
PRZ 0,75%
PRZ 1,0%
0,75
0,50
0,25
0,00
-0,25
-0,50
0,004
0
20
40
60
80
100
0,000
-0,004
-0,008
0
20
40
60
80
100
Taxa de cisalhamento (1/s)
FIGURA 27 - Reogramas da tensão de cisalhamento versus taxa de cisalhamento (A) e
viscosidade versus taxa de cisalhamento dos sistemas (B) para as emulsões onde houve adição
de PRZ.
Na Figura 27, nas concentrações de 0 a 0,5% foi observado uma
sobreposição nas curvas indicando que a viscosidade dessas emulsões não
sofreu alteração de valor, corroborando com a teoria proposta de que o fármaco
inicialmente é solubilizado no interior da vesícula emulsionada para depois que
saturada, próximo a 0,5% de PRZ, passa para a interface da gotícula competindo
com os tensoativos. Nas concentrações de 0,75 a 1,0% há um aumento da
viscosidade, sugerindo-se que ocorreu a formação de microestruturas mais
volumosas provocada pelas interações do PRZ com a interface dos sistemas,
podendo perturbar a organização da interface, promovendo espaçamento entre as
moléculas de tensoativo, formando uma estrutura mais organizada, que reflete
84
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
diretamente sobre a viscosidade do sistema, corroborando com os resultados
obtidos para turbidez e índice de refração na Figura 23.
Por serem sistemas que se comportam como fluidos pseudoplásticos (PRZ
0,75% e PRZ 1%), as altas taxas de cisalhamento aplicadas provocam além da
desestruturação, a diminuição da viscosidade. No caso dessas emulsões, isto se
deve ao alinhamento das gotículas coloidais na direção do escoamento,
diminuindo a resistência interna e consequentemente a viscosidade (SCHRAMM,
2006).
As alterações que ocorrem sobre as propriedades reológicas ao longo do
tempo podem ser verificadas determinando a viscosidade em função da
velocidade de cisalhamento de modo ascendente e descendente continuamente.
Quando as curvas se sobrepõem, o sistema é caracterizado como tempo
independente e indica que apresenta uma rápida reestruturação. Quando a curva
ascendente indica valores maiores que os da curva descendente, o sistema é
chamado de tixotrópico, e quando ocorre o contrário, o sistema tem
comportamento
reopético.
A diferença entre as curvas ascendentes e
descendentes dos reogramas ilustra o fenômeno de histerese e sua área indica a
energia requerida para a quebra da estrutura do sistema (LABBA, 1993).
Os resultados apresentados na Figura 26 e 27 indicam que a maioria das
amostras são tempo independentes, o que já era esperado uma vez que essas
amostras apresentam comportamento newtoniano. Já as amostras PRZ 0,75% e
PRZ 1%, comportam-se como fluidos pseudoplásticos e apresentam área de
histerese com comportamento tixotrópico. Dessa maneira, resolveu-se estudar
também as propriedades tixotrópicas dessas emulsões por meio de testes
oscilatórios.
Nos ensaios oscilatórios podem ser obtidos os módulos elásticos (G´) e
viscosos (G´´) e a magnitude destes módulos é uma indicação qualitativa da
estrutura do sistema. Se G’ >> G”, pode-se sugerir que o sistema está interligado
quimicamente, ou se G’ > G” o sistema está estruturado por ligações secundárias,
mas se G’ ≤ G”, diz-se que as moléculas do sistema estão ligadas apenas por
interações físicas (CEULEMANS; VINCKIER; LUDWIG, 2002). A viscoelasticidade
é usada para descrever comportamento de materiais, os quais apresentam
comportamento intermediário entre os elásticos clássicos extremos, que são
85
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
chamados de sólidos hookeanos e líquidos newtonianos. Materiais viscoelásticos
têm simultaneamente propriedades elástica e viscosa (KORHONEN, 2003).
A Figura 28 mostra a evolução dos módulos de armazenagem (G’) e de
perda (G”) das EM contendo PRZ na concentração de 0,75% e 1%.
FIGURA 28 - Evolução dos módulos de armazenagem G’e de perda G” das emulsões contendo
0,75 e 1% de PRZ.
Analisando o gráfico plotado para o teste oscilatório (Figura 28) é possível
perceber que o módulo de perda (habilidade do material dissipar energia) é maior
do que o modulo de armazenagem (habilidade do material armazenar energia)
para as duas amostras em estudos, o que confirma que o sistema apresenta
comportamento viscoelástico.
O comportamento viscoelástico das formulações é coerente com a análise
visual das amostras que continham PRZ, podendo-se observar a relação entre o
aumento de fármaco na formulação, que a torna mais viscosa, ou seja, mais
organizada e com o aumento da componente elástica. Sugere-se então, que ao
se aumentar a quantidade de PRZ, o fármaco organiza-se de maneira a saturar a
parte hidrofóbica dos tensoativos, formando mesofase cristalinas, o que justifica o
aumento na viscoelasticidade apresentada por essas formulações. Pode-se
sugerir também que a interação do PRZ com a FO provoca a formação de
86
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
microestruturas mais volumosas, que se refletem diretamente no índice de
consistência (PESTANA, et al., 2008).
Por fim, partiu-se para a análise da estabilidade acelerada da emulsão com
fármaco incorporado.
5.4.2 Efeito do fármaco na estabilidade da emulsão
A partir da suspeita de que o PRZ poderia estar interagindo com os
componentes da formulação como um tensoativo, um estudo de estabilidade foi
realizado modificando-se a concentração de tensoativos na emulsão na presença
de fármaco.
O ensaio foi realizado em um período de 30 dias avaliando-se o índice de
cremagem, o pH, a condutividade elétrica, a turbidez, o teor do fármaco e a
microscopia óptica com aumento de 400x. Todas essas foram realizadas em
associação, para que essas metodologias em conjunto pudessem oferecer
maiores informações a respeito da caracterização das emulsões. A Figura 29
apresenta os resultados para dois desses parâmetros: o índice de cremagem
(Figura 29 - A) e a turbidez (Figura 29 -B).
A
B
FIGURA 29 - Gráficos do efeito do fármaco na estabilidade das emulsões Sendo emulsões: (○)
com 5% de T, sem PRZ; (●) com 1% de T + PRZ, (▲) com 2,5% de T + PRZ, (■) com 5% de T +
PRZ.
Na Figura 29-A, observou-se que a emulsão sem o fármaco apresentou
índice de cremagem quase constante durante os 30 dias, variando esse índice na
faixa de 12-14%. Para os sistemas com PRZ e adição de 1 e 2,5% de tensoativos,
87
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
observa-se um aumento gradativo de ambos os índices, ficando próximo de 15%
ao longo dos 30 dias de avaliação. Para as emulsões com 5% de tensoativos não
foi observado variação do IC, indicando que tal emulsão foi a mais estável frente
às demais emulsões analisadas. Isso porque, a estabilização de emulsões pelo
uso de tensoativos não-iônicos se faz através de impedimento estérico e ligações
de hidrogênio. A porção apolar do tensoativo se insere nas partículas de óleo e os
grupos de óxido de etileno na fase aquosa. Os grupos de óxido de etileno causam
impedimento estérico que inibe as partículas de óleo sofrerem colisão e
coalescer, alem de formarem ligações de hidrogênio com a água (FOX, 1986;
SILVA & SOARES, 1996). Entretanto, a estabilização de emulsões pode também
ser obtida usando concentração mais elevada de agentes emulsificantes, pois
isso resultará num filme ao redor das gotículas de óleo mais firme e compacto
reduzindo a coalescência (FOX, 1986).
Estes resultados demonstram que o fármaco aumenta a estabilidade dos
sistemas, pois aquelas contendo 1% de tensoativos foram mais estáveis do que
aquelas contendo 5% de tensoativos sem fármaco. Este resultado demonstra
claramente que o fármaco interage preferenciamente na interface e que age como
um tensoativo nos sistema.
Analisando a Figura 29-B, é possível afirmar que o menor valor de turbidez
é para a emulsão sem PRZ, no entanto, para as emulsões com o fármaco, com o
aumento da concentração dos tensoativos, os valores da turbidez aumentaram
relativamente. Indicando, conforme visto no estudo anterior (5.4.1), que o
aumento da quantidade de tensoativos promoveu uma maior estruturação no
sistema. Pode-se observar essa estruturação do sistema, também, na Figura 31,
uma vez que existe uma maior uniformidade do tamanho e quantidade de
gotículas para 5% de tensoativos. Os resultados de turbidez confirmam os
resultados obtidos para IC.
Estudou-se também o pH e a condutividade das diferentes emulsões, com
o objetivo de se avaliar também processos de instabilidade. Os resultados do
estudo estão apresentados na Figura 30.
88
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
A
B
FIGURA 30 - Gráficos do efeito do fármaco na estabilidade das emulsões Sendo emulsões: (○)
com 5% de T, sem PRZ; (●) com 1% de T + PRZ, (▲) com 2,5% de T + PRZ, (■) com 5% de T +
PRZ.
Avaliando estatisticamente os valores obtidos do pH para as diferentes
emulsões (Figura 30-A), não foi observado alteração significativa [F (3,12) =
0,665, (p = 0,590)], indicando que a mudança na quantidade de tensoativos no
meio não é um indicativo de instabilidade para esse parâmetro.
Percebe-se na Figura 30–B que a condutividade aumentou com o aumento
da concentração de tensoativos, resultado esse observado também no estudo do
item anterior (5.4.1) onde houve variação de tensoativos de 1 a 10%. Esse
aumento da condutividade está relacionado à formação de uma camada elétrica
ao redor da gotícula dispersa ocasionado pelo uso dos tensoativos não iônicos
(FRANGE, GARCIA, 2009).
Para uma análise morfológica, foram obtidas as fotomicrografias dos
diferentes sistemas emulsionados em função do tempo (Figura 31).
89
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
FIGURA 31 - Fotomicrografia das emulsões contendo 1% de PRZ e 1; 2,5 e 5% de tensoativos
durante os 30 dias de estudo de estabilidade. Aumento de 400x.
Por meio da Figura 31, é possível observar que para as emulsões contendo
1 e 2,5% de tensoativos, os glóbulos encontram-se heterogêneos, variando de
tamanho durante os 30 dias de estudo. Já para as emulsões contendo 5% de
tensoativos observa-se uma maior homogeneidade dos glóbulos durante os 30
90
Resultados e discussão
_________________________________________________________________
dias de estudo. Esse resultado indica que na concentração de 5% de tensoativo e
1% de PRZ há uma boa estabilização do sistema emulsionado.
Avaliou-se também a eficiência de incorporação do fármaco nos sistemas
obtidos com o intuito de averiguar se o aumento da quantidade de tensoativos no
meio alterava a eficiência de incorporação do PRZ. O resultado dessa avaliação
está apresentado na Figura 32.
FIGURA 32 - Gráfico para determinação do teor de fármaco nas emulsões em 30 dias de estudo.
Sendo emulsões: (○) com 5% de T, sem PRZ; (●) com 1% de T + PRZ, (▲) com 2,5% de T + PRZ,
(■) com 5% de T + PRZ.
Na Figura 32 observou-se que somente as emulsões contendo 5% de
tensoativos foram capazes de incorporar cerca de 1% de fármaco, a quantidade
de PRZ incorporado ao sistema está associada ao aumento de tensoativos. Tal
efeito pode ser explicado pela ocorrência de uma maior estabilização da vesícula
emulsionada, o que proporcionou um aumento da quantidade de fármaco
incorporado. Isso pode ser observado na Figura 30 onde as gotículas parecem
mais homogêneas para os sistemas com 5% de tensoativos.
Para tal estudo, o sistema que apresentou melhor estabilidade quando
observado todos os parâmetros analisados foi o sistema contendo 5% de
tensoativos. Para uma quantidade de tensoativos inferior a 5%, observaram-se
processos de instabilidade e um menor teor de fármaco incorporado ao longo dos
30
dias.
91
Conclusão
_________________________________________________________________
6. CONCLUSÃO
O método de análise por espectrofotometria UV proposto foi validado para
doseamento do PRZ, demonstrando ser simples, rápido, específico, preciso,
exato e robusto. Dessa forma, o método analítico constituiu uma ferramenta útil,
de baixo custo e fácil execução para a quantificação do fármaco nos sistemas
emulsionados.
O estudo de estabilidade aparente ao longo de 7 dias das emulsões,
contendo Tween® 80 e Span® 80, por meio do índice de cremagem, possibilitou a
determinação do melhor EHL, estando em 11.
O emprego do diagrama pseudoternário se mostrou bastante simples
ajudando na escolha das concentrações água/óleo/tensoativos que foram
empregadas para formulação emulsões O/A. Através do diagrama, foi também
possível determinar e identificar as várias regiões geradas como sistemas
emulsionados opaco brancos, sistemas translúcidos, sistemas emulsionados
opaco amarelos e separação de fases. Além de indicar a melhor combinação dos
componentes das fórmulas em suas respectivas quantidades a fim de produzir um
sistema mais estável.
O sistema emulsionado apresentou estabilidade, quando submetido a um
estresse térmico, durante trinta dias de estudo sem cotensoativo, bem como
quando adicionado álcool etílico como cotensoativo. O melhor método para a
incorporação do fármaco foi a adição do mesmo na fase oleosa antes da inversão
de fases, entretanto, a adição de álcool etílico não contribuiu para o aumento da
quantidade de fármaco incorporado.
No estudo da interação do fármaco com o sistema, foi observado através
da caracterização físico-química por medidas de turbidez, condutividade, índice
de refração, reologia e análise morfológica que o fármaco encontra-se
incorporado
à
vesícula
emulsionada
promovendo
uma
modificação
na
estruturação do sistema proporcional à quantidade incorporada.
No estudo de estabilidade da emulsão com o fármaco incorporado,
mediante a avaliação do índice de cremagem, pH, condutividade, turbidez, índice
92
Conclusão
_________________________________________________________________
de refração, teor de fármaco e microscopia óptica, o sistema que apresentou
maior estabilidade foi aquele contendo 5% de tensoativos na sua formulação.
Dessa forma, o sistema emulsionado em estudo apresentou estabilidade e
capacidade de incorporar alta quantidade de PRZ, sendo interessante para
desenvolvimento de uma nova formulação farmacêutica para o combate da
esquistossomose.
93
Perspectivas
_________________________________________________________________
PERSPECTIVAS
Considerando a experiência profissional adquirida por ocasião da
realização deste trabalho, experiência esta que veio se somar à minha formação
escolar e superior anteriormente adquirida, pretendo continuar desenvolvendo
projetos na área de tecnologia farmacêutica no doutorado.
Somado a esse trabalho existem resultados que não foram aqui
divulgados, mas que serão publicados em um artigo cientifico, segue resumo:
Obtention and characterization oil-in-water soybean nanoemulsions as a
potential delivery system for drug water insoluble
Nanoemulsion systems composed of water, polysorbate 80 (tween® 80), sorbitan
monooleate (span® 80) and soybean oil, were investigated as potential drug
delivery vehicles for insolubles drugs. Pseudo-ternary phase diagram of the
investigated system, was constructed at room temperature by titration, and the oilto-surfactants mass ratios (O/SC) that exhibit the maximum in the solubilization of
water were found. This allowed the investigation of the continuous structural
inversion from water-in-oil to oil-in-water nanoemulsions on dilution with water
phase. The microstructures of the system were characterized by polarized light
microscopy, zeta potential, dynamic light scattering (DLS) and rheological
behavior that the size of the oil droplets increased proportionally with increase in
amount of oil phase and decreased with increase amount of surfactants. In all
cases the Zeta potential resulted below |-40 mV|. For all samples a Newtonian
behavior was found. The obtained results suggest that the samples show droplets
with an interior capable of incorporating hydrophobic drugs with low aqueous
solubility. The investigated nanoemulsions should be very interesting as new drug
carrier systems.
Key-words: phase diagram, nanoemulsion, soybean oil.
94
Referências bibliográficas
_________________________________________________________________
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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107
ANEXOS
Anexo I - Resumo e reivindicações da patente intitulada: COMPOSIÇÃO E
PROCESSO DE PRODUÇÃO DE FORMA LÍQUIDA DE ADMINISTRAÇÃO A
BASE DE SISTEMAS LIPÍDICOS EMULSIONADOS, DO TIPO EMULSÃO,
MICROEMULSÃO
E/OU
NANOEMULSÃO
CONTENDO
PRAZIQUANTEL,
depositada no INPI BR 10 2013 000455 3.
108
ANEXO I
RESUMO
COMPOSIÇÃO E PROCESSO DE PRODUÇÃO DE FORMA LÍQUIDA DE
ADMINISTRAÇÃO A BASE DE SISTEMAS LIPÍDICOS EMULSIONADOS, DO
TIPO EMULSÃO, MICROEMULSÃO E/OU NANOEMULSÃO CONTENDO
PRAZIQUANTEL
A patente de invenção refere-se a uma forma líquida de administração do
praziquantel
[(±)-2ciclo-hexilcarbonil-1,2,3,6,7,11b-hexa-hidro-4H-pirazino[2,1-
a]isoquinolin-4-ona] contido no interior de uma fase oleosa, emulsificada no
interior de uma fase aquosa com o auxilio de tensoativos, podendo estar
associados a cotensoativos e a moleculas de direcionamento do fármaco para o
parasita. O sistema lipídico emulsionado pode se apresentar como emulsão,
microemulsão e/ou nanoemulsão, dependendo da composição e o do método de
fabricação empregados. Os referidos sistemas aumentam a quantidade de
fármaco solúvel em um sistema aquoso por até mais de 100 vezes, o que
potencialmente intensifica sua absorção oral e possibilita sua administração
parenteral, modificando desta forma biodisponibilidade em relação às formas de
administração disponíveis.
REIVINDICAÇÕES
1
COMPOSIÇÃO E PROCESSO DE PRODUÇÃO DE FORMA LÍQUIDA DE
ADMINISTRAÇÃO A BASE DE SISTEMAS LIPÍDICOS EMULSIONADOS, DO
TIPO EMULSÃO, MICROEMULSÃO E/OU NANOEMULSÃO CONTENDO
PRAZIQUANTEL, caracterizado por uma forma líquida de administração do
praziquantel incorporado em uma fase oleosa emulsificada por tensoativos no
interior de uma fase aquosa, a qual pode ser administrada por via oral e/ou
parenteral para todas as faixas etárias de humanos ou animais (uso veterinário).
2
Sistema lipídico emulsionado para a administração do praziquantel de acordo com
a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sistema pode se apresentar na
forma de emulsão, microemulsão e/ou nanoemulsão, de acordo com a
composição, estabilidade termodinâmica ou método de produção utilizados para a
109
concepção dos mesmos.
3
Sistema lipídico emulsionado para a administração do praziquantel de acordo com
a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida fase externa aquosa é
composta por água, podendo ser acrescida de agentes estabilizantes, como
conservantes, antioxidantes e tampões, equanto a fase interna oleosa pode ser
constituída por óleo sintético, preferencialmente a base de triglicerídeos de cadeia
média (MCT) como fase oleosa, o qual compreende ésteres de glicerídeos
predominantemente saturados com número de carbonos igual a oito (50-80%) e
dez (20-45%) podendo variar conforme a disponibilidade do mercado, ou por óleo
vegetal de uso farmacêutico, preferencialmente o óleo de soja; ou ainda por por
óleo mineral de uso farmacêutico.
4
Sistema lipídico emulsionado para a administração do praziquantel de acordo com
a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o referido agente tensoativo é
selecionado de um ou mais do grupo que consiste em polissorbatos, monoesteres
do sorbitano, oleato de sódio, fosfatidilcolina de soja e fosfatidilcolina de gema de
ovo, podendo estar associados a agentes cotensoativos.
5
Sistema lipídico emulsionado para a administração do praziquantel de acordo com
a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de alguma molécula de direcionamento
como por exemplo o colesterol estar contida, preferencialmente adsorvida na
interface óleo/água pela sua potencial capacidade de promover o direcionamento
do sistema lipídico contendo o fármaco para o parasita.
6
Método de fabricação de sistema lipídico emulsionado para a administração do
praziquantel de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os
componentes da fase oleosa são misturados com os componentes da fase
aquosa, em uma faixa de temperatura de 25 a 75ºC, preferencialmente a 75ºC,
utilizando agitadores do tipo magnético, mecânico com hélices e ou pás, do tipo
ultra-turrax, sonda de ultrassom ou ainda extrusão em alta pressão, nos quais o
fármaco pode ser incorporado no momento da mistura ou depois de obtidos os
sistemas emulsionados.
110