análise de células t regulatórias foxp3 no líquen plano oral joabe

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
CURSO DE MESTRADO EM PATOLOGIA ORAL
JOABE DOS SANTOS PEREIRA
ANÁLISE DE CÉLULAS T REGULATÓRIAS FOXP3+
NO LÍQUEN PLANO ORAL
Natal / RN
2010
JOABE DOS SANTOS PEREIRA
ANÁLISE DE CÉLULAS T REGULATÓRIAS FOXP3+
NO LÍQUEN PLANO ORAL
Dissertação apresentada ao Colegiado do Programa
de Pós-Graduação em Patologia Oral do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Patologia Oral
Orientadora: Profa. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel
Natal / RN
2010
Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia
Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
Pereira, Joabe dos Santos.
Análise de células T regulatórias FoxP3+ no líquen plano oral / Joabe dos
Santos Pereira. – Natal, RN, 2010.
107 f. : il.
Orientador: Profa. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel.
Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral.
1. Líquen Plano Oral – Dissertação. 2. Imunoistoquímica – Dissertação. 3. Celulas T Regulatórias – Dissertação. 4. FoxP3 – Dissertação. I. Miguel, Márcia Cristina da Costa. II. Título.
RN/UF/BSO
Black D66
O temor do Senhor é o princípio do saber...
Pv. 1:7
Dedicatória
A Deus, princípio de todas as coisas e para quem todas elas são, razão do meu viver e existir;
Aos meus pais, por terem acreditado e investido em mim;
Às minhas irmãs por sempre me trazerem alegria;
A todos aqueles que me incentivaram mesmo sem saber, com suas palavras ou ações, e até
mesmo pela simples lembrança presente em minha memória...
...dedico.
Não a nós, Senhor, não a nós, mas ao teu nome dá glória, por amor da tua
misericórdia e da tua fidelidade. Por que dirão as nações: Onde está o seu Deus?
No céu está o nosso Deus e tudo faz como lhe agrada.
Salmos 115:1-3
Agradecimento Especial
Agradeço à Profa. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel, minha orientadora, pela
dedicação incessante no desenvolvimento dos trabalhos, por sempre se mostrar solícita nos
momentos de orientação, pelo desejo sempre presente de transmitir seus conhecimentos, pelo
interesse de realizar tudo que faz com excelência, por todo conhecimento científico
compartilhado, pela imensa e fundamental contribuição na realização deste trabalho.
Obrigado pela amizade, pela presença nos momentos de informalidade, pela compreensão nos
momentos de dificuldade, pela paciência que teve para comigo, demonstrada desde o início do
curso. Enfim, por ter me preparado e capacitado para ser um profissional melhor. Certamente
levarei comigo seus ensinamentos por toda a minha vida acadêmica.
Tu, Senhor, conservarás em perfeita paz aquele cujo propósito é firme;
porque ele confia em ti. Confiai no Senhor perpetuamente, porque o
Senhor Deus é uma rocha eterna.
Isaías 26:3,4
Agradecimentos
A Deus, por ter me concedido de graça toda paz e felicidade que possuo. Por ter concretizado
em minha vida a realização deste sonho. Por me dar capacidade para enfrentar todas as etapas
da minha vida e me fazer chegar até aqui. Por me tornar tudo aquilo que sou hoje. Pelos
momentos difíceis que me fizeram crescer, amadurecer e ser mais forte. Por renovar meus
sonhos e me dar novos propósitos nos momentos de maior dificuldade, nunca me deixando só.
Por tudo enfim, obrigado Senhor!
À meus pais Jorge Avelino Pereira e Jaidete dos Santos Pereira, por terem acreditado e
investido em mim durante toda a minha vida. Por serem exemplos de honestidade, humildade,
integridade, perseverança e tantas outras qualidades que nem as maiores intempéries da vida
podem apagar do meu coração nem do meu caráter. Com eles aprendi não somente a ser
alguém melhor, mas a ter um sentido para ser melhor. Obrigado pela fé que me ensinaram.
Às minhas irmãs Joyce e Jeísa, por toda felicidade que me trazem. Por estarem sempre
presentes nos momentos mais importantes da minha vida. À minha tia Maria Dasdores por
todo o carinho dispensado, pelo cuidado, pelo interesse, pela saudade e por todas as alegrias.
Ao meu sobrinho Arthur por me dar mais um motivo pra ser feliz. À minha avó Eunice,
exemplo de fé, de coragem, de amor a Deus e ao próximo. Obrigado por tudo que me ensinou.
À todos os meus amigos, pessoas sem as quais seria muito difícil chegar até aqui.
Ao Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, exemplo de dedicação e amor pelo que faz. Sua
experiência e seus conhecimentos contribuem de forma singular com nosso aprendizado
científico.
À Profa. Dra. Lélia Batista de Souza, por todos os seus valiosos conhecimentos
compartilhados, por toda colaboração para a melhoria deste Programa de Pós-graduação. Pelo
interesse em tornar seus alunos profissionais melhores. Pelos momentos de seriedade e
probidade com os quais conduz suas atividades, e pela simpatia nos momentos de
descontração.
À Profa. Dra. Roseana de Almeida Freitas, pelos valiosos ensinamentos e pela
disponibilidade sempre presente nos momentos de dúvida.
À Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, por toda a competência com que conduz suas
atividade neste programa.
À Prof. Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, pela confiança em nós depositada durante a
realização das nossas atividades, por ser sempre incentivadora e pelos estímulos cedidos.
Ao Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, por ser para seus alunos um exemplo de
integridade e seriedade naquilo que faz, além de proporcionar valiosos momentos de
descontração.
À Profa. Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira, por ser para nós um exemplo de dedicação
e perseverança. Pelo seu amor à profissão demonstrado em todas as suas atitudes. Pelo
entusiasmo contagiante sempre presente no nosso cotidiano.
Ao Prof. Dr. Manuel Antonio Gordón Nuñez, pelo seu exemplo de dedicação e humildade.
À Profa. Dra. Ana Miryam Costa de Medeiros, por toda a competência demonstrada na
condução da clínica da estomatologia. Por ser uma pessoa atenciosa, calma e paciente para
ensinar.
Ao Prof. Dr. Kênio Costa Lima, pela contribuição na realização da análise estatística deste
trabalho.
Ao Prof. Dr. Gustavo Pina Godoy por ser um grande exemplo de professor e pesquisador,
pela participação importante nas etapas da minha vida acadêmica desde a graduação, pelo
encaminhamento a este Programa de Pós-Graduação.
Aos meus amigos da turma de Mestrado, por todos os momentos compartilhados. Pela força
durante as dificuldades, e pelas dificuldades compartilhadas também. Pelo companheirismo
presente no nosso dia a dia. Pelo otimismo, pela ajuda mútua, pelo cuidado e preocupação.
Por todos os nossos momentos de alegria...
... como teria sido difícil esta caminhada sem todos vocês!
Vocês estarão sempre presentes na minha memória. Obrigado Cyntia Carvalho, Emeline
Lima, Felipe Matos, Maiara Moraes, Marianne Carvalho, Thaís Benevenuto.
Aos meus amigos da turma de doutorado, com quem sempre posso compartilhar não somente
experiências acadêmicas, mas também momentos excepcionalmente simples e especiais,
como uma conversa agradável durante o almoço, Águida, Pedro Paulo, Alessandra,
Valéria, Ana Rafaela, sem vocês meu dia a dia não seria o mesmo.
Aos colegas do doutorado Cassiano, George, Déborah, Bruna Rafaela, Bruna Amaral,
Karuza, Alexandre, Polliana, Cristina, Adriana, Marcelo e Ruth por toda a ajuda
dispensada no início e no decorrer do curso. Pelas experiências compartilhadas, pelos
ensinamentos, por toda atenção e pelo convívio sempre agradável.
Aos funcionários: Gracinha, Sandrinha, Lourdinha, Canindé, Andréia, Idelzuite e Hévio,
por toda a ajuda prestada.
À CAPES, pelo incentivo financeiro que me permitiu cursar este Mestrado.
Agradeço.
Resumo
RESUMO
As células T regulatórias (Treg) possuem a função de controlar respostas imunes e
manter a autotolerância. O FoxP3 tem sido considerado o marcador mais específico para
células Treg. O objetivo deste estudo foi avaliar a imunoexpressão do FoxP3 no infiltrado
inflamatório do líquen plano oral (LPO) comparado ao da hiperplasia fibrosa inflamatória (HFI)
e posteriormente entre as formas reticular e erosiva do LPO. A amostra foi composta por 32
casos de LPO (17 reticulares e 15 erosivos) além de 10 casos de HFI que foram submetidos à
marcação imunoistoquímica para o FoxP3. A localização da marcação foi classificada em
justaepitelial ou intraepitelial e a quantidade das células FoxP3+ foi avaliada através da
contagem destas em 10 campos consecutivos, com aumento de 400x. Os valores foram
expressos em média ± desvio-padrão, e submetidos aos testes estatísticos com nível de
significância de 5%. Observou-se uma diferença estatisticamente significativa na quantidade de
células Treg FoxP3+ entre os dois tipos de LPO reunidos (1,6 ± 2,2) e a HFI (0,5 ± 0,4)
(P<0,05). Isto talvez possa ser explicado pelo mecanismo imunológico do LPO, que envolve
uma provável indução antigênica permanente com conseqüente perpetuação da lesão,
suscitando a proliferação e recrutamento constante das células Treg. Em contrapartida, a HFI
apresenta uma etiopatogenia diferente, na qual também há geração de um infiltrado
inflamatório variável, porém qualitativamente distinto do verificado no LPO. A forma erosiva
do LPO exibiu um maior número (1,7 ± 2,4) de células Treg FoxP3+ que a forma reticular (1,5
± 2,1). Estas alterações podem ter relação com a maior atividade da doença verificada no LPO
erosivo, ou ainda, com anormalidades na função reguladora das células Treg que
ocasionariam o aumento observado. Considerando-se a capacidade já bem estabelecida na
literatura, tanto das células Treg modularem as respostas imunológicas, quanto da mucosa
oral em exibir um grande potencial de regeneração, sugere-se que a possibilidade de
desenvolvimento e implantação de estratégias imunoterapêuticas que regulem a freqüência e a
função destas células, possa futuramente auxiliar no tratamento de doenças inflamatórias
mediadas imunologicamente, como o LPO.
Palavras-chave: líquen plano oral, imunoistoquímica, célula T regulatória, FoxP3
Abstract
ABSTRACT
T regulatory cells have the function of controlling immune responses and maintaining
self-tolerance. The FoxP3 has been considered the most specific marker for Treg cells. The
aiming of this paper was to evaluate the immunoexpression of FoxP3 in the inflammatory
infiltrate from oral lichen planus (OLP) and to compare it with the infiltrate in fibrous
inflammatory hyperplasia (FIH) and then, between reticular and erosive forms of OLP. The
samples were composed by 32 cases of OLP (17 reticular and 15 erosive) beyond 10 cases of
FIH that were submitted to immunohistochemistry staining for FoxP3. Localization of the
staining was classified in underepithelial and intraepithelial and the amount of FoxP3+ cells was
evaluated through cells counting in 10 consecutive fields, at 400x power magnification. The
values were expressed in mean ± standart deviation, and submitted to statistical tests with 5% of
significance level. It was observed a statistical significant difference in the amount of FoxP3+
Treg cells between the two combined forms of OLP (1,6 ± 2,2) and the FIH (0,5 ±0,4) (P<0,05).
This maybe could be explained by immunological mechanism of OLP, which involves a
permanent antigenic induction likely with consequent perpetuation of lesion, eliciting the
proliferation and constant recruitment of Treg cells. Otherwise, FIH presents a different
etiopathogenesis, in which there is also generation of a variable inflammatory infiltrate,
however qualitatively distinct from that seen in OLP. The erosive form of OLP exhibited a
greater number (1,7 ± 2,4) of FoxP3+ Treg cells than reticular form (1,5 ± 2,1). These
alterations could have relation with the great disease activity verified in erosive OLP, or also,
with abnormalities in the regulatory function of Treg cells that could cause the increase
observed. Considering the capacity already well established in the literature, both about Treg
cells in modulating immune responses, as in the oral mucosa in showing great potential for
regeneration, it is suggested that the possibility of development and implantation of
immunotherapeutic strategies that regulate the frequency and function of these cells, may help
in future treatment of immune-mediated inflammatory diseases such as OLP.
Key words: oral lichen planus, immunohistochemistry, regulatory T cells, FoxP3
Lista de Ilustrações
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 01
Critérios diagnósticos propostos pela OMS para LPO, modificados por van
der Meij e van der Waal (2003).......................................................................
Quadro 02
52
Especificidade, clone, recuperação antigênica, diluição e tempo de
incubação dos anticorpos utilizados................................................................
53
Gráfico 01
Distribuição da amostra quanto ao tipo de lesão. Natal/RN – 2010................ 58
Gráfico 02
Barra de Erros da média ± desvio padrão em relação ao tipo de lesão.
Natal/RN - 2010............................................................................................... 62
Gráfico 03
Barra de Erros da média ± desvio padrão em relação ao tipo de lesão.
Natal/RN - 2010............................................................................................... 64
Figura 01
Corte histológico de líquen plano oral corado em HE, exibindo atrofia
epitelial ...........................................................................................................
Figura 02
Corte histológico de líquen plano oral corado em HE, exibindo os Corpos
de Civatte ....................... ................................................................................
Figura 03
66
66
Imunoexpressão do FoxP3 em líquen plano oral, exibindo a formação de
centro germinativo no infiltrado inflamatório justaepitelial ............ .............. 67
Figura 04
Imunoexpressão do FoxP3 nas células Treg intraepiteliais (setas) em líquen
plano oral reticular ............ ............................................................................. 68
Figura 05
Imunoexpressão do FoxP3 nas células Treg intraepiteliais e justaepiteliais
(setas) em líquen plano oral erosivo ...............................................................
Figura 06
68
Imunoexpressão do FoxP3 nas células Treg justaepiteliais (setas) em líquen
plano oral reticular ............ ............................................................................. 69
Figura 07
Figura 08
Imunoexpressão do FoxP3 nas células Treg justaepiteliais (setas) em líquen
plano oral erosivo ........... ...............................................................................
Imunoexpressão do FoxP3 nas células Treg intraepiteliais e justaepiteliais
(setas) em hiperplasia fibrosa inflamatória ............. .......................................
69
70
Lista de Tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela 01
Distribuição dos casos quanto ao tipo de lesão em relação ao tipo de
ceratinização. Natal/RN – 2010....................................................................... 59
Tabela 02
Distribuição dos casos quanto ao tipo de lesão em relação ao tipo de
hiperceratinização. Natal/RN – 2010............................................................... 59
Tabela 03
Distribuição dos casos quanto ao tipo de lesão em relação às características
epiteliais. Natal/RN – 2010.............................................................................
Tabela 04
60
Quantidade, média ± desvio padrão e intervalo de confiança (95%)
relativos à contagem de células justaepiteliais imunomarcadas para o
FoxP3. Natal/RN – 2010. ...............................................................................
Tabela 05
62
Valor de P e Intervalo de Confiança (95%) obtidos através do teste t de
Student para a quantidade de células justaepiteliais imunomarcadas para o
FoxP3. Natal/RN – 2010. ...............................................................................
Tabela 06
63
Quantidade, média ± desvio padrão e intervalo de confiança (95%)
relativos à contagem de células intraepiteliais imunomarcadas para o
FoxP3. Natal/RN – 2010. ...............................................................................
Tabela 07
64
Valor de P e Intervalo de Confiança (95%) obtidos através do teste t de
Student para a quantidade de células intraepiteliais imunomarcadas para o
FoxP3. Natal/RN – 2010. ...............................................................................
65
Lista de Siglas e Abreviaturas
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
Treg
Célula T regulatória
LPO
Líquen plano oral
HFI
Hiperplasia fibrosa inflamatória
LP
Líquen plano
MMP
Matrix metalloproteinase – metaloproteinase da matriz
CD
Cluster of differentiation - unidade de diferenciação
MHC
Major histocompatibility complex - complexo principal de histocompatibilidade
IL
Interleukin - interleucina
APC
Antigen-presenting cell - célula apresentadora de antígeno
Th
T helper cells - células t auxiliares
INF
Interferon
NF-κB
Nuclear factor-kappa b – fator nuclear kappa b
TGFβ
Transforming growth factor-β - fator transformador de crescimento-β
ICAM
Intercellular adhesion molecule - molécula de adesão intercelular
VCAM
Vascular cell adhesion molecule – molécula de adesão celular vascular
MEC
Matriz extracelular
CXCR
Chemokine receptor cxc – receptor à quimiocina cxc
CCR
Chemokine (c-c motif) receptor – receptor (c-c motif) à quimiocina
TNFα
Tumor necrosis factor alpha – fator de necrose tumoral alfa
TNF-R
Tumor necrosis factor Receptor – receptor ao fator de necrose tumoral
VEGF
Vascular endothelial growth factor – fator de crescimento endotelial vascular
nTreg
Célula T regulatória natural
iTreg
Célula T regulatória induzida
Ts
Célula T supressora
TCR
T cell receptor - receptor de célula T
IPEX
Immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome –
síndrome da desregulação imune, poliendocrinopatia, enteropatia, ligada ao X
NK
Natural killer cells – células eliminadoras naturais
CTLA
Cytotoxic T lymphocyte antigen – antígeno associado ao linfócito T citotóxico
mRNA
Messenger ribonucleic acid – ácido ribonucléico mensageiro
GITR
Glucocorticoid-induced TNF receptor – receptor TNF induzido por
glicocorticóide
HE
Hematoxilina e eosina
Tr
Células T reguladoras
AMP
Adenosine monophosphate – monofosfato de adenosina
DC
Dendritic cell – células dendríticas
TLR
Toll-like receptor – receptor Toll-like
Sumário
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 25
2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................ 28
2.1 Líquen plano oral...................................................................................................... 28
2.2 Células T regulatórias............................................................................................... 36
3 PROPOSIÇÃO .......................................................................................................... 48
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 50
4.1 Considerações Éticas ................................................................................................ 50
4.2 Caracterização do estudo .......................................................................................... 50
4.3 População ................................................................................................................. 50
4.4 Amostra .................................................................................................................... 50
4.5 Critérios de seleção da amostra ................................................................................ 51
4.5.1 Critérios de inclusão .............................................................................................. 51
4.5.2 Critérios de exclusão ............................................................................................. 51
4.6 Estudo morfológico .................................................................................................. 51
4.7 Estudo imunoistoquímico ......................................................................................... 52
4.7.1 Método imunoistoquímico..................................................................................... 52
4.7.2 Análise do perfil imunoistoquímico ...................................................................... 55
4.8 Análise Estatística .................................................................................................... 56
5 RESULTADOS .......................................................................................................... 58
5.1 Caracterização da amostra ........................................................................................ 58
5.2 Análise morfológica ................................................................................................. 58
5.3 Análise do perfil imunoistoquímico ......................................................................... 61
6 DISCUSSÃO .............................................................................................................. 72
7 CONCLUSÕES.......................................................................................................... 87
REFERÊNCIAS
APÊNDICES
ANEXO
Introdução
25
1
INTRODUÇÃO
O líquen plano (LP) é uma doença inflamatória crônica imunologicamente mediada
que pode afetar a pele e a mucosa. É uma das condições dermatológicas que mais
freqüentemente envolvem a cavidade oral. Sua prevalência na população é estimada entre 1 a
2%, existindo um grande número de casos relatados em mulheres (BORNSTEIN, HAKIMI e
PERSSON, 2008; MCCARTAN e HEALY, 2008; SOUSA e ROSA, 2008).
De acordo com Sousa e Rosa (2008), o líquen plano oral (LPO) possui características
clínicas específicas, se apresentando mais comumente em duas formas principais: a reticular e
a erosiva. A forma reticular geralmente é assintomática, sendo descoberta na maioria das
vezes durante exame clínico intra-oral de rotina. Diferentemente, as lesões erosivas são
dolorosas, causando incômodo no paciente (BORNSTEIN, HAKIMI e PERSSON, 2008;
MCCARTAN e HEALY, 2008).
Não existem tratamentos específicos para o LPO, todavia o paciente deve ser
orientado para diminuir possíveis traumas mecânicos ou químicos, o que pode levar à
remissão dos sintomas (EISEN et al, 2005). As medicações para estas lesões são utilizadas de
forma paliativa e agem apenas temporariamente na resolução das lesões. As drogas usadas
podem ser de ação local ou sistêmica e possuem como principais componentes ativos os
corticosteróides (AGHA-HOSSEINI et al, 2009).
O LPO apresenta etiologia desconhecida, todavia, Sugerman et al (2002) afirmaram
que mecanismos imunológicos específicos e não-específicos podem estar envolvidos na sua
patogênese. Bornstein, Hakimi e Persson (2008) citam como mecanismos específicos a
apresentação de antígenos pelos ceratinócitos e a morte celular causada pelos linfócitos T
citotóxicos, enquanto que os não-específicos incluem a degranulação dos mastócitos e
ativação das MMPs (metaloproteinases da matriz).
No LPO, as células T CD4+ podem ser ativadas por um antígeno ainda desconhecido
associado ao MHC de classe II nas células de Langerhans ou ainda nos ceratinócitos. Altos
níveis de expressão antigênica, coexpressão de CD40 e CD80, e secreção de IL-12 pelas
APCs podem promover uma resposta Th1 CD4+ com secreção de IL-2 e INF-γ. A produção
local de INF-γ pode manter a expressão do MHC de classe II pelos ceratinócitos, contribuindo
para a cronicidade da lesão. Lodi et al (2005) relatam ainda que a maior parte das células
citotóxicas das lesões de LPO são os linfócitos T CD8+, que por motivos ainda
26
desconhecidos, são ativadas de forma descontrolada, como reposta a um antígeno de natureza
incerta associado ao MHC de classe I nos ceratinócitos da camada basal do epitélio,
conduzindo estes ceratinócitos à apoptose.
Um subconjunto de células T, conhecidas como células T regulatórias (Treg), possui a
função de controlar respostas imunes e manter a autotolerância (YAN e LIU, 2009;
FEUERER et al, 2009). Estas células são geradas principalmente no timo, mas também
podem se desenvolver nos tecidos periféricos (ABBAS, LICHTMAN e PILLAI, 2008).
Possuem ainda a função de prevenir respostas imunes descontroladas contra patógenos ou
alérgenos, ajudar a manter o equilíbrio da microflora normal e prevenir que tumores escapem
da vigilância imunológica (FEUERER et al, 2009). Boros e Bromberg (2009) afirmam que as
células Treg demonstram ser importantes no desenvolvimento do câncer, na autoimunidade,
alergia e asma.
Existem vários estudos sobre o papel das Treg em diferentes doenças, como: dermatite
atópica (ITO et al, 2009); doença do enxerto versus hospedeiro (WANG et al, 2009; RAO et
al, 2009; XIE et al, 2009); linfoma de células T (KARUBE et al, 2004; MARZANO et al,
2009; RAO et al, 2009; WADA et al, 2009); miastenia grave (MU et al, 2009); linfoma de
células B (GRILLE et al, 2009); aterosclerose (VAN ES et al, 2009); esclerose múltipla
(VANDENBARK et al, 2009); lúpus eritematoso sistêmico (FERREIRA et al, 2009; YANG
et al, 2009); artrite reumatóide (RAGHAVAN et al, 2008; CHEN et al, 2008), líquen plano
cutâneo (DE BOER et al, 2007a); líquen plano oral (TAO et al, 2009).
O FoxP3 é o marcador mais específico para células Treg disponível atualmente
(KARUBE et al, 2004; YAGI et al, 2004; BONELLI et al, 2007; LIN et al, 2007;
SCHEREIBER, 2007; SOLOMON e MAGRO, 2008; WADA, 2009). Yan e Liu (2009) e
Feuerer et al (2009) afirmam que as células Treg exercem um papel essencial na manutenção
da autotolerância e na prevenção de doenças autoimunes bem como no controle de respostas
imunes exacerbadas. Mesmo assim, estudos que verifiquem a presença e função deste subtipo
celular em líquen plano oral são raros na literatura. Diante disto, o objetivo desta pesquisa
consistiu em avaliar a presença destas células Treg no LPO e se estas exerceram algum papel
no desenvolvimento de suas principais formas clínicas, a reticular e a erosiva.
Revisão da Literatura
28
2
REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Líquen Plano Oral
O Líquen Plano (LP) é uma doença mucocutânea crônica, relativamente comum e
que pode envolver a mucosa oral, pele, mucosa genital, couro cabeludo e unhas. Embora
sua etiologia permaneça desconhecida, uma patogênese mediada imunologicamente tem
sido reconhecida nessa entidade. O LP tem sido relatado com maior freqüência em
pacientes de meia idade e do sexo feminino, sendo raros os casos encontrados em crianças
(ISMAIL, KUMAR e ZAIN, 2007). Balasubramaniam, Ogboli e Moss (2008) relatam que
a maioria dos casos de LP em crianças ocorre na Índia, com média de idade de 10 anos e
em indivíduos do gênero masculino.
Estudo recente relatou a prevalência do líquen plano oral (LPO) em uma população
indiana, o qual revelou 1,26% da população estudada acometida, principalmente na faixa
etária entre 41 e 60 anos (MATHEW et al, 2008). Pentenero et al. (2008), encontraram em
seu estudo uma freqüência de 1,46% de ocorrência do LPO entre as lesões orais, sem
diferença entre gênero. Todavia, vários estudos relatam uma predominância desta
condição em mulheres (LOZADA-NUR e MIRANDA, 1997; KOVAC- KOVACIC e
SKALERIC, 2000; EISEN, 2002). A prevalência do LPO relatada na literatura varia de
0,5 a 2,2% da população, com idade entre 30 e 60 anos (VAN DER WALL, 2009).
De acordo com Bidarra et al (2008), o LP confinado em mucosa oral com mínimo
envolvimento em pele, é encontrado em aproximadamente 15% dos casos relatados.
Outros sítios de acometimento citados na literatura são o esôfago, a mucosa gástrica, a
conjuntiva, a bexiga e a mucosa vulvolvaginal, muito embora casos nessas regiões sejam
incomuns.
O LP em pele apresenta-se clinicamente em forma de pápulas, de superfície plana,
com coloração violácea, forma poligonal, pruriginosa e um aspecto rendilhado na
superfície (BATRA et al, 2008). Os principais locais de acometimento são as superfícies
flexoras dos punhos, pernas, terço distal das extremidades inferiores, abdome, região do
sacro, genitálias e unhas (JACQUES et al, 2003). O envolvimento das unhas pode resultar
em cicatrizes, formação de pterígio, ou perda permanente da estrutura, enquanto o
29
envolvimento do couro cabeludo resulta em alopécia por cicatriz (SUGERMAN et al.,
2002).
As lesões de LPO surgem como lesões esbranquiçadas, de forma reticulada ou
estriada (estrias de Wickham), pápulas ou placas, eritemas, erosões ou bolhas. Essas
lesões são geralmente bilaterais e as de forma atrófica, erosiva ou bolhosa usualmente
ocorrem com sensação de queimação ou dor (ISMAIL, KUMAR e ZAIN, 2007; RAD et
al, 2009). O sítio mais comum de envolvimento é a mucosa jugal, seguida pela língua,
gengiva, mucosa labial, e vermelhão do lábio. As lesões no palato, assoalho da boca e no
lábio superior são incomuns. (EISEN, 2002). De acordo com Kovac-Kovacic e Skaleric
(2000) o tipo reticular é a forma de apresentação mais comum, que em seu estudo teve
92,3% de prevalência entre os diversos tipos de LPO.
De modo geral, o LPO pode se apresentar clinicamente de duas formas distintas: a
reticular e a erosiva. A forma reticular ocorre com maior freqüência, sendo caracterizada
por estriações brancas conhecidas como estrias de Wickham, geralmente cercadas por
bordas discretamente eritematosas. Essa forma usualmente é assintomática. A forma
erosiva tem por característica ser sintomática (dor e/ou ardor), se apresentando como áreas
eritematosas frequentemente rodeadas por finas estrias (SOUSA e ROSA, 2008).
Em algumas lesões, as características clínicas por si só podem ser suficientes para
o diagnóstico do LPO, particularmente quando o padrão reticular está presente. A
evidência relativa à necessidade da biópsia para confirmação histológica do diagnóstico já
foi bastante questionada (VAN DER MEIJ e VAN DER WAAL, 2003). Todavia, por ser
uma condição crônica, essa patologia exige tratamento e monitoramento por tempo
prolongado, o que torna a biópsia uma prática clínica prudente, particularmente quando a
doença não mostra suas características clínicas típicas, ou quando há dúvida com relação à
existência de displasia ou malignidade (EISENBERG, 2000).
De acordo com Epstein et al (2007) as lesões de LPO que apresentam
endurecimento, componente vermelho, superfície não homogênea e ulceração são as mais
indicadas para a realização de biópsia. Os pacientes com lesões vermelhas precisam ser
examinados preferencialmente duas vezes por ano.
Numerosos estudos vêm tentando esclarecer a patogênese do LPO. Neste sentido,
especula-se que haja um ou mais antígenos expressos pelos ceratinócitos da camada basal
do epitélio responsáveis pelo início da lesão do LPO. Também é possível que este evento
30
inicial no LPO possa variar de paciente para paciente, através de mecanismos específicos
e não específicos. Todavia, após o evento inicial da lesão, tanto os mecanismos
específicos quanto os não específicos permanecem induzindo a formação e conseqüente
expansão da lesão. A susceptibilidade de um paciente em desenvolver LPO pode resultar
de uma combinação de fatores, incluindo a expressão desregulada de antígeno pelos
ceratinócitos do epitélio de mucosa oral, persistência das células de Langerhans orais
maduras, circulação de células T auto reativas e atividade imunossupressora defeituosa
combinada com o reconhecimento de algum antígeno próprio (SUGERMAN et al., 2002).
Lodi et al (2005) afirmam que no LP, as células T CD8+ lesionais podem ser
ativadas por um antígeno associado ao MHC de classe I nos ceratinócitos basais. Estes
então são levados à apoptose, sendo a natureza deste antígeno ainda desconhecida. As
células de Langerhans, ou ainda os ceratinócitos também apresentam um antígeno
associado ao MHC de classe II para as células T CD4 auxiliares, que secretam IL-2 e INFγ. A combinação destes dois mecanismos pode ser responsável pela ativação dos linfócitos
T CD8+ citotóxicos. A produção local de INF-γ pode manter a expressão do MHC classe
II pelos ceratinócitos, contribuindo assim para o cronicidade do LPO. Além disto, o
rompimento da membrana basal pode ainda ser mediado pelas proteases dos mastócitos
diretamente ou indiretamente através da ativação da MMP-9, secretada pelas células T.
De acordo com Scully e Carrozzo (2008) a forma crônica do LPO pode resultar da
ativação do NF-κB e a inibição da via do TGF-beta/smad pode causar a hiperproliferação
dos ceratinócitos, levado às lesões brancas. Os autores relatam que as células T são
recrutadas e migram através do epitélio oral, também atraídas por moléculas de adesão
celular (ICAM-1 e VICAM), pelo aumento na regulação das proteínas da MEC (matriz
extracelular) da membrana basal do epitélio, incluindo colágeno IV e VII, laminina e
integrinas e possivelmente pelas vias de sinalização CXCR3 e CCR5.
Khan et al (2003) mostraram que as células inflamatórias mononucleares no LPO
expressaram INF- γ superficialmente na lâmina própria e TNF-α adjacente aos
ceratinócitos da camada basal, como uma faixa contínua. Houve uma expressão variada de
TGF-β1 no infiltrado subepitelial enquanto que nenhuma célula mononuclear intraepitelial
expressou essa proteína. Esses dados corroboram a hipótese de que as células T CD8+
citotóxicas no LPO secretam TNF-α, que por sua vez conduz os ceratinócitos à apoptose
pela via TNF-R1, muito embora a participação da granzima não possa ser excluída.
31
Muitos estudos têm sugerido um papel central do INF-γ e TNF-α na patogênese do
LPO. Um estudo sugeriu que a produção aumentada de INF-γ relacionada a polimorfismo
genético pode ser um fator importante para o desenvolvimento de LPO. Constatou-se
nesta pesquisa que a alta produção do INF-γ determinada geneticamente pode ser
responsável pelas lesões orais crônicas, enquanto que a presença de alta produção de
TNF-α, determinada da mesma forma, pode estar envolvida no início das lesões cutâneas
(CARROZZO et al, 2004).
Kalogerakou et al (2008) citam que as citocinas representam um foco no estudo da
patogênese da autoimunidade. Em geral, as citocinas são classificadas em dois grupos: as
do tipo 1 (IL-2, IL-12, INF-γ, TNF-α) que se encontram relacionadas com a imunidade
mediada por células, e as do tipo 2 (IL-4, -5, -6, 10, -13) que promovem a imunidade
humoral. Estes autores observaram uma redução no número de células produtoras de IL12 e INF-γ no sangue periférico de pacientes com LPO, indicando uma falha na resposta
imune mediada por células nesses pacientes.
O INF-γ é encontrado em altas concentrações nas células mononucleares do
infiltrado inflamatório em lesões de LPO. Essas células secretam INF-γ, induzindo a
expressão do MHC de classes I e II nos ceratinócitos e consequentemente viabilizando a
interação direta entre as células T citotóxicas e as T auxiliares com os ceratinócitos
(YOUNGNAK-PIBOONRATANAKIT et al, 2009).
As moléculas CD40/CD40L são proteínas transmembrana, expressas por células
com alto potencial de proliferação, incluído os ceratinócitos. Estas proteínas estão
relacionadas com a indução ou inibição da apoptose em diferentes cânceres. Um estudo
observou a perda de expressão de CD40/CD40L na região basal de áreas de LPO,
sugerindo que os ceratinócitos basais podem escapar da indução de apoptose através desta
via no LPO, comprovando que outros mecanismos de apoptose encontram-se mais
envolvidos nessa patologia (NEPPELBERG et al, 2007).
Neppelberg e Johannessen (2007) reportam que a E-caderina, uma proteína
envolvida na adesão intercelular do epitélio escamoso estratificado encontra-se expressa
na mucosa oral normal e sua manutenção tem sido relacionada com a prevenção da morte
celular por apoptose em linhagens de células imortais. Observou-se perda focal de
expressão da E-caderina no epitélio de mucosa oral no LPO, o que pode contribuir com a
32
redução da integridade estrutural da camada basal, permitindo o aumento da migração de
células T para o epitélio no LPO.
Mazzarella et al (2006) citam que as MMPs estão envolvidas no processo de
degradação da membrana basal do epitélio no LPO que permite a migração dos linfócitos
para dentro do epitélio. Foi então realizado um estudo para avaliar a expressão das MMPs
em lesões de LPO. Constatou-se que os níveis da expressão dessas proteínas se encontram
aumentados nas lesões erosivas quando relacionadas com as reticulares, podendo as
MMP-1 e MMP-3 estarem associadas com o desenvolvimento da forma erosiva. Dessa
forma, as diferentes formas clínicas do LPO estão associadas com diferenças entre os
níveis das MMPs.
Um estudo recente identificou a presença de angiogênese significativa nos
pacientes com LPO através da expressão de VEGF, CD34, CD106 e CD54. Esses dados
indicam que a angiogênese no líquen além de restabelecer a oxigenação tecidual, possui
uma função importante na modificação dos elementos inflamatórios da área afetada, bem
como na perpetuação da doença através da liberação de proteases que influenciam a
infiltração celular e remodelação dos tecidos (SCARDINA et al, 2009).
De acordo com Lehman et al (2009), o padrão histopatológico do LP nas
superficies mucocutâneas é constituído pela presença de um infiltrado linfo-histiocítico
em forma de banda na junção derme-epiderme, associado à degeneração hidrópica na
camada basal. Pode-se observar disceratose representada pela presença de ceratinócitos
necrosados (corpos de Civatte ou corpos citóides) os quais são expulsos para a derme
papilar. Fendas subepiteliais (fendas de Max-Joseph) podem ser formadas como
conseqüência da inflamação na interface epitélio-conjuntivo. Além da acantose irregular e
hiperortoceratose, quando encontram-se áreas de hiperparaceratose pode-se suspeitar de
erupção liquenóide por drogas. De acordo com estes autores acredita-se que as estrias de
Wickham originam-se como resultado da hipergranulose.
Beachkofsky et al (2009) descrevem os achados histopatológicos do LP
hipertrófico com hiperortoceratose focal, projeções epiteliais em forma de dente de serra,
alterações vacuolares na camada basal do epitélio e um infiltrado linfocítico em faixa.
Para o LPO as características histopatológicas são: liquefação da camada basal,
seguida por um infiltrado inflamatório linfocítico disposto em faixa imediatamente abaixo
do epitélio, numerosos corpos eosinofílicos na interface epitélio-conjuntivo (corpos de
33
Civatte), projeções epiteliais ausentes, hiperplásicas ou em forma de dente de serra;
espessura variável da camada espinhosa e variáveis graus de orto ou paraceratose
(SOUSA e ROSA, 2008).
Várias lesões que acometem a mucosa oral podem apresentar um infiltrado
inflamatório em posição justaepitelial semelhante ao que acontece no LPO, como por
exemplo, as hiperplasias fibrosas inflamatórias (HFIs), com a diferença de que no LPO o
infiltrado é predominantemente linfocítico. As hiperplasias fibrosas inflamatórias, por sua
vez são caracterizadas por uma hiperplasia do tecido conjuntivo fibroso, que geralmente
encontram-se associadas ao uso de próteses mal adaptadas, observando-se graus variáveis
de infiltrado inflamatório mononuclear, entretanto mais variável e que muitas vezes
também pode se encontrar disposto em faixa subepitelial (NEVILLE et al, 2009).
Zarei, Chamania e Amanpoorb (2007) afirmam que as HFIs são lesões semelhantes
a tumor, porém não neoplásicas. Estas são originadas após a ocorrência de injúrias, que
desencadeiam um processo crônico caracterizado pela formação de tecido de reparo em
excesso no local afetado. As HFIs podem se apresentar na forma séssil ou pediculada, com
superfície íntegra ou ulcerada. Sua cor varia entre rosa pálido, vermelho ou púrpura e sua
consistência pode ser amolecida, flexível ou firme, dependendo da quantidade de fibras
colágenas no local. Algumas lesões com maior vascularização podem apresentar
sangramento. Estes autores realizaram um estudo para verificar as características clínicas
de hiperplasias reacionais orais em um grupo de iranianos, no qual observaram a
ocorrência de HFIs em indivíduos de 33 até 79 anos de idade, com média de 52 anos,
relação homem-mulher igual a 1:1,37 e uma maior freqüência destas lesões na região
anterior da mandíbula.
Freitas et al (2008) avaliaram a prevalência de lesões na mucosa oral associadas
com o uso de próteses totais. Eles citam que as lesões mucosas relacionadas às próteses
totais se dividem em reações agudas e crônicas, podendo ser causadas pela adesão da
placa bacteriana à base da dentadura, ou como conseqüência de uma injúria, má-adaptação
e desenho inadequado da prótese. As reações agudas incluem úlceras traumáticas, reações
alérgicas e infecção aguda, enquanto que as crônicas incluem estomatite por prótese,
queilite angular e hiperplasia fibrosa inflamatória. Os autores encontraram que a HFI foi
estatisticamente associada ao uso de prótese, estando ainda relacionada negativamente
com a integridade física da mesma. Ademais, o risco de desenvolver esta lesão aumenta
com a idade e é influenciado pela qualidade e higiene da prótese.
34
Além da HFI, várias outras lesões também podem ser similares ao LPO tanto
clinicamente quanto histopatologicamente, sendo conhecidas como reações liquenóides.
Essas reações abrangem várias condições: reações liquenóides por contato (que ocorrem
por contato da mucosa com materiais restauradores); aquelas que ocorrem por influência
de fármacos, como agentes hipoglicêmicos orais, inibidores da enzima angiotensinaconvertase e antiinflamatórios não-esteróides; reações liquenóides da doença do enxerto
versus hospedeiro (AL-HASHIMI et al, 2007). Além disto, no diagnóstico diferencial do
LPO, Ismail, Kumar e Zain (2007) ainda citam as leucoplasias, o lúpus eritematoso e a
doença do enxerto versus hospedeiro.
A eliminação de fatores que exacerbam o LPO sintomático é um passo inicial no
seu tratamento. Em sua grande maioria, os fatores consistem em restaurações ásperas,
próteses mal-adaptadas, comidas ácidas, picantes ou muito temperadas e bebidas
alcoólicas. O esclarecimento do paciente e as ações no sentido de diminuir estes possíveis
traumas mecânicos ou químicos podem levar à melhora no quadro sintomatológico
(EISEN et al, 2005). Intervenções psico-sociais também são importantes, mormente o
estresse emocional agudo e/ou ansiedade que têm sido relacionados com a patogênese do
LPO (CHAUDHARY, 2004).
Como ainda não existe tratamento definitivo para as lesões de LPO, as medicações
têm sido usadas de forma paliativa, com a finalidade de aliviar os sintomas dolorosos e o
tamanho das lesões, promovendo assim a saúde bucal do paciente. As drogas usadas
podem ser de ação local ou sistêmica, e possuem como principais componentes ativos os
corticosteróides como a Triancinolona, acetonida de fluocinolona e fluocinonida. Elixir de
dexametasona e clobetasol são frequentemente utilizados em pacientes com envolvimento
oral (ISMAIL, KUMAR e ZAIN, 2007).
As lesões de LPO são tratadas de acordo com as suas características clínicas,
recomendando-se um acompanhamento rigoroso do paciente, que pode necessitar de
várias visitas ao profissional. Novas biópsias podem ser requeridas para o diagnóstico da
lesão, tratamento ou controle dos sinais e sintomas. (EPSTEIN et al, 2007).
Vários efeitos adversos têm sido relacionados aos tratamentos à base de esteróides,
ainda que sejam a curto prazo, como insônia, alterações do humor, fadiga, retenção de
líquidos, entre outros. Dessa forma, os corticosteróides sistêmicos devem ser usados
apenas nas exacerbações agudas, em lesões múltiplas ou extensas, ou ainda em pacientes
35
que não respondem ao tratamento com medicações de uso tópico (THONGPRASOM e
DHANUTHAI, 2008).
Um estudo verificou o efeito da acetonida de fluocinolona de uso tópico em
pacientes, por dois anos de tratamento, encontrando uma total remissão das lesões em
77,3% dos casos estudados, enquanto que aqueles que utilizaram a acetonida de
fluocinolona a 0,1% em solução, mostraram 21,4% de remissão das lesões
(THONGPRASOM et al, 2003).
Youngnak-Piboonratanakit et al (2009) avaliaram a eficácia da acetonida de
fluocinolona em orabase a 0,1% para o tratamento das lesões de LPO. Esses autores
encontraram que após um mês de tratamento, as células inflamatórias mononucleares,
incluindo as INF- γ positivas, sofreram uma diminuição em número nas lesões, mostrando
que o INF- γ pode estar associado com a imunopatogênese do LPO.
A discussão relativa ao potencial de transformação maligna de um LPO tem
crescido desde o primeiro relato de caso de um carcinoma de células escamosas
desenvolvido a partir desta lesão. Estudos recentes têm mostrado diferentes proporções de
possibilidade de potencial maligno do LPO, em geral variando entre 0,04 e 1,74%.
Considerando estes dados, muitos autores têm aceitado a idéia de que esta lesão possui
potencial para transformação maligna. Todavia, outros propuseram o uso do termo “lesão
liquenóide oral”, para lesões com características histopatológicas de líquen plano que
exibem também displasia epitelial, diferenciando-as do LPO verdadeiro. Provavelmente,
estas lesões possuem um considerável potencial de transformação maligna, o que as difere
dos reais casos de LPO (ACAY et al, 2006).
Ainda não existem evidências que apontem a quimio-prevenção ou a remoção
cirúrgica das lesões displásicas como medidas preventivas contra a transformação maligna
da lesão no decorrer do tempo (EPSTEIN et al, 2007).
MacCartan e Healy (2008) citam que o líquen plano é considerado como uma lesão
com significativo potencial para transformação maligna. Scully e Carrozzo (2008) citam
ainda que este risco de transformação varia entre 0,4 e 5%, em pacientes com um período
de observação de 0,5 a 20 anos. Todavia, ainda existem muitas controvérsias concernentes
a este potencial, principalmente com relação à forma clínica que possui maior risco de
sofrer malignização e quanto às terapias usadas para o tratamento do LPO.
36
Tizeira, Agua e Sano (2003) observaram em sua pesquisa que as formas clínicas de
LPO que sofrem transformação maligna com mais freqüência são as formas de placa e
erosiva. Estes autores acompanharam durante sete anos 719 pacientes com líquen plano
oral e encontraram uma freqüência de transformação maligna correspondente a 6,51%.
Bermejo-Fenoll et al (2009), em estudo com uma população de 550 pacientes
diagnosticados com LPO, encontrou uma ocorrência de carcinoma epidermóide em 0,9%
dos pacientes, em um período de acompanhamento de 24 ± 20,83 meses, sendo a língua o
local de acometimento mais comum.
2.2 Células T regulatórias
As células T regulatórias (Treg) são um subconjunto de células T que possuem a
função de suprimir respostas imunes e, consequentemente, manter a autotolerância (YAN
e LIU, 2009; FEUERER et al, 2009).
Independente da linhagem, todos os linfócitos regulatórios identificados até o
momento inibem a autoimunidade e induzem a autotolerância por dois mecanismos gerais.
As células regulatórias podem exercer sua função supressiva em células T, B e dendríticas
através de contato direto ou por secreção de citocinas, geralmente referida como inibição
extrínseca à célula. A tolerância é também induzida por mecanismos intrínsecos à célula
como deleção clonal de células auto-reativas, edição de receptores de células B ou T que
reconhecem o “próprio”, e a iniciação de sinais de anergia ou apoptose na periferia após
contato com antígenos próprios. Apesar das células Treg serem consideradas como os
agentes supressores de maior importância, outros tipos celulares também exercem papéis
cruciais na manutenção da homeostase imunológica, incluindo células CD8+, B e CD4+
(SKAGGS et al, 2008).
Existem dois tipos de células Treg CD4+: as naturais (nTreg), produzidas no timo,
e as induzidas (iTreg), produzidas na periferia por células T CD4+ sob indução antigênica.
Ambas possuem o papel de manter a tolerância periférica através da supressão de
respostas autoimunes potenciais e controlar as respostas às infecções (WORKMAN et al,
2009). Apesar das células nTreg constituírem apenas de 5 a 10% de todas as células T
CD4+ periféricas, sua presença é vital para o indivíduo (SAKAGUCHI, 2005).
37
Pesquisas
recentes
têm
estabelecido
que
a
família
de
linfócitos
T
regulatórios/supressores consiste não apenas na população de células T CD4+, mas
também inclui populações de células CD8+. Vários tipos de células Ts (T supressoras)
CD8+ com fenótipos diversos parecem existir em seres humanos e em animais. Os
modelos de supressão, podem incluir citotoxicidade à células marcadas, supressão
mediada por contato célula-célula e secreção de citocinas antiinflamatótias (SUZUKI et
al, 2008).
As células Treg são geradas principalmente através do reconhecimento de
antígenos próprios no timo, mas também podem se desenvolver nos órgãos linfóides
periféricos. Sua produção e sobrevida dependem de citocinas como o fator de crescimento
transformador- β (TGF- β) e IL-2, além da co-estimulação pela via B7-CD28, muito
embora não esteja claro o que estes sinais fazem no desenvolvimento das células Treg. Da
mesma forma, se desconhecem os fatores que determinam se a célula será efetora, de
memória, ou ainda, regulatória (ABBAS, LICHTMAN e PILLAI, 2008).
Ainda de acordo com Abbas, Lichtman e Pillai (2008) apesar de estas células
reconhecerem antígenos próprios e serem geradas pelo reconhecimento destes, sua
especificidade e diversidade de receptores em indivíduos normais ainda não está definida.
Uma das formas das células Treg controlarem respostas imunes é pela secreção de
citocinas imunossupressoras. Muitos estudos mostram que a função das células Treg
depende do TGF- β, que por sua vez tem a função de inibir as respostas imunes de
linfócitos e macrófagos. Desse modo, as células T que produzem essas citocinas, podem
bloquear a ativação e as funções efetoras de outras células T.
As células Treg originadas no timo são conhecidas também como células Treg
naturais, podendo ser reconhecidas pela expressão de CD4+CD25+FoxP3+ (VILA, ISAACS e
ANDERSON, 2009). Estas células executam um papel crucial na prevenção da doença
autoimune e na manutenção da tolerância periférica (SAKAGUSHI et al, 2008).
As moléculas CD4+ são proteínas das células T que se ligam às moléculas do MHC
classe II e traduzem os sinais pelo complexo TCR durante a ativação das células T, sendo
conhecidas como co-receptores. Dessa forma, a principal função do CD4+ é transduzir
sinais no momento de reconhecimento do antígeno além de reforçarem a ligação entre as
células T e as APCs. Estas moléculas são glicoproteínas transmembrana, membros da
superfamília das imunoglobulinas, sendo expressas como um monômero na superfície das
38
células T periféricas e dos timócitos, também sendo encontradas em fagócitos
mononucleares e em algumas células dendríticas. Esta molécula tem ainda quatro
domínios extracelulares, uma região transmembrana hidrofóbica e uma cauda
citoplasmática altamente básica. A proteína CD4+ liga-se ao domínio β2 da molécula de
MHC classe II através de dois domínios N-terminais. O maior número das células T CD4+
restritas à classe II do MHC são células que produzem citocinas, atuam como auxiliares e
funcionam na defesa contra os microrganismos extracelulares ingeridos pelos macrófagos
ou que esperam ser reconhecidos por anticorpos para serem removidos (ABBAS,
LICHTMAN e PILLAI, 2008).
Um gene regulador da autoimunidade, conhecido como Aire, promove a expressão
de antígenos próprios tecido-específicos através das células epiteliais medulares do timo
(ANDERSON et al, 2002). A expressão desse gene é essencial para o estabelecimento da
tolerância central através de alguns peptídeos próprios, levando à deleção os timócitos que
são fortemente auto-reativos (KYEWSKI e KLEIN, 2006).
Os sinais que influenciam o desenvolvimento das células nTreg em humanos ainda
não estão totalmente esclarecidos, muito embora se conheça a influência exercida pelas
moléculas co-estimuladoras e citocinas, afinidade antigênica e TCR. Em adição à força e
afinidade peptídica do sinal do TCR, o contexto no interior do timo onde o antígeno é
encontrado pode influenciar se o timócito vai ser selecionado, deletado ou se tranformar
em células Treg (WORKMAN et al, 2009).
As células nTreg reconhecem antígenos estranhos com a mesma freqüência que as
células T convencionais, o que sugere uma participação dos peptídeos do timo na sua
seleção, podendo ser estes diferentes daqueles que guiam a proliferação e função das
células nTreg periféricas (PACHOLCZYK et al, 2007). Um estudo mostrou que o
contexto ou nicho no qual as células T entram em contato com o antígeno é mais
importante na determinação da deleção ou seleção das células do que a afinidade ao
antígeno próprio (VAN SANTEN, BENOIST E MATHIS, 2004).
Embora as células nTreg expressem CD25, um receptor de alta afinidade à IL-2,
estas células são incapazes de produzir IL-2 (SU et al, 2004). Não existem marcadores de
superfície celular que marquem apenas células Treg, muito embora existam algumas
proteínas que são preferencialmente expressas nestas células, como o CD25 e o FoxP3. O
39
CD25 não é exclusivo das células Treg, as células T como um todo expressam CD25
quando ativadas pelo ligante do TCR (VIGNALI, COLLISON e WORKMAN, 2008).
O CD28 (molécula co-estimuladora do linfócito T) parece suportar a sobrevivência
das células nTreg promovendo a produção da IL-2 pelas células T convencionais além de
manter a expressão do CD25 nas células nTreg (TANG et al, 2003; FONTENOT et al,
2005). Fontenot et al (2005) ainda relatam que a sinalização de IL-2 parece ser crítica, não
somente para a sobrevivência das células nTreg, mas também para sua produção e função
no timo e na periferia.
A deficiência genética do CD25 em humanos resulta em manifestações clínicas
similares às da IPEX (síndrome ligada a mutações no gene do FoxP3 que exibe
desregulação imune, poliendocrinopatia e enteropatia ligadas ao cromossomo X) o que
enfatiza a importância da IL-2 na função e manutenção das células nTreg (VELLA et al,
2005). Estudos em humanos e em ratos mostraram que a neutralização promovida pela
anti-IL-2 induz à autoimunidade e reduz de forma significante o número das células nTreg
no timo e na periferia (SAKAGUCHI, 2004; BAYER et al, 2005).
O FoxP3 é um fator de transcrição, pertencente à família forkhead, essencial para o
desenvolvimento e função da maioria das células Treg. A ocorrência de mutações em
FoxP3 em murinos e no homem resulta na ausência de linfócitos Treg CD25+ e doença
autoimune em múltiplos sistemas (ABBAS, LICHTMAN e PILLAI, 2008). Banham et al
(2006) afirmam que a expressão do FoxP3 é crítica para o desenvolvimento do fenótipo
regulatório, o que não ocorre com o CD25. O FoxP3 tem sido considerado o marcador
mais confiável para avaliação de células Treg (YAGI et al, 2004; KARUBE et al, 2004;
SCHEREIBER, 2007, LIN et al, 2007; SOLOMON e MAGRO, 2008; WADA, 2009).
Hori, Nomura e Sakaguchi (2003) afirmam em seu estudo que a expressão de
FoxP3 é predominantemente restrita à população de células CD25+CD4+ tanto no timo
quanto nos tecidos linfóides periféricos e que essa expressão é estável nas células Treg
CD25+CD4+ independente do modo ou estado de ativação destas. Esses autores ainda
verificaram que a expressão ectópica do FoxP3 foi suficiente para converter células T
näive não-regulatórias em um fenótipo de células Treg capazes de suprimir a proliferação
de outras células T, através da inibição da produção de IL-2.
Fontenot, Gavin e Rudensky (2003) demonstraram em seu estudo que o FoxP3 é
essencial para o desenvolvimento de células Treg CD25+CD4+ no timo, de forma que a
40
deficiência desta proteína resulta na ausência destas células. Eles ainda ressaltam que o
FoxP3 é suficiente para ativar um mecanismo supressor das células T CD4+ nãoregulatórias periféricas.
O FoxP3 possui um papel crucial na regulação da resposta imune pelas células T
periféricas, prevenindo a autoimunidade e possibilitando a manutenção das células Treg
(KHATTRI et al, 2003). Uma mutação no gene da FoxP3 é responsável pelo
desenvolvimento da síndrome IPEX. Os portadores desta condição apresentam
autoimunidade e imunodeficiência variável, com conseqüências fatais tanto em ratos
quanto em humanos, demonstrando assim, a importância dessa proteína em humanos
(GAMBINERI, TORGERSON e OCHS, 2003, VERCOULEN et al, 2009).
Fontenot et al (2005) mostraram em seu estudo que as células FoxP3+ são
encontradas somente na medula do timo, sugerindo que o desenvolvimento das células
nTreg ocorre relativamente tarde no desenvolvimento deste órgão. Segundo Pacholczyk et
al (2007) e Liston et al (2008) muito embora o FoxP3 não seja detectado no córtex do
timo, alguns estudos sugerem que a seleção da linhagem das células nTreg pode ocorrer
neste local, em um estágio inicial do desenvolvimento do órgão.
Outro estudo relatou que entre a população de células T CD4+ no timo, existem
células CD25high que representam as precursoras imediatas das células nTreg, as quais
encontram-se prontas para expressar FoxP3 após estimulação com IL-2 ou IL-15. Este
dado sugere que em adição ao TCR, estas interleucinas exibem um papel essencial no
desenvolvimento das células nTreg (LIO e HSIEH, 2008).
Outra molécula que desempenha papel importante no desenvolvimento das células
nTreg é o TGF-β, cuja sinalização constante é necessária para manter a expressão e função
supressora do FoxP3 nessas células, além de manutenção e homeostase da células nTreg
periférica (MARIE et al, 2005). A sinalização de TGF-β nas nTreg periféricas é essencial
para a supressão de vários tipos celulares, como células Th1, células T CD8+ citotóxicas e
células NK (MARIE, LIGGITT e RUDENSKY, 2006).
Estudo recente indica que o FoxP3 exerce um papel essencial na manutenção
periférica da estabilidade fenotípica da células nTreg, incluindo anergia e dependência à
IL-2. As citocinas inibitórias IL-10, TGF- β e IL-35, expressas pelas células nTreg, são
consideradas um dos principais mecanismos de supressão utilizados por estas. Todavia, o
conceito de um fator solúvel mediando a supressão pelas células Treg permanece
41
controverso, considerando a hipótese anteriormente existente de que o contato célulacélula era requerido para mediar a supressão. Todavia, existe uma lista crescente de
estudos in vivo que descrevem a importância do IL-10, TGF-β e IL-35 na supressão de
várias respostas imunes (WORKMAN et al, 2009).
A citólise promovida pelas células Treg é mediada pela granzima A em humanos
e granzima B em ratos. Enquanto a dependência da perforina permanece em questão,
modelos de células Treg parecem capazes de eliminar células marcadas através de um
mecanismo granzima-dependente (GONDEK et al, 2005; CAO et al, 2007).
Existem vários estudos que buscam definir os mecanismos de supressão exercidos
pelas células Treg, mostrando que estas células não exercem um mecanismo simples de
supressão, mas possuem um arsenal de mecanismos reguladores. Esses podem ser
classificados em alguns tipos básicos: citocinas inibitórias, citólise, rompimento
metabólico e modulação da função das APCs (WORKMAN et al, 2009)
Concernente às doenças autoimunes, Vila, Isaacs e Anderson (2009) afirmam que
estas surgem de uma falha na tolerância imunológica periférica, levando à respostas
imunes anormais contra antígenos próprios. As células Treg, incluindo as naturais que se
originam no timo e as induzidas, geradas de novo na periferia, são responsáveis pelo
controle destas células auto-reativas.
As células Th17 caracterizam-se pela produção de IL-17, aparentemente estando
associadas à patogênese da doença autoimune, regulações imunes e defesa do hospedeiro.
As células Th17 foram caracterizadas como uma nova linhagem das células T CD4+,
especulando-se que as células Th17 e as células Treg são reguladas reciprocamente
(CHEN et al, 2007).
Sugyiama et al (2005) afirmam que o equilíbrio entre as funções regulatórias e
efetoras são importantes na manutenção de respostas imunes eficientes e na prevenção da
autoimunidade. Estes autores observaram em seu estudo que uma subpopulação de células
Treg caracterizada como CD4+CD25highCTLA4+FoxP3high era deficiente em sua atividade
supressora no sangue periférico de pacientes com psoríase, uma doença dermatológica
autoimune relativamente comum. Essa deficiência foi demonstrada através da proliferação
acelerada de células T CD4+ reativas, da qual a maioria expressou CXCR3. As células
Treg foram também isoladas de fragmentos de pele afetada pela psoríase, revelando uma
deficiência na sua função supressora contra as células T efetoras. Dessa forma, os autores
42
afirmam que a falha na atividade supressora das células Treg tanto no sangue quanto nos
tecidos lesionados, pode conduzir a uma hiperproliferação de células T patogênicas na
psoríase.
Gao et al (2009) avaliaram em uma população chinesa a associação entre
polimorfismos no gene do FoxP3 e a susceptibilidade à psoríase. Os autores encontraram
relação de alguns polimorfismos com um risco aumentado de desenvolver essa doença
enquanto outros foram relacionados com a sua severidade, acentuando assim a relação
entre os polimorfismos no gene do FoxP3 e a psoríase.
Flores-Borja et al (2008) em pesquisa avaliando a função e expressão de células
Treg CTLA-4+ em pacientes com artrite reumatóide, verificaram que as células Treg
isoladas destes pacientes são incapazes de suprimir a produção de citocinas pelas células
T convencionais. Constataram-se anormalidades na expressão e função das células Treg,
ligadas ao CTLA-4, uma molécula relacionada com a sinalização das células Treg, o que
pode ocasionar falhas nessas células em pacientes com artrite reumatóide.
Recente trabalho comparou a proporção de células T CD4+CD25high e as T
CD4+FoxP3+ em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico ativo e inativo e comparou
com um grupo controle formado por indivíduos saudáveis. Para isso, foi coletado sangue
dos pacientes e a proporção foi encontrada através de citometria de fluxo. Os resultados
mostraram que o aumento da atividade da doença estava associado com a diminuição nas
proporções de células T CD4+CD25high e aumento das T CD4+FoxP3+, sugerindo que a
expressão do FoxP3 nas células T CD4+ dos pacientes doentes estava dissociada da
expressão do fenótipo CD4+CD25high. Observou-se ainda uma correlação significativa
entre a atividade clínica da doença e as proporções das células T CD4+FoxP3+. Desse
modo, a expressão do FoxP3 nas células T CD4+ dos pacientes com lúpus eritematoso
sistêmico reflete a ativação destas células frente à atividade da doença, não indicando
necessariamente uma capacidade funcional das células Treg (BONELLI et al, 2008).
Solomon e Magro (2008) avaliaram o papel das células Treg FoxP3+ em vários
infiltrados reacionais, discrasias pré-linfomatosas de células T e linfomas de células T em
pele. Os autores afirmam que as células FoxP3+ raramente excedem 30% da população
celular no infiltrado inflamatório de condições reacionais. Observou-se também um
número maior dessas células nos infiltrados linfocíticos reacionais, um valor intermediário
nas discrasias endógenas pré-linfomatosas de células T e uma menor quantidade nos
43
linfomas de células T. A expressão do FoxP3 mostrou-se reduzida quando não ausente nos
casos de dermatomiosite e de lúpus eritematoso, indicando defeitos qualitativos e
quantitativos na função das células T, o que contribui para o excesso e desregulação de
células T e B auto-reativas nestas doenças autoimunes. A baixa expressão do FoxP3 nas
lesões de pele da dermatomiosite e do lúpus eritematoso, bem como da doença do enxertoversus-hospedeiro poderiam facilitar a persistência e propagação das células T autoreativas.
Wang et al (2009) em seu estudo que verificou a expressão do mRNA do FoxP3 na
urina de pacientes com nefrite associada ao lúpus, observaram que a quantidade do mRNA
desta proteína foi maior em pacientes com lúpus ativo quando comparado àquele latente.
Ainda verificou-se que os pacientes com nefrite proliferativa exibiram um nível maior de
expressão de mRNA do FoxP3 na urina que aqueles com nefrite não proliferativa e que o
FoxP3 urinário foi relacionado de forma significativa com a atividade sistêmica e
histológica da doença. Estes autores acrescentam que o mRNA do FoxP3 encontrado seria
originário das células T infiltradas no rim.
Em estudo recente em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico, Yang et al
(2009) avaliaram a atividade das células Treg e das Th17 nessa patologia. Os autores
observaram que esta condição pode estar relacionada ao aumento na população de células
Th17, que sugere um ambiente de citocinas distinto que se encontra ativo no lúpus. Estes
autores encontraram ainda uma diminuição da população das células nTreg, indicando que
as citocinas produzidas pelo sistema imune dos pacientes com a doença ativa suprime a
geração deste subconjunto celular.
Yan e Liu (2009) citam que existe uma grande quantidade de células CD4+CD25FoxP3+ presentes no sangue periférico de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico. Eles
sugerem que essa quantidade de células CD4+CD25-FoxP3+ aumentada pode constituir um
reservatório periférico da população de células Treg CD4+CD25+FoxP3+. Sob reativação
da doença autoimune, as células CD4+CD25-FoxP3+ poderiam ser recrutadas para
expandir a coleção de células Treg com o ganho de CD25, no esforço de reverter um
desequilíbrio na expansão de células T e B auto-reativas no lúpus.
Estudo recente buscou elucidar o papel das células Treg FoxP3+ na aterosclerose,
considerando que estas foram descritas como agentes protetores nessa patologia. Dessa
forma, murinos foram vacinados contra FoxP3 o que ocasionou redução das células Treg
44
FoxP3+ em vários órgãos e um aumento na formação da lesão aterosclerótica. Os dados
exibem o importante papel destas células Treg na aterosclerose, denotando a função
protetora destas células (VAN ES et al, 2009).
Ito et al (2009) avaliaram a quantidade e qualidade de células T FoxP3+ na
circulação de pacientes com dermatite atópica comparando com um grupo controle através
de citometria de fluxo. A freqüência de células FoxP3+CD25+ entre a população de células
CD4+ nos indivíduos com essa doença foi significativamente maior que aquela do grupo
controle, exibindo ainda uma diminuição na quantidade conforme as lesões regrediam. Os
autores sugerem que a flutuação dinâmica nos números das células Treg FoxP3+ pode
contribuir com a patogênese da dermatite atópica, acrescentando que estas células podem
ser expandidas em resposta à inflamação alérgica sistêmica ou local.
Radstake et al (2009) investigaram o papel das células Treg na esclerose sistêmica.
Para tanto, as células CD3+ foram isoladas e subsequentemente estudadas através de
citometria de fluxo para a expressão de CD4, CD8, CD25, FoxP3, CD127, CD62L, GITR
e CD69. A função supressora destas foi correlacionada com a expressão do CD69 e a
secreção/expressão do TGFβ. As células T CD4+CD25+ e CD25highFoxP3highCD127neg
foram altamente expressas em todos os casos de esclerose sistêmica quando comparados
com o grupo controle. Já a expressão do CD62L e do CD69 foi baixa nesses indivíduos,
sendo relacionadas com uma função supressora diminuída. A co-incubação de células
Treg de indivíduos saudáveis com o plasma de pacientes com esclerose sistêmica anulou
completamente qualquer atividade supressora. Os resultados indicam que fatores solúveis
no plasma de pacientes com esclerose sistêmica inibem a função das células Treg,
associados às alterações na expressão do CD69 e do TGFβ.
Dessa forma, as células T regulatórias são um subconjunto de linfócitos T que
exercem uma função central na tolerância imunológica e no término de respostas imunes.
A atividade funcional das células T e das células Treg deve estar em condições
equilibradas
para
possibilitar
respostas
imunes
adequadas.
Consequentemente,
anormalidades no número e na função das células Treg prejudicam o controle deste
mecanismo de regulação imune e podem contribuir para a patogênese de certas doenças. A
identificação dessas células em condições normais e inflamatórias pode contribuir para um
melhor entendimento de patologias associadas (DE BOER et al, 2007a).
45
Investigou-se a expressão de FoxP3 e GITR na pele normal e em um painel de
diferentes dermatoses inflamatórias: LP, psoríase, dermatite espongiótica e leishmaniose.
Os resultados revelaram que o FoxP3 e o GITR estavam quase que exclusivamente
presentes nas células T que expressaram tanto CD4 como CD25. Em geral, a freqüência
das células FoxP3+ se mostraram similares na pele normal e no LP. Estas freqüências
também não variaram entre os outros espécimes patológicos, o que pode ser resultado do
processo inflamatório inerente a estas lesões, enquanto que na pele normal, uma grande
variação na freqüência de células FoxP3+ foi encontrada entre os diferentes pacientes.
Estes dados, no entanto, não indicam necessariamente que as células Treg não estão
envolvidas na patogênese das doenças inflamatórias em pele (DE BOER et al, 2007a).
Tao et al (2009) analisaram a correlação entre o número de células FoxP3+ e a
atividade das lesões de LPO. Estes observaram que o FoxP3 está presente
preferencialmente nas células que apresentam o fenótipo CD4+CD25+. Constataram um
aumento no número de células Treg FoxP3+ e alta transcrição do próprio FoxP3+ nas
lesões de LPO, além de uma baixa quantidade do número dessas células nas lesões
eritematosas/erosivas em comparação com as reticulares. Esses dados indicam que as
células Treg FoxP3+ estão envolvidas na patogênese do LPO e relacionadas com o subtipo
clínico e com a atividade da doença.
Embora estudos prévios que buscaram relacionar a densidade/quantidade do
infiltrado inflamatório no LPO com as formas clínicas (reticular e erosiva) não mostrem
relação entre as duas variáveis, estes sugerem haver uma relação entre a apresentação
clínica da lesão e a qualidade do infiltrado inflamatório, o que justifica o interesse em
identificar tipos celulares específicos neste infiltrado para então qualificá-lo (SEOANE et
al, 2004; LÓPEZ-JORNET, 2009).
As células Treg são importantes na supressão imunorregulatória da proliferação e
função das células T. O número e/ou função anormal destas pode ocasionar doenças
inflamatórias. As células Treg naturais desenvolvem-se no timo antes de sofrerem
exposição ao antígeno, enquanto que as células Treg adaptativas são geradas nos tecidos
linfóides periféricos através das células naïve CD4+FoxP3- antes de sofrerem exposição
antigênica. A expressão do FoxP3 é considerada mais importante que o CD25 para o
desenvolvimento do fenótipo regulatório. A expressão dessa proteína nas células T é
considerada como padrão ouro para se definir as células Treg, que suprimem direta ou
46
indiretamente as células efetoras da inflamação alérgica, como os eosinófilos
(TANTIBHAEDHYANGKUL, 2009).
Piccirillo et al (2008) afirmam que a identificação de marcadores de alta
especificidade e fidedignidade que discriminem as células Treg das efetoras, permitirá o
desenvolvimento de reagentes apropriados para facilitar o monitoramento da freqüência e
função destas células nas doenças, ou ainda, a verificação clínica da eficácia de novas
terapias que modulem a função das células Treg in vivo. Novos marcadores também
poderão auxiliar na diminuição ou aumento da supressão mediada pelas células Treg de
forma seletiva no intuito de tratar ou prevenir várias desordens inflamatórias.
Até o momento, na literatura pesquisada, só existe um artigo que avalia o papel
das células Treg nas lesões de líquen plano oral (TAO et al, 2009). Desse modo, se fazem
necessários estudos que elucidem melhor a etiopatogênese destas lesões, incluindo o papel
exercido pelas células Treg, considerando que estas exercem uma função importante no
controle das respostas imunes e que possuem um grande potencial terapêutico para o
tratamento e possível cura destas doenças.
Proposição
48
3
PROPOSIÇÃO
Este trabalho analisou a expressão imunoistoquímica do FoxP3 no infiltrado
inflamatório do líquen plano oral, objetivando identificar as células Treg FoxP3+ e
posteriormente comparar com a expressão do mesmo marcador no infiltrado inflamatório das
hiperplasias fibrosas inflamatórias. Além disto, avaliou comparativamente a imunoexpressão
deste marcador entre as formas clínicas de líquen plano oral (reticular e erosiva). Através
desta análise, buscou-se verificar se alterações no número de células Treg se relacionariam
com a etiopatogenia do líquen plano oral e se exerceriam algum papel no desenvolvimento
das suas duas formas clínicas distintas, pretendendo-se com isto um melhor entendimento da
etiopatogênese desta doença, o que pode propiciar futuramente o aperfeiçoamento do
tratamento dirigido a estas lesões.
Material e Métodos
50
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Considerações éticas
O presente estudo foi submetido à análise pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN
e pelo Sistema Nacional de Ética na Pesquisa-SISNEP, tendo sido aprovado sob o parecer no.
253/2009 em reunião deste comitê em setembro de 2009.
4.2 Caracterização do estudo
Este estudo foi caracterizado como uma pesquisa retrospectiva descritiva constituída
pela observação, análise e registro da expressão imunoistoquímica do FoxP3 em líquen plano
oral e hiperplasia fibrosa inflamatória. O objetivo consistiu em analisar comparativamente a
imunoexpressão desta molécula entre o infiltrado inflamatório do LPO e da hiperplasia
fibrosa inflamatória, bem como entre as duas formas clínicas de líquen plano oral (reticular e
erosiva).
4.3 População
Para o desenvolvimento desta pesquisa, foram utilizados todos os casos de líquen
plano oral e hiperplasia fibrosa inflamatória registrados, diagnosticados e arquivados no
Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral da Faculdade de Odontologia
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
4.4 Amostra
A amostra foi intencional, uma vez que foram selecionados todos os casos
diagnosticados como líquen plano oral e hiperplasia fibrosa inflamatória do arquivo
supracitado, baseado na quantidade e qualidade do material disponível nos blocos de parafina
existentes, onde os mesmos deveriam ser suficientes para a realização do estudo morfológico
e imunoistoquímico. Foram selecionados 32 casos de líquen plano oral, divididos entre as
formas reticular (17 casos) e erosiva (15 casos) e 10 casos de hiperplasia fibrosa inflamatória.
Foram consideradas formas reticulares de LPO aquelas lesões descritas nas fichas clínicas dos
51
pacientes como assintomáticas, com linhas brancas entrelaçadas ou como pápulas e as
erosivas como lesões eritematosas, ulceradas e sintomáticas (apresentando dor e/ou ardor),
conforme Neville et al (2009).
4.5 Critérios de seleção da amostra
4.5.1 Critérios de inclusão
•
Foram incluídos os espécimes diagnosticados histopatologicamente como
líquen plano oral que continham as informações clínicas disponíveis para
caracterizá-los nas formas reticular ou erosiva e os espécimes de hiperplasia
fibrosa inflamatória com intenso infiltrado inflamatório disposto em posição
justaepitelial.
•
Foram incluídos os espécimes que tinham material suficiente nos blocos de
parafina para o desenvolvimento da pesquisa.
4.5.2 Critérios de exclusão
•
Foram excluídos os espécimes que não satisfizeram os critérios de inclusão
descritos anteriormente.
4.6 Estudo morfológico
Dos espécimes de líquen plano oral e hiperplasia fibrosa inflamatória existentes nos
Arquivos da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da UFRN
selecionados para este estudo, foi realizada uma análise histomorfológica em microscopia de
luz, nos aumentos de 40x, 100x e 400x, em cortes de 5 µm de espessura, dispostos em
lâminas de vidro e corados pela técnica da hematoxilina e eosina, a fim de definir as
características histopatológicas incluindo algumas características epiteliais, tais como
ceratinização, atrofia, apoptose (com formação de corpos de Civatte), além de intensidade e
localização do infiltrado inflamatório. A avaliação foi realizada por um único observador e
para as lesões de LPO foi adotado o critério diagnóstico proposto pela OMS (1978) e
52
modificado por van der Meij e van der Waal (2003) associado aos dados clínicos presentes
nos prontuários dos pacientes (Tabela 01).
QUADRO 01. Critérios diagnósticos propostos pela OMS para LPO, modificados por
van der Meij e van der Waal (2003).
Critérios Histopatológicos
Presença de uma zona em faixa, bem definida, de infiltração celular, confinada à porção
superficial do tecido conjuntivo, consistindo principalmente de linfócitos
Sinais de liquefação degenerativa na camada basal do epitélio
Ausência de displasia epitelial
4.7 Estudo imunoistoquímico
4.7.1 Método imunoistoquímico
Do material emblocado em parafina foram obtidos cortes de 3µm de espessura e
estendidos em lâminas de vidro previamente limpas e preparadas com adesivo à base de
Organosilano (3-aminopropyltriethoxi-silano, Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA). Aos
cortes histológicos foi aplicado anticorpo dirigido contra a proteína FoxP3 cujas
especificações encontram-se no Quadro 01.
53
QUADRO 02 – Especificidade, clone, recuperação antigênica, diluição e tempo de
incubação dos anticorpos utilizados.
Especificidade
Clone
Recuperação
Diluição
antigênica
FoxP3*
FoxP3
Tris-EDTA
(H190)
pH 9,0
Tempo de
incubação
1:150
Overnight
*Marca: Santa Cruz Biotechnology, Inc
Para detecção da marcação imunoistoquímica foi aplicado o sistema Envision® (Dako
Co., Carpinteria, CA, USA). Foram utilizados como controle positivo para o FoxP3 cortes de
tecido tonsilar. O controle negativo foi feito substituindo-se o anticorpo primário por
albumina de soro bovino a 1% (BSA – Bovine Serum Albumin) em solução tampão. A técnica
utilizada foi realizada conforme os passos que se seguem:
•
Desparafinização: 2 banhos em xilol, ambos por 10 minutos à temperatura ambiente (TA);
•
Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis:
•
álcool etílico absoluto I (5 minutos) TA;
•
álcool etílico absoluto II (5 minutos) TA;
•
álcool etílico absoluto III (5 minutos) TA;
•
álcool etílico absoluto IV (5 minutos) TA;
•
álcool etílico 95°GL (5 minutos) TA;
•
álcool etílico 80°GL (5 minutos) TA;
•
Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol 95° por 10
minutos, à temperatura ambiente;
•
Lavagem em água corrente por 10 minutos;
54
•
2 passagens em água destilada por 5 minutos cada;
•
Recuperação dos sítios antigênicos (Quadro 1);
•
Lavagem em água corrente por 10 minutos e 2 passagens em água destilada por 5 minutos
cada;
•
Duas incubações dos cortes, pelo período de 10 minutos cada, em solução de 0,3% de
peróxido de hidrogênio em metanol para bloqueio da peroxidase endógena tecidual;
•
Lavagem em água corrente por 10 minutos e 2 passagens em água destilada por 5 minutos
cada;
•
Duas passagens em solução tampão TRIS-HCl (tris-hidroximetil-aminometano, Sigma
Chemical, St Louis, MO, USA) pH 7,4 por 5 minutos cada;
•
Incubação com o anticorpo primário (Quadro 1) diluído em solução BSA (albumina sérica
bovina, BIOTEST S/A, São Paulo, Brasil) a 1% conservada em azida sódica a 0,1% em
TRIS-HCl pH 7,4;
•
Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 por 5 minutos cada;
•
Incubação tampão TRIS-HCl, pH 7,4 (2 passagens – 5 minutos cada)
•
Incubação do anticorpo secundário + Envision® (Dako Co., Carpinteria, CA, USA);
•
Incubação do complexo avidina/biotina, diluído em TRIS gelado (A+B)
•
Lavagem em solução tampão TRIS-HCl, pH 7,4;
•
Imersão em TRIS-HCl pH 7,4, duas trocas de 5 minutos cada;
•
Aplicação do agente cromógeno diaminobenzidina 25 a 30 mg (3,3-diaminobenzidina,
Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA), diluída em 100 ml TRIS-HCl pH 7,4,
acrescida de 1,2 ml de peróxido de hidrogênio 10 volumes durante 3 minutos na câmara
escura;
•
Lavagem em água corrente por 10 minutos;
•
Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);
•
Contracoloração com hematoxilina de Mayer por 10 minutos à temperatura ambiente;
55
•
Lavagem em água corrente – 10 minutos;
•
Duas passagens em água destilada por 5 minutos cada;
•
Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
•
álcool etílico 80°GL (2 minutos) TA;
•
álcool etílico 95°GL (2 minutos) TA;
•
álcool etílico absoluto I (5 minutos) TA;
•
álcool etílico absoluto II (5 minutos) TA;
•
álcool etílico absoluto III (5 minutos) TA;
•
Diafanização em dois banhos de xilol: xilol 1 (2 minutos) e xilol 2 (2 minutos);
•
Montagem da lamínula em resina Permount ® (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ, USA).
4.7.2 Análise do perfil imunoistoquímico
A expressão imunoistoquímica do FoxP3 foi analisada em microscópio óptico Nikon®
considerando-se a localização da expressão imunoistoquímica em região nuclear e a
quantidade de células marcadas. Tanto para o LPO quanto para a hiperplasia fibrosa
inflamatória a avaliação foi realizada por um único observador, sendo os achados anotados
em ficha previamente elaborada (Apêndice C) para posterior análise dos resultados obtidos.
A localização da marcação, definida como a região onde as células marcadas pelo
FoxP3 se encontraram, foi classificada em: justaepitelial ou intraepitelial.
A quantidade foi avaliada contando-se as células marcadas em 10 campos
consecutivos (com aumento de 400x) em cada espécime, para o tecido conjuntivo subjacente
e para o epitélio. Para as células justaepiteliais e para as intraepiteliais foi feita uma média
representando a quantidade de células marcadas em cada caso, conforme Loddenkemper et al
(2009). Os dados de ambas as somas foram expressos em médias ± desvio-padrão, conforme
Di Stefano et al (2009).
Os dados encontrados foram descritos e tabulados objetivando a análise comparativa
dos resultados obtidos.
56
4.8 Análise estatística
Uma vez realizadas as análises imunoistoquímicas, os resultados obtidos foram
organizados em um banco de dados informatizado com o auxílio do programa estatístico
SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) na versão 17 e submetidos aos testes de
Kolmogorov-Smirnov, o teste t de Student e o Exato de Fisher, para verificar diferenças
estatisticamente significativas (nível de significância de 5%).
Resultados
58
5 RESULTADOS
5.1 Caracterização da amostra
A amostra deste estudo foi composta por 32 casos de líquen plano oral, divididos entre
as formas clínicas reticular (17 casos) e erosiva (15 casos), além de 10 casos de hiperplasia
fibrosa inflamatória (HFI). Todos os espécimes utilizados na amostra foram obtidos dos
arquivos do Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral da Faculdade de
Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
15
36%
10
24%
LPO reticular
LPO erosivo
HFI
17
40%
GRÁFICO 01. Distribuição da amostra quanto ao tipo de lesão. Natal/RN – 2010.
5.2 Análise morfológica
Foram analisadas as características histopatológicas do LPO corados com
hematoxilina e eosina (HE) onde verificou-se a presença de epitélio de revestimento do tipo
pavimentoso estratificado. A lamina própria papilar e reticular foi composta por tecido
conjuntivo fibroso de densidade variada. Em relação às características de ceratinização do
epitélio, a maioria dos LPO erosivos foi paraceratinizada (n=11; 73,3%) enquanto a forma
reticular se dividiu entre paraceratinizada (n=7; 41,1%) e ortoceratinizada (n=10; 58,9%). Os
dados encontram-se descritos na Tabela 02. Quanto à presença ou não de hiperceratinização
observou-se que a maioria dos LPO erosivos foi paraceratinizada/ortoceratinizada (n=11;
59
73,3%) e a grande parte dos LPO reticulares foi hiperparaceratinizada/hiperortoceratinizada
(n=12; 70,6%), sendo esta relação estatisticamente significativa (P<0,05) (Tabela 03).
TABELA 01. Distribuição dos casos quanto ao tipo de lesão em relação ao tipo de
ceratinização. Natal/RN – 2010.
Paraceratinizado
Hiperparaceratinizado
Ortoceratinizado
Hiperortoceratinizado
LPO erosivo
8 (72,7%)
3 (42,9%)
3 (60,0%)
1 (11,1%)
LPO reticular
3 (27,3%)
4 (57,1%)
2 (40,0%)
8 (88,9%)
11 (100,0%)
7 (100,0%)
5 (100,0%)
9 (100,0%)
Total
TABELA 02. Distribuição dos casos quanto ao tipo de lesão em relação ao tipo de
hiperceratinização. Natal/RN – 2010.
Paraceratinizado/
Hiperparaceratinizado/
Ortoceratinizado
Hiperortoceratinizado
LPO erosivo
11 (68,8%)
4 (25,0%)
LPO reticular
5 (31,3%)
12 (75,0%)
16 (100,0%)
16 (100,0%)
Total
Valor de P
0,032
Teste Exato de Fisher P<0,05
Com relação às características epiteliais verificou-se que 20 casos (62,5%) de LPO
apresentaram predominância de atrofia (Figura 01). Apesar de não ter havido resultado
estatisticamente significativo (P>0,05), verificou-se que a maioria dos casos de LPO erosivo
(n=12; 80,0%) exibiu este padrão, por sua vez, os LPO reticulares se dividiram entre nove
casos (52,9%) demonstrando hiperplasia e oito (47,1%) atrofia, conforme se observa na
60
Tabela 04. Ainda do total, 18 casos (56,3%) exibiram projeções epiteliais em forma de
“dentes de serra”, a maior parte dos LPO erosivos não mostrou as projeções (n=9; 60,0%) e a
maior parte dos reticulares (n=12; 70,6%) apresentou esse padrão.
TABELA 03. Distribuição dos casos quanto ao tipo de lesão em relação às
características epiteliais. Natal/RN – 2010
Hiperplasia
Atrofia
LPO erosivo
3 (25,0%)
12 (60,0%)
LPO reticular
9 (75,0%)
8 (40,0%)
12 (100,0%)
20 (100,0%)
Total
Valor de P
0,076
Teste Exato de Fisher P>0,05
De acordo com a presença de exocitose nas lesões, a maioria dos casos de LPO
(n=19; 59,4%) apresentou infiltrado inflamatório intraepitelial em quase toda a extensão do
epitélio, onde sete (46,7%) foram LPO erosivos e 12 (70,6%) foram do tipo reticular.
Verificou-se também a presença de corpos de Civatte na região justaepitelial dos espécimes,
onde se observou que em oito casos (53,3%) das lesões erosivas houve a presença desta
estrutura e ausência em sete (46,7%). Nos LPO reticulares, 13 (76,5%) exibiram corpos de
Civatte e quatro (23,5%) não exibiram (Figura 02).
Nos casos de LPO analisados, o tecido conjuntivo fibroso foi predominantemente
frouxo, exibindo intenso infiltrado inflamatório predominantemente linfocítico, posicionado
em forma de faixa contínua em região justaepitelial. Observou-se que dentre os espécimes de
LPO erosivos, um caso (6,7%) apresentou a formação de centros germinativos na região mais
superficial do tecido conjuntivo. Na forma reticular, três (17,7%) exibiram quantidade
variável destas formações.
A análise dos cortes histológicos de hiperplasia fibrosa inflamatória mostrou
fragmentos de mucosa oral revestidos por epitélio pavimentoso estratificado com camada
córnea de espessura variável, sendo ortoceratinizada ou paraceratinizada, com hiperplasia,
61
acantose e exocitose variável. O tecido conjuntivo fibroso subjacente foi predominantemente
frouxo, exibindo intenso infiltrado inflamatório, predominantemente mononuclear, situado
principalmente em região justaepitelial.
5.3 Análise do perfil imunoistoquímico
A marcação imunoistoquímica para o FoxP3 em região nuclear foi analisada em
microscopia de luz, a qual se revelou difusa quanto à sua distribuição, localizando-se nas
células presentes no infiltrado inflamatório predominantemente linfocítico situado em região
justaepitelial, bem como em algumas células inflamatórias intraepiteliais. Nos centros
germinativos, verificou-se que poucas células imunomarcadas foram encontradas em seu
interior e uma maior quantidade de marcação foi encontrada em sua periferia. Nestes casos de
marcação positiva, a quantidade de células imunomarcadas ao redor das formações foi
semelhante àquela encontrada nas demais áreas dos espécimes (Figura 03).
Foram contadas as células justaepiteliais e intraepiteliais do infiltrado inflamatório
imunomarcadas para o FoxP3 em 10 campos consecutivos, sendo obtida uma média para cada
caso. Posteriormente, foi encontrada uma média ± desvio padrão de todos os casos de LPO
reticular, erosivo e de hiperplasia fibrosa inflamatória. (Figuras 04 a 08). A distribuição
Normal dos dados foi constatada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov.
De acordo com a contagem na região justaepitelial, o tipo reticular exibiu uma média
de 1,5 ± 2,1 de células marcadas. O tipo erosivo exibiu uma média discretamente maior que o
reticular, sendo esta de 1,7 ± 2,4. Os casos de hiperplasia fibrosa inflamatória, por sua vez,
exibiram média sensivelmente menor que os dois tipos clínicos de LPO, correspondendo a 0,5
± 0,4 (Tabela 05) (Gráfico 02).
62
TABELA 04. Quantidade, média ± desvio padrão e intervalo de confiança (95%)
relativos à contagem de células justaepiteliais imunomarcadas para o FoxP3. Natal/RN –
2010.
Espécime
n (%)
Média ± desvio
padrão
Intervalo de confiança (95%)
Mínimo
Máximo
LPO reticular
17 (40,0)
1,5 ± 2,1
0,421
2,667
LPO erosivo
15 (36,0)
1,7 ± 2,4
0,304
3,182
HFI
10 (24,0)
0,5 ± 0,4
0,214
0,906
63
Como a distribuição dos dados foi Normal em todos os casos, inicialmente aplicou-se
o teste t de Student para verificar a relação existente entre a imunomarcação para o FoxP3
entre os tipos do LPO e a HFI separadamente, onde não houve diferença estatisticamente
significativa (P>0,05). Posteriormente, os dois tipos de LPO foram reunidos (1,6 ± 2,2) e
analisados com a HFI (0,5 ± 0,4), revelando uma diferença estatística significativa (P<0,05).
A mesma análise foi aplicada avaliando-se a quantidade de células marcadas pelo FoxP3 entre
o LPO reticular e o erosivo. Este teste revelou não haver diferença estatisticamente
significativa entre as formas clínicas de LPO (P>0,05). Estes dados são demonstrados na
Tabela 06.
TABELA 05. Valor de P e Intervalo de Confiança (95%) obtidos através do teste t de
Student para a quantidade de células justaepiteliais imunomarcadas para o FoxP3.
Natal/RN – 2010.
Intervalo de confiança (95%)
Valor de P
Mínimo
Máximo
LPO reticular x HFI
0,162
- 0,4243
2,3918
LPO erosivo x HFI
0,105
- 0,2798
2,6455
LPO x HFI
0,019
0,1848
1,9686
LPO reticular x LPO erosivo
0,814
- 1,9192
1,5209
De acordo com a contagem das células imunomarcadas na região intraepitelial, o tipo
reticular exibiu uma média de 0,9 ± 1,7 de células marcadas. O tipo erosivo exibiu uma média
discretamente menor que o reticular, sendo esta de 0,4 ± 0,4. Os casos de hiperplasia fibrosa
inflamatória, por sua vez, exibiram uma média situada entre os valores dos dois tipos de LPO,
correspondendo a 0,6 ± 0,6 (Tabela 07) (Gráfico 03).
64
TABELA 06. Quantidade, média ± desvio padrão e intervalo de confiança (95%)
relativos à contagem de células intraepiteliais imunomarcadas para o FoxP3. Natal/RN
– 2010.
Espécime
n (%)
Média ± desvio
padrão
Intervalo de confiança (95%)
Mínimo
Máximo
LPO reticular
17 (40,0)
0,9 ± 1,7
0,034
1,941
LPO erosivo
15 (36,0)
0,4 ± 0,4
0,133
0,667
HFI
10 (24,0)
0,6 ± 0,6
0,163
1,137
65
Verificou-se ainda a relação existente entre a quantidade de células intraepiteliais
marcadas pelo FoxP3 entre as formas clínicas de LPO e a HFI, separadamente, entre os dois
tipos de LPO reunidos e analisados com a HFI e posteriormente entre o LPO reticular e o
erosivo. Nenhum desses testes revelou diferença estatisticamente significativa (P>0,05). Estes
dados são demonstrados na Tabela 08.
TABELA 07. Valor de P e Intervalo de Confiança (95%) obtidos através do teste t de
Student para a quantidade de células intraepiteliais imunomarcadas para o FoxP3.
Natal/RN – 2010.
Intervalo de confiança (95%)
Valor de P
Mínimo
Máximo
LPO reticular x HFI
0,576
- 0,8900
1,5650
LPO erosivo x HFI
0,294
- 0,7324
0,2324
LPO x HFI
0,889
- 0,8468
0,9734
LPO reticular x LPO erosivo
0,244
- 0,4228
1,5978
66
FIGURA 01 – Corte histológico de líquen plano oral corado em HE, exibindo atrofia epitelial
(200x).
FIGURA 02 – Corte histológico de líquen plano oral corado em HE, exibindo os Corpos de
Civatte (setas) (400x).
67
FIGURA 03 – Imunoexpressão do Foxp3 em líquen plano oral, exibindo a formação de centro
germinativo no infiltrado inflamatório justaepitelial (200x).
68
68
FIGURA 04 – Imunoexpressão do Foxp3 nas células Treg intraepiteliais (setas) em líquen plano
oral reticular (400x).
FIGURA 05 – Imunoexpressão do Foxp3 nas células Treg intraepiteliais e justaepiteliais (setas)
em líquen plano oral erosivo (400x).
69
FIGURA 06 – Imunoexpressão do Foxp3 nas células Treg justaepiteliais (setas) em líquen plano
oral reticular (400x).
FIGURA 07 – Imunoexpressão do Foxp3 nas células Treg justaepiteliais (setas) em líquen plano
oral erosivo (400x).
70
FIGURA 08 – Imunoexpressão do Foxp3 nas células Treg intraepiteliais e justaepiteliais (setas)
em hiperplasia fibrosa inflamatória (400x).
Discussão
72
6 DISCUSSÃO
O líquen plano é uma condição inflamatória mucocutânea que em sua maioria afeta
adultos de meia idade, com predominância entre as mulheres e que possui etiologia pouco
esclarecida (ANURADHA et al, 2008; CARROZZO e THORPE, 2009). Sua prevalência é
desconhecida, mas tem sido estimada em aproximadamente 1% da população
(CARROZZO, 2008). As lesões em pele geralmente são autolimitadas e causam prurido,
se caracterizando como pápulas violáceas, poligonais e de superfície plana (EISEN et al,
2005). A mucosa oral é afetada mais frequentemente na mucosa jugal, língua e gengiva.
As lesões geralmente são bilaterais, simétricas e se dividem em dois tipos clínicos
principais: reticulares e erosivos (ANURADHA et al, 2008).
As lesões de LPO reticular apresentam-se como um rendilhado de linhas brancas
entrelaçadas, podendo exibir pápulas e placas. Os pacientes com este tipo de lesão
raramente se queixam de algum sintoma e geralmente se encontram desapercebidos da
presença das alterações. As lesões erosivas por sua vez, podem causar vários níveis de
desconforto, possuindo um número ou grau de ulceração bem variável, com tamanho e
localização diversa como afirmado por Anuradha et al (2007); Karatsaidis et al (2007);
Carrozzo e Thorpe (2009). Segundo Chainani-Wu et al (2001), Edwards e Kelsch (2002) e
Huber (2004), a forma reticular é a mais freqüente do LPO em detrimento à forma erosiva.
Nos dois tipos de LPO a região posterior da mucosa jugal é o local mais freqüente de
acometimento, seguido pela língua, gengiva, mucosa labial e vermelhão do lábio. As
lesões do palato, assoalho da boca e lábio superior são incomuns (XUE et al, 2005;
ANURADHA et al, 2007; CARROZZO e THORPE, 2009; DO PRADO, MAROCCHIO e
FELIPINI, 2009).
O mecanismo de destruição da camada basal do epitélio, característico no LPO,
encontra-se relacionado a um processo imunológico mediado por células T. As lesões de
LPO exibem uma grande quantidade de células T auxiliares, células T citotóxicas e
células de Langerhans. Estas células T auxiliares podem ser ativadas por um antígeno
ainda desconhecido associado ao MHC de classe II, apresentado pelas células de
Langerhans ou pelos ceratinócitos (LODI et al, 2005; ANURADHA et al, 2008; FARHI e
DUPIN, 2010). Já as células T CD8 citotóxicas podem ser ativadas através da produção
de citocinas pelas células T auxiliares ou por algum antígeno expresso pelos ceratinócitos
73
e associado ao MHC classe I, promovendo então a apoptose dos ceratinócitos (FARHI e
DUPIN, 2010).
Scully e Carrozzo (2008) afirmam que as células T migram através do epitélio oral
atraídas pelas moléculas ICAM-1 e VICAM, responsáveis pela adesão celular,
contribuindo também com este processo o aumento na regulação de proteínas da MEC.
Segundo Farhi e Dupin (2010) o antígeno que ocasiona a resposta imune inflamatória no
LPO ainda não foi identificado, podendo ser um antígeno próprio ou um antígeno
exógeno. Alguns fatores supõem a intervenção de uma resposta autoimune nas lesões de
LPO: cronicidade da doença, início na fase adulta, prevalência no sexo feminino,
associação com outras doenças autoimunes, presença de células T auto-citotóxicas e
efetividade de terapia imunossupressora. Lodi et al (2005) ainda citam que existe uma
grande variedade de fatores que podem precipitar a reação imune que resulta nas lesões de
LPO, se destacando as infecções virais, produtos bacterianos, traumas mecânicos, drogas
sistêmicas e hipersensibilidade por contato.
De acordo com Sousa et al (2009) as características histológicas principais do LPO
são a presença de liquefação na camada basal do epitélio de revestimento, infiltrado
linfocítico intenso em região subepitelial e padrão normal de ceratinização das células
epiteliais. Os achados ocasionais seriam projeções interpapilares, hiperparaceratose,
corpos de Civatte e o epitélio separado da lâmina própria.
Já Lehman et al (2009)
acrescentam como aspectos histológicos do LP mucocutâneo, as fendas subepiteliais de
Max-Joseph, formadas como conseqüência da inflamação na interface epitélio-conjuntivo,
acantose irregular e hiperortoceratose. Sousa e Rosa (2008) ainda citam que as projeções
epiteliais podem estar ausentes, serem hiperplásicas ou em forma de dentes de serra.
Este estudo observou que de acordo com as características histológicas, alguns
casos
foram
paraceratinizados/hiperparaceratinizados
(56,3%)
e
outros
ortoceratinizados/hiperortoceratinizados (43,7%). López-Jornet e Camacho-Alonso (2008)
também encontraram uma maior freqüência de lesões paraceratinizadas em comparação às
ortoceratinizadas.
Em seu estudo, estes autores buscaram determinar as diferenças
clínicas e histopatológicas existentes entre os pacientes com LPO que possuíam
restaurações de amálgama e aqueles que não possuíam restaurações. Esses autores
encontraram
uma
freqüência
de
86,0%
para
as
lesões
paraceratinizadas
/
hiperparaceratinizadas e 14,0% para as ortoceratinizadas / hiperortoceratinizadas nos dois
grupos analisados.
74
Ainda verificou-se em nosso trabalho que a maioria dos LPO reticulares foram
hiperceratinizados (12/70,6%) enquanto que a grande parte dos LPO erosivos exibiu
ausência de hiperceratinização (11/73,3%). Sousa e Rosa (2008) e Neville et al (2009)
afirmam que graus variáveis de ceratinização podem estar presentes na superfície do
epitélio do LPO, dependendo da forma clínica analisada ser reticular ou erosiva.
Com relação à presença de atrofia no epitélio de revestimento, nosso estudo
mostrou um valor elevado desse padrão histológico (62,5% da amostra: 12/60,0% erosivos
e 8/40,0% reticulares) em comparação com o encontrado no estudo de López-Jornet e
Camacho-Alonso (2008). Estes autores analisaram as características clínicas e histológicas
dos pacientes com LPO e verificaram uma freqüência de atrofia epitelial em apenas 14,5%
dos casos, todavia a amostra deles era composta principalmente por lesões reticulares,
com apenas 10,8% de lesões sendo erosivas. Os autores ainda citam que as lesões erosivas
caracteristicamente apresentam um maior grau de atrofia epitelial em comparação com as
do tipo reticular. Este fato pode explicar a baixa freqüência de atrofia encontrada no
estudo de López-Jornet e Camacho-Alonso (2008), frente ao nosso.
Neste sentido, ainda Brant, Vasconcelos e Rodrigues (2008) verificaram que o
LPO erosivo apresentou um maior grau de atrofia epitelial que o LPO reticular e ambos os
tipos apresentaram-se atróficos em relação à mucosa saudável utilizada como controle. Os
autores ainda acrescentaram que a diminuição da espessura epitelial é característica do
LPO, todavia observaram que este padrão variou de acordo com a forma clínica. Citam
ainda que as diferenças clínicas entre as formas reticular e erosiva são provavelmente
conseqüências das variações histológicas e biológicas, como variações na espessura
epitelial e intensidade de apoptose.
Conforme Xia et al (2006) a coloração avermelhada nas lesões de LPO erosivo é
causada pela inflamação local e/ou atrofia epitelial. Dessa forma, segundo os autores, a
atrofia observada nas lesões erosivas indica que esse aspecto clínico corresponde a um
estágio mais ativo da doença, enquanto que o LPO reticular corresponde a uma fase mais
quiescente.
Dentre os casos de LPO analisados em nosso estudo, 65,6% apresentaram corpos
de Civatte, freqüência maior que a encontrada por Brant, Vasconcelos e Rodrigues (2008)
que foi de 38,5%. Eles verificaram que a apoptose foi mais intensa nas lesões de LPO que
na mucosa oral normal, sugerindo que esse processo encontra-se envolvido na morte
75
celular observada nessa doença. Citam ainda que este evento ocorreu somente nas
camadas basal e parabasal, que representam as regiões mais susceptíveis às agressões pelo
infiltrado inflamatório subjacente. Os autores concluem afirmando que a apoptose possui
um papel importante na patogênese das duas formas de LPO, sendo responsável pela
diminuição da espessura do epitélio.
De acordo com Abdel-Latif, Abuel-Ela e El-Shourbagy (2008) a quantidade de
apoptose observada no LPO pode influenciar suas características clínicas, principalmente
no que concerne à presença de ulceração em lesões com maior grau de apoptose. Estes
autores estudaram a expressão da caspase-3, um marcador de alta especificidade para
detecção de apoptose, no LP cutâneo e no LPO. Inicialmente verificaram que a caspase-3
foi expressa com mais freqüência nas camadas basal e suprabasal do LP quando
comparada com a pele normal, indicando que a cascata de caspase encontra-se mais ativa
na região proliferativa do LP. Posteriormente, observaram que a expressão desta molécula
nas células epiteliais encontrava-se maior no LPO que no LP cutâneo, indicando uma
maior freqüência de apoptose no LPO. Os autores ainda acrescentam que estes achados
podem ter relação com uma alta expressão de moléculas citotóxicas ou presença de baixos
níveis de fatores antiapoptóticos no LPO em comparação com o LP cutâneo.
Todos os casos de LPO examinados exibiram um denso infiltrado inflamatório
predominantemente linfocítico disposto em forma de faixa em região subepitelial.
Diversos estudos citam como um dos principais achados histológicos do líquen plano a
presença de um infiltrado inflamatório em banda composto por células T (HUBER, 2004;
ANURADHA et al, 2008; BRANT, VASCONCELOS e RODRIGUES, 2008;
YOUNGNAK-PIBOONRATANAKIT et al, 2009). Farhi e Dupin (2010) acrescentam que
o LPO tipicamente exibe um infiltrado de células T CD8+ citotóxicas no epitélio adjacente
aos ceratinócitos apoptóticos da camada basal e que sob este, na lâmina própria, se
encontra um infiltrado de células T CD4+ auxiliares, caracterizando assim de uma forma
geral, o infiltrado nas lesões de LPO.
Redahan et al (2005) e Xiong et al (2009) citam que o LPO além de crônico
apresenta uma predisposição a ser recalcitrante à terapia medicamentosa, especialmente
em pacientes com lesões erosivas. Redahan et al (2005) adicionam que as lesões erosivas
exibem exacerbações freqüentes e imprevisíveis e raramente apresentam remissões. Brant,
Vasconcelos e Rodrigues (2008) afirmam que essa forma do LPO além de causar grande
desconforto oral, corresponde a uma fase mais destrutiva da doença em comparação com o
76
tipo reticular. Para estes autores, o infiltrado inflamatório nessas lesões parece exercer um
importante papel na injúria da mucosa.
Seoane et al (2004) e López-Jornet (2009) em seus estudos que tentaram relacionar
a densidade do infiltrado inflamatório no LPO com as suas formas clínicas erosiva e
reticular, não observaram correlação entre os tipos clínicos de LPO e a densidade do
infiltrado inflamatório como um todo, sugerindo a existência de uma relação entre a
apresentação clínica da lesão e aspectos qualitativos do infiltrado inflamatório. Dessa
forma, a maior atividade das lesões e sua evolução para uma forma atrófica-erosiva não
depende fundamentalmente da quantidade do infiltrado inflamatório subepitelial e sim da
qualidade deste infiltrado, segundo estes autores.
Já Charazinska-Carewicz et al (2008) avaliaram a imunidade celular e humoral em
pacientes com os tipos reticular e atrófico/erosivo de LPO através de coleta de sangue e
posterior citometria de fluxo. Nos pacientes com lesões atróficas/erosivas a freqüência de
células T citotóxicas/supressoras e sua subpopulação de células T näive foi menor do que
aquela observada nos indivíduos com LPO reticular. Os autores acrescentam que esta
menor quantidade de células T citotóxicas/supressoras pode ser causada pelo excesso de
estimulação antigênica ou ainda por distúrbios na função supressora, sendo esta última
uma característica típica de doenças autoimunes. Dessa forma, os autores afirmaram que
através da análise do infiltrado inflamatório destas lesões, pode-se sugerir que o LP
apresenta uma patogênese autoimune.
Um subconjunto de células T, conhecidas como células T regulatórias possui a função
de controlar respostas imunes e manter a autotolerância (YAN e LIU, 2009; FEUERER et al,
2009). Estudos verificaram que as células Treg são encontradas no infiltrado inflamatório
de diversas lesões (KARUBE et al, 2004; CHEN et al, 2008; RAO et al, 2009, XIE et al,
2009; WADA et al, 2009; YANG et al, 2009). O objetivo do nosso estudo foi comparar a
quantidade de células Treg no infiltrado inflamatório entre o LPO e a HFI e posteriormente
verificar se havia diferença entre as formas clínicas (reticular e erosiva) de LPO. No nosso
estudo, a HFI foi escolhida para ser comparada com o LPO porque apesar de
esporadicamente apresentar um intenso infiltrado inflamatório justaepitelial semelhante ao
LPO, as duas lesões apresentam etiopatogenia distinta: o LPO é uma doença
imunologicamente mediada, enquanto as HFIs são lesões normalmente ocasionadas por
traumas mecânicos freqüentes e de baixa intensidade. Ainda Tao et al (2009) afirmam que
as células Treg podem estar envolvidas na patogênese do LPO.
77
As células Treg são uma subpopulação de células T responsáveis pela
autotolerância imunológica, pela deleção clonal e anergia, suprimindo de forma efetiva a
ativação e expansão de células T auto-reativas (AZAB et al, 2008). Estas células têm sido
estudadas em diferentes doenças das mais variadas etiologias, como: dermatite atópica (ITO
et al, 2009); doença do enxerto versus hospedeiro (WANG et al, 2009); linfoma de células T
(MARZANO et al, 2009); linfoma de células B (GRILLE et al, 2009); miastenia grave (MU
et al, 2009); aterosclerose (VAN ES et al, 2009); esclerose múltipla (VANDENBARK et al,
2009); lúpus eritematoso sistêmico (FERREIRA et al, 2009); artrite reumatóide
(RAGHAVAN et al, 2008) e líquen plano cutâneo (DE BOER et al, 2007a).
Existem dois tipos de células Treg CD4+: as naturais (nTreg), produzidas no timo e
as induzidas (iTreg), produzidas na periferia por células T CD4+ sob indução antigênica.
Ambas possuem o papel de manter a tolerância periférica através da supressão de
respostas autoimunes potenciais e controlar as respostas às infecções (BLUESTONE e
ABBAS, 2003; PICCIRILLO, 2008; WORKMAN et al, 2009).
De acordo com Vocanson et al (2009), vários subtipos de células T CD4+ apresentam
atividades regulatórias, como as Tr1, Th3, Th2, NKT e as CD4+CD25+FoxP3+. Hori, Nomura
e Sakaguchi (2003), Khattri et al (2003), de Boer et al (2007a) e Wada et al (2009) citam
que o FoxP3 é o marcador mais confiável para identificação de tal subtipo celular. Zheng
e Rudensky (2007) declaram que o gene do FoxP3 foi descoberto durante esforços para se
entender as bases genéticas de uma doença autoimune ligada ao X, que é fatal em
humanos e conhecida pela sigla IPEX. De acordo com Wing e Sakaguchi (2010), a função
do FoxP3 não é determinar o fenótipo celular dos timócitos em desenvolvimento para
gerar células Treg, de outro modo, o FoxP3 tem o papel de estabilizar a função das células
Treg uma vez que o seu fenótipo esteja determinado.
As células Treg possuem diversos mecanismos de supressão: bloqueio da função
de células B e T auto-reativas através de contato direto célula-célula e secreção de
múltiplas citocinas; ligação à membrana e secreção de TGFβ, IL-10 e IL-35; indução de
moléculas citolíticas como o Fas, as granzimas e a perforina nas células efetoras; e alta
regulação do AMP cíclico nas células alvo através da liberação deste pelas células Treg ou
ainda pelo aumento de adenosina no espaço extracelular através da expressão do CD39 e
CD73 também pelas células Treg (SOJKA, HUANG e FOWELL, 2008; SKAGGS,
SINGH e HAHN, 2008; WORKMAN et al, 2009)
78
O presente estudo verificou que dos 32 casos de LPO analisados (17/53,1%
reticulares e 15/46,9% erosivos), todos apresentaram marcação positiva para o FoxP3,
muito embora em diferentes quantidades.
Para fins comparativos, os dois tipos de LPO foram reunidos e confrontados com a
HFI, revelando uma diferença estatisticamente significativa entre as quantidades de
células Treg FoxP3+ encontradas sendo as mesmas mais freqüentes no LPO. De acordo
com Canger, Celenk e Kayipmaz (2009) as HFIs se caracterizam pela presença de tecido
conjuntivo fibroso hiperplásico podendo apresentar inflamação e ulceração severas. Esta
inflamação pode apresentar uma celularidade variável e o infiltrado inflamatório pode
ocasionalmente se encontrar disposto em faixa subepitelial (NEVILLE et al, 2009).
Através dos resultados encontrados sugere-se que os casos de HFI apresentaram
uma menor quantidade de células Treg FoxP3+ talvez devido à sua etiologia ser associada
a fatores traumáticos e/ou infecciosos, o que produz um infiltrado inflamatório distinto
daquele observado no LPO, podendo suscitar a expressão de várias moléculas de adesão,
além de citocinas diferentes daquelas geradas numa doença imunologicamente mediada,
como ocorre no LPO.
Em relação a este fato, Farahani, Navabazam e Ashkevari (2010) afirmam que os
mastócitos são células da imunidade que possuem a propriedade de interagir com os
fibroblastos e contribuir com a síntese de colágeno em várias doenças e condições
patológicas, inclusive na HFI. Em seu estudo, estes autores compararam a quantidade de
mastócitos nas lesões reativas orais de tecido mole (fibroma de irritação, HFI, granuloma
periférico de células gigantes e fibroma ossificante periférico), além de avaliar a
correlação entre o número destas células e o grau de inflamação. A quantidade de
mastócitos foi maior nas lesões estudadas que no tecido gengival normal.
Ainda segundo estes autores, os mastócitos podem afetar o comportamento
funcional dos fibroblastos e conseqüentemente o processo de fibrose, através da liberação
de mediadores como histamina, proteoglicanos, enzimas proteolíticas e citocinas
fibrogênicas (fator transformador de plaquetas, TNFα, fator de crescimento fibroblástico).
A síntese crônica e liberação do TNF por estas células podem manter a migração
leucocitária e promover a cronicidade das lesões inflamatórias. Os mastócitos ainda
produzem triptase e quimase que causam a decomposição da matriz fibrosa e das proteínas
estruturais da membrana basal, facilitando a infiltração leucocitária nos tecidos durante o
79
desenvolvimento da inflamação (FARAHANI, NAVABAZAM e ASHKEVARI, 2010).
Segundo os autores, estes achados sugerem que estas células exercem alguma função na
síntese de colágeno e conseqüentemente na variação das características microscópicas das
lesões estudadas, podendo colaborar com o entendimento dos nossos resultados no que
concerne à presença do infiltrado inflamatório nas lesões de HFI e com a diferença na
freqüência de células Treg encontrada nestas lesões.
Dessa forma, existe uma grande diferença entre a patogenia do LPO a da HFI, onde
o primeiro apresenta a expressão de um ou mais antígenos de natureza incerta que iniciam
e perpetuam a resposta inflamatória. Lodi et al (2005) afirmam que este antígeno ainda
desconhecido quando apresentado às células T CD4 auxiliares e às células T CD8
citotóxicas ocasiona uma série de eventos imunológicos. Entre estes eventos destacam-se
a produção de citocinas pró-inflamatórias como o INFγ e o TNFα, o recrutamento e
migração de células T através do epitélio, expressão de moléculas de adesão celular como
as VICAM e ICAM-1, aumento na regulação de proteínas da MEC como o colágeno IV e
VII, laminina e integrinas, secreção de citocinas pelos ceratinócitos como IL-1, IL-8 e IL12, que também são quimiotáticas para linfócitos (SCULLY e CARROZZO, 2008). Estes
fatos culminam com a manutenção do processo inflamatório que tornam o LPO uma
doença crônica imunologicamente mediada.
Vários fatores estão implicados na proliferação e recrutamento das células Treg.
Wing e Sakaguchi (2010) afirmam que as células Treg são recrutadas ao local de
inflamação e então são ativadas, sendo responsáveis por suprimir células T auto-reativas e
consequentemente prevenir a autoimunidade. Já Kubo et al (2004) citam que as IL-6, IL-1
e IL-2 podem induzir um aumento significativo na proliferação das células Treg. Os
autores ainda afirmam que em circunstâncias nas quais a supressão pelas células Treg
encontra-se inibida, tipicamente nas respostas associadas com maturação e ativação das
células dendríticas (DC) pela via de receptores Toll-like (TLR), as células Treg são
induzidas a proliferar em paralelo com as células T CD4 näive, sofrendo então expansão
clonal e diferenciação em células efetoras. Estes fatores talvez possam explicar a maior
quantidade destas células encontradas nas lesões de LPO em comparação com as HFIs, já
que estas primeiras possuem mecanismos imunológicos que envolvem indução antigênica
permanente com conseqüente perpetuação da lesão.
Nosso estudo encontrou que a quantidade de células inflamatórias justaepiteliais
imunomarcadas para o FoxP3 nas lesões erosivas foi sensivelmente maior que nas lesões
80
reticulares, muito embora este resultado não tenha sido significativo estatisticamente.
Nossos achados divergem dos encontrados por Tao et al (2009), que em pesquisa
semelhante encontraram marcação positiva para FoxP3 em 86,9% da amostra utilizada,
verificando uma maior quantidade de células Treg FoxP3+ nas lesões reticulares (n = 7,
63,6 ± 23,2) que naquelas erosivas (n = 13, 28,8 ± 16,8). Os autores acrescentam que mais
estudos precisam ser feitos com relação aos mecanismos de recrutamento das células
Treg, os quais poderiam ajudar a entender a diferença na quantidade de células Treg
FoxP3+ entre as formas de LPO erosiva e reticular. Citam ainda que a densidade das
células FoxP3+ nas lesões foi negativamente correlacionada com a atividade da doença.
Em contrapartida, outros estudos realizados com doenças distintas, algumas delas
autoimunes, têm verificado o contrário, onde quanto maior a atividade da doença, maior o
número de células Treg encontrado (DE BOER et al, 2007b; LIN et al, 2007). Estes
achados poderiam estar relacionados aos nossos, uma vez que no LPO do tipo erosivo há
uma maior atividade da doença quando comparado com o reticular, o que poderia suscitar
um maior número de células Treg para controlar a resposta imune exacerbada.
Neste sentido, de Boer et al (2007b) investigaram a freqüência de células Treg
naturais nos diferentes estágios de desenvolvimento das lesões de aterosclerose em
humanos, através da imunomarcação com FoxP3 e GITR. Fragmentos de artérias normais,
lesões recentes, placas fibroescleróticas e placas de alto risco foram utilizadas e os valores
encontrados foram comparados com a contagem das células Treg em biópsias de tecido
normal e de lesões inflamatórias da pele (psoríase, dermatite espongiótica e líquen plano).
Nos fragmentos de vasos normais as células T estavam virtualmente ausentes e as lesões
de alto risco exibiram um aumento significativo de células Treg em comparação com as
lesões estáveis. Os valores médios das células FoxP3+ nas lesões ateroscleróticas foram
consideravelmente menores que nas lesões inflamatórias de pele. A baixa quantidade de
células Treg no tecido lesional da aterosclerose revela implicações clínicas e biológicas, já
que as células T e sua ativação são de grande importância no desenvolvimento da lesão de
aterosclerose e no início da síndrome coronária aguda, além disso, a presença das células
Treg parece ser capaz de diminuir o volume da placa in vivo. Dessa forma, entendemos
que alterações nas freqüências das células Treg, neste caso a diminuição, podem tornar o
tecido mais susceptível para o desenvolvimento de doenças com envolvimento
imunológico, como ocorreu com a aterosclerose.
81
Lin et al (2007) também correlacionaram positivamente a freqüência das células
+
CD4 FoxP3+ com a atividade da doença em pacientes com lúpus. Estes autores avaliaram
a quantidade de células FoxP3+ no sangue periférico de pacientes com lúpus eritematoso
sistêmico, observando sua freqüência absoluta e a sua freqüência entre as células T CD4+.
Os pacientes com lúpus exibiram uma freqüência maior de células FoxP3+ que o grupo
controle e a quantidade de células CD4+FoxP3+ estava associada à maior atividade da
doença. Estes achados mostraram que a freqüência de células Treg FoxP3+ encontra-se
alteradas nos indivíduos com lúpus ativo, sugerindo que a maior quantidade destas células
pode indicar uma maior fase de atividade da doença.
Em conformidade com os estudos citados, Charazinska-Carewicz et al (2008)
afirmam que o desequilíbrio numérico entre as subpopulações de linfócitos no LPO pode
ocasionar falhas nas funções supressoras. Conforme o LPO progride como doença e as
alterações
clínicas
se
intensificam
originando
a
forma
erosiva,
as
células
citotóxicas/supressoras predominam no infiltrado inflamatório local e diminuem no
sangue periférico. Dessa forma, as alterações observadas no sangue periférico são
secundárias à infiltração local pelas células mononucleares e dependem da forma clínica
do LPO, encontrando-se em menor quantidade nas lesões atróficas/erosivas que nas
reticulares. Diante disto, podemos supor que esse mecanismo que ocorre com as células
citotóxicas/supressoras pode ocorrer também com as células Treg, de modo que quando as
lesões de LPO são mais severas, as células Treg naturais se deslocariam do sangue para
juntamente com as células Treg induzidas infiltrar os tecidos, aumentando então a sua
quantidade em região justaepitelial.
Já de Boer et al (2007a) encontraram uma freqüência de células Treg FoxP3+
similar entre a pele normal e diferentes doenças de pele. Estes autores afirmam que as
células Treg FoxP3+ são facilmente detectáveis nestas doenças, dentre elas o líquen plano,
bem como em pele normal, ressaltando que existe variação na quantidade de células
imunomarcadas entre os diferentes tipos de tecidos. Eles investigaram a expressão do
FoxP3 e GITR em pele normal, reação de hipersensibilidade (dermatite espongiótica),
doença infecciosa (leishmaniose) além da psoríase e do líquen plano. Seus resultados
exibiram uma freqüência de FoxP3 menor que as demais somente na leishmaniose.
Todavia, estes resultados, segundo os autores, não indicam necessariamente que as células
Treg não estejam envolvidas na patogênese de qualquer uma das doenças estudadas.
82
Apesar de existirem divergências quanto aos achados dos estudos que
correlacionam a freqüência das células Treg com a atividade da doença, verificamos que
existe concordância no fato de que alterações na quantidade dessas células podem
influenciar o curso clínico da doença.
Com relação à diferença entre as quantidades de células Treg nas lesões erosivas
em comparação com as reticulares encontrada no nosso estudo, esta ainda pode ser
explicada por algum tipo de anormalidade funcional que iniba a função supressora destas
células. Vários estudos tentam elucidar e descrever mecanismos que inibem a função
supressora das células Treg (KUBO et al, 2004; PENG et al, 2005; YAN et al, 2008).
Com relação a estas alterações funcionais das células Treg, Peng et al (2005)
afirmam que algumas vias de sinalização ativadas nestas células podem inibir a função
supressora das mesmas. Em seu estudo, eles relatam que os TLRs são moléculas
responsáveis pelo reconhecimento de várias outras estruturas moleculares conhecidas
como padrões moleculares associados à patógenos, que permitem que os TLRs percebam
e iniciem respostas imunes inatas e adaptativas. Tais respostas são produzidas através da
maturação das DCs, evento este que permite que este tipo celular ative as células T näive
e tornem as células efetoras resistentes às células Treg. Estes autores comprovaram que a
via de sinalização do TLR–8 pode ser necessária e suficiente para a inibição da função
supressora das células Treg.
Neste sentido, o estudo de Kubo et al (2004) também mostra alguns mecanismos
que conduzem a uma perda de função pelas células Treg. Estes autores avaliaram as
atividades supressora e proliferativa das células Treg relacionando-as com a maturação e
ativação das DCs. Inicialmente os autores encontraram que a maturação e ativação das
DCs pela via do TLR inibiu a função supressora das células Treg. Os autores ainda
observaram que as IL-6 e IL-1 produzidas pelas DCs (induzidas pelo TLR) aumentaram a
capacidade de resposta proliferativa das células Treg. Todavia, independente do aumento
desta capacidade proliferativa, a IL-6 foi também relacionada com estímulos que tornaram
as células T CD4+CD25- efetoras resistentes à supressão pelas células Treg. Dessa forma,
ao mesmo tempo em que as citocinas pró-inflamatórias aqui citadas (IL-6 e IL-1) induzem
o aumento da capacidade proliferativa das células Treg, inibem a atividade supressora das
mesmas.
83
Yan et al (2008) ainda observaram em seu estudo que os pacientes com lúpus ativo
não tratado exibiram um número maior de células Treg CD4+CD25+FoxP3+ entre as
células CD4+, quando comparados com indivíduos saudáveis. Estes autores investigaram a
função supressora das células Treg em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico ativo.
De acordo com seus resultados, as células Treg se mostraram incapazes de inibir a
proliferação de células efetoras na presença de APCs de pacientes com lúpus, sugerindo
que a alta produção de IL-6 e TNFα pelas APCs poderia bloquear a atividade das células
Treg. Os autores ainda relataram que devido ao bloqueio das células Treg mediado pelas
APCs, verificou-se um aumento no número das células Treg adaptativas no esforço de
manter a homeostase imunológica. Este estudo nos mostra que apesar dos pacientes
exibirem uma quantidade aumentada de células Treg em comparação com os indivíduos
saudáveis, estas células se mostraram deficientes na sua função supressora. Diante disto,
podemos sugerir que a maior quantidade de células Treg encontradas nas lesões erosivas
nos nossos resultados, talvez seja uma tentativa do organismo de manter a homeostase
imunológica, já que estas células poderiam estar com sua função supressora
comprometida.
Costantino et al (2008) citam que a esclerose múltipla é uma doença caracterizada
por inflamação crônica do sistema nervoso central, cuja patogenia é atribuída a células T
efetoras auto-reativas. As células Treg antígeno-específicas possuem uma importância
considerável em conferir resistência genética contra a autoimunidade órgão-específica e
na limitação da injúria tecidual. Os autores afirmam que a freqüência de células Treg é
igual nos pacientes com esclerose múltipla e nos indivíduos saudáveis, mas sua função
nos primeiros pode estar diminuída, provavelmente por fatores genéticos ainda não
elucidados.
De acordo com Workman et al (2009) a produção de IL-10 pelas células Treg
constitui um dos seus mecanismos de supressão. Neste sentido, Heo et al (2010) avaliaram
se a IL-10, uma potente citocina antiinflamatória, exerce efeito supressor na ativação das
células Th17 pró-inflamatórias em indivíduos com artrite reumatóide. Verificou-se que o
tratamento com IL-10 diminuiu significativamente a quantidade de células Th17 e induziu
a produção de células Treg FoxP3+ na população T CD4+. Os autores ainda citam que a
expressão de IL-10 foi menor nas culturas de pacientes com artrite reumatóide do que nos
indivíduos saudáveis. Estes resultados nos sugerem que uma menor quantidade de IL-10
está relacionada a uma deficiência na capacidade supressora das células Treg, e que a IL-
84
10 produzida por estas células poderia ser empregada no futuro como um importante
agente terapêutico nestas doenças.
Neste sentido, Costantino et al (2008) afirmam que a terapia para a esclerose
múltipla deveria estar baseada em corrigir a origem da sua disfunção. Dessa forma, a
imunoterapia teria o propósito de modificar a resposta imune para prevenir ou tratar desta
doença. Os autores citam que as células Treg possuem potencial para controlar a
autoimunidade no sistema nervoso central e que a reversão da ausência de células Treg
funcionais seria um tipo de tratamento viável e produtivo. Uma vez que o conhecimento
sobre as células Treg em humanos se torne maior, esta área será um atrativo para a
intervenção imunoterapêutica, no objetivo de aumentar o número ou ainda a
funcionalidade destas células nos pacientes com esclerose múltipla.
Segundo Xu, Xu e Xu (2009) a esclerose múltipla é uma doença inflamatória,
iniciada e mediada por células T auto-reativas contra antígenos da mielina. Estes autores
investigaram a capacidade de um glicocorticóide (metilprednisolona) em afetar a atividade
das células Treg baseados na expressão do FoxP3 e de citocinas relacionadas. Seus
resultados mostraram uma quantidade reduzida de células T CD4+CD25+FoxP3+ e baixa
expressão do FoxP3 nos pacientes com esclerose múltipla quando comparados com os
indivíduos saudáveis, o que foi correlacionado com uma baixa capacidade supressora das
células Treg nestes pacientes.
Verificaram também que os pacientes tratados com o
glicocorticóide mostraram restauração da função e da freqüência das células Treg FoxP3+,
além de aumento na secreção de IL-10 por estas células. Diante destes resultados e de
outros citados na literatura, verificamos uma possível função terapêutica das células Treg
para o tratamento de doenças que apresentam comprometimento da função supressora das
células Treg, como pode ser o caso do LPO.
Diante do exposto, constatamos que as anormalidades funcionais das células Treg
além de comprometerem sua função, podem ocasionar aumento da sua proliferação numa
tentativa do organismo de conter a resposta inflamatória. Estas suposições podem se
aplicar ao nosso estudo, onde as células Treg apresentariam algum tipo de deficiência
funcional, e por isso sua freqüência estaria aumentada nas lesões com maior atividade,
como a forma erosiva do LPO.
Ainda com relação aos nossos resultados, verificou-se uma menor quantidade
absoluta de células Treg intraepiteliais imunomarcadas para o FoxP3 no LPO erosivo
85
tanto em comparação com o LPO reticular quanto com a HFI. Esse fato talvez possa ser
explicado pelo grau de atrofia epitelial encontrado nas lesões de LPO erosivo que é maior
que nas lesões reticulares (Brant, Vasconcelos e Rodrigues, 2008). A atrofia presente
principalmente no LPO erosivo causa uma diminuição na espessura do epitélio e
consequentemente um espaço menor susceptível à infiltração intraepitelial pelas células
Treg. A variação desta característica entre as lesões de LPO pode modificar a quantidade
do infiltrado inflamatório intraepitelial, dificultando assim uma mensuração confiável das
células Treg FoxP3+ nessa região. A HFI, por sua vez, é caracterizada por apresentar
hiperplasia e não atrofia, exibindo então maior espessura epitelial e maior susceptibilidade
para infiltração por estas células.
Este estudo avaliou a expressão do FoxP3 no infiltrado inflamatório justaepitelial e
intraepitelial dos diferentes tipos de LPO e HFI, verificando ainda diferenças na
imunomarcação desta molécula entre os tipos reticular e erosivo de LPO. Nossos
resultados exibiram uma diferença considerável na quantidade de células Treg FoxP3+ nas
diferentes lesões. Ademais, a quantidade de células Treg FoxP3+ exibiu variações de
acordo com o tipo clínico do LPO, sugerindo uma correlação entre estas células e o
comportamento biológico da doença.
Conclusões
87
7 CONCLUSÕES
De acordo com os resultados encontrados neste estudo podemos concluir que:
As células Treg FoxP3+ são encontradas no infiltrado inflamatório de ambas as formas
clínicas de LPO, bem como na HFI, todavia em maior quantidade no LPO, provavelmente
pela diferença existente na etiopatogênese destas lesões. Pode-se sugerir que os mecanismos
imunológicos envolvendo uma provável indução antigênica permanente e conseqüente
perpetuação da lesão, podem suscitar a proliferação e recrutamento constante das células Treg
no LPO, o que poderia explicar uma maior quantidade destas células nessa lesão. Já a HFI
possui etiologia associada a fatores traumáticos e/ou infecciosos, gerando nestas lesões
também um infiltrado inflamatório, porém qualitativamente distinto daquele visualizado no
LPO.
A forma erosiva do LPO exibiu um maior número de células Treg FoxP3+ no seu
infiltrado inflamatório que a forma reticular, de forma que esta diferença poderia estar
relacionada com a etiopatogenia do LPO, influenciando assim o desenvolvimento de suas
duas formas clínicas distintas. Sugere-se que as alterações na quantidade das células Treg
FoxP3+ observadas neste estudo podem ter relação com a atividade da doença, onde as lesões
de LPO do tipo erosivo, que apresentam uma fase de maior atividade, exibiriam um maior
número de células Treg no intuito de controlar a resposta imune exacerbada, ou de outro
modo, é possível também que estas células, mesmo em maior quantidade, possuam
anormalidades funcionais o que comprometeria sua função reguladora.
Finalmente, considerando-se a capacidade já estabelecida que as células Treg possuem
de modular as respostas imunológicas, juntamente com o grande potencial de regeneração que
a mucosa oral apresenta, ressalta-se que o desenvolvimento e a implantação de novas
estratégias imunoterapêuticas que regulem as freqüências e funções destas células talvez
possam futuramente auxiliar no tratamento de várias lesões inflamatórias mediadas
imunologicamente, entre elas o LPO.
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ZHENG, Y.; RUDENSKY, A.Y. Foxp3 in control of the regulatory T cell lineage. Nat
Immunol, v. 8, n. 5, p. 457-462, 2007.
Trabalho de acordo com as normas de documentação da Associação Brasileira de Normas
Técnicas – ABNT, a saber:
NBR 6023: Informação e Documentação – referências – elaboração, 2002;
NBR 6024: Informação e Documentação – numeração progressiva das seções de um
documento escrito – Apresentação 2003;
NBR 6027: Informação e Documentação – sumário – Apresentação 2003;
NBR 6028: Informação e Documentação – resumos – Apresentação 2003;
NBR 10520: Informação e Documentação – citação em documentos – Apresentação, 2002;
NBR 14724: Informação e Documentação – trabalhos acadêmicos – Apresentação, 2002.
Apêndices
APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
PARA LÍQUEN PLANO ORAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Este é um convite para você participar da pesquisa “ANÁLISE DE CÉLULAS T
REGULATÓRIAS FOXP3+ NO LÍQUEN PLANO ORAL”, que é coordenada pela Profª.
Drª. Márcia Cristina da Costa Miguel. Sua participação é voluntária, o que significa que você
poderá desistir a qualquer momento, retirando seu consentimento, sem que isso lhe traga
nenhum prejuízo ou penalidade. Essa pesquisa procura avaliar o perfil do infiltrado
inflamatório no líquen plano oral reticular e erosivo. Caso você decida aceitar o convite, não
irá passar por nenhum procedimento clínico ou cirúrgico, não havendo qualquer desconforto.
Apenas nos dará a oportunidade de manusear o material já recolhido durante biópsia realizada
previamente, para que possamos estudar as características do infiltrado inflamatório nos
diferentes tipos de líquen plano oral. Todas as informações obtidas serão sigilosas e seu nome
não será identificado em nenhum momento. Os dados serão guardados em local seguro e a
divulgação dos resultados será feita de forma a não identificar os voluntários.
Você terá o benefício de ter sua biópsia reexaminada por um grupo de pesquisadores
da área de patologia oral, e no caso de alguma mudança de diagnóstico perante a reavaliação,
terá a informação do novo diagnóstico do caso para que se procure ajuda especializada, caso
seja necessária. Você não será manipulado cirúrgica nem clinicamente, sendo assim, o risco
de sua participação nesse estudo é mínimo.
Se você tiver algum gasto que seja devido à sua participação na pesquisa, você será
ressarcido, caso solicite. Em qualquer momento, se você sofrer algum dano comprovadamente
decorrente desta pesquisa, você terá direito a indenização.
Você ficará com uma cópia deste Termo e toda a dúvida que você tiver a respeito
desta pesquisa, poderá perguntar diretamente para Profª Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel,
no Departamento de Odontologia da UFRN, no endereço Av. Sen. Salgado Filho, nº 1787 ,
Lagoa Nova, Natal – RN, ou pelo telefone (84)3215-4138. Dúvidas a respeito da ética dessa
pesquisa poderão ser questionadas ao Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN, localizado no
Campus Universitário da UFRN, ou pelo telefone (84)3215-3135.
Consentimento Livre e Esclarecido
Eu,
_______________________________________________________________,
declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será realizada, os riscos e
benefícios envolvidos e concordo em participar voluntariamente da pesquisa “ANÁLISE DE
CÉLULAS T REGULATÓRIAS FOXP3+ NO LÍQUEN PLANO ORAL”.
__________________________________________________________
Assinatura do Participante
_______________________________________________________________
Profª Dra Márcia Cristina da Costa Miguel
Pesquisadora Responsável
Av. Sen. Salgado Filho, nº 1787. Lagoa Nova, Natal/RN. CEP – 59056-000
Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN (Tel: 84-32153135)
APÊNDICE B – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
PARA HIPERPLASIA FIBROSA INFLAMATÓRIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Este é um convite para você participar da pesquisa “ANÁLISE DE CÉLULAS T
REGULATÓRIAS FOXP3+ NO LÍQUEN PLANO ORAL”, que é coordenada pela Profª.
Drª. Márcia Cristina da Costa Miguel. Sua participação é voluntária, o que significa que você
poderá desistir a qualquer momento, retirando seu consentimento, sem que isso lhe traga
nenhum prejuízo ou penalidade. Essa pesquisa procura avaliar o perfil do infiltrado
inflamatório na hiperplasia fibrosa inflamatória. Caso você decida aceitar o convite, não irá
passar por nenhum procedimento clínico ou cirúrgico, não havendo qualquer desconforto.
Apenas nos dará a oportunidade de manusear o material já recolhido durante biópsia realizada
previamente, para que possamos estudar as características do infiltrado inflamatório nos
diferentes tipos de líquen plano oral. Todas as informações obtidas serão sigilosas e seu nome
não será identificado em nenhum momento. Os dados serão guardados em local seguro e a
divulgação dos resultados será feita de forma a não identificar os voluntários.
Você terá o benefício de ter sua biópsia reexaminada por um grupo de pesquisadores
da área de patologia oral, e no caso de alguma mudança de diagnóstico perante a reavaliação,
terá a informação do novo diagnóstico do caso para que se procure ajuda especializada, caso
seja necessária. Você não será manipulado cirúrgica nem clinicamente, sendo assim, o risco
de sua participação nesse estudo é mínimo.
Se você tiver algum gasto que seja devido à sua participação na pesquisa, você será
ressarcido, caso solicite. Em qualquer momento, se você sofrer algum dano comprovadamente
decorrente desta pesquisa, você terá direito a indenização.
Você ficará com uma cópia deste Termo e toda a dúvida que você tiver a respeito
desta pesquisa, poderá perguntar diretamente para Profª Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel,
no Departamento de Odontologia da UFRN, no endereço Av. Sen. Salgado Filho, nº 1787 ,
Lagoa Nova, Natal – RN, ou pelo telefone (84)3215-4138. Dúvidas a respeito da ética dessa
pesquisa poderão ser questionadas ao Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN, localizado no
Campus Universitário da UFRN, ou pelo telefone (84)3215-3135.
Consentimento Livre e Esclarecido
Eu,
_______________________________________________________________,
declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será realizada, os riscos e
benefícios envolvidos e concordo em participar voluntariamente da pesquisa “ANÁLISE DE
CÉLULAS T REGULATÓRIAS FOXP3+ NO LÍQUEN PLANO ORAL”.
__________________________________________________________
Assinatura do Participante
_______________________________________________________________
Profª Dra Márcia Cristina da Costa Miguel
Pesquisadora Responsável
Av. Sen. Salgado Filho, nº 1787. Lagoa Nova, Natal/RN. CEP – 59056-000
Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN (Tel: 84-32153135)
APÊNDICE C - FICHA PARA COLETA DE DADOS
+
ANÁLISE DE CÉLULAS T REGULATÓRIAS FOXP3 NO LÍQUEN PLANO ORAL
Anticorpo: FoxP3 ( )
Espécime: LPO erosivo ( )
No do
LPO reticular ( )
HFI ( )
Localização Intraepitelial
Localização Justaepitelial
Quantidade de células por campo
Quantidade de Células por campo
Observações
caso
3
4
5
Média
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
Média
7
8
9
10
Média
2
Média
1
Anexos