título do resumo

EXPRESSÃO GÊNICA DO FATOR DE TRANSCRIÇÃO FOXP3 E CXCR4:
IMPLICAÇÕES NA PATOGÊNESE DO CÂNCER DE MAMA
Nathália de Sousa Pereira (IC/Fundação Araucária), Marla Karine Amarante,
Maria Angelica Ehara Watanabe (Orientadora), e-mail: [email protected].
Universidade Estadual de Londrina, Departamento
Patológicas, Centro de Ciências Biológicas (CCB)
de
Ciências
Ciências Biológicas III, Imunologia, Imunogenética
Palavras-chave: câncer de mama, FOXP3, CXCR4.
Resumo
Tem sido evidenciado que clones metastáticos de células tumorais possuem
aumento de receptores CXCR4. Células T regulatórias (Tregs) são capazes de
suprimir a resposta imune. Este subtipo de linfócitos T apresenta fator de
transcrição FOXP3. Tem sido também verificado que células tumorais podem
expressar o fator de transcrição FOXP3, levantando a possibilidade de que o
infiltrado de Tregs no tumor influencia na imunidade antitumoral e também que
as próprias células tumorais modulam as funções das células T através do
FOXP3. No presente trabalho não houve associação significativa entre a
expressão de FOXP3 e CXCR4 com os parâmetros clínicos. No entanto, foi
verificado que amostras de tecido de câncer de mama apresentaram maior
expressão gênica de FOXP3 e CXCR4 (7,112 ± 0,896 e 6,762 ± 0,997,
respectivamente) em relação ao RNA normal, indicando assim o envolvimento
destes genes na patogênese do câncer de mama.
Introdução
A importância mundial do câncer é inquestionável, uma vez que é a
segunda maior causa de mortes no mundo, seguida apenas das doenças
cardiovasculares. O câncer de mama é uma das neoplasias malignas mais
comuns em mulheres e é responsável por uma grande parcela de mortes
relacionadas ao câncer em todo o mundo. O INCA estimou cerca de 57.120
novos casos de câncer de mama para o ano de 2014 no Brasil (INCA/MS,
2014).
O fator 1 derivado de células estromais (SDF-1 ou CXCL12) é expresso
por diversos tipos celulares, como osteoblastos imaturos e células endoteliais
no interior da medula, bem como por células epiteliais em diversos órgãos
(NEIVA et al., 2005; SUN et al., 2010). Além de ser importante na migração
celular, a literatura tem indicado que esta quimiocina parece desempenhar um
1
papel na patogênese de tumores malignos, como no câncer de mama (DE
OLIVEIRA et al., 2004; DE OLIVEIRA et al., 2009).
O receptor CXCR4 (receptor de quimiocina (família CXC) 4) se liga
especificamente a quimiocina CXCL12 e foi demonstrado que esta interação
desempenha um importante papel no crescimento e na invasão tumoral
(MÜLLER et al., 2001).
A proteina forkhead Box 3 (FOXP3) é um fator de transcrição, cuja
função é exercida sobre regiões reguladoras específicas dentro do DNA,
aumentando ou suprimindo a transcrição de genes específicos. A proteína
FOXP3 é altamente expressa não só em células T reguladoras, mas também
nas células tumorais, atuando como um repressor transcricional de oncogenes
do câncer de mama. A expressão nas células tumorais de FOXP3 levanta a
possibilidade de que as próprias células malignas modulem as funções dos
linfócitos T através do fator de transcrição FOXP3, proporcionando um
potencial marcador prognóstico.
Dentro deste contexto, este estudo teve como objetivo elucidar os
aspectos moleculares a nível de expressão gênica do fator de transcrição
FOXP3 e receptor de quimiocina CXCR4 e suas possíveis implicações na
patogênese do câncer de mama.
Materiais e Métodos
Seleção de Amostras
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa de Seres
Humanos da Universidade Estadual de Londrina. Foram obtidas 57 amostras
de tecidos mamários tumorais e de tecido normal (adjacentes ao tumor) das
mesmas pacientes.
Obtenção de células do tecido mamário (RNA de tecido)
Os tecidos mamários tumoral e normal foram homogeneizados por
pinçamentos sucessivos em solução fisiológica. A partir destas células foi
obtido o RNA após adição de 500 µL de TRIzol-LS (Invitrogen, São Paulo, SP,
Brasil), segundo as instruções do fabricante. As amostras foram quantificadas
por espectrofotometria no aparelho NanoDrop ND-2000c (Uniscience).
Reação de Transcriição Reversa (RT-PCR)
A síntese de DNAc foi realizada a partir de 500ng de RNA e 1U de
transcriptase reversa (M-MLV RT; Invitrogen™, USA) a 42ºC por 60 minutos.
PCR Quantitativo em Tempo Real (qRT-PCR)
Foi utilizado o gene GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase)
como gene constitutivo e os genes de interesse foram o FOXP3 e CXCR4. A
reação foi realizada em triplicata e a temperatura de anelamento foi de 54ºC. A
2
reação de RT-PCR quantitativa foi realizada utilizando o fluoróforo
Platinum®SYBR Green qPCRSuperMix UDG (Invitrogen TM) e 0.25 µM dos
iniciadores.
Análise estatística
A análise estatística quanto a associação da expressão gênica com
parâmetros clínicos foi realizada utilizando-se o programa SPSS Statistics 17.0
(SPSS inc., Chicago, Illinois, USA). Para análise da expressão gênica utilizouse o programa GraphPad Prism versão 5.00 para Windows (GraphPad
Software, San Diego, California, USA, www.graphpad.com). Para todos os
dados o nível de significância adotado foi de p<0,05.
Resultados e Discussão
As pacientes com câncer de mama apresentaram: tamanho tumor 0,106,08 cm (2,40±1,33), subtipo histológico carcinoma ductal invasor (94,23%), a
maioria foram classificados como receptor hormonal positiva (90,38%) e
negativo para HER-2 (75,51%). Na análise de PCR quantitativo foi observada
aumento de expressão relativa de FOXP3 7,112 (± 0,896) e CXCR4 6,762 (±
0,997), respectivamente, Figura 1.
Figura 1 - Expressão gênica do CXCR4 e FOXP3. Quantificação do RNAm do CXCR4 e
FOXP3 foi realizada por PCR em tempo real em 31 amostras de tecido de tumor de mama e
amostra de RNA de tecido da glandula mamária normal. Para o cálculo foi utilizado a fórmula 2∆∆Ct (Livak; Schmittgen, 2001). Células MCF7 expressaram menor quantidade de FOXP3 e
CXCR4 em relação a média de expressão das pacientes.
Neste trabalho, não houve associação significativa entre a expressão de
FOXP3 e CXCR4 mRNA em relação ao receptor hormonal, HER-2 expressão,
3
a expressão da p53, metástase linfonodal, a expressão de Ki67, tamanho do
tumor e faixa etária.
Conclusões
Apesar de serem necessários estudos adicionais, os nossos resultados
sugerem que a expressão aumentada de FOXP3 e CXCR4 observada no
microambiente tumoral pode indicar o envolvimento destes genes na
patogênese do câncer de mama.
Agradecimentos
CNPq, Fundação Araucária e CAPES.
Referências
DE OLIVEIRA CAVASSIN, G. G. et al. Molecular investigation of the stromal
cell-derived factor-1 chemokine in lymphoid leukemia and lymphoma patients
from Brazil. Blood Cells, Molecules and Diseases, v. 33, n. 1, p. 90-3, Jul-Aug
2004.
DO VAL CARNEIRO, J. L. et al. Plasma malondialdehyde levels and CXCR4
expression in peripheral blood cells of breast cancer patients. Journal of Cancer
Research Clinical Oncology, v. 135, n. 8, p. 997-1004, Aug 2009.
FRIDMAN, WH; GALON, J; DIEU-NOSJEAN, MC; CREMER, I; FISSON, S;
DAMOTTE, D; PAGÈS, F; TARTOUR, E; SAUTÈS-FRIDMAN, C. Immune
Infiltration in Human Cancer: Prognostic Significance and Disease Control.
Current Topics in Microbiology and Immunology, v. 344, p. 1-24, May 2011.
INCA/MS. Estimate/2014 – Cancer Incidence in Brazil. Instituto Nacional de
Câncer José Alencar Gomes da Silva, Coordenação de Prevenção e Vigilância.
Rio de Janeiro, INCA: Ministério da Saúde. 2014. .
MULLER, A. et al. Involvement of chemokine receptors in breast cancer
metastasis. Nature, v. 410, n. 6824, p. 50-56, Mar. 2001.
OLIVEIRA, KB; ODA, JMN; NASSER, TF; FUJITA, TC; ONO, MA;
VOLTARELLI, JC; WATANABE, MAE. CXCL12 rs1801157 Polymorphism in
Patients with Breast Cancer, Hodgkin’s lymphoma and non-Hodgkin’s
lymphoma. Journal of Clinical Laboratory Analysis, v. 23, p. 387-393, 2009.
SUN, X. et al. CXCL12 / CXCR4 / CXCR7 chemokine axis and cancer
progression. Cancer Metastasis Reviews, v. 29, n. 4, p. 709-22, Dec. 2010.
4