título do resumo

PADRONIZAÇÃO DA ANÁLISE DO POLIMORFISMO RS3761548 DE FOXP3
EM MULHERES INFECTADAS PELO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV)
Nathália Tatakihara (UEL- IC/UEL), Guilherme César Martelossi Cebinelli,
Karen Brajão de Oliveira (Orientadora), e-mail: [email protected].
Universidade Estadual de Londrina/Departamento de Ciências Patológicas/
Londrina- PR
Ciências Biológicas, Imunologia, Imunogenética.
Palavras-chave: Câncer cervical, HPV, Tregs.
Resumo:
O câncer cervical é o terceiro tipo de câncer mais frequente entre
brasileiras. Os Papilomavírus Humano (HPV) são vírus da família
Papilomaviridae, tendo sido identificados mais de 100 tipos virais, os quais são
classificados de acordo com seu potencial carcinogênico em alto, baixo e risco
indeterminado. Considera-se que a persistência do papilomavírus humano
(HPV) é necessária para o desenvolvimento de neoplasia intraepitelial cervical
(NIC) 2 e 3 bem como o câncer cervical. Contudo sabe-se que a interação
entre tumor – hospedeiro é complexa, e sua compreensão implica no
entendimento do microambiente tumoral-imunológico. Neste microambiente
podemos destacar as células T regulatórias, que por meio da liberação de
citocinas inibitórias modulam a resposta imune no microambiente tumora. Os
resultados sugerem que o método de reação em cadeia da polimerase polimorfismo de fragmentos de restrição (PCR - RFLP) é bastante efetivo. Foi
possível otimizar a reação diminuindo a quantidade de reagentes utilizados.
Introdução
As estimativas para o câncer de colo de útero no Brasil, para 2014,
apontam para uma ocorrência de cerca de 15.590 novos casos (INCA 2014). O
Papilomavírus Humano (HPV) é considerado um importante agente
sexualmente transmissível (Taquette et al. 2004), uma vez que é transmitido
pelo contato com a pele ou mucosa infectada, preferencialmente durante as
relações sexuais e também pelo simples contato íntimo do casal. Já foram
identificados mais de 150 subtipos de HPV, dos quais 40 são conhecidos por
infectarem o trato anogenital, dando origem a verrugas genitais ou lesões
neoplásicas. A infecção por HPV de alto risco é considerada como o principal
fator causador do câncer cervical (Zur Hausen 2009). As células T regulatórias
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(Tregs) são uma população de células T que atuam na tolerância imunológica e
são moduladoras essenciais na resposta imune a patógenos, alérgenos,
células cancerígenas e antígenos próprios, uma vez que estas induzem a
supressão das células T efetoras, bloqueando sua ativação e função.
Deficiência no desenvolvimento ou na função das Tregs são as principais
causas de doenças autoimunes e inflamatórias em humanos e animais
(Sakaguchi et al. 2008; Melo and Carvalho 2009). As células Tregs CD4+
CD25+ expressam o gene regulador FOXP3. Este gene codifica um fator de
transcrição denominado forkhead transcription factor 3 (Fontenot et al. 2003;
Khattri et al. 2003; Coffer and Burgering 2004). Polimorfismos no gene FOXP3
podem levar a falta de funcionalidade das Tregs CD4+ CD25+, podendo causar
graves doenças autoimunes sistêmicas (Wildin et al. 2002; Ban et al. 2007).
Portanto este projeto teve como objetivo a padronização da genotipagem do
polimorfismo rs3761548 da região regulatória do gene FOXP3 através de
técnica de biologia molecular conhecida como reação em cadeia da polimerase
(PCR). Um fator de transcrição importante presente em células T regulatórias
(Tregs).
Materiais e métodos
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres
Humanos – Universidade Estadual de Londrina (CONEP-CAAE 0278.0.268.000-06). Este estudo consistiu de amostras de sangue periférico de
mulheres acima de 18 anos atendidas em programas de prevenção ao câncer
de colo de útero de unidades básicas de saúde (UBS), localizadas na região
Norte do Paraná. A padronização da análise do polimorfismo rs3761548 foi
realizada através da reação em cadeia da polimerase alelo específico e
também da reação em cadeia da polimerase seguida de clivagem por
endonucleases sítio específica (PCR-RFLP), seguindo a técnica descrita por
He et al, 2013 e modificando-a de acordo com as necessidades. Os fragmentos
amplificados para polimorfismo rs3761548 (de acordo com cada técnica) foram
analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida (10%) e corados com
Nitrato de Prata (AgNO3).
Resultados e Discussão
Observou-se baixa especificidade da metodologia PCR – alelo específico
na genotipagem do polimorfismo, pois quando feito a análise em pacientes
masculinos, em alguns casos, observou-se genótipo heterozigoto, não
condizendo com a localização gênica que é presente no cromossomo X e que
deveria ser hemizogoto para homens. Ainda, como a reação é realizada em
dois microtubos diferentes, observou-se diferenças de intensidade das bandas
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de mesmas amostras, deste modo, podendo ocorrer erros na visualização e
interpretação dos resultados.
Para metodologia PCR-RFLP, foram realizadas diversas reações,
adequando-as de acordo com a necessidade dos resultados. Inicialmente
foram realizadas 2 concomitantemente com a mesmas amostras. A reação 1 se
assemelhou ao protocolo utilizado por He et al, 2013 e a reação 2 foi
modificado para se assemelhar aos protocolos já padronizados no laboratório.
Resultou-se na amplificação do fragmento correto, porém o PCR foi
inespecífico, aparecendo bandas inespecíficas na eletroforese podendo
atrapalhar na visualização do genótipo após a clivagem enzimática. Assim,
como os resultados foram semelhantes escolheu-se modificar a reação 2 pois
utilizava menos reagentes. As reações 3 e 4 foram realizadas
concomitantemente, seguindo os padrões da reação 2, porém aumentando a
temperatura de anelamento em ambas, e adição de glicerol na reação 3.
Resultou-se que na reação 3 não ocorreu amplificação do fragmento e na
reação 4 ocorreu à amplificação, porém com a presença de bandas
inespecíficas. A reação 5 consistiu na modificação da reação 4, na qual,
diminuiu-se a concentração de cloreto de magnésio, porém resultou-se ainda
em uma reação inespecífica. A reação 6 consistiu na modificação da reação 5,
na qual, aumentou em 1ºC a temperatura de anelamento, apresentando ainda
reação inespecífica. Na reação 7 diminuiu-se a concentração dos primers,
resultando-se em uma reação específica, sendo ótima para a análise do
polimorfismo.
Para otimizar o PCR, na reação 8, diminuiu-se o consumo da Taq
polimerase e observou-se os mesmos resultados observados na reação 7.
Sendo empregada a reação 8 como sendo a mais otimizada para a avaliação
do polimorfismo.
Com a realização da análise do polimorfismo em amostras de pacientes,
em alguns casos em que a pureza da amostra estava baixa observou-se
inibição da reação de PCR por conta de contaminantes que estavam
interagindo principalmente com a enzima Taq polimerase, deste modo,
instituiu-se a reação 9, na qual empregou a utilização de BSA para amostras
que saiam negativas.
A padronização da restrição enzimática PCR-RFLP consistiu na alteração
da quantidade de enzima empregada na reação e o tempo de incubação. Na
realização dos diferentes protocolos testados os resultados obtidos foram
iguais, sendo escolhida a reação que demandava menos enzima e tempo.
Conclusões
Estes resultados sugerem que o método de PCR-RFLP é bastante
efetivo. A adição de BSA colaborou para diminuir os interferentes, e foi possível
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otimizar o PCR diminuindo a quantidade de reagentes utilizados na reação
para obter um mesmo resultado.
Agradecimentos
Ao CNPq, Fundação Araucária, CAPES e PROPPG-UEL.
Referências
Ban, Y., T. Tozaki, et al. (2007). "The regulatory T cell gene FOXP3 and genetic
susceptibility to thyroid autoimmunity: an association analysis in Caucasian and
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Coffer, P. J. and B. M. Burgering (2004). "Forkhead-box transcription factors
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HE, Y. Q. et al. FoxP3 genetic variants and risk of non-small cell lung cancer in
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Khattri, R., T. Cox, et al. (2003). "An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T
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Melo, K. M. and B. T. C. Carvalho (2009). "Células T regulatórias: mecanismos
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Sakaguchi, S., T. Yamaguchi, et al. (2008). "Regulatory T cells and immune
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Taquette, S. R., M. M. d. Vilhena, et al. (2004). "Doenças sexualmente
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Wildin, R. S., S. Smyk-Pearson, et al. (2002). "Clinical and molecular features of
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Zur Hausen H. (2009). “Papillomaviruses in the causation of human cancers - a
brief historical account.” Virology 384:260-265.
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