Efeito Nematicida de Extratos Aquosos de Sementes de Plantas

Comunicado 144
Técnico
ISSN 9192-0099
Brasília, DF
Setembro, 2006
EFEITO NEMATICIDA DE EXTRATOS AQUOSOS DE
SEMENTES DE PLANTAS SOBRE JUVENIS DE SEGUNDO
ESTÁDIO DE Meloidogyne incógnita
Thales Lima Rocha1
Aline Melro Murad23
Raphael Garcia de Sousa Evaristo3
Warley da Silva Almeida 3
José Cesamildo Cruz Magalhães 4
Maria Cristina da Silva Mattar 5
Maria Fátima Grossi-de-Sá 5
____________________________________________________________________________________________________________
Introdução
A interação nematóide-vegetal geralmente induz a diferenciação de focos celulares, provocando
a formação de galhas radiculares que reduzem severamente a produtividade. Nos casos mais
graves, esta patogenia conhecida como meloidoginose pode levar a morte da planta (DUFOUR
et al., 2006). A meloidoginose é provocada por fitonematóides do gênero Meloidogyne spp.
Estes fitoparasitas são cosmopolitas, possuem ampla disseminação, um alto poder destrutivo e
representam um severo problema para a agricultura brasileira e mundial (ABAD et al., 2003;
DUFOUR et al., 2006; AMARAL et al., 2002). As perdas provocadas a culturas como algodão,
café e cana-de-açúcar atingem patamares de US$ 4,1 bilhões, US$ 2,6 bilhões e US$ 16,5
bilhões, respectivamente (BALDWIN et al., 2004; VEECH e DICKSON, 1987).
As estratégias mais utilizadas no controle destes fitoparasitas têm sido o uso de variedades
resistentes, rotação de culturas e os nematicidas sintéticos (DUFOUR et al., 2006; AMARAL et
al., 2002; CHITWOOD, 2002; INSUNZA et al., 2001). A utilização de variedades resistentes é
uma maneira natural e bastante recomendável de controlar pragas e doenças. Porém, no caso
específico de fitonematóides, são poucas as variedades resistentes disponíveis para o agricultor
e, mesmo assim, a resistência geralmente é direcionada a umas poucas espécies de nematóides
considerados mais relevantes para certas culturas (DUFOUR et al., 2006; FERRAZ e FREITAS,
1
2
3
4
5
Biólogo, Ph.D., Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Graduanda em Biologia, Universidade Católica de Brasília (UCB)
Graduando em Biologia, Faculdades Integradas da Terra de Brasília (FTB)
Auxiliar de Operações 3, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Bióloga, Ph.D., Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
2004). Uma alternativa que tem se
de mais de 100.000 produtos naturais de
mostrado bastante atrativa está relacionada
baixo peso molecular conhecidos como
ao uso de plantas antagonistas em
substâncias vegetais/metabólitos
esquemas de rotação de culturas ou plantio
secundários (COELHO et al., 2006; DIXON,
consorciado. Algumas
2001). Existem inúmeros trabalhos
destas plantas fixam nitrogênio da
descritos na literatura sobre a utilização de
atmosfera e todas fornecem grandes
extratos de plantas como fontes em
volumes de matéria orgânica, aumentando
potencial de compostos nematicidas e
a atividade de fungos antagonistas e
nematostáticos, principalmente de folhas,
melhorando consideravelmente as
raízes e sementes (SILVA et al., 2002;
características do solo (DUFOUR et al.,
CHITWOOD, 2002). Esses efeitos têm sido
2006; FERRAZ e FREITAS, 2004). Embora
relacionados geralmente à presença de
esta estratégia propicie benefícios como a
lectinas e metabólitos secundários
diminuição de pragas e doenças,
(ÁLVAREZ, 1989; MOLAN et al., 2000).
normalmente os produtores se decepcionam
As lectinas são amplamente encontradas na
com os gastos extras, que reduzem
natureza, especialmente em leguminosas
significativamente os lucros esperados
(MARBAN-MENDONZA et al., 1987,
assim como a falta de aumento de
1992). Lectinas são proteínas ou
produção. O método mais utilizado
glicoproteínas que se ligam reversivelmente
atualmente no controle destes fitoparasitas
a um mono ou oligossacarídeo específico.
é a aplicação de nematicidas sintéticos.
Vários papéis biológicos são atribuídos as
Além de caros, esses produtos podem ser
lectinas, dentre eles as atividades
também detrimentais ao ambiente, à saúde
inseticida, fungicida e nematicida. As
humana e à organismos não alvo (DUFOUR
lectinas têm sido associadas ao bloqueio de
et al., 2006). Normalmente estes fazem
quimioreceptores de nematóides, o qual
parte de dois grupos predominantes: os
dificulta tanto a motilidade quanto a
fumigantes de solo que apresentam baixo
localização da planta por parte do parasita
peso molecular e os de contato constituídos
(MARBAN-MENDONZA et al., 1987).
por carbamatos ou organofosfatos
Metabólitos secundários são pequenas
(BAKKER, 1993; WHITEHEAD, 1997).
moléculas orgânicas que interagem
Conseqüentemente, pesquisas que levem à
diretamente com proteínas e outras
obtenção de métodos de controle mais
macromoléculas (TAIZ e ZIEGER, 2002) e
aceitáveis e viáveis ecologicamente tornam-
podem atuar como substratos, inibidores ou
se fundamentais. Reconhecidamente, as
ativadores alostéricos de uma enzima. Além
plantas são fontes de um espectro amplo
disso, podem ser precursores de alguma
molécula importante nas inúmeras rotas
do Laboratório de Interação Molecular
metabólicas celulares ou até mesmo um
Planta-Praga (LIMPP). Além disso, as
resíduo metabólico de alguma via de
informações obtidas poderão ser usada em
síntese ou degradação de macromoléculas
projetos de pesquisa na Embrapa Recursos
que por algum motivo é estocado e
Genéticos e Biotecnogia, visando a
utilizado como defesa química contra algum
obtenção de biomoléculas efetivas no
patógeno. Os metabólitos são mais comuns
controle de pragas da agricultura.
em plantas e fungos e podem atuar como
componentes estruturais, defesas contra
Materiais e Métodos
herbívoros e patógeno, atrativos para
polinizadores e agentes nas interações
Obtenção dos extratos aquosos:
interespecificas como alelopatia. (TAIZ e
As sementes das plantas foram cedidas
ZIEGER, 2002; CHALLIS e HOPWOOD,
pela Embrapa Sede. Para a obtenção dos
2003).
extratos aquosos, vinte gramas de
Dentre os metabólitos secundários
sementes de P. lunatus (semente branca,
destacam-se os polietienos encontrados em
vermelha e preta), S. lycocarpum, L.
Tagetes, isotiocianatos e glicosinolatos
auriculata e Phaseolus spp. foram trituradas
oriundos de Brassica e outros compostos
com auxílio de um triturador elétrico
isolados de diferentes famílias vegetais
Turrax. As sementes moídas foram
como glicosídeos cianogênicos, alcalóides,
homogeneizadas em 120 mL de água
terpenóides e compostos fenólicos (VIEIRA
destilada. Os extratos foram mantidos em
et al., 2001).
agitação lenta por 8 horas à 4ºC. Em
Tendo em vista a necessidade de se
seguida as amostras foram centrifugadas a
encontrar novas alternativas mais viáveis e
12000 rpm por 40 minutos à 4ºC em tubos
eficientes para o controle de
de polipropileno de 30 mL. Os
fitonematoides, o objetivo desse trabalho
sobrenadantes foram coletados e filtrados
foi testar a eficácia de extratos aquosos de
com filtro estéril descartável Milipore de
sementes de Phaseolus lunatus (semente
0,22 m. A conc
entração de proteínas dos
branca, vermelha e preta), Solanum
sobrenadantes foi determinada pelo método
lycocarpum (lobeira), Luetzelburgea
de Bradford (1976) utilizando BSA como
auriculata e Phaseolus spp, contra o
padrão. O perfil protéico dos extratos foi
fitonematóide Meloidogyne incognita. Os
determinado em SDS-PAGE 12% de acordo
resultados deste trabalho serão importantes
com Laemmli (1970).
para dar inicio a composição de um banco
de extratos e moléculas nematicidas dentro
Obtenção de Juvenis de segundo estádio:
de 3 mL por placa de Petri. As placas foram
A extração de ovos de M. incognita foi
mantidas a 26ºC e após 24 h os J2 mortos
realizada utilizando raízes de tomateiro
e vivos foram contados com o auxílio de
(Lycopersicum esculentum) infestadas.
microscópio estereoscópico e lâmina de
Essas raízes tiveram suas galhas
Peters. Os ensaios foram realizados em
seccionadas e trituradas em um
triplicata tendo como controle negativo
liquidificador contendo uma solução de
água destilada. A mortalidade dos J2 foi
hipoclorito de sódio 0,5% para a obtenção
certificada transferindo alguns dos juvenis
dos ovos, de acordo com a metodologia
tratados, aparentemente mortos, para uma
desenvolvida por Hussey e Barker (1973).
placa de Petri contendo água destilada e
Esses ovos foram colocados em uma
examinando-os após um período de cinco a
câmara de eclosão e, após 48 horas, os J2
seis horas (para verificar se os nematóides
foram contados utilizando microscópio
se reanimaram).
óptico e lâmina de Peters e posteriormente,
transferidos para placas de Petri de 5 cm
Resultados e discussão
de diâmetro, na proporção de 100
nematóides por placa, para a execução dos
Os extratos aquosos das sementes
testes biológicos.
apresentaram concentrações protéicas que
variavam de 6 a 15 µg/µL. O SDS-PAGE
Testes in vitro para avaliação da atividade
12% demonstrou a presença de muitas
nematicida dos extratos vegetais:
proteínas, com pesos moleculares entre 7
Para avaliar o efeito dos extratos de
kDa e 200 kDa. Adicionalmente, foi
sementes sobre a mortalidade dos
observada a existência de polimorfismo
nematóides, foi utilizado 500 µg de cada
entre os extratos aquosos das diferentes
extrato contra 100 J2 em um volume final
sementes analisadas (Figura 1).
Figura 1: SDS-PAGE 12% dos extratos vegetais. Foram aplicados ao redor de 30µg de amostra
em cada poço. M: marcador molecular; 1: P. lunatus (semente branca); 2: P. lunatus (semente
vermelha); 3: P. lunatus (semente preta); 4: S. lycocarpum; 5: L. auriculata; 6: Phaseolus sp.
Todos os extratos apresentaram efeito tóxico aos nematóides, entretanto, com
intensidades diferentes (Figura 2).
Figura 2: Análise do efeito nematicida de extratos aquosos de sementes de plantas contra J2
de M. incognita. Foram utilizados 500 µg de proteínas de cada amostra contra 100 nematóides
em um volume final de 3mL. 1: Controle (dH2O); 2: S. lycocarpum; 3: Phaseolus sp.; 4: L.
auriculata; 5:P. lunatus (semente branca); 6: P. lunatus (semente vermelha); 7: P. lunatus
(semente preta). Os testes foram realizados em triplicata.
A adição de 500 µg dos extratos aquosos
formação de galhas nas raízes (WALLACE,
nos bioensaios mostrou níveis mais altos de
1963). De acordo com Marban-Mendonza
atividade nematicida para L. auriculata,
et al., 1987 estas proteínas poderiam
com 100% de mortalidade, seguido por P.
também aumentar a resistência das plantas
lunatus (semente branca) com 68,5%
ao nematóide.
(figura 2). Vale ressaltar que a mortalidade
Apesar do grande número de trabalhos
foi confirmada transferindo-se os J2
publicados indicando a atividade de
aparentemente mortos para água e
diversos extratos contendo metabólitos
examinando-os após 6 horas. Depois deste
secundários, pouco se sabe a respeito das
período de tempo, não foi observada a
biomoléculas atuantes, muito menos sobre
recuperação da movimentação dos J2
o mecanismo de ação das mesmas. Isto
mesmo quando estimulados com auxílio de
reforça a necessidade de mais estudos na
um estilete.
área de prospecção de biomoléculas
O tipo de molécula ativa responsável pela
oriundas de fontes vegetais. Grande parte
mortalidade dos nematóides (protéico ou
dos trabalhos realizados visando à busca de
composto secundário) não foi identificado.
moléculas vegetais para o controle de M.
Existem relatos a cerca de extratos
incognita utiliza folha, caule ou então raízes
vegetais ricos em metabólitos secundários,
de plantas (CUNHA et al., 2003), poucos
peptídeos ou proteínas com atividade
são os que usam sementes. Essas são
nematicida (DEMUNER et al., 2003;
fontes de inúmeras substâncias, dentre elas
CHITWOOD, 2002; SILVA et al., 2002).
proteínas, carboidratos, lipídeos e
O efeito de lectinas (glicoproteínas) sobre
metabólicos secundários como alcalóides,
fitonematóides foi primeiramente estudado
compostos fenólicos, entre outros (MOLAN
por Zuckerman (1983) que constatou
et al., 2000; DEMUNER et al, 2003). A
bloqueio das reações do sistema
presença dessas substâncias em sementes
quimioreceptor de nematóides, alterando o
evidencia a relevância dos estudos de
quimiotropismo. A orientação e a migração
prospecção de possíveis moléculas ativas
dos fitonematóides para raízes de plantas
contra M. incognita utilizando essa fonte
dependem de vários fatores, dentre os
vegetal (SILVA et al., 2002).
quais a natureza dos exsudatos radiculares.
Os novos extratos aquosos apresentando
As lectinas poderiam modificar a
efeito nematicida gerados nesse trabalho de
constituição química do exsudato da planta
pesquisa serão depositados e ampliarão o
e com isso afetar a recepção dos estímulos
banco de extratos e substâncias vegetais
quimioreceptores dos juvenis, o que
recém estabelecido no LIMPP. Esses
explicaria a baixa penetração e posterior
resultados representam um avanço e são a
base para as atividades relacionadas à
prospecção de biomoléculas efetivas no
controle de nematóides fitopatogênicos que
constitui uma das principais linhas de
pesquisa dentro dos projetos do LIMPP.
Espera-se que as informações e dados
obtidos nesse e nos trabalhos anteriores
sejam, no futuro, a base para a implantação
da plataforma tecnológica de engenharia de
metabolismo na Embrapa. Essa plataforma
possibilitará não somente entender a rota
de síntese e produção das moléculas
nematicidas, mas também regular a
produção destas em plantas relevantes para
a agricultura.
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