AULA-P8-B2 Corpos cetónicos _09

Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
Ano Lectivo 2009/2010
Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II
Mestrado Integrado em MEDICINA
1º Ano
ENSINO PRÁTICO E TEORICO-PRÁTICO
8ª AULA PRÁTICA
Determinação da concentração plasmática de corpos cetónicos (β
β -hidroxibutirato)
CORPOS CETÓNICOS
A
designação
“corpos
cetónicos”
engloba
2 compostos:
acetoacetato e β-
hidroxibutirato.
O acetoacetato e o β-hidroxibutirato são moléculas hidrossolúveis, formadas no fígado,
podendo ser utilizadas por outros orgãos (músculo, rim) como uma importante fonte de
energia. Estes compostos são ácidos e causam cetoacidose quando a sua concentração se
encontra em excesso no sangue circulante.
Os corpos cetónicos são formados a partir de acetil-CoA (figura 1) produzido na etapa
final do processo da β-oxidação dos ácidos gordos, que ocorre em condições de jejum
prolongado (fome) ou na Diabetes Mellitus. A formação de corpos cetónicos também pode
ocorrer como resultado da degradação de aminoácidos, que podem originar acetil-CoA (Thr,
Lys, Ile, Try), HMG CoA (Leu) ou acetoacetato (Phe, Tyr). Assim, a nível hepático, forma-se
acetoacetato, que se converte em D-3-hidroxibutirato (β-hidroxibutirato), na presença de
NADH, por acção da enzima mitocondrial D-3-hidroxibutirato desidrogenase, num equilíbrio
que depende do estado redox da célula, i.e., da razão NAD+/NADH. Acetoacetato e βhidroxibutirato são interconvertíveis. No sangue, a razão [β-hidroxibutirato]/[acetoacetato]
varia numa proporção de 1:1 a 10:1. A concentração total de corpos cetónicos normal no
sangue de animais bem-nutridos não excede 0,2 mmol/L. Nos humanos, a excreção urinária
é normalmente inferior a 1 mg/24h. A descarboxilação espontânea (não enzimática) do
acetoacetato gera acetona, que é volátil e é eliminada pelos pulmões (hálito “cetónico”).
Os corpos cetónicos podem ser oxidados nos tecidos extra-hepáticos, por conversão
em acetil-CoA, com o objectivo de formar ATP, proporcional à sua concentração no sangue,
até cerca de 12 mmol/L. A ocorrência de cetonémia está geralmente associada a um
aumento da produção de corpos cetónicos pelo fígado, mas experiências em ratos aos
quais foi removido o pâncreas demonstraram que a cetonémia associada à Diabetes
Mellitus pode aumentar também devido a uma redução na capacidade de catabolismo dos
corpos cetónicos. Se, por um lado, o acetoacetato e o β-hidroxibutirato são facilmente
oxidados pelos tecidos extra-hepáticos, a acetona é dificilmente oxidada, sendo volatilizada
ao nível dos pulmões, o que explica o hálito cetónico característico das situações de
hipercetonémia.
O metabolismo dos corpos cetónicos encontra-se esquematizado na figura 2.
1
2 AcetilCoA
Acetoacetil-CoA sintetase
AcetoacetilCoA
HMG-CoA sintetase
β-Hidroxi-β-metilglutaril-CoA (HMG-CoA)
HMG-CoA liase
NADH+H+
Acetoacetato
CO2
+
β -hidroxibutirato
NAD
Acetona (propanona)
Figura 1- Formação dos corpos cetónicos (fígado).
Fígado
Acil-CoA
Glucose
Sangue
Tecidos
Extrahepáticos
Ácidos gordos
livres
URINA
Acil-CoA
Glucose
Acetil-CoA
Acetil-CoA
Corpos
cetónicos
Ciclo de
Krebs
Corpos cetónicos
Corpos
cetónicos
Acetona
PULMÕES
Ciclo de
Krebs
Figura 2- Metabolismo dos corpos cetónicos (fígado, sangue e tecidos periféricos):
2
Determinação da concentração plasmática de β -hidroxibutirato:
Fundamento do método enzimático colorimétrico (espectrofotometria):
Por acção da enzima 3-hidroxibutirato desidrogenase (3-HBDH), o D-3-hidroxibutirato
+
(ácido D-3-hidroxibutírico) é oxidado a acetoacetato na presença de NAD (nicotinamida
adenina dinucleótido). Por acção da diaforase, o NADH formado, na presença de uma
solução de cloreto de iodonitrotetrazolium (INT), origina um complexo corado (formazan)
que apresenta um pico de absorção máxima a 492 nm e cuja absorvância é directamente
proporcional à concentração de β-hidroxibutirato presente na amostra inicial (aplicação da
Lei de Beer-Lambert).
3-Hidroxibutirato desidrogenase
+
Acetoacetato + NADH + H+
D-3-hidroxibutirato + NAD
Diaforase
+
NAD+ + formazan
NADH + INT + H
NOTAS IMPORTANTES:
1- Neste ensaio, as amostras túrbidas deverão ser filtradas e só as amostras límpidas
deverão ser usadas.
2- O pH das amostras ácidas deverá ser ajustado a pH 8 com NaOH ou KOH.
3- As amostras que contêm proteínas deverão ser desproteinizadas com uma solução de
ácido perclórico (HClO4)
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Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II, Mestrado Integrado em MEDICINA, 2009/2010
PROTOCOLO DE BANCADA - 8ª AULA PRÁTICA
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE CORPOS CETÓNICOS (β
βHIDROXIBUTIRATO)
Grupos 1 a 4
1- Amostra de plasma desproteinizado.
3 ml de sangue colhido em EDTA (anticoagulante) foi centrifugado durante 10 minutos a
2.000 rpm. Retirou-se 1 ml de plasma e adicionou-se 4 ml de ácido perclórico a 0,7 M e 2 ml
de solução contendo 0,4 M KOH, 0,13 M K2CO3 e 0,5 M Tris. Agitou-se a mistura e
centrifugou-se durante 15 minutos a 3.000 rpm a uma temperatura de 4ºc. Recolheu-se o
sobrenadante e desperdiçou-se o sedimento proteico.
2- Ensaio para a determinação de β -Hidroxibutirato:
Solução 1: Tampão fosfato potássio/trietanolamina (pH 8,6), Triton X-100
Solução 2: Diaforase (1,6 U/ml), NAD+ (11,2 mg/ml)
Solução 3: Cloreto de iodonitrotetrazolium – o INT é sensível à luz manter no escuro.
Solução 4: 3-Hidroxibutirato desidrogenase (15U/ml)
Reagentes
Amostra
Branco
Solução 1
300 µl
300 µl
Solução 2
100 µl
100 µl
Solução 3
100 µl
100 µl
Amostra *
30 µl
--
Àgua destilada
970 µl
1000 µl
* Plasma desproteinizado
Procedimento:
- Adicionar na cuvette as soluções referidas no quadro, incluindo a amostra, de modo a
prefazer 1,5 ml; misturar;
- Após 2 minutos, ler a DO da mistura (DO1) a 492 nm;
- Adicionar 25 µl da solução 4 (3-hidroxibutirato desidrogenase) à cuvette;
- Misturar e aguardar 20 minutos (reacção) no escuro; ler a DO a 492 nm (DO2).
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Cálculos: De acordo com a equação geral para o cálculo de concentrações:
V x PM
x ∆DO , em que
C=
ε x d x v x 1000
C = concentração,
V = volume final (ml)
v = volume de amostra (ml)
PM = peso molecular da substância (g/mol)
d = distância, em cm, percorrida pelo feixe de luz (largura da cuvette cm, geralmente 1 cm)
ε=coeficiente de extinção molar do formazan a 492nm: 19,9 mM .cm
-1
-1
∆DO = DO2 – DO1
Então,
1,525 (ml) x 104,1 (g/mol)
[β
β -hidroxibutirato] (g/l) =
X
-1
∆DO X F
-1
19,9 (l x mmol x cm ) x 1 (cm) x 0,030 (ml) x 1000
F = factor de diluição (7)
Valores normais: negativo, < 2,1 g/l, < 0,020 mM ou < 1mg/100 ml (sangue)
Interferências e fontes de ferro:
1)
O uso de soluções fora do prazo de validade ou de reagentes (diaforase, NAD ou INT)
mantidos à temperatura ambiente por um período superior a 1 hora podem retardar a
reacção.
2)
O INT é sensível à luz.
3)
Altas concentrações de agentes redutores como o ácido ascórbico, o ácido sulfuroso,
ou fontes de ferro (Fe2+) interferem com o método, pois reagem facilmente com o INT.
Neste caso, as amostras deverão ser pré-tratadas com peróxido de hidrogénio (H2O2) como
agente oxidante.
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