desenvolvimento de protocolos para micropropagação de espécies

DESENVOLVIMENTO DE PROTOCOLOS PARA MICROPROPAGAÇÃO DE ESPÉCIES
DE BROMELIACEAE
Eldelon de Oliveira Pereira, Ester Ujiie Nogueira, Matheus Fonseca de Souza,
Simone Paiva Caetano, Andreia Barcelos Passos Lima
Universidade Federal do Espírito Santo/Departamento de Produção Vegetal, Alto Universitário s/n,
Guararema, Alegre, ES, [email protected], [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected]
Resumo- Este trabalho foi executado no Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Campus de Ciências
Agrárias da UFES, visando o desenvolvimento de protocolos para estabelecimento e propagação in vitro de
bromélias nativas do Distrito de Burarama, Município de Cachoeiro do Itapemirim, ES. O principal problema
para o desenvolvimento desta técnica é a contaminação fúngica e bacteriana dos explantes provenientes do
campo, exigindo um tratamento eficiente para descontaminação. Foram testados ápices caulinares, gemas,
segmentos foliares e base de folhas de plantas mantidas em casa de vegetação, na presença de 1 mg/L de
ANA e BAP, porém devido ao alto índice de contaminação, optou-se por utilizar plantas germinadas in vitro
como doadoras de explantes. Obteve-se a germinação e estabelecimento in vitro de Ananas macrodontes,
Canistropsis billbergioides e Pitcairnia flammea, que podem ser plantas doadoras de explantes sadios. Foi
observada indução de organogênese indireta nas concentrações de 1 e 4µM de ANA combinadas com 4µM
de BAP em A. macrodontes.
Palavras-chave: Bromeliaceae, contaminação, germinação in vitro.
Área do Conhecimento: Ciências agrárias
Introdução
Bromeliaceae é a maior família das
angiospermas, quase exclusivamente neotropical,
presente desde o Sul da América do Norte até a
Patagônia (Argentina) (WANDERLEY et al., 2007).
São encontradas nas mais variadas condições de
altitude, temperatura e umidade e apresentam
sofisticadas adaptações ao hábito epifítico,
podendo ser epífitas obrigatórias ou facultativas
(BENZING, 2000). Muitas de suas espécies são
também terrícolas, saxícolas ou rupícolas, e foi
registrado o fato de também vegetarem em solos
sujeitos a inundações periódicas (SCARANO et
al., 1997). O grande interesse pelas bromélias
pode ser explicado pela sua aparência exótica e
bela, característica importante para o paisagismo
e a comercialização de artigos ornamentais, e por
sua rusticidade, não precisando de muitos
cuidados para garantir sua sobrevivência
(CARVALHO, MERCIER, 2005); isso torna essas
plantas de fácil manejo e utilização em pesquisas.
As bromélias apresentam elevado grau de
importância ecológica nos ecossistemas onde se
inserem e afetam muitos aspectos do ecossistema
que habitam. Contribuem para sustentabilidade da
diversidade do ecossistema, atuam como
indicadores globais de mudanças climáticas, além
de fornecer ao homem matéria-prima para a
horticultura, para fins medicinais e valor
econômico (NADKARNI, 1991).
Podem ser propagadas de forma sexuada ou
assexuada. Na propagação assexuada, ou
vegetativa, formam-se brotos a partir da planta
mãe, que podem sair da base da planta por
estolhos ou rizomas, ou do interior da própria
roseta. O processo sexual envolve a formação de
sementes, das quais podem ser obtidas grandes
quantidades de plântulas (RAUH, 1979). A
propagação vegetativa de bromélias é muito lenta,
uma vez que poucos brotos laterais são
produzidos por planta (KOH, DAVIES, 1997). A
propagação in vitro tem demonstrado grande
potencial em relação às técnicas convencionais
como redução do tempo, espaço e custos
(GRATTAPAGLIA,
MACHADO,
1999).
Os
explantes
utilizados
nos
protocolos
de
micropropagação de bromélias são variados.
Plântulas in vitro foram usadas como material
inicial, em algumas espécies de Tillandsia
Linnaeus (MEKERS, 1977; KOH, DAVIES, 2001) e
em Dyckia distachya Hassler (POMPELLI,
GUERRA, 2005). Alternativamente, outras fontes
de explantes foram usadas, como folhas
(MERCIER,
KERBAUY,
1992),
estolões
(CARNEIRO et al., 1999) meristemas intercalares
(KOH, DAVIES, 1997) e brotos estiolados
(PEREIRA et al., 2001).
XIII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e
IX Encontro Latino Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba
1
A germinação de sementes in vitro de algumas
bromélias já vem sendo relatada na literatura, com
resultados diferenciados entre as espécies
(POMPELLI et al., 2001; ARANDA-PERES, 2005).
Além disso, o cultivo in vitro de sementes pode ser
considerado uma técnica de grande importância
na conservação de germoplasma de bromélias
ameaçadas de extinção, visto que a emergência
da planta ocorre em um tempo mais reduzido,
quando comparado ao processo natural, além de
um número muito maior de sementes germinarem
(MERCIER, KERBAUY, 1997). Um dos princípios
básicos para o sucesso da Cultura de Tecidos
depende, em parte, de medidas de controle e
prevenção da contaminação microbiana (LEIFERT
et al., 1994; SILVA et al., 2003). A assepsia do
material vegetal é de fundamental importância na
micropropagação e, sendo efetuada com sucesso,
evitará contaminação no meio de cultura por
fungos e bactérias, que ocasionam perdas do
material vegetativo e do meio de cultura
(RODRIGUES et al., 2003). Os microrganismos
contaminantes competem com os explantes pelos
nutrientes do meio de cultura, eliminando no meio
metabólitos tóxicos, podendo ocasionar a morte
das plântulas (PEREIRA et al., 2003). Portanto, o
desenvolvimento
de
protocolos
de
descontaminação de explantes de Bromeliaceas
pela técnica de cultura de tecidos, é de grande
importância, pois constitui um recurso útil na
micropropagação. A utilização de plantas
germinadas in vitro como doadora de explantes é
uma
estratégia
viável
nos
ensaios
de
micropropagação, pois garante a obtenção de
plantas assépticas e explantes sadios para
introdução no cultivo in vitro.
O objetivo desse trabalho foi desenvolver
protocolos para a desinfestação de explantes de
bromélias nativas, visando a micropropagação e
seu estabelecimento em cultivo in vitro
Metodologia
O experimento foi conduzido no Laboratório de
Biotecnologia Vegetal do Centro de Ciências
Agrárias da Universidade Federal do Espírito
Santo (CCA-UFES), localizado no município de
Alegre – ES.
Foram utilizadas espécies de bromélias
identificadas e coletadas no distrito de Burarama,
situado no município de Cachoeiro de ItapemirimES.
Quanto à utilização do material vegetal para
obtenção de explantes, foram adotadas duas
estratégias de trabalho: plantas coletadas no
campo e mantidas em casa de vegetação e
sementes obtidas de indivíduos da região de
trabalho, que foram secas em estufa e mantidas
na geladeira até o uso.
Ápices caulinares, gemas e segmentos foliares
de plantas mantidas em casa de vegetação
(espécies Canistropsis billbergioides e Pitcairnia
flammea) foram lavados em água corrente e
detergente comercial, imersos em álcool 70% por
3 minutos e transferidos para o hipoclorito de
sódio a 2,5% + tween 20 por 15 minutos, sob
agitação. Na capela de fluxo laminar os explantes
foram imersos em álcool 70% por 1 minuto,
hipoclorito de sódio a 2% por 5 minutos e
enxaguados 3 vezes em água destilada e
autoclavada.
Em um primeiro experimento foram utilizados
segmentos de folhas (30 explantes), gemas (10
explantes) e meristemas (4 explantes) cultivados
em meio MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962)
acrescido de ANA (1 mg/L), BAP (1 mg/L),
-1
sacarose (30g) e Ágar (7g.L ). Os explantes foram
mantidos na sala de cultivo nas condições de claro
e escuro.
O segundo experimento foi realizado nas
mesmas condições do primeiro, utilizando como
explantes apenas as bases das folhas visando a
diminuição da porcentagem de contaminação.
Foram utilizados 40 segmentos de base de folhas
cultivados nas condições de claro e escuro.
Na tentativa de reduzir a contaminação
proveniente
do
campo
foram
iniciados
experimentos utilizando explantes provenientes de
plântulas germinadas in vitro.
Foram realizados ensaios com três espécies de
Bromeliaceae: Ananas macrodontes, Canistropsis
billbergioides e Pitcairnia flammea.
Sementes de A. macrodontes foram imersas
em álcool 92,8% por 1 minuto e em seguida
transferidas para hipoclorito de sódio a 2,5% por 5
minutos, sob agitação. Na capela de fluxo laminar
as sementes foram enxaguadas 3 vezes em água
destilada e autoclavada. As sementes foram
inoculadas em meio MS (MURASHIGE, SKOOG,
-1
1962) acrescido de sacarose (30g) e ágar (7 g.L ).
As plântulas germinadas in vitro serviram como
doadoras de explantes para um experimento
realizado com base e segmentos de folhas. Neste
experimento foram utilizadas diferentes doses de
ANA (0; 0,5; 1; 2 e 4 µM) e uma dose constante de
BAP (4µM), constituindo 5 tratamentos, sendo 4
repetições de 3 tubos, totalizando 12 tubos por
tratamento para cada explante testado. Foi
utilizado o meio MS (MURASHIGE, SKOOG, 1962)
nas mesmas condições do experimento anterior.
Após a inoculação os explantes permaneceram na
condição de escuro.
Sementes
de
C.
billbergioides
foram
desinfestadas como descrito anteriormente e em
seguida embebidas em água destilada por 4 horas
e na capela de fluxo laminar repetiu-se a
desinfestação inicial, seguido de tríplice enxágüe
com
água
destilada
e
autoclavada
e
XIII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e
IX Encontro Latino Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba
2
posteriormente
inoculação
em
meio
MS
(MURASHIGE, SKOOG, 1962).
Para as sementes de P. flammea houve a
necessidade inicial de se testar diferentes
tratamentos de desinfestação. Foram realizados 6
tratamentos com 4 repetições, 3 tubos por
repetição e 3 sementes por tubo (216 sementes).
Os tratamentos estão descritos a seguir: 1 minuto
em ácool 92% e 5 minutos em hipoclorito 1%; 1
minuto em ácool 92% e 10 minutos em hipoclorito
1%; 1 minuto em ácool 92% e 5 minutos em
hipoclorito 2%; 1 minuto em ácool 92% e 10
minutos em hipoclorito 2%; 1 minuto em ácool
92% e 5 minutos em hipoclorito 3%; 1 minuto em
ácool 92% e 5 minutos em hipoclorito 3%.
Após a desinfestação, as sementes foram
inoculadas em meio MS (MURASHIGE, SKOOG,
-1
1962) acrescido de sacarose (30g) e Ágar (7 g.L ).
Resultados
Inicialmente
foram
utilizados
gemas,
meristemas e segmentos foliares nos ensaios de
indução de organogênese na presença de BAP e
ANA e avaliada a porcentagem de contaminação
bacteriana. A inoculação foi realizada em 10
gemas no claro, 10 gemas no escuro, 30
segmentos foliares no claro e 30 no escuro, 4
meristemas no claro e 4 no escuro. Na condição
de claro houve 100% de contaminação. Na
condição de escuro, 50% dos explantes foliares
não apresentaram contaminação.
No segundo experimento utilizando 40
explantes de base foliar, na condição de claro e
escuro.
No
claro,
15%
dos
explantes
apresentaram contaminação bacteriana e no
escuro apenas 10%.
Para A. macrodontes foram inoculadas 32
sementes,
obtendo
87,5%
de
sementes
germinadas, em aproximadamente 30 dias. As
plântulas de C. billbergioides foram germinadas
apenas em condição de claro. Após 30 dias de
inoculação, as sementes mantidas na condição de
escuro foram transferidas para a condição de claro
e todas também germinaram. As sementes de P.
flammea, apresentaram 100% de geminação.
Figura 1 – Calos e brotações em base foliar de A.
macrodontes. A – 4µM de ANA com 4µM de BAP
B – 1µM de ANA com 4µM de BAP. Barra=1cm.
Figura 2 – Germinação de Bromeliaceae em meio
MS. A - A. macrodontes. B – P. flammeae var.
cuspidata. C – C. billbergioides. Barra=1cm.
Discussão
Foram inoculados 10 gemas no claro, 10
gemas no escuro, 30 segmentos foliares no claro
e 30 no escuro, 4 meristemas no claro e 4 no
escuro. Na condição de claro houve 100% de
contaminação. Na condição de escuro, 50% dos
explantes
foliares
não
apresentaram
contaminação. Nesta mesma condição, as gemas
e meristemas não apresentaram sinais de
contaminação, entretanto, pôde-se notar sinais de
necrose tecidual.
Posteriormente foi realizado um segundo
experimento utilizando 40 explantes de base foliar,
na condição de claro e escuro. No claro, 15% dos
explantes apresentaram contaminação bacteriana
e no escuro apenas 10%.
As menores taxas de contaminação foram
alcançadas sob condição de escuro, com
explantes foliares cultivados na presença de ANA
(1 mg/L) e BAP (1 mg/L).
Com a utilização de explantes de base foliar
houve redução na taxa de contaminação, apesar
de não apresentarem respostas morfogênicas in
vitro.
Provavelmente, deva existir algum tipo de
influência
dos
agentes
descontaminantes
utilizados neste trabalho sob o desenvolvimento in
vitro de explantes de bromélias.
Objetivando
reduzir
os
índices
de
contaminação e tentar induzir o desenvolvimento e
XIII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e
IX Encontro Latino Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba
3
diferenciação celular in vitro de Bromeliaceae,
foram
utilizados
explantes
de
plântulas
germinadas in vitro das três espécies estudadas.
Para A. macrodontes foram inoculadas 32
sementes,
obtendo
87,5%
de
sementes
germinadas, em aproximadamente 30 dias. No
entanto, o padrão de germinação foi desuniforme.
As plântulas obtidas neste experimento foram
doadoras de explantes para ensaios de indução
de organogênese.
Foram utilizados como explantes base e
segmentos de folha cultivados na presença de
ANA e BAP, sendo mantidos na condição de
escuro. Após 57 dias de cultivo, como os
explantes
não
apresentaram
respostas
morfogênicas, os mesmos foram transferidos para
a condição de claro.
Foi observada indução de organogêse indireta
apenas nas concentrações de 1 e 4 µM de ANA e
4 µM de BAP. Foi verificado o início de
diferenciação celular com a emissão de brotos
(FIGURA 1).
Plântulas de C. billbergioides foram germinadas
apenas em condição de claro. Após 30 dias de
inoculação, as sementes mantidas na condição de
escuro foram transferidas para a condição de claro
e todas também germinaram.
As sementes de P. flammea foram inicialmente
submetidas
a
diferentes
tratamentos
de
desinfestação.
Todos
os
tratamentos
se
mostraram eficientes na desinfestação, não
diferindo estatisticamente e garantindo 100% de
germinação.
Segundo Steward (1958), citado por Murashige
(1974), o desenvolvimento in vitro de algumas
espécies vegetais, como Dacus carota L.,
Asparagus officinalis L., orquídea, gérbera e
bromélias,
é
bastante
influenciado
pela
consistência do meio de cultura. A utilização do
meio líquido é considerado economicamente mais
viável para uma propagação em massa
(TAUTORUS, DUNSTAN, 1995). Segundo Caldas,
Haridasan, Ferreira (1990), o meio semi-sólido tem
a propriedade de impor restrições à velocidade de
difusão de nutrientes em relação ao meio líquido,
causando deficiência nutricional das plantas.
Embora não tenha sido obtido sucesso com a
utilização de explantes retirados de plantas vindas
do campo e mantidas em casa de vegetação, foi
possível a germinação e estabelecimento in vitro
de espécies de Bromeliaceae que podem ser
utilizadas como plantas doadoras de explantes
sadios (FIGURA 2).
A
manutenção
in
vitro
assegura
o
armazenamento de germoplasma e é vantajosa
inclusive por proporcionar uma alta taxa de
multiplicação, a produção de plantas saudáveis, e
a representação de grande variedade de
genótipos em espaços reduzidos (ENGELMANN,
1991). Neste caso, o cultivo in vitro a partir de
sementes é aconselhado também por gerar um
grande número de plantas-matrizes, evitando a
retirada de indivíduos da natureza, o que agravaria
o grau de ameaça sobre estas espécies. Outra
vantagem decorre da maior facilidade na
desinfestação de sementes quando comparadas
com tecidos extraídos de plantas nativas
(MERCIER, KERBAUY, 1994).
Conclusão
Para condição dessa pesquisa:
•
Foi observada alta taxa de contaminação
quando explantes retirados de plantas mantidas
em casa de vegetação foram cultivados em meio
MS na presença de ANA e BAP;
•
Foram obtidas plantas de A. macrodontes,
C. billbergioides e P. flammea germinadas in vitro;
•
Foi observada indução de organogêse
indireta a partir de base de folha de A.
macrodontes nas concentrações de 1 e 4 µM de
ANA e 4 µM de BAP. Foi verificado o início de
diferenciação celular com a emissão de brotos;
•
Todos os tratamentos se mostraram
eficientes na desinfestação de sementes de P.
flammea, não diferindo estatisticamente e
garantindo 100% de germinação.
Referências
ARANDA-PERES, A. N. Cultivo in vitro de
bromélias da Mata Atlântica: micropropagação,
avaliação nutricional e substrato para aclimatação.
2005. 125f. (Tese Doutorado) - Escola Superior
de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de
São Paulo. Piracicaba, 2005.
BENZING, D. H. BROMELIACEAE, Profile for an
adaptative radiation. Cambridge University Press,
Cambridge. 690p. 2000.
CALDAS, L.S.; HARIDASAN, P.; Ferreira, M.E.
Meios Nutritivos. In: TORRES, A.C; CALDAS,
L.S.(eds.). Técnicas e Aplicações da Cultura
deTecidos
de
Plantas.
Brasília:
ABCTP/EMBRAPA-CNPH. p.37-69. 1990.
CARNEIRO, L. A.; ARAÚJO, R. F. G.; BRITO, G.
J. M.; FONSECA, M. H. P. B.; COSTA, A.;
CROCOMO, O.J.; MANSUR, E. In vitro
regeneration from leaf explants of Neoregelia
cruenta (R. Graham) L.B. Smith, an endemic
bromeliad from eastern Brazil. Plant Cell, Tissue
and Organ Culture, n. 55, p. 79-83. 1999.
XIII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e
IX Encontro Latino Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba
4
ENGELMANN, F. In vitro conservation of tropical
plant germplasm – a review. Euphytica, 57: 227243. 1991.
GRATTAPAGLIA, D. E.; MACHADO, M. A.
Micropropagação. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L.
S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e
transformação genética de plantas. Brasília:
Embrapa-SPI/Embrapa-CNPH. p.183-260. 1999.
KOH, Y. C.; DAVIES, F. T. J. Micropropagation of
Cryptanthus with leaf explants with attached
intercalary meristems excised from greenhouse
stock plants. Scientia Horticulture, v. 70, p. 301307. 1997.
KOH, Y. C.; DAVIES, F. T. J. Mutagenesis and in
vitro culture of Tillandsia fasciculata Swartz var.
fasciculata (Bromeliaceae). Scientia Horticulturae,
v. 87, p. 225-240. 2001.
LEIFERT, C.; MORRIS, C. E.; WAITES, W. M.
Ecology of microbial saprophytes and pathogens
in tissue culture and field grown plants: reason
for
contamination problems in vitro. Critical
Reviews in Plant Sciences. v.13, p. 139-183, 1994.
MEKERS, O. In vitro propagation of some
Tillandsioideae (Bromeliaceae). Acta Horticulturae,
v. 78, p. 311-317. 1977.
MERCIER, H.; KERBAUY, G. B. In vitro
multiplication of Vriesea fosteriana. Plant Cell,
Tissue and Organ Culture. v. 30, p. 247-249. 1992.
MERCIER, H.; KERBAUY, G. B. In vitro culture of
Vriesea hieroglyphica, an endangered bromeliad
from the Brazilian Atlantic forest. J. Bromeliad, 44:
120-124. 1994.
MERCIER, H.; KERBAUY, G. B. Micropropagation
of ornamental bromeliads (Bromeliaceae). In Biotechnology in Agriculture and Forestry, ed.
Bajaj Y.P.S. Springer-Verlag, Berlin, Germany, 40,
p. 43–57, 1997.
MURASHIGE, T. Plant propagation through
Tissue Cultures.
Annual
Review
Plant
Physiology, Palo Alto, v.25, p.135-166, 1974.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for
rapid growth and bioassays with tobaco tissue
cultures. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15,
p. 473-497, 1962.
NADKARNI, N. M. The conservation of epiphytes
and their habitats: summary of a discussion at the
international symposium on the biology and
conservation of epiphytes. Selbyana, Sarasota, n.
13, p. 140- 142, 1991.
PEREIRA, E.; MATTOS, M.; FORTES, G.
Identificação e
controle com antibióticos de
bactérias endofíticas contaminantes e explantes
de
batata
micropropagados. Pesquisa
Agropecuária Brasileira. v.38, p. 827-834, 2003.
PEREIRA, F. D.; BRAGA, M. F.; SÁ, M. E. L.;
Alcino, O. A. G.; Colenghi, I. C. Influência de BAP
e NAA na multiplicação de abacaxi cv. Perolera a
partir de brotos estiolados in vitro. BioScience
Journal, v. 17, n. 2, p. 46-60. 2001.
POMPELLI,
M.
F.;
GUERRA,
M.
P.
Micropropagation enables the mass propagation
and conservation of Dyckia distachya Hassler.
Crop Breeding and Applied Biotechnology. v. 5, p.
117-124. 2005.
POMPELLI, M. F.; PINTO, T. H.; GUERRA, M. P.
Micropropagação de Dyckia distachya L. B. Smith:
uma bromélia ameaçada de extinção. In: VIII
CONGRESSO BRASILEIRO DE FISIOLOGIA
VEGETAL. 8, Ilhéus. Resumos... 1 CD-ROM.
Seção Artigos, 2001.
RAUH, W. Bromeliads for home, garden and
greenhouse. London: Blendford Press, 58 p. 1979.
RODRIGUES, T. M.; PAIVA, P. D. O.; PAIVA, R.;
PASQUAL, M. Assepsia de sementes de bromélia
imperial para cultivo in vitro. In: Congresso
Brasileiro de Cultura de Tecidos de Plantas, 1.,
Lavras. Anais... Lavras: ABCTP, p. 251. 2003.
SCARANO, F. R.; RIBEIRO, K. T.; MORAES, L. F.
D.; LIMA, H. C. Plant establishment on flooded and
unflooded patches in a swamp forest in
southeastern Brazil. Journal of Tropical Ecology
14: 793-803. 1997.
SILVA, J. A. T.; NHUT, D.T.; TANAKA, M.; FUKAI,
S. The effect of antibiotics on the in vitro growth
response of chrysanthemum and tobacco stem
transverse thin cell layers (tTCLs). Scientia
Horticulture. v. 97, p. 397-410, 2003.
TAUTORUS, T.E.; DUNSTAN, D.I. Scale-up of
embryogenic plant suspension cultures in
bioreators. In: JAIN, M.; GUPTA, P.K. (eds.)
Somatic embryogenesis
in
woody plantas.
Dordrecht, Netherlands:
Kluwer
Academic
Publishers. p.265-292. 1995.
WANDERLEY, M. G. L.; SHEPHERD, G. J.;
MELHEM, T. S.; GIULIETTI, A. M. Flora
XIII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e
IX Encontro Latino Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba
5
fanerogâmica do Estado de São Paulo. São
Paulo: Instituto de Botânica. v.5. 476p. 2007.
XIII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e
IX Encontro Latino Americano de Pós-Graduação – Universidade do Vale do Paraíba
6