NÃO Resumo expandido LUCIANA

Produção de Anticorpos Antiamarílicos em Lhama utilizando a técnica de Phage
Display
Luciana Rocha Almeida.1
Dr. Rodrigo Guerino Stábeli2
RESUMO: Cerca de 200.000 casos de febre amarela ocorrem anualmente, sendo 90% no continente africano. O
vírus da febre amarela causa hemorragia, falência multiorgânica e choque, sendo letal em cerca de 20 a 50% dos
casos graves. A febre amarela pode ser prevenida pelo uso da vacinação antiamarílica (YF-17D), mas até então
nenhum tratamento específico foi determinado para esta doença, quando instalada, além das recomendadas medidas
intensivas de suporte. Deste modo, a tecnologia de Phage Display em camelídeos pode ser utilizada como um dos
sistemas mais convenientes para a produção de insumos soroterápicos de ação neutralizante, como alternativa de
tratamento para a febre amarela, assim como a utilização em métodos diagnósticos. A nossa pesquisa teve como
objetivo geral a produção de anticorpos monoclonais do tipo VHH em Llama glama contra os epítopos relevantes do
vírus amarílico revertido através de infecção celular da cepa YF-17D, utilizando a técnica de Phage Display para
produção de biblioteca recombinante para o repertório VHH. Assim, foi realizado a imunização do animal com o
antígeno específico, coleta de linfócitos do sangue periférico, após janela imunológica apropriada, purificação de
mRNA dos linfócitos circulantes purificados, realização de RT-PCR para síntese de cDNA e amplificação do gene
correspondente às imunoglobulinas de cadeias pesadas (PCR I), seguida de posterior reamplificação do gene VHH
(PCR II). A clonagem em vetor de fagomídeo e a transformação de células competentes para a obtenção da
biblioteca recombinante de VHH serão passos futuros de nosso grupo de pesquisa.
PALAVRAS CHAVES: febre amarela, cepa viral YF-17D, anticorpo de camelídeo (VHHs), produção de biblioteca
recombinante, Phage Display, soroneutralização.
ABSTRACT: About 200.000 cases of yellow fever happen annually and more than 90% are localized in the African
continent. The yellow fever virus (YF) causes hemorrhage, organs failure and shock. About 20 to 50% of the YF
evolutes for serious cases. The yellow fever vaccination is the best way of the prevention, but nowadays there isn’t
specific treatment for this disease. Phage Display technology in Camelidae can be used as one of the most
convenient systems for production of neutralizing antibodies for serumtherapy, as YF treatment possibilities, as well
diagnosis methods. The main objective of this work is to produce VHH antibodies in Llama glama against yellow
fever, using the Phage Display technique, from the VHH-phages library. For this, we immunized one species of
Lhama glama with the specific antigen and the lymphocytes was purified from peripheral blood and their mRNA
was isolated. The mRNA was utilized for cDNA synthesis (RT-PCR) and, posteriously, two primers was utilized as
template for VHH region of the immuneglobulins cloning. How future perspectives, the 400pb corresponding of the
VHH gene region will be cloning into phagmide vectors and utilized for VHH library construction.
KEY- WORDS: Yellow fever virus, YF- 17D, Antibodies from Camelidae (VHHs), VHH library, Phage Display,
serumtherapy.
1.0 - INTRODUÇÃO
A febre amarela consiste numa doença infecciosa não contagiosa causada por um flavivírus
mantido em ciclos silvestres, ou em áreas de transição urbana. Os mosquitos hematófagos dos
gêneros Aedes, Haemagogus e Sabethes, na África e na América, são considerados os vetores de
transmissão da doença (VASCONCELOS, 2003).
O vírus da febre amarela causa hemorragia, falência multiorgânica e choque, sendo letal em
cerca de 20 a 50% dos casos graves (EPPS, 2005).
Cerca de 200.000 casos de febre amarela ocorrem anualmente no continente africano
(BARNETT, 2007). Esta doença pode ser prevenida pelo uso da vacinação antiamarílica (YF1
2
Bolsista PIBIC/CNPq, acadêmica do curso de Medicina- UNIR
Orientador
17D), mas até então nenhum tratamento específico foi determinado, além das recomendadas
medidas intensivas de suporte (DAFFIS, 2006).
Na perspectiva de um tratamento mais efetivo pode-se pensar em imunoterapia, neste
contexto encontra-se a tecnologia de Phage Display em camelídeos, que pode ser utilizada
como um dos sistemas mais convenientes para a produção de insumos soroterápicos de ação
neutralizante, como alternativa de tratamento para a febre amarela.
De acordo com Abbas e Lichtman (2005), todas as moléculas de anticorpos possuem as
mesmas características estruturais básicas, compostas por duas cadeias leves, e duas cadeias
pesadas, unidas por pontes dissulfeto intra-domínios e interdomínios. Entretanto, o soro dos
camelídeos contém uma importante fração de imunoglobulinas funcionais desprovidas de
cadeias leves classificadas como IgG2 e IgG3. As regiões de reconhecimento de antígenos
destas classes de IgGs são denominadas de VHH e possuem uma região CDR3 funcional
independente de interação com a região CDR3 de cadeias leves, como acontece com as IgGs
convencionais (CONRATH et al., 2003).
As regiões VHH das IgG2 e 3, podem ser clonados dos linfócitos periféricos circulantes
de camelídeos imunizados e utilizadas como ferramentas para produção de soroneutralizantes e
diagnóstico específicos, quando expressa em grande quantidades. Ainda, esta classe de
moléculas apresenta algumas vantagens quando comparados a anticorpos convencionais
utilizados para o mesmo fim (CONRATH et al., 2001).
A técnica de phage display, desenvolvida inicialmente para a seleção de anticorpos, tem
sido aprimorada e amplamente utilizada para selecionar peptídeos e proteínas com as
propriedades e funções específicas através de construções de bibliotecas (PASCHKE, 2006).
Esta tecnologia, por exemplo, poderá permitir o isolamento de VHHs contra qualquer antígeno
através de seleção clonal de fragmentos de anticorpos num sistema procariótico, o que facilita
tanto imunoterapia quanto diagnóstico in vivo (RONDOT et al., 2001).
Neste contexto, utilizamos o vírus amarílico revertido (YF-17D) para obter a resposta
imune de um Lhama glama e avaliamos os possíveis potenciais terapêuticos e diagnósticos
destes anticorpos produzidos, através da produção de anticorpos monoclonais do tipo VHH
contra os epítopos relevantes do vírus amarílico revertido.
2.0 – MATERIAL E MÉTODOS
A imunização do Llama glama com amostras liofilizadas da vacina YF-17D, (cedidas
pela SEMUSA e produzidas por Biomanguinhos), procedeu com a administração de três doses
de 150 g de YF-17D diluídas em 1000 l de solução de NaCl 0,9 M e 1000 l de adjuvante de
Freund completo, na primeira aplicação e incompleto nas duas últimas.
O segmento 5’ das cadeias pesadas das imunoglobulinas foi amplificado por PCR com
dois primers gene-específicos: VH BACK A6: 5’ GAT GTG CAG CTG CAG GCC TCT
GG(A/G) GGA GG 3’ e CH2 FOR TA4: 5’ CGC CAT CAA GGT ACC AGT TGA 3’. Do
produto desta PCR, foram reamplificados os genes VHH com VH FOR 36: 5’ CAT GCC ATG
ACT GCG GGC CCA GCC GGC CAT GGC CGA (G/C)GT (G/C)CA GCT 3’ e VH BACK
A4: 5’ GG ACT AGT TGC GGC CGC TGA GGA GAC GGT GAC GGT GAC CTG 3’,
contendo sítios para as enzimas de restrição SfiI e NotI (sublinhados).
A amplificação do fragmento VH-CH2 foi realizada com embasamento nos protocolos
propostos por LAFAYE (1997) , com algumas alterações, sendo utilizado DNA da primeira
PCR 1 µl, MgCl2 3 µl, PCR buffer (l0x) 2 µl, dNTP 2 µl, iniciador VH Back A4 2 µl,
iniciador VHFor 36 2 µl, taq polimerase 0,1µl, H2O 10,9 µl. A concentração dos dois primers
foram de 5 moles/µl, 94°C 05 min, 94°C 30 sec, 45°C 30 sec e 35 ciclos, 72°C 30 sec e 72°C
10 min.
O produto da PCR foi resolvido em gel de 1,5 %, de agarose no qual observamos a
presença de banda contendo o tamanho de aproximadamente 600 pb, correspondente ao
fragmento gênico de VHH-CH2, e a banda de aproximadamente 800 pb, correspondente ao
fragmento gênico de VH-CH1-CH2.
A banda visualizada de aproximadamente 600 pb foi cortada do gel de agarose e a
quantidade de ácido nucléico foi quantificada através de espectrofotometria.
O produto purificado foi submetido a nova PCR utilizando dois novos iniciadores com
sítios de restrição para as enzimas SfiI e NotI. O protocolo seguido consistiu no proposto por
LAFAYE (1997), com algumas alterações: DNA da primeira PCR
1 µl, MgCl2 3 µl, PCR
buffer (l0x) 2 µl, dNTP 2 µl, Iniciador VH Back A4 2 µl, Iniciador VHFor 36 2 µl, taq
polimerase 0,1 µl, H2O 10,9 µl. Concentração dos dois primers : 5 pmoles/µl, sendo 35 ciclos
de 94°C 05 min, 94°C 30 sec, 45°C 30 sec, 72°C 30 sec e 72°C 10 min.
O fragmento amplificado foi de aproximadamente 400 pb, e possivelmente codifica para
a fração VHH da imunoglobulina do camelídeo (LAFAYE, 1997). Esta porção foi purificado
através de sedimentação em etanol/NaAc (3,0 M) e quantificado em espectrofotômetro
(260nm).
A purificação das reações por precipitação com Etanol/NaAc se procedeu com junção
dos remanescentes 40µl total com template, acrescidos de 4µl (geral: 1/10 volume da solução
contendo DNA) de Acetato de sódio 3M, pH 5,2 e 100µl de Etanol 100%. Os volumes foram
misturados e colocados no gelo por 15 minutos, depois centrifugado por 10 min. a 1200 rpm a
4°C. O sobrenadante então foi descartado. Foi acrescentado 300 µl EtOH 70% e centrifugado
para coletar o resto do líquido no fundo do tubo e posteriormente retirado e secado a TA por
aproximadamente 5 minutos ou até a completa remoção de etanol.
3.0 - RESULTADOS
A resposta imune do camelídeo ao antígeno foi obtida com êxito e verificada através de
ELISA utilizando soro pré- e pós-imunização , posteriormente se procedeu o isolamento dos
linfócitos periféricos. O isolamento do mRNA destes linfócitos se deu através da técnica de
TRIZOL. Assim, 200ml de sangue foram extraídos através de pulsão da veia jugular do animal
e submetidos a separação de células, através do procedimento descrito no manual “FicollPaque PLUS® - for in vitro isolation of lymphocytes” (Amershan Biosciences). Posteriormente
o mRNA total foi extraído, sendo este submetido a uma reação de transcriptase reversa com a
produção de cDNA. Os PCRs foram então iniciados a fim de se obter
o fragmento VHH
para clonagem.
Obtivemos então uma banda de cerca de 800 pb, que corresponde ao fragmento
correspondente a seqüência VH-CH1-CH2 da cadeia pesada das imunoglobulinas tradicionais, e
outra de cerca de 600 pb, correspondente a VH-CH2 das imunoglobulinas de cadeia pesada do
tipo camelídica. Não houve amplificação no controle negativo no que se refere ao PCR I (Fig.
1A), o que de fato era esperado.
Para a realização do PCR II (Fig. 1B) foi utilizada então a banda de 600 pb, purificada
através de corte em gel (Fig. 1A), a fim de se obter o fragmento VHH de cerca de 400 pb, o
que ocorreu com sucesso.
800 pb
600 pb
400 pb
A
B
Figura 1: Eletroforese em gel de agarose 1,5%, com brometo de etídeo, para as análises de PCR I e II,
visualizado através de radiação UV. (A) Observa-se na primeira raia do gel, o peso molecular de 100 pb; na
segunda raia, duas bandas visíveis, uma de 800 pb e outra de 600 pb. Na terceira raia, o controle negativo, no qual
não houve qualquer amplificação. (B) Na primeira raia do gel, encontra-se resolvido o peso molecular de 100 pb; na
segunda raia, a banda de 400 pb e a terceira raia corresponde ao controle negativo, sem amplificações.
4.0- DISCUSSÃO
Lafaye et al. (1997) afirmam que a construção de uma biblioteca de fragmentos de
anticorpos humanos (Fab ou scFv) expostos na superfície de bacteriófagos filamentosos e sua
seleção de “anticorpos phage” (Phabs) por afinidade pelo antígeno constituem poderoso meio
de gerar novas ferramentas de aplicação clínica em imunoterapia passiva. No empenho de
construir uma biblioteca de vetores fagomídeos recombinantes com grande variabilidade, as
atividades propostas realizadas foram a imunização do animal com o antígeno específico;
coleta de linfócitos do sangue periférico do animal; purificação de mRNA das células brancas;
realização de RT-PCR; amplificação do gene correspondente às imunoglobulinas de cadeias
pesadas (PCR I), seguida de posterior reamplificação do gene VHH (PCR II).
As regiões correspondentes às porções VH e VHH foram amplificadas no PCR. No
primeiro PCR, o primer VHBACKA6
foi utilizado para
amplificar o fragmento gênico
correspondente a porção CH2-CH1-VH das imunoglobulinas
do camelídeo. Segundo
MUYLDERMANS et al (2001), este primer é o preferido para codificar 1 a 10 do subgrupo III de
VHH do camelídeo, sendo esta família pertencente apenas aos anticorpos deste animal.
Os produtos desse PCR foram derivados de cadeias pesadas homodiméricas de
anticorpos e de cadeias pesadas de imunoglobulinas clássicas. No segundo PCR, houve a
reamplificação de VHH com a utilização do primer VHBACKA4 contendo SfiI e o primer
VHFOR36 contendo NotI. Nesta etapa apenas é selecionado a porção variável do gene da
cadeia pesada das IgG2 ou IgG3 dos camelídeos com o tamanho aproximado de 400pb
esperados. O que foi conseguido com êxito como observado na figura 1B. Desta forma, os
PCRs apresentaram-se satisfatórios, de modo que obtivemos as bandas de cerca de 800pb e
600pb, e posteriormente a reamplificação da banda 600pb para obtenção do fragmento VHH de
cerca de 400pb.
Deve-se ressaltar que dificuldades foram encontradas nas atividades realizadas
posteriormente ao resultado do PCR. A incapacidade de se obter células competentes
satisfatórias, resultou em um número reduzido de colônias nas placas, limitando assim a
variabilidade na biblioteca de vetores fagomídeos recombinantes. A construção de novos
mecanismos para a obtenção de células competentes deverão ser analisadas para a continuidade
deste trabalho.
5.0- REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA:
ABBAS, Abul K; LICHTMAN, Andrew H. Imunologia Celular e Molecular. Tradução de Claudia
Reali. 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, v.51, p. 47-49, 2005.
CONRATH, K.E.; WERNERY, U.; MUYLDERMANS, S; NGUYEN, V.K. Emergence and evolution of
functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Development and Comparative Immunology, n. 27, p.
87 – 103, 2003.
CONRATH, Katja Els; LAUWEREYS, Mark; WYNS, Lode; MUYLDERMANS, Serge. Camel Singledomain Antibodies as Modular Building Units in Bispecific and Bivalent Antibody Constructs. The
Journal of Biological Chemistry, v. 276, n. 10, p. 7346 – 7350. 2001.
LAFAYE, P; CHOUMET, V; DEMANGEL, C; BON, C; MAZIÉ, J.-C. Biolocally active human anticrotoxin scFv isolated from a semi-synthetic phage library. Immunotechnology, n. 3, p. 117 – 125, 1997.
MUYLDERMANS, Serge; CAMBILLAU, Christian; WYNS, Lode. Recognition of antigens by singledomain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Biochemical Sciences, v. 26, n. 4,
p. 230 – 235, abr. 2001.
PASCHKE, Matthias. Phage Display systems and their applications.Applied Microbiology and
Biotechnology, n. 70, p. 2 – 11, 2006.
RONDOT, S; KOCH, J.; BREITLING, F.; DÜBEL, S. A helper phage to improve single-chain antibody
presentation in phage display. Nature Biotechnology, v. 19, p. 75 – 78, 2001.