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Inserir logotipo do laboratório Procedimentos Operacionais Padrão POP.BIO- xxx HDL DIRETO PLUS INDICAÇÃO MÉDICA DO EXAME Exame que se destina à determinação quantitativa do Colesterol HDL em soro e plasma humano, útil na investigação das dislipidemias e na avaliação de risco de doenças coronarianas. EXAMES CORRELATOS São exames correlatos: eletroforese de lipídeos, colesterol total, colesterol LDL e triglicerídeos. MÉTODO E PRINCÍPIO Método: Enzimático. Principio: A eliminação de quilomícrons, Colesterol-VLDL e Colesterol-LDL pelo colesterol esterase e pela colesterol oxidase e subseqüentemente pela catalase. Medição específica do Colesterol HDL após a liberação do Colesterol HDL por detergentes no Reagente 2. AMOSTRA Tipo: Soro ou plasma (heparina ou EDTA). Volume ideal: Definir o volume mínimo a ser encaminhado para análise Volume mínimo: Definir o volume mínimo a ser encaminhado para análise Critérios para rejeição: Presença de hemólise intensa. Fazer referência ao manual ou POP de coleta, separação e distribuição de material. Acondicionamento: Sob refrigeração (2 - 8ºC), o colesterol no soro ou plasma é estável por cinco dias. Congelado, esta estabilidade estende-se por vários meses. Precauções de segurança: Conforme Manual de Biossegurança. Preparo do Paciente: O paciente deve estar com peso e dieta estáveis por três semanas e em jejum de 12 a 14 horas (O jejum é imprescindível para a dosagem de colesterol HDL e para a determinação dos triglicérides e frações do colesterol). A abstinência alcoólica é desejável nas 72 horas que antecedem o teste. Evitar garroteamento por período superior a 2 minutos e colher em posição sentada com o paciente em repouso por 5 minutos. PRODUTO UTILIZADO HDL Direto Katal Biotecnológica Ind. Com. Ltda. Rua: Leiria, 1.160 - CEP 31255-100. Belo Horizonte - MG. Brasil. Registro ANVISA – 10377390190 1. Reagente 1: N,N-Bis (2-hidroxietil)-2-amino etano ácido sulfônico 100mmol/L pH 7,0; HDAOS N-(2-hidroxi-3sulfopropil)-3,5-dimetoxianiolina 0,7 mmol/L; Colesterol Esterase 800 U/L; Colesterol Oxidase 500 U/L;Catalase 300 KU/L. 2. Reagente 2: N,N-Bis (2-hidroxietil)-2-amino etano ácido sulfônico 100mmol/L pH 7,0; 4-Amino antipirina 4 mmol/L; Peroxidase 4 KU/L Azida Sódica 0,09% p/v. 3. Calibrador Colesterol HDL: Frasco contendo colesterol HDL humano liofilizado. A concentração está impressa no rótulo do frasco. Conservar entre 2 - 8°C. 1/6 Inserir logotipo do laboratório Procedimentos Operacionais Padrão POP.BIO- xxx Nota: Depois de abertos os reagentes 1 e 2 são estáveis até a data de validade indicada no rótulo, se mantidos entre 2 - 8ºC quando armazenados protegidos da luz, bem vedados e não sendo expostos a contaminações química e microbiana. Apresentações: - 80 mL (27B): 1 x 60 mL Reagente 1 1 x 20 mL Reagente 2 - 320 mL (64B): 1 x 240 mL Reagente 1 1 x 80 mL Reagente 2 Precauções e cuidados especiais Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação do reagente. Fazer referência ao manual ou POP de segurança. Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições indicadas são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão sujeitos à contaminação de natureza química e microbiana que podem provocar redução da estabilidade. O laboratório deve estabelecer a estabilidade em suas condições operacionais. Os reagentes contêm azida sódica, que é tóxica. Deve-se tomar cuidado para evitar a ingestão e, no caso de contato com os olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e cobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar o reagente. Fazer referência ao manual ou POP de segurança. EQUIPAMENTOS Procedimento manual 1. Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância em 600 nm. 2. Pipetas para medir amostras e reagentes. Procedimento automatizado Indicar o nome, modelo e o local onde se encontra o equipamento analítico; fazer referência ao manual ou POP para utilização do mesmo. INSTRUMENTOS ESPECIAIS Se realizado por procedimento manual é necessário o uso de: Centrífuga Banho-maria Vidraria Pipetas manuais ou automáticas Destilador ou Deionizador Equipamento compatível. PROCEDIMENTO DE CALIBRAÇÃO Para técnica manual: A cada teste ou se utilizado método do Fator de calibração realizar a cada mudança de lote do reagente, quando os controles estiverem inadequados. 2/6 Inserir logotipo do laboratório Procedimentos Operacionais Padrão POP.BIO- xxx Para automação: A cada mudança de lote do reagente, quando os controles estiverem inadequados, após qualquer manutenção corretiva do equipamento e quando a curva de calibração estiver vencida. CONTROLE DE QUALIDADE Materiais Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, número de catálogo), instruções de preparo e frequência da utilização dos mesmos. Limites de tolerância Descrever o procedimento para definição dos limites de tolerância, o sistema adotado para utilização do mapa de Levey-Jennings e das regras de controle e as providências a serem tomadas diante de valores que ultrapassem tais limites. Fazer referência ao manual ou POP para utilização dos materiais de controle. Verificação de novo lote de controles e/ou reagentes Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e de reagentes. Gerenciamento dos dados Definir como os dados relativos ao controle da qualidade são arquivados e gerenciados. Fazer referência ao manual ou POP de garantia da qualidade INSTRUÇÕES DE PREPARO Preparo do Calibrador: Deixar o frasco do calibrador a temperatura ambiente por 10 minutos. Adicionar 1,0mL de água destilada ao conteúdo do frasco. Aguardar 10 minutos e homogeneizar com movimentos circulares. Estável por 03 dias entre 2 - 8°C e 30 dias a -20ºC. Recomendamos separar o calibrador em alíquotas antes do congelamento. Após descongelar, homogeneizar antes da utilização. O material congelado deve ser degelado uma única vez. Nota: É fundamental que a água utilizada para a reconstituição do calibrador seja de boa qualidade, para evitar a deteriorização do mesmo e alteração dos resultados analisados. PROCEDIMENTO Dosagem – soro ou plasma Separar 2 tubos de ensaio e proceder como a seguir: Amostra Calibrador Reagente 1 Teste 0,01mL 0,75mL Calibrador 0,01mL 0,75mL Homogeneizar bem e colocar no banho-maria a 37°C durante 5 minutos. Determinar as absorbâncias do teste e do calibrador em 600 nm, acertando o zero com água deionizada. As absorbâncias encontradas serão A1. Reagente 2 Teste 0,25mL Calibrador 0,25mL Homogeneizar bem e colocar no banho-maria a 37°C durante 5 minutos. Determinar as absorbâncias do teste e do calibrador em 600 nm, acertando o zero com água deionizada. As absorbâncias encontradas serão A2. 3/6 Inserir logotipo do laboratório Procedimentos Operacionais Padrão POP.BIO- xxx Precauções e cuidados especiais 1. Para manusear e descartar reagentes e material biológico, aplicar as normas estabelecidas de segurança. Fazer referência ao manual ou POP de segurança. 2. A limpeza e secagem adequadas do material são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos. Fazer referência ao manual ou POP de limpeza e verificação da qualidade da limpeza dos materiais. 3. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes e usar nas medições, deve ter resistividade 1 megaohm ou condutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos 0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxague da vidraria a água pode ser do tipo III, com resistividade 0,1 megaohms ou condutividade 10 microsiemens. No enxague final utilizar água tipo II. Quando a coluna deionizadora está com sua capacidade saturada ocorre a produção de água alcalina com liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água. Fazer referência ao manual ou POP de água reagente. 4. Misturar bem as amostras lipêmicas antes de iniciar a dosagem. CÁLCULOS 1. Colesterol HDL (mg/dL) = [Abs. Teste (A2 - A1Cor.*) Abs. Calibrador (A2 – A1Cor.)] x Concentração do Calibrador 2. Fator de calibração = Concentração do Calibrador Abs. Calibrador (A2 – A1Cor.) 3. Colesterol HDL (mg/dL) = Abs. Teste (A2 - A1Cor.) x Fator *Correção: A primeira leitura da absorbância (A1) deverá ser corrigida para o volume final da reação obtendo-se A1Corrigido, antes do cálculo da concentração de HDL. A1Cor. = A1 x 0,75. Exemplo: Teste: A1 = 0,002 A1Cor. = 0,0015 A2 = 0,111 Calibrador: A1 = 0,002 A1Cor. = 0,0015 A2 = 0,037 Concentração do Calibrador: 20mg/dL Colesterol HDL (mg/dL): [(0,111 – 0,0015) (0,037 – 0,0015)] x 20 = 61,7 Fator de Calibração: 20 (0,037 – 0,0015) = 563 Colesterol HDL (mg/dL): (0,111 – 0,0015) x 563 = 61,7 INTERFERENTES O ensaio não é afetado por amostras ictéricas (bilirrubina <30 mg/dL), fatores reumatóides <1000IU/mL, amostras hemolisadas (Hb <500mg/dL) e amostras lipêmicas (triglicérides <1200 mg/dL). Amostras lipêmicas com uma concentração >1200 mg/dL devem ser diluídas 1 + 9 com NaCI 0.9% (p/v) antes de ensaiar. O resultado obtido dever ser multiplicado por 10. Substâncias que aumentam o nível de colesterol: cimetidinas, etanol e ácido nicotínico. Resultados diminuídos: pacientes com diabetes, obesidade, sedentarismo, fumantes, CHD entre outros. 4/6 Inserir logotipo do laboratório Procedimentos Operacionais Padrão POP.BIO- xxx RESULTADOS Valores de Referência Recomenda-se que cada laboratório estabeleça sua própria faixa de referência na sua população atendida. Os valores abaixo são fornecidos como orientação. Soro ou plasma De 2 a 9 anos De 10 a 19 anos > 20 anos Desejável ≥ 40 mg/dL ≥ 35 mg/dL ≥ 40 mg/dL VALORES POTENCIALMENTE CRÍTICOS Determinado pelo laboratório. Incluir o procedimento a ser adotado diante de um resultado crítico. LINEARIDADE A reação é linear até 130 mg/dL. Para valores acima de 130 mg/dL, diluir a amostra com água destilada. Multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. SENSIBILIDADE Limite de detecção: 3 mg/dL ESPECIFICIDADE A comparação com método similar, que também utiliza a metodologia do ácido fosfotúngstico/cloreto de magnésio, já validado, mostrou um coeficiente de correlação, r, igual a 0,989 a partir de amostras aleatórias oriundas de pacientes de ambulatório. A equação de regressão obtida foi : Y = 0.979X + 0.029. INTERPRETAÇÃO TÉCNICA Amostras lipêmicas podem apresentar turbidez. Neste caso, diluir o soro 1:2 com NaCl 0,85% e repetir a determinação. Multiplicar o resultado final por 2. Hemólise acentuada e bilirrubina acima de 10 mg/dl interferem com o teste. SIGNIFICADO CLÍNICO O colesterol é o principal esterol do organismo, estando presente em todas as células como um componente estrutural das membranas e das lipoproteínas (HDL, VLDL e principalmente, LDL). É também o precursor na formação dos hormônios esteroides pelas gônadas e córtex adrenal. Cerca de 70 a 75% do colesterol plasmático encontra-se na forma de éster e 25 a 30% existe como colesterol livre. A importância clínica dos lipídeos está associada a sua contribuição para a coronariopatia (CHD) e para vários distúrbios lipoprotéicos. Quando as concentrações de colesterol total e de colesterol LDL são altas, a incidência e prevalência de CHD também são altas. Ao contrário do colesterol LDL, o aumento das concentrações de colesterol HDL mostrou ser um protetor para a CHD tanto em estudos experimentais como clínicos. Pelo fato de a aterosclerose começar na infância e poder levar décadas para manifestar-se clinicamente, a mensuração dos lipídeos e lipoproteínas 5/6 Inserir logotipo do laboratório Procedimentos Operacionais Padrão POP.BIO- xxx plasmáticas é um meio valioso de identificar indivíduos em risco para CHD e determinar a terapia mais apropriada. ANEXOS Não aplicável. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: Triglyceride, High Density Lipoprotein and Coronary Heart Disease. Washington D.C. Feb 26-28, 1992. Izawa S., Okada M., Matsui H., and Horita Y. J. Medicine and Pharmaceutical Sci., 1385 - 1388, 37 (1997). Shih WJ, Bachorik PS, Haga JÁ, Myers GL, Stein EA; Clinical Chemistry, 2000; 46:3:351-364. Third Report of the National Cholesterol Education Programme (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation and treatment of High Blood Cholesterol in Adults(Adult Treatment Panel III), JAMA Publication, Vol 285, No. 19, P 2486-2497; 2001. Jacobs, D. et al. In Labboratory and Test Handbook; Jacobs, D.S: Kasten, B.L., De Mott, W.R., Wolfson, W.L., Eds; Lexi – Comp Inc: Hudson (Cleveland); 1990 P. 219. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, 6nd Ed., pg. 426, Saunders Press, Phila. 2008. Katal: Dados de Arquivo. 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