asahara

Science, vol. 275, 1997, 14 February, Takayuki Asahara et al.
http://www.sciencemag.org
Isolation of putative progenitor cells for angiogenesis (1997)
Introdução
- Células progenitoras endoteliais (CPE) ou angioblastos foram isoladas do
sangue periférico humano através de seleção com “contas” magnéticas,
tomando como base a expressão de antígenos na superfície celular.
- In vitro, essas células se diferenciaram em células endoteliais.
- As CPE homólogas, heterólogas e autólogas foram incorporadas em modelos
animais com isquemia, nos sítios ativos de angiogênese.
- Os resultados sugerem que CPE podem ser úteis para aumentar o
crescimento de vasos sanguíneos colaterais em tecidos isquêmicos (como
terapia angiogência) e para distribuir agentes anti- ou pro-angiogênicos,
respectivamente, para regiões de angiogêne patológica ou funcional.
- Há dois processoas diferentes de neovascularização: a angiogêse
propriamente dita e a vasculogêse.
- Segundo o que se acreditava, a vasculogênese, que consiste na formação de
vasos a partir de células progenitoras endoteliais ou angioblastos, ocorreria
apenas durante a embriogênse (as células tronco só existiram nas fases iniciais
do desenvolvimento).
- Além disso, pensava-se que a angiogênse, formação de vasos sanguínoes
que persiste no indivíduo adulto, se daria apenas através da proliferação,
migração e remodelação de células endoteliais (CE) já diferenciadas e
derivadas de vasos preexistentes.
- OBS: vasculogêse => inicia-se com formação de um grupo de células, ou “ilha
de sangue”, contendo angioblastos na periferia e células-tronco
hematopoéticas (CTH) no centro, sendo que todas essas células compartilham
certos antígenos, incluindo Flk-1 (também conhecido como VEGFR-2 em
camundongos, cujo homólogo humano é o KDR), Tie-2 e CD34, o que torna
concebível o fato dessas células terem um precursor comum.
Hipótese
- O sangue periférico contém células que podem se diferenciar em CE.
Metodologia e resultados
- Foram explorados dois antígenos compartilhados por CTH e angioblastos
(CD34 e Flk-1) para isolar supostas CPE de uma fração de leucócitos do
sangue periférico.
- A amostra de sangue foi submetida a uma reação com anticorpo para CD34,
contendo “contas” magnéticas para posterior isolamento.
- A FACS – análise por fluorescência- foi usada para completar a seleção
específica de células mononucleares CD34-positivas (MBCD34+). Já as células
sem o marcador CD34 (MBCD34 -) foram utilizadas como controles. (OBS:
mesmo foi feito para o outro antígeno)
- As células MBCD34+ e MBCD34 – foram fixadas em culturas diferentes.
- Em ambos os casos, embora em proporção diferente, um pequeno número de
células adquiriu um novo formato, de bastão ou fuso ( células denominadas no
artigo como ATCD34 +)
- Para confirmar se as células ATCD34 + derivaram de outras CD34-positivas, as
MBCD34+ foram marcadas com fluorescência, enquanto as MBCD34 - , não.
Posteriormente, elas foram coincubadas.
- Como resultado, percebeu-se que a coincubação com as MB CD34 –
aumentava a proliferação de MB CD34 + em mais de 10 vezes, em relação à
cultura isolada da mesma; que estimulava a sua diferenciação (inclusive a
formação de redes celulares e estruturas tubulares); e que dentro de 12 horas
de cocultura, formavam-se múltiplos agrupamentos de células derivadas
sobretudo das MB CD34 +, contendo células esféricas centrais e outras com foma
de bastão ou fuso na periferia => semelhante àquela “ilha de sangue” que se
forma na vasculogêse => foi o que eu entendi, pelo menos)
- Para analisar se células MB CD34 + progrediam para um fenótipo semelhante
ao de CE (células endoteliais), foram incubadas com anticorpos fluorescentes *
células MB CD34 + recém-isoladas, células AT CD34 + após cultivo por 7 dias e
células endoteliais de veia umbilical humana.
*para marcadores de leucócitos e de células endoteliais
- Resutado: as células que apresentavam todos os maracdores de CE, e em
maior quantidade, mas raros marcadores de leucócitos: as AT CD34 +.
- Para confirmar a semelhança de fenótipos, foram documentadas a expressão
de ecNOS , Flk-1/KDR e mRNA de CD31, sendo a evidência demonstrada em
um teste fucional => em resposta à acetilcolina e ao mitógeno específico de
CE, o VEGF, as células AT CD34 + produziram óxido nítrico (o que é feito por CE
típicas).
- Para determinar se as células MB CD34 + contribuíam para a angiogênese in
vivo, foram usados modelos animais de camundongos e coelhos com isquemia
num dos membros inferiores – induzida pela excisão de uma artéria femoral.
- Nesse experimento, células MB CD34 + foram retiradas do animal antes da
injúria, cultivadas e marcadas in vitro e reintrojetadas posteriormente no
mesmo animal.
- Aproximadamente todas as células marcadas apareceram, após 6 semanas,
nas paredes de capilares sanguíneos que expressavam CD31 e reagiam com
lectina BS-1, na região neovascularizada do membro isquêmico.
- Foi feito experimento semelhante, mas com o uso de células sanguíneas
MBFlk-1. (OBS: os procedimentos são um tanto complexos)
Conclusão
- O estudo sugere que células isoladas com anti-CD34 ou anti-Flk-1 podem se
diferenciar em CE in vitro.
- As células MB CD34 + e MB Flk-1 + circulantes podem contribuir para a
neoangiogênese em espécies adultas, sendo consistente com a vasculogêse
(que, portanto, não se restringe à embriogêse).
- As CPE podem ser usadas na terapia celular tendo em vista a angiogêses ou
neovascularização.