BLASTO Como se vêm as células hematopoiéticas no citometro?
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HEMATOPOIESE Compartimento invisível BLASTO Thymus CLP CMP CFU-GEMM CFU-Meg BFU-E CFU-E CFU-GM CFU-M CFU-G MONO GRAN B-cell Progenitor T/NK-cell Progenitor NK-cell Progenitor T-cell Progenitor c. visível MADURO IMATURO Stem cell PLT ERITR LINFÓCITOS Esfregaço de MEDULA OSSEA CAPACIDADE DE ANÁLISE - PATOLOGIA CITOGENÉTICA Observação de 1 a 100 células LEUCEMIA PROMIELOCITICA AGUDA CITOMETRIA DE FLUXO 100 000 células/min FISH Observação de 1 a 100 células DEFENIÇÕES • Citometria de Fluxo - Flow Cytometry – Mede as propriedades das células em suspensão Líquido Células em suspensão fluem em “fila-única” através dum espaço confinado onde estas são exposta a um Optica feixe de luz e emitem fluorescência. Esta é colectada, filtrada e convertida em valores Electronica digitalizados que são guardados num computador. • Flow Sorting – Separa as células (Sorting) baseando-se nas suas propriedades – Também designado Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) Becton Dickinson FACSCalibur 4-color analyser ...Equipado com 2 lasers 1° laser – 15mW 488nm air-cooled argon-ion laser 2° laser – 635nm red diode laser ...e 4 detectores de fluorescência FL1 – 530 ± 15nm FL2 – 585 ± 21nm FL3 – 670+nm FL4 – 661 ± 8nm CITOMETRO - ESQUEMA Forward light scatter Side light scatter Lixo Bomba de ar Regulação da pressão de ar Feixe laser (50-300 µm) Nozzle Laser Sheath fluid Regulador de amostra Amostra em suspensão Fluxo Laminar: o líquido da amostra passa pelo tubo central e não se mistura com solução tampão Emissão detectada a 180ºC (frente) em relação ao eixo do laser Laser FSC Tamanho da célula (ou particula) Emissão detectada a 90ºC (lateral) em relação ao eixo do laser Laser FSC ssc Forma e homogeniedade da célula Monócitos Granulócitos Como se vêm as células hematopoiéticas no citometro? Side Scatter Projection 200 Lymphocytes Forward Scatter Projection 800 600 400 Monocytes Scale 1000 200 100 50 40 30 20 15 8 0 Forward Scatter Neutrophils FSC Linfócitos 1000 SSC 0 200 400 600 800 1000 90 Degree Scatter Purdue University Cytometry Laboratories Compartimento invisível IMATURO Como se vêm as células hematopoiéticas no citometro? Stem cell BLASTO Thymus CLP CMP CFUGEMM B-cell Progenitor CFU-Meg BFU-E CFU-E T/NK-cell Progenitor CFU-GM NK-cell T-cell Progenitor Progenitor CFU-M CFU-G LINFÓCITOS Como se vêm as células hematopoiéticas no citometro? Fresh CB CD34+ cells Stem cell CD45 96.5% 98% CD38 CD34+CD38+ Progenitores hematopoiéticos CFU-Meg BFU-E CFU-E CFU-GM CFU-M Emission FITC 525nm PE 575nm PE-TexasRed 613nm GFP 515nm Propidium Iodide 600nm CD34 CFU-G 25.2% CD19 Fluorochrome Diferenciação de células B CD45 CD34 CLP CMP CFUGEMM CD10 DIFERENCIAÇÃO CELULAR CICLO CELULAR 300 Análise DNA 75 150 C o u n t s G2 M 0 Counts 225 G0 G1 0 200 400 600 800 PI Fluorescence 1000 0 200 2N 400 600 4N DNA content 800 1000 Ciclo celular – Detecção de Fase S BrdU Incorporação de um nucleótido marcado - Bromodeoxiuridina (BrdU) (análogo da timidina) PI J.W. Gray, F. Dolbeare & M.G. Pallavicini - MLM Chapt. 23 APOPTOSE – Morte celular programada ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS Célula “encolhe” A forma da célula muda Condensação do citoplasma Alterações no envelope nuclear Fagmentação nuclear Perda de estruturas de superfície Corpos apoptóticos Descolamento celular Fagocitose dos “debris” celulares ALTERAÇÕES FUNCIONAIS/BIOQUIMICAS Aumento dos niveis livres de cálcio Interações bcl2/BAX Desidratação celular Perda dos potênciais de membrana mitocôndriais Proteolise Externalização fosfatidilserina Proteolise Lamin B Desnaturação DNA Clivagem 50-300kb Clivagem intranucleosomal cross-linking de proteínas 150 0 75 Counts 225 300 Quantificação de DNA 0 200 400 600 800 1000 4N 2N PI Fluorescence DETECÇÃO de Sub G1 Células apoptóticas começam a ter menos DNA que células normais em G1 Indução de morte celular com adição de substância tóxica Detecção das fases iniciais de apoptose Residuos de Fosfatidilserina (PS) são translocados para a face externa: Sinal para as células vizinhas iniciarem a fagocitose Fluorescence Activated Cell Sorting 488 nm laser FSC Fluorescence detector Placas carregadas - + Células separadas e recolhidas uma a uma As células podem ser separadas até 25,000 células/segundo em ambiente esterelizado (importante para estudos in vitro ou in vivo das células separadas) Adaptado de Purdue University Cytometry Laboratories
