Como interpretar? ? Dra Silvia Inés A C Pires Ferreira

Aplicações Clínicas da Citometria de Fluxo
Imunologia
Hematologia
•
Diagnóstico baseado nas células
•
Prognóstico baseado nas células
•
Monitoramento de terapias
•
Analise de lesões e morte celular
Anatomia patológica
Biologia celular
Oncologia

Avaliação de populações celulares: normais/
reativas/ em regeneração/ malignas.

Classificar as neoplasias hematopoiéticas

Monitorar a eficácia do tratamento: Estudo da
doença residual mínima
Imunofenotipagem (IMF) - Etapas

Indicação clínica e Avaliação dos dados clínicos

Marcação das amostras: Seleção e combinação de
AcMo, Morfologia

Análise e interpretação de dados:
› Caracterização fenotípica das populações celulares:
normais e alteradas
› Identificação da população neoplásica

Laudo : diagnóstico ou descritivo

Conhecimento da diferenciação imunofenotipica
das células hematopoiéticas em medula óssea
normal, timo e outros tecidos, e sua freqüência:
› Permite a seleção adequada de painéis (AcMo)
› Reconhecimento de padrões anormais de diferenciação,
de proliferações, de células em regeneração, de padrões
reativos

“software”de analises para CF : melhora a
capacidade, eficiência e velocidade de analise
dos dados pois informam simultaneamente uma
serie de parâmetros numa única células.
Selecionar o painel adequado dos marcadores antigênicos
 Definir as populações a analisadas em % e qualitativamente:
› Blastos
› maturação
de neutrófilos, monócitos e com menor
freqüência: eritroblastos e megacariocitos


Definir as alterações fenotípicas a serem consideradas:
› alterações numéricas , aberrações fenotípicas nos blastos.
› intensidade de fluorescência
› expressão assíncrona de marcadores associados à
maturação
Loken et al, Leuk Res, 2007
Interpretação de dados
› Descrever em % as populações celulares da amostra:
normais ou alteradas.
› Nas neoplasias hematopoiéticas correlacionar com a
classificação da OMS
› Comentar as limitações de interpretação
› Emitir o laudo.




Tipo de amostra
Indicação e historia clinica
Dados morfológicos
Combinações dos diferentes tubos de AcMo
baseada na expressão antigênica das
células durante a hematopoiese em MO.

Objetivo: detectar e diferenciar as linhagens
de células hematopoiéticas e seus estádios
maturativos
Combinação mínima de AcMo com sensibilidade para
demonstrar a presença ou ausência de neoplasia
hematopoiética.

CD79a citoplasma, CD10, CD19, CD20, CD45,
Kappa, Lambda.
Linfócitos T/NK

CD2, CD3citoplasma ou membrana, CD4,
CD5, CD7,CD8,CD56
Células
Mielomonocíticas

MPO,CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33,
CD117, CD34, CD7, CD56
Células
Plasmáticas

CD19, CD38, CD56, CD117
Linfócitos B
Wood B., Cytometry, Part B. 2007
Combinação de AcMo que permita realizar o diagnóstico,
classificação e auxilie no prognóstico
Linfócitos B
Linfócitos T/NK

CD9, CD11c, CD15, CD22, cCD22, CD23, CD25, CD13, CD33,
CD34, CD38, CD43, CD58, CD79b, CD103, FMC7, Bcl-2,
cKappa, cLambda, TdT, Zap-70, cIgM/membrana

CD1a, cCD3, CD10, CD16, CD25, CD26, CD30,
CD34, CD45RA, CD45RO, CD57, ab-TCR, gd-TCR,
cTIA-1, TdT

Células
Mielomonocíticas
Células
Plasmáticas

CD2, CD4, CD25, CD36, CD38, CD41, CD61, CD61c,
CD64, CD71, CD123, CD163, CD235a, CD105.
CD10, CD138, CD56, CD117,
Wood B., Cytometry, Part B. 2007

serie de etapas com múltiplas mudanças e variações na
intensidade de expressão de produtos gênicos nas células
hematopoiéticas.
Precursor Linfoide
Cel.Tronco
Precursor Mielóide
Linfócitos-T
Linfócitos-B
Células-NK
CD Plasmocitoides
Células Eritróides
Células Megacariocíticas
Neutrófilos
Monócitos
CD Monocíticas
Eosinófilos
Basófilos
Mastócitos
Celulas
%±
% dp
Intervalo 2dp
CD34+(CPH)
1,1
± 0,6
0,3 – 2,6
CD34+ ou CD117+
2,2
± 1,4
0,6 – 6.0
Eritroides
4,7
± 2,1
2.0 – 9.0
Neutrófilos
67
± 6,1
57 – 80
Células monocitárias
4,3
± 1,4
2.0 – 6.0
Eosinofilos
2,5
± 1.3
0,8 – 5.0
Basófilos
0,4
± 0.4
<0.1 – 2.4
Mastocitos
0,02
± 0.02
<0.03
Plasmocitos
0,2
± 0.2
0.01 –0.5
Linfócitos B maturos
2,9
± 1.5
1.6 – 6.3
Linfócitos B precursores
0,9
± 0.8
0.1 – 3.9
Linfócitos T
9,2
± 4.5
2.6 - 18.0
Células Natural Killer
2,8
± 1.4
0.7 – 5.0
Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009
Linhagem
Eritroide
% Freqüência
15
B
5 -35
Megacariocitica <1
31
12 - 39
Eosinofilica
<1
Basofilica
<1
<1 - 3
Monocitica
5
3 -15
Mastocitica
<1
Dendritica Pl
6
1 -15
Linfoide B
23
<1 - 45
Total
81
SSC
Neutrofilica
CD34+
HPC
CD34-APC
% CD34+ HPC: 1.1 + 0.6 (0.3-2.6)
Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009
Informação Fenotípica

Identificação e enumeração das CP CD34+ da MO e seu
comprometimento às diferentes linhagens :
› Imaturas e comprometidas a linhagem neutrofilica e
linfoides B
› Outras CP: monociticas, basofilicas, dendriticas (pDC),
mastocíticas e eritróides.

Caracterização fenotípica dos diferentes compartimentos das
CP CD34+ ( MO normal x MO SMD) :
› Detecção de bloqueios maturativos em MO displásica
› Investigação de padrões alterados na expressão de
antígenos individuais.
MO Normal
Monócitos
SSC
Granulócitos
S.Eritróide
CP CD34+
CD45
SSC
SSC
SSC
MO SMD: Fenótipos Alterados
CD45
CD45
CD45
Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009
CPH
Pluripotente
• CPH CD34+ Linfóide origina:
linfócitos T e B
CPH
Linfoide
• Maturação T- timo
• Maturação B - MO
Progenitor
Linfoide T
Progenitor
Linfoide
B
Progenitor
Linfoide B
Celulas T
• Células Plasma ticas - presentes
na MO,tecido linfático e
tecido conectivo
Celulas B
Celulas
Plasmaticas
Timo
Medula Ossea
Ross 5th Ed Table 10.4
Maturação de Linfócitos B
SP
MO
Tecidos
Linfoides
SP
MO
Mucosa
Baco
Perez M., Cytometry, Part B. 2010
Maturação de linfócitos T
Prótimócito
Timócito
Precoce
Timócito
Comum
Timócito
Maduro
CD34,HLA-DR
TdT
TdT
(CD10) TdT
(TdT)
CD3c
CD3c
CD3c
(TCR-CD3)
CD1a
CD2,CD7
CD5
(CD3c)
TCR-CD3
CD2 CD7
CD2 CD7
CD5
CD2 CD7
CD5
CD4
ou
CD8
CD4 TCR-CD3
CD2 CD7 CD5
CD4 CD8
CD8 TCR-CD3
CD2 CD7 CD5
Linfócitos T - Timo
Linfócitos T Periféricos
Linfócitos B
Sangue periférico Normal
Piatosa B., Cytometry, Part B. 2010

Células B circulantes :
› Os diferentes fenótipos estão relacionados ao processo maturacional
› Correlação com o estado imune : alterações no desenvolvimento de
células B, auto-imunidades, e linfoproliferação, tais como a linfocitose B
monoclonal
Perez M., Cytometry, Part B. 2010
WHO, 4th Ed., Fig 8.02, 2008
Fenotipos B – Normal x neoplásico
CD45
CD38
MO normal
CD34
CD34
CD45
CD38
Blastos na LLA-B
CD34
CD34
WHO, 4th Ed., Fig. 8.04, 2008
Blastos de LLA-T
Origem das células
Linfocito B
Linfocito T
Relacao
Pele
<1
> 95
95
Timo
<1
> 95
95
Linfonodo
20
70
3.5
Baco
50
40
0.8
Tonsilas
50
40
0.8
Lamina P.
30
70
2.3
Placas de Peyer
40
45
1.1
Int Delgado
Cuidado! A freqüência dos linfócitos e influenciada por muitas
variáveis: Idade, sexo, stress, Infecções ...
Westermann J.; J of Mol. Med., 1992

Distribuição da população celular (n=15), analisada por
CF . Volume LCR: 1.3 ± 0.6 mL ( 0.3 – 2.4 mL)
Quijano S. et al., JCO 2009
Diferenciação Granulocítica – MO normal
CD34+
CD117+
HLA-DR+
CD13+forte
CD33+forte
CD13+ fraco
CD33+
CD15 +
CD11b+
Promielocito
Mielocito
Densidade antigênica
Mieloblasto
HLA-DR-/+
CD13+
CD33+forte
CD15+
CD11b-/+
Maturação Neutrofílica
CD13+
CD33+f
CD15 +
CD11b+ CD16-/+
Meta-mielocito
Bastao
CD13+forte
CD33+fraco
CD15
CD11b+fo CD16+fo
Neutrofilo
Maturação neutrófilos
Analise da expressão de CD13, CD11b, CD15, MPO
Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009
Diferenciação Granulocítica – MO normal
Promonócito
Monócito
Densidade antigênica
Monoblasto
Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009
CÉLULAS MONOCÍTICAS
Irem-2
MO NORMAL
Irem-2
MO SMD: Fenótipos Alterados
Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009
Estágio I
Estágio II
Estágio III
Estágio IV
Densidade antigênica
Eritrócitos
SSC
CD64
MO Normal
CD45
CD36
SSC
CD64
MO SMD: Fenótipos Alterados
CD45
CD36
Orfao A. , Simpósio Citometria, Sao Paulo 2009

A IMF por CF :
› Método ágil e preciso.

Uma boa análise e interpretação exigem:
› Um conhecimento sólido da técnica e dos padrões
normais da expressão antigênica nas diferentes
populações.

É necessário a padronização e validação da técnica
para obter informações precisas.

Novos programas de análise, novos fluorocromos e
anticorpos monoclonais, abrem novas perspectivas
para esta tecnologia.
Obrigada!
Chng W. et al, Clin and Diag Lab Imm., 2004