Perfil de Resultados – Proficiência Clínica

Perfil de Resultados – Proficiência Clínica
Área: Citometria de Fluxo
Rodada: Set/2015
Tema
Elaboradores
Quantificação de Subopulação Linfocitária e Células Progenitoras CD34 por Citometria de
Fluxo
Nydia Strachman Bacal – Médica Hematologista e Patologista Clínica. Laboratório Clínico do Departamento
de Patologia Clínica – Medicina Diagnóstica Hospital Albert Einstein. Centro de Hematologia de São Paulo.
Ana Carolina Apelle Bortolucci – Biomédica. Analista de Laboratório Setor de Citometria de Fluxo.
Laboratório Clínico do Departamento de Patologia Clínica – Medicina Diagnóstica Hospital Albert Einstein.
Laiz Cameirão Bento – Biomédica. Analista de Laboratório Setor de Citometria de Fluxo. Laboratório Clínico
do Departamento de Patologia Clínica – Medicina Diagnóstica Hospital Albert Einstein.
Rodolfo Patussi Correia – Farmacêutico. Analista de Laboratório Setor de Citometria de Fluxo. Laboratório
Clínico do Departamento de Patologia Clínica – Medicina Diagnóstica Hospital Albert Einstein.
Análise das respostas e comentários aos participantes
Questão 2: A resposta é a opção 4. A temperatura de transporte e armazenamento das amostras de sangue periférico até o seu
processamento deve ser de 18 a 25ºC. É importante que essa temperatura seja rigorosamente controlada e monitorada durante todo
o processo pré-analítico. A refrigeração a 4ºC pode estabilizar as células em condições em que o armazenamento pré-processamento
seja prolongado, porém, a refrigeração pode afetar seletivamente algumas populações de linfócitos, como os linfócitos T CD4+, e,
portanto, não é recomendada para análise de subpopulações linfocitárias. O mesmo vale para temperaturas elevadas, e que também
devem ser evitadas (1).
Questão 3: A resposta é a opção 3. O gate de linfócitos deve ser realizado utilizando critérios como a dispersão de luz e a expressão
de CD45 (SSC x CD45), sendo que a pureza deste gate deve ser controlada para que os resultados, de fato, sejam diretamente
proporcionais à população de linfócitos presentes na amostra. Os monócitos são uma das populações que mais contaminam o gate
de linfócitos, e na evidência dessa contaminação, é importante que os resultados sejam corrigidos. Dentre os marcadores de linhagem
monocítica, recomenda-se a utilização do CD14 no painel de subpopulação linfocitária, sendo que a região de células CD45+CD14neg
atrelada a região de linfócitos deve ser maior ou igual a 95,0%(1).
Questão 5: A resposta é a opção 4. A soma das porcentagens referente a todas as populações linfocitárias (linfócitos T, B e NK) deve
ser o mais próximo de 100%, mas sabendo que algumas condições clínicas e patológicas podem alterar estas populações, a soma
pode variar de +/- 10% do total de 100%. Este critério de consistência é importante, pois reflete diretamente a estratégia e pureza do
gate de linfócitos, que deve ser maior ou igual a 95,0%(1).
Questão 6: A resposta é a opção 3. Dentre as opções, a única que não deve ser considerada como ponto crítico de execução para
subpopulações linfocitárias por citometria de fluxo, é a lipemia na amostra de sangue periférico. Todas as outras opções podem
alterar significantemente os resultados.
Questão 7: A resposta é a opção 3. Por definição um método é considerado qualitativo quando não apresenta relação numérica
mensurável – são ensaios do tipo positivo/negativo e a comparabilidade é feita por meio de análise de concordância. Seu
desempenho deve ser avaliado por meio de parâmetros como sensibilidade, especificidade, valores preditivos e eficiência. Já para
ensaios quantitativos podem-se utilizar métodos comparativos aceitando como diferença o coeficiente de variação do ensaio(2,3).
Questão 8: A resposta é a opção 1. A marcação com CD34 de classe II pode ser utilizada para quantificação de células CD34+,
porém o anticorpo de classe II reconhece um alvo particular nas células CD34+ enquanto o anticorpo monoclonal CD34 classe III tem
afinidade à todas as variantes glicosiladas da molécula. Tendo em vista essa afirmação, a alternativa 2 onde se lê “A marcação com
CD34 de classe II deve ser utilizada, pois ela é capaz de detectar todas as glicoformas de CD34” se torna incorreta, invalidando a
alternativa 4 como resposta(1,4,5).
Questão 9: A resposta é a opção 3. O coeficiente de variação para a Quantificação de CD34+ deve ser de 10%. Para alcançar essa
precisão e sensibilidade, um mínimo de 100 eventos CD34+ deve ser adquiridos. Por exemplo, se a contagem de células CD34+ é de
0,13%, 75.000 eventos devem ser colecionados na região de células CD45+, para podermos obter uma contagem de 100 eventos em
região de CD34+(1,4,5).
Questão 10: A resposta é a opção 2. O gate em região de células CD45+, definido como leukocyte gate, tem a finalidade de
marcar/incluir todas as células hematopoiéticas presentes na amostra, bem como separar os glóbulos brancos dos glóbulos
vermelhos em casos de hemólise prejudicada, separar glóbulos brancos de eritroblastos, plaquetas e restos celulares, que são CD45
negativos(1,4,5).
Questão 11: A resposta é a opção 3. A viabilidade das células CD34+ deve avaliada pela técnica de citometria de fluxo, incluindo no
mesmo tubo os marcadores CD34, CD45 e um corante de viabilidade. O corante 7-amino actinomicina-D (7-aad) confere excelentes
resultados neste tipo de análise, e é o marcador recomendado pelo protocolo ISHAGE(1,4,5).
Questão 13: A resposta é a opção 2. A técnica de pipetagem reversa é indicada para a pipetagem de pequenos volumes e garante
maior precisão do volume a ser transferido. Como a medição de volume é um passo crítico em uma técnica de plataforma única, onde
um pequeno erro de pipetagem pode causar um erro significativo no resultado, é essencial a verificação periódica da calibração dos
instrumentos que são utilizados no laboratório. A verificação da calibração consiste em estabelecer a relação entre o valor indicado
pelo instrumento e o valor efetivamente medido. Portanto a utilização de pipetas calibradas juntamente com a técnica de pipetagem
reversa garantem maior precisão e acurácia ao teste.
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Rodada: Set/2015
Referências
Bibliográficas
•
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Enumeration of Immunologically Defined Cell
Populations by Flow Cytometry; Approved Guideline—Second Edition. CLSI document H42-A2 (ISBN 156238-640-9). Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne,
Pennsylvania 19087-1898 USA, 2007)(1).
•
www.portal.anvisa.gov.br(2).
•
www.sbpc.org.br(3).
•
SUTHERLAND, D. R.; KEENEY, M.; GRATAMA, J. W. Enumeration of CD34+ hematopoietic stem and
progenitor cells. Curr Protoc Cytom, v. Chapter 6, p. Unit 6 4, 2003(4).
•
Gratama J. et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells.
1998;34:128-145 (5).
Respostas dos Participantes
Opções (%)
Opção 1
Opção 2
Opção 3
Opção 4
Questão 1
1.3%
84.7%
14.0%
-
2
Questão 2
20.4%
2.5%
1.9%
74.5%
4
Questão 3
2.5%
6.4%
55.4%
33.1%
3
Resultado(s) aceito(s)
Questão 4
3.8%
7.0%
80.3%
7.6%
3
Questão 5
46.5%
18.5%
3.8%
25.5%
4
Questão 6
22.3%
17.2%
45.2%
12.7%
3
Questão 7
18.5%
7.0%
61.1%
9.6%
3
Questão 8
34.4%
8.3%
11.5%
38.9%
1
Questão 9
15.9%
14.0%
45.2%
21.0%
3
Questão 10
21.0%
47.8%
15.3%
7.6%
2
Questão 11
12.1%
19.7%
52.9%
10.2%
3
Questão 12
0.6%
90.4%
2.5%
3.8%
2
Questão 13
2.5%
58.6%
31.8%
3.2%
2
Questão 14
81.5%
4.5%
3.8%
6.4%
1
Questão 15
5.1%
77.7%
4.5%
9.6%
2
Questionários Respondidos
157
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