a importância da coloração de gram na triagem de amostras
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A IMPORTÂNCIA DA COLORAÇÃO DE GRAM NA TRIAGEM DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS Keite Nogueira GRAM: POR QUÊ? • • • • • • • Diagnóstico rápido Direcionar terapia Necessidade de cultura Avaliação de microbiota Monitoramento da cultura Suspeita de anaeróbios Interpretação da resposta inflamatória Preparo do Esfregaço 1. Lâminas limpas e novas 2. Espessura do esfregaço: mediana 3. Fixação 4. Amostras: Swab: rolar gentilmente sobre a lâmina Aspirados, exsudatos, escarro, fezes,etc. Selecionar porções purulentas Material espesso emulsionar em salina Preparo do Esfregaço Líquor e outros fluidos Centrifugar e processar o sedimento Urina: gota não centrifugada Material seco ou em pouca quantidade Biópsias e tecidos Cultura em caldo Colônia de meio sólido Métodos • Corante – Cristal violeta • Descorante – Álcool – Acetona – Álcool-acetona • Contracorante – Fucsina fenicada – Safranina * Hucker´s * Carbol-fucsina * Kopeloff´s Fucsin COLORAÇÃO DE GRAM • INTERPRETAÇÃO: – GRAM POSITIVO: parede com peptideoglicano e ác. teicoico, retém coloração violeta – GRAM NEGATIVO: parede com fina camada de peptideoglicano ligada a um fosfolipídio- polissacáride assimétrico Classificação • Tamanho e Morfologia • Arranjo • Afinidade aos corantes Interferentes • • • • • • • Fantasma Descoloração Tempo de ação do corante Uso de lâminas sujas e engorduradas Análise de campos isolados Aquecimento excessivo na fixação Esfregaço fino ou espesso Controle de Qualidade • Verificar os reagentes diariamente: – Precipitação do cristal violeta – Evitar a evaporação • Cepa padrão corada diariamente e a cada novo lote – E. coli ATCC 25922 – S. epidermidis ATCC 12228 ou – S. aureus ATCC 25923 Controle de Qualidade GRAM • AMOSTRA CLÍNICA: – Qualidade da amostra – Diagnóstico presuntivo – Diagnóstico definitivo Triagem /Diagnóstico Presuntivo • Anaeróbio • Bactérias Fastidiosas • Urocultura – Bacterioscopia da urina não centrifugada Triagem - Anaeróbios Triagem - Anaeróbios Triagem - Anaeróbios Triagem – Bactérias Fastidiosas Triagem – Bactérias Fastidiosas Triagem de URINA Gram da Gota Não Centrifugada • Considera-se como “positivo” o esfregaço que contiver pelo menos uma bactéria ou leucócito por campo de grande aumento (1.000x), em urinas não-centrifugadas e bem homogeneizadas. Triagem – Gram da Gota de Urina Não Centrifugada Diagnóstico Definitivo Uretrite masculina - Neisseria gonorrhoeae Diagnóstico Definitivo Vaginose bacteriana - Gardnerella e Mobiluncus Diagnóstico Definitivo Vaginose bacteriana - Gardnerella e Mobiluncus CRITÉRIOS DE NUGENT BACTÉRIAS N.º DE BACTÉRIAS SCORE Lactobacilos >30 5-30 1-4 <1 0 >5 1-4 0 >30 5-30 1-4 <1 0 0 1 2 3 4 2 1 0 4 3 2 1 0 Mobiluncus Gardnerella / Bacteroides Score 0-3 4-6 7-10 Interpretação Normal Intermediário, rep. Vaginose bact. Qualidade da Amostra - Feridas MÉTODO DO SCORE Q (Qualitativo) Leucócitos Células Epiteliais /CAMPO SCORE 0 1-9 10-24 >25 0 1-9 10-24 >25 0 +1 +2 +3 0 -1 -2 -3 INTERPRETAÇÃO Q3: Cultura aeróbia e anaeróbia Q2 ou Q1: Cultura aeróbia Q0 ou Inferior: Cultura aeróbia, contaminação ou colonização Qualidade da Amostra – Feridas e Secreções em Geral Qualidade da Amostra – Escarro e Amostras Respiratórias Qualidade da Amostra – Escarro e Amostras Respiratórias Avaliação da Amostra-Escarro • Exame macroscópico • Preparo da amostra Avaliação Bacteriológica do Escarro • Análise microscópica • Células epiteliais e leucócitos • A amostra ideal é aquela que contém pouca ou nenhuma célula epitelial (menos de 10 células epiteliais por campo) e leucócitos (mais de 25 leucócitos por campo). • Macrófagos alveolares e células colunares ciliadas • Bactérias: relatar aquelas que estão entre os leucócitos e macrófagos, no meio do muco. Coleta de Escarro • Seguir as instruções correntes • Evitar secreções do trato respiratório alto (principalmente pós-nasal) • Enviar imediatamente ao laboratório • Processar o quanto antes Avaliação Macroscópica Secreções Respiratórias • Serosa: Água + Eletrólitos + Mucoproteínas +células • Mucóide: Água + Eletrólitos + Mucoproteínas + Células • Purulenta: Componentes anteriores + Leucócitos em grande quantidade • Hemática: Componentes anteriores + sangue Preparo da Amostra Parte purulenta (grumos de pus) ou mucóide Lavagem com salina estéril (técnica original) Técnica adaptada: Os grumos devem ser retirados (palito de madeira) e arrastados sobre uma superfície estéril (placa de petri). O excesso de saliva fica aderido à superfície. O material purulento é então utilizado para a confecção do esfregaço e inoculação nos meios de cultivos. Avaliação Microscópica Sistema de graduação de Murray e Washington Classificação Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Células Epiteliais 25 25 25 10-25 <10 Leucócitos 10 10-25 25 25 >25 Avaliar no mínimo 10 campos, em aumento de 100X Considerações •A análise microscópica deve ser feita em áreas onde há menor número de células epiteliais. • Avaliar a presença de bactérias levando em consideração quantidade, predomínio, fagocitose e morfologia sugestiva de anaeróbios. •Macrófagos alveolares e células colunares ciliadas: são indicativos de trato respiratório inferior. ACHADOS EVENTUAIS ACHADOS EVENTUAIS ACHADOS EVENTUAIS ACHADOS EVENTUAIS ACHADOS EVENTUAIS ACHADOS EVENTUAIS ACHADOS EVENTUAIS ACHADOS EVENTUAIS ACHADOS EVENTUAIS ACHADOS EVENTUAIS ACHADOS EVENTUAIS ACHADOS EVENTUAIS ACHADOS EVENTUAIS ACHADOS EVENTUAIS ACHADOS EVENTUAIS VALE LEMBRAR • O preparo do esfregaço deve ser cuidadoso, procurar áreas representativas • Gram: cor, tamanho, forma e arranjo • A triagem pela pesquisa de células epiteliais e leucócitos pode ser utilizadas para diversos materiais clínicos • Pacientes neutropênicos ou infecção por bactérias que lisam leucócitos, outros parâmetros devem ser levados em consideração
