H - Departamento de Fisiologia e Biofísica

REAVALIANDO A FUNÇÃO DOS
ÁCIDOS GRAXOS
Rui Curi
Departamento de Fisiologia e Biofísica
ICB-USP
Gordura: Os ácidos graxos
ÁCIDOS GRAXOS SATURADOS
Ác. Palmítico (16:0)
O
CH2
CH3
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
C
CH2
CH2
CH2
O H
Carboxila
(Polar)
Radical
(Apolar)
Curta
ACETATO
PROPIONATO
BUTIRATO
C2
C3
C4
Média
LÁURICO
MIRÍSTICO
C12
C14
Longa
PALMÍTICO
ESTEÁRICO
ARAQUÍDICO
C16
C18
C20
> Número de Carbonos,
> Ponto de Fusão
Ácidos Graxos Poliinsaturados
Ácido Linoleico
18:2  6
2
13

3

6 carbonos
1
 C
Esteárico
18:0
COOH
CH3
H
H
Oleico
cis 18:1
C
Elaídico
trans 18:1
CH3
CH2
CH2
CH2
CH2
C
O
trans
CH2
cis
CH2
H
CH2
CH2
C
C
CH2
H
CH2
CH2
CH2
CH2
C
H
O
FUNÇÕES DOS
ÁCIDOS GRAXOS
TECIDO
ADIPOSO
1,2,3,4,…
Fabio Bessa-Lima
EXERCÍCIO AERÓBIO/JEJUM
SNC
DESEMPENHO
120 g/24 horas
GLICOSE
FÍGADO
 glicogenólise
 gliconeogênese
(ATP)
 Lipólise
ADIPÓCITO
Unger & Orci, 1981; Stumvoll et al., 1995
CONTEÚDO DE
GLICOGÊNIO
aa
 proteólise
AGL
MÚSCULO
ESQUELÉTICO
CICLO ÁCIDO GRAXO - GLICOSE
CICLO DE RANDLE
Acil-CoA
Acil-CoA
Acetil-CoA
OAA
CS
ACS
CoA
Citrato
Lactato
PDH
piruvato
FDP
-
ATP
 citrato
FFQ
F6P
AG
Mitocôndria
 AG
glicose
 G6P
HQ
-
Glicogênio
GLUT-4
glicose
RANDLE et al., 1963
Professor Sir Philip Randle has died in Oxford at the age of
80 on Tuesday, 26th September 2006, after a brief illness
Sir Philip Randle was founding Professor and Chairman (1964-1975) of the Department of Biochemistry at the University of Bristol, and then
founding Professor and Chairman (1975-1993) of the Nuffield Department of Clinical Biochemistry at Oxford University. He has served as a
senior member of a number of professional societies, including the Royal Society, of which he was Vice President (1988-89), and the
Biochemical Society, of which he is a former President (1995-2000).
The funeral arrangements are not yet known, beyond the fact that
it will be in Oxford
FOSFOLIPÍDIO
MEMBRANA CELULAR
FOSFOLIPÍDIOS DE MEMBRANA PLASMÁTICA
PROSTAGLANDINAS
Família 6
Família 3
Família 9
Linoleico
18:2  6
Linolênico
18:3  3
Oleico
18:1  9
Araquidônico
20:4  6
Eicosapentaenóico
EPA
22: 5  3
6 - dessaturase - 2 H
Elongase
+ 2 CH2
5 - dessaturase
Elongase
4 - dessaturase
Docosa-hexaenóico
DHA
22: 6  3
Ácidos Graxos e a Apoptose de
Linfócitos de Diabéticos
DIABETES
Pacientes diabéticos: incidência 3 a 4 vezes
maior de tuberculose (Banyai, 1931)
Diabéticos estão mais predispostos a certas
infecções (tais como otite externa malígna,
mucormicose rinocerebral)
EFEITO DO DIABETES NA MORTE
DO LINFÓCITO ?
Morte celular
Necrose:
• Processos patológicos
• Entumecimento celular
• Liberação de mediadores
lisossomais
• Perda da integridade de
membrana
Morte celular
Apoptose
• Morte celular programada
• Redução de volume celular
• Organelas permanecem
íntegras
• Condensação da cromatina
• Fragmentação nuclear
Kerr & Currie (1972)
Apoptose
x
Necrose
 A indução leva 1-3 h
 Trauma severo, induz
resposta inflamatória
  do tamanho celular
  do tamanho mitocondria
 Condensação da cromatina
 Perda de Membrana
(formação de “blebbing”)
 Fragmentação nuclear
 Floculação nuclear
 Perda da integridade
da membrana plasmática
CORPOS
APOPTÓTICOS
Citometria de fluxo
Fluxo
de
Amostra
Amostra
Side Angle
Side
Light Scatter
Tampão
Filtros
Ópticos
Laser
Lixo
Sistema
de Luzes
Sistema
Fluídico
Light
Angle
Scatter
Green
Green
fluorescence
Flourescen
FL1
ce (FL1
)
Red-Orange
Orang
-Red
fluorescence
Flourescen
e
FL2
ce (FL2
)
Red
Red
fluorescence
Flourescen
FL3
ce (FL3
)
Sistema Óptico e
Eletrônico
Forward Angle
Light Scatter
Fluorescência
Forward Angle
Foward
Light Scatter
Light
Angle
Scatter
Side Angle
Light Scatter
Detectores
Fluorescência
Sistemas de Controle
e Arquivo de Dados
Citometria de fluxo
Iodeto de Propídeo (PI)
Composto fluorescente que se liga ao DNA – intercala-se
inespecificamente entre as bases.
Normalmente não atravessa a membrana celular – pouco
lipossolúvel. Portanto, se atravessar indica perda de viabilidade.
Espectro de excitação a 488
nm e de emissão a 580 nm –
FL2.
Avaliação da Fragmentação de DNA
• Células
incubadas
em
tampão Citrato: Triton +
Iodeto de Propídeo por 24
horas a 4°C.
• Células são lisadas, expondo
seus núcleos.
INDUÇÃO DE DIABETES E OBTENÇÃO DE LINFÓCITOS
+ +
Administração de aloxana
(40mg/kg) i.v.
Jejum de 16 h
+ +
Após 7 dias
retirada do
linfonodo
mesentérico
Machos com
200-250g
Linfócitos livres
Imediatamente e após
cultura por 12, 24 e 48
horas
Effect of alloxan-induced diabetes on DNA fragmentation of
rat lymphocytes
DNA fragmentation (%)
Untreated
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
**
control
*
diabetic
*
*
**
0
12
24* 48
0
*
12
24 48 hours of culture
*P<0.05 for comparison with the control group.
Fragmentação do DNA
MW
Control
Diabetic
CONDENSAÇÃO DE CROMATINA
Coloração com Hoescht 33442
Linfócitos cultivados
por 24 e 48 h
Centrifugação
Pellet com 2x106
células em 20 µl
1µl de Hoescht
33442
(0,01mg/ml)
Microscopia de
fluorescência
5 min. incubação no
escuro
CONTROLE
DIABÉTICO
0h
Linfócitos de ratos
induzidos ao diabetes
por injeção de aloxana
e corados com
Hoescht 3334
24h
a
48h
Pacientes do Hospital Universitário
Diabéticos com glicemia acima de 200 mg/dL
11 homens e 3 mulheres
Idade de 13 a 82 anos
Controles – 9 homens e 5 mulheres
Idade de 21 a 43 anos
Obtenção de linfócitos humanos
1:1
1:2
25 mL
PBS
6 mL
PBS
sangue
diluído
25 mL
sangue
3 mL
mononucleares
centrifuga 30 min
1200 rpm 25oC
histopaque
histopaque
neutrófilos
eritrófilos
30 min
centrifuga 10 min
1200 rpm 4oC
pellet
em suspensão Aderidas
Linfócitos monócitos
Fragmentação de DNA em Linfócitos Humanos
cells with fragmented DNA (%)
20
*
18
16
14
12
10
8
6
*
4
2
0
Freshly obtained1
48 h in culture
*P<0.05 comparado com o controle
control
diabetic
Avaliação molecular de uma
paciente diabética descompensada
não diagnosticada
Anti-apoptotic
Pro-apoptotic
bcl-x S
2.5
2.5
2
2
arbitrary unit
arbitrary unit
bcl-2
1.5
1
0.5
1.5
1
0.5
0
0
control
cont rol
DM
DM
GAPDH
p 53
2
arbitrary unit
arbitrary unit
c-myc
2.5
2.5
1.5
1
0.5
2
1.5
1
0.5
0
0
control
control
DM
GAPDH
DM
Possível Papel da
Glicose ?
Análise em LY humanos e de
ratos, células Raji, Jurkat
Lymphocytes with Fragmented DNA (%)
Correlação entre a proporção de linfócitos com DNA
fragmentado e a concentração de glicose no sangue
2
R = 0.1661
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
200
400
600
800
Blood Glucose Levels (mg/dl)
1000
1200
Efeito do tratamento com insulina (2 U por rato - 3 dias)
sobre a fragmentação do DNA de linfócitos de ratos
cells with fragmented DNA (%)
100
*
90
80
70
60
50
40
30
20
10
*
0
0 h 0h control
48 h48h diabetic
0 h 0h diabetic
48 h 48h diabetic
0 h 0h diabetic
48 h48h
control
control
diabetic
insulin treated diabetic
*P<0.05 para comparação com o controle.
Possível Papel dos
Corpos Cetônicos?
DIABÉTICO:  INSULINA
CETOGÊNESE
FÍGADO
 LIPÓLISE
AGL
ADIPÓCITO
Unger & Orci, 1981; Stumvoll et al., 1995
CORPOS
CETÔNICOS
Sem efeito
Na morte de
linfócitos
DIABÉTICO:  INSULINA
 LIPÓLISE
ADIPÓCITO
Unger & Orci, 1981; Stumvoll et al., 1995
AGL
mEq/L de ácidos graxos livres
Concentração plasmática de ácidos graxos livres
0.6
*
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
controle
diabético
Linfócitos de ratos jejuados por 16, 24 e 48 horas
controle
% de células com DNA fragment ado
Fragmentação de DNA em linfócitos de ratos em jejum
jejum
a
60
a
a
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Tempo (h) de jejum
40
45
50
55
PAPEL DOS ÁCIDOS GRAXOS NA MORTE
DE LEUCÓCITOS DURANTE EXERCÍCIO
FÍSICO MUITO INTENSO
Distâncias percorridas em provas oficiais
Prova
Natação
Ciclismo
Corrida
Duração da
Km
Km
Km
prova
Ironman
3,8
180
42,2
 8h e 30 min
Half Ironman
2
90
21
4h
Olímpico
1,5
40
10
2h
Short/Sprint
0,75
20
5
 58 min
Concentração de AG livre (mEq/L)
Correlação positiva entre fragmentação de DNA e
concentração de ácidos graxos livres
r=0,688
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5
10
15
20
25
% de células com DNA fragmentado
30
Possível Papel dos
Ácidos Graxos ?
Toxicidade dos Ácidos Graxos
Em Linhagens Linfocíticas
• Cultivo de células Jurkat (linfócito T) e
Raji (linfócito B) por 24 horas na
presença de diferentes ácidos graxos.
• As concentrações de AG variaram de
50 M a 1 mM.
Concentração Máxima Tolerada de Ácidos Graxos
Mais abundantes
no plasma
Mais tóxicos
Ácido Graxo
Jurkat
Raji
Propiônico C3:0
> 1mM
> 1mM
Butírico C4:0
800M
700M
Capróico C6:0
> 1mM
> 1mM
Caprílico C8:0
> 1mM
> 1mM
Cáprico C10:0
400M
400M
Láurico C12:0
200M
200M
Mirístico C14:0
150M
150M
Palmítico C16:0
50M
100M
Palmitoleico C16:1
100M
100M
Esteárico C18:0
50M
50M
Oléico C18:1
250M
250M
Elaídico C18:1
300M
400M
Vacênico C18:1
200M
150M
Linoleico C18:2
100M
100M
Linolênico C18:3
50M
50M
Araquidônico C20:4
50M
25M
Eicosapentaenóico C20:5
50M
25M
Docosahexaenóico C22:6
50M
25M
Menos tóxicos
ÁCIDOS GRAXOS DO PLASMA DE RATOS DIABÉTICOS (HPLC)
Proporção de
ácidos graxos
no plasma de
ratos
CONTROLE
CONTROLE
DIA 6
0.76±0.25
a
Láurico
1.74±0.39
Linolênico
1.28±0.34
DHE
1.79±0.22
Mirístico
5.16±0.36
5.14±0.85
AA
3.21±0.41
11.74±1.65
1.85±0.54
3.65±1.13
a
a
DIA 6
0.0017mM
0.00076mM
0.0012 mM
0.00185mM
0.0017mM
0.0036mM
0.0051mM
0.0051mM
0.003mM
0.011mM
Palmitoléico
1.08±0.2
1.87±0.65
0.001mM
0.0018mM
Linoléico
9.55±0.9
12.3±3.9
a
0.009mM
0.012mM
Palmítico
31.13±0.94
0.03mM
0.03mM
0.0046mM
0.016mM
Oléico
Esteárico
Eicosa
4.61±0.38
30.69±1.43
16.32±1.96
a
40.7±1.5
40.65±7.1
0.04mM
0.04mM
0.45±0.02
0.45±0.08
0.0004mM
0.0004mM
RATO DIABÉTICO POR ALOXANA:
Ácido oleico apresentou aumento de
cerca de 4 vezes
TOXICIDADE DO ÁCIDO OLEICO?
EFEITOS DO ÁCIDO OLEICO EM
CÉLULAS JURKAT CULTIVADAS
POR 12, 24 E 48 HORAS
Volume e granulosidade
das células Jurkat
OLÉICO 100 µM
granulosidade
granulosidade
CONTROLE
volume
volume
% de células viavéis
Viabilidade Celular
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
*
*
*
*
*
0
25
50
24 h
48 h
72 h
*
**
**
100
200
Concentração de oléico (µM)
% de DNA fragmentado
Fragmentação de DNA
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
*
*
*
*
*
0
25
50
100
200
Concentração de oléico (µM)
24 h
48 h
72 h
Condensação de Cromatina
controle
oléico 100 µM
CELULAS
Apoptoticas
Viaveis
Folheto Externo
Folheto Interno
Fosfatidilserina
AnexinaV
% de células com
externalização de fosfatidilserina
Externalização de Fosfatidilserina
16
14
12
10
*
controle
8
6
4
2
0
AO 100 µM
0
6 12 18 24
Tempo (horas)
ÁCIDOS GRAXOS DO PLASMA DE RATOS DIABÉTICOS (HPLC)
Proporção de
ácidos graxos
no plasma de
ratos
CONTROLE
CONTROLE
DIA 6
0.76±0.25
a
Láurico
1.74±0.39
Linolênico
1.28±0.34
DHE
1.79±0.22
Mirístico
5.16±0.36
5.14±0.85
AA
3.21±0.41
11.74±1.65
1.85±0.54
3.65±1.13
a
a
DIA 6
0.0017mM
0.00076mM
0.0012 mM
0.00185mM
0.0017mM
0.0036mM
0.0051mM
0.0051mM
0.003mM
0.011mM
Palmitoléico
1.08±0.2
1.87±0.65
0.001mM
0.0018mM
Linoléico
9.55±0.9
12.3±3.9
a
0.009mM
0.012mM
Palmítico
31.13±0.94
0.03mM
0.03mM
0.0046mM
0.016mM
Oléico
Esteárico
Eicosa
4.61±0.38
30.69±1.43
16.32±1.96
a
40.7±1.5
40.65±7.1
0.04mM
0.04mM
0.45±0.02
0.45±0.08
0.0004mM
0.0004mM
Solução: 0,10mM -----100%
x -----1,74%=0,0017mM
Fragmentação de DNA em LY humanos com diferentes [ ] ácidos graxos
100
*
80
*
*
*
*
*
60
40
20
0
normal
etanol
0.1
0.2
0.3
controle
0.4
0.1
0.2
0.3
diabético
0.4
mM
Mitochondrial Transmembrane Potential (MTP)
External
mitochondrial
membrane
H+
H+
Intermembrane Space
+
H
+++++++++
++++++++
H+ H+ H+ H+
H+ H+
+
H+
H
+
H H+
+ H+ H+
H+
+ H+H+ H+
+
H
H
H
+
+
H+ H
H+ H+ H+ H H+ H+
H+
H+
H+ H+ H+
Internal
mitochondrial
membrane
-------roda-------roda-
roda
roda roda
H+
H+
+
H+H
H+
H+
H+
+
H+ H+H H+
H+
+
H+
H
ADP
H+
H+
H+
ATP
+
H
H+
+
H+ H H+ +
H
Mitochondrial Transmembrane Potential (MTP)
External
mitochondrial
membrane
H+
H+
Intermembrane Space
+++
+++
H+
H+ H+ H+
H
H+
Internal
mitochondrial
membrane
--roda --
H+
roda
H+
+
H+H
H+
+
H+
H
+ H+
H+ +
H
+
H+ H+ H+ H H+
+
H+
H+
+
H+ H+H H+
H+
+
H+
H
ADP
H+
H+
ATP
H+
H+
H+H+ H+
H+
H+
+
H
H+
+
H+ H H+ +
H
Marcação com Rodamina 123 em LY humanos após 40h
% de células com membrana
despolarizada
45
*
40
35
30
25
*
*
0.3
0.4
*
20
15
10
5
0
normal
etanol
0.2
0.3
controle
0.4
0.2
diabético
mM
ESTADO
DIABÉTICO
ÁCIDOS
GRAXOS?
mitocôndria
APOPTOSE DE
LINFÓCITOS
IDENTIFICAÇÃO DE GENES
REGULADOS PELO ÁCIDO
OLEICO
EM CÉLULAS JURKAT E RAJI
POR
“MACROARRAY”
Linhagem de
células
Célula tratada
Célula controle
Tratamento da cultura de
células com ácido oleico (50 M)
por 24 horas
Tratamento com etanol
(controle)
Extração do RNA total, síntese de
cDNA e marcação da sonda com
33P
Hibridização
Análise da membrana por densitometria (Array-Pro Analyzer)
Confirmação por PCR
Ácido Graxo
(DHA)
Controle
Genes Regulados pelo Ácido Oleico
nas Células RAJI
Citocinas e receptores relacionados - 1
Vias de transdução de sinais - 6
 Fatores de transcrição e genes relacionados - 7
 Ciclo celular - 2
 Defesa e reparo - 6
 Síntese de DNA - 2
 Apoptose – 5 (CASP 3, BAX, bcl-xL, Bcl2, BIK)
ESTADO
DIABÉTICO
ÁCIDOS
GRAXOS?
ÁCIDOS
GRAXOS?
PPAR
mitocôndria
APOPTOSE DE
LINFÓCITOS
EFEITO DOS ÁCIDOS GRAXOS NA
SINALIZAÇÃO INTRACELULAR EM
LEUCÓCITOS
IL-2
IL-2

JAK 3
JAK 3
JAK 1
P
g

P
IL-2R
Gab2
P
JAK 1
P
P
P
P
JAK 3
JAK 1
P
P
Shc
P
P
P
Grb2
Sos
Ras-GDP
Ras-GTP
PI-3K
AKT
IL-2
+ cyclin D1
P
P
STAT5 a/b
ERK
+ E2F
transcription
NF-kB activation
Inhibition of: Bad,
caspase 9,GSK-3
Elk-1, Fos, AP-1, NF-AT, cMyc
Transcription factors
Cell proliferation
P
NOSSO GRUPO VEM
ESTUDANDO HÁ 10 ANOS A
TRANSFERÊNCIA DE ÁCIDOS
GRAXOS ENTRE CÉLULAS
Glicose
Exportados
piruvato
Colesterol
Fosfolipídios
Ácidos graxos
Lipídios
PEP
OAA
Acetil-CoA
malato
acetato
malato
oxoglutarato
glutamato
Glutamina
piruvato
Acetil-CoA
acetoacetato
AOA
Krebs
citrato
mitocôndria
18 mL MEM SFB 10%
1,0x107 linfócitos / 2 mL
(0,2Ci/ 2mL) de [14C]-ácido graxo
6h
Adesão dos macrófagos
(6h)
Incorporação
em lipídios
insert
Macrófagos
aderidos
Co-cultura (3h)
Transferência da radioatividade
para os macrófagos
Análise dos lipídios: Extração e TLC
Transferência de Ácidos Graxos entre Leucócitos
glicose e
glutamina
glicose e
glutamina
ácidos graxos
Macrófago
ácidos graxos
Linfócito
modula a proliferação
modula a fagocitose
Transferência de Ácidos Graxos
in vivo
[14C]- ác. Araquidônico
MACRÓFAGO
Insulina
ILHOTAS
Ácidos graxos
Ácidos graxos
Ácidos graxos
MACRÓFAGOS
LINFÓCITOS
Tec. Adiposo
ILHOTAS
DE
LANGERHANS
(CITOCINAS, HORMÔNIOS)
ÁCIDOS GRAXOS
AGL
AGL
CIRCULAÇÃO
MONÓCITOS/ LINFÓCITOS
Músculo
Esquelético
Fibroblastos
Linfócitos
Macrófagos
AGL
Endotélio
Ilhotas de
Langerhans
Neutrófilos
Bicamada
Lipídica
AGRADECIMENTOS
Laboratório de Fisiologia Celular
NENHUM PÁSSARO
VOARÁ ALTO DEMAIS SE
ESTIVER VOANDO
APENAS COM SUAS ASAS.
William Blake
Artigos publicados pelo grupo sobre ácidos graxos nos últimos 5 anos
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OUR GROUP AND
COLLABORATIONS
Senior researchers: Tania C. Pithon Curi, Rosemari Otton, Sandra Sampaio Cocuzzo, Anna
Karenina de Azevedo Martins, Maria Fernanda Cury Boaventura, Claudia Jacques
Lagranha, Reinaldo Bassit and Tatiana C. Alba-Loureiro.
Technicians: Ms. Érica Paula Portioli, José Roberto Mendonça, and Geraldina de Souza.
Post-doctors: Thais Martins de Lima, Leonardo dos Reis Silveira, Elaine Hatanaka, Sandro
Massao Hirabara.
PhD students: Renata Gorjão, Aurélio Pimenta, Augusto Ducati Luchessi, Tavane David
Cambiaghi, Marco Aurélio Ramirez, Hilton Kenji Takahashi, Jarlei Fiamoncini, Adriana
Cristina Levada Pires, and Rafael Herling Lambertucci.
Master students: Fernanda Berdariol, and Carlos Hermano.
Undergraduate students: Monique N. Simões, Thiago Crespo Hirata, Vivian Paschoal.
Brazilian Collaborators: Angelo R. Carpinelli, Joaquim Procopio, Jorge Mancini Filho, Yara
Cury, Carla Roberta Carvalho, Silvana Bordin, Mario Saad, Lício Velloso, Anibal Vercesi,
Antonio C. Boschero, Everardo Magalhães, and Dan Waitzberg.
Internacional Collaborators: Philip Newsholme, Philip Calder, Parveen Yaqoob, Sigurd
Lenzen, Rolando Bacis Ceddia, and Sonia Q. Doi.
Financial Support: FAPESP, CNPq, CAPES
Convite:
Departamento de
Fisiologia e Biofísica
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Sítio: www.fisio.icb.usp.br