Micro aula 4 - Coloração de Gram

UPC II – Microbiologia
Aula prática 4
2012/2013
Maria José Correia
17/10/2012
Sumário P4:

Observação de bactérias do biofilme oral
 Preparação de esfregaço
 Técnicas de coloração:


22/10/2012
Colorações simples (azul de metileno)
Colorações diferenciais (Coloração de Gram)
UPC II - Microbiologia 2012/2013
2
Técnicas de coloração
o Permitem revelar a forma, a dimensão e os
componentes das células bacterianas, bem como, os
aspetos bioquímicos da sua estrutura.
o Permitem observar células bacterianas em
microscopia de campo claro.
o Como o índice de refração do protoplasma
bacteriano difere muito pouco do meio circundante, é
difícil o exame direto de preparações não coradas, a
não ser que se utilizem técnicas especiais de iluminação.
22/10/2012
UPC II - Microbiologia 2012/2013
3
Técnicas de coloração

Preparação do esfregaço

Fixação do esfregaço

Coloração

Observação ao microscópio
22/10/2012
UPC II - Microbiologia 2012/2013
4
Preparação e fixação do esfregaço
o Preparado sobre uma gota de água
abrangendo uma superfície de 1 cm2
o As lâminas usadas devem ser lavadas com uma
mistura de álcool-éter (1:1)
o Fixação pelo calor em movimentos circulares.
o Evitar aquecer demasiado a preparação para
não destruir as células
22/10/2012
UPC II - Microbiologia 2012/2013
5
Em caso de incêndio….
Manter a calma!!… os movimentos rápidos alimentam
a combustão
Tapar o frasco
e a lamparina
NÃO APAGAR O FOGO
COM ÁGUA
Cobertor
Extintor
22/10/2012
UPC II - Microbiologia 2012/2013
6
Azul de metileno
• Método de coloração simples – utilização de um único
corante.
• Corante básico ou catiónico - fixado pelas estruturas
mais negativas da célula como os ácidos nucleicos e
a parede celular das bactérias
22/10/2012
UPC II - Microbiologia 2012/2013
7
Coloração com azul de metileno
1. Corar com azul de metileno durante 1 minuto
2. Lavar com água
3. Secar com cuidado e observar ao microscópio
http://www.bigroom.org/wordpress/?m=200704
22/10/2012
UPC II - Microbiologia 2012/2013
8
Coloração de Gram
• Coloração diferencial
• Distingue bactérias Gram + de bactérias Gram• Indispensável na identificação bacteriana
Gram +
Gram -
http://www.apsnet.org/education/IntroPlantPath/PathogenGroups/bacteria/text/fig12.htm
22/10/2012
UPC II - Microbiologia 2012/2013
9
Bactérias Gram+ e Gram
Composição diferente da parede celular

Gram+: Parede homogénea e espessa, formada
essencialmente por peptidoglucano, baixa percentagem
de lipoproteínas.

Gram-: Parede fina, camada de peptidoglucano fina,
camada externa complexa, formada por lipoproteínas e
polissacarídeos
22/10/2012
UPC II - Microbiologia 2012/2013
10
Coloração de Gram
dH2O
dH2O
Violeta de
cristal
Lugol
(iodo)
Álcool
Safranina
1 minuto
1 minuto
30-60 segundos
30-60 segundos
22/10/2012
UPC II - Microbiologia 2012/2013
11
Trabalho a realizar:
oIsolamento de colónias (biofilme oral):
• Repicagem (riscado em placa)
oPreparação de esfregaço a partir de meio líquido e
sólido
oTécnicas de coloração:
• Coloração de Gram
22/10/2012
UPC II - Microbiologia 2012/2013
12