Influência dos miRNAs na activacao da microglia
Propaganda
OCUPAÇÃO CIENTIFICA NAS FÉRIAS 12 - 23 JULHO 2010 Influência dos miRNAs na activação da microglia Coordenação : Doutora Ana Luísa Cardoso Juliana Simões Beatriz Corte Real Martins ÍNDICE Introdução Actividades laboratoriais realizadas: Plaqueamento de células Transfecção Western Blot Alamar Blue: Viabilidade Teste de Griess qRT-PCR: Extracção de RNA e Transcrição Conclusão INTRODUÇÃO Durante estas duas semanas, realizámos experiências no âmbito do estudo da microglia. Este tipo de células, juntamente com os astrócitos e os neurónios, constituem os tipos celulares presentes no cérebro. A microglia é o conjunto celular responsável pela protecção do cérebro e desempenha funções de suporte, protecção e eliminação de possíveis ameaças. Leg.1: Activação da Microglia ☺PLAQUEAMENTO DE CÉLULAS☺ Objectivo: Colocar o mesmo número de células em cada multiwell Procedimento: 1º: Retirar as células do frasco para um falcon 2º Contar as células com o hemocitómetro 3º Fazer uma solução com a densidade celular desejada 4º Distribuir pelos 24 poços Leg.2. Observação do hemocitómetro ao microscópio Leg.3. Visualização de células ao microscópio ☺TRANSFECÇÃO ☺ * Objectivo: Introduzir um plasmídeo para expressar algo ( no nosso caso, proteína GFP) * Procedimento: 1º Preparar os complexos de lipossomas+folatos+DNA 2º Distribuir os complexos pelos poços e aguardar 4 horas 3º Mudar o meio celular para o mesmo não se tornar tóxico Leg.4: Introdução de lipossomas nas células Leg.5: Troca de meio às células ☺ ALAMAR BLUE ☺ * Objectivo: Determinar a viabilidade celular e averiguar se a transfecção foi tóxica para as células. * Procedimento: 1º: Preparar a mistura de resazurina com o meio das células 2º: Pôr um 1ml de meio nas células 3º: Ir avaliando a mudança de cor do meio 4º: Retirar uma amostra e ler a absorvância 5º: Calcular a percentagem de viabilidade em função do controlo Leg.6:Mudança de cor do meio celular ☺ TESTE DE GRIESS☺ * Objectivo: Determinar a produção de óxido nítrico e nitratos pelas células * Procedimento: 1º Tirar uma amostra de meio após o estímulo com LPS 2º Adicionar sulfanamide e posteriormente NED 3º Ler a absorvância do meio 4º Comparar a absorvância com uma curva de calibração 5ª Determinar a concentração de nitritos na amostra Leg.7: Obtenção de resultados do Teste de Griess ☺ WESTERN BLOT ☺ * Objectivo: Determinar a presença e a quantidade de uma dada proteína em amostras de células ou tecido. Leg.8: Proteínas a correr no gel Leg.9: Western Blot ☺QRT-PCR ☺ * Objectivo: Quantificar o RNA mensageiro de um determinado gene. * Procedimento: 1º Fazer a extracção do RNA a partir das células 2º Quantificar o RNA 3ºFazer a transcrição com o Transcriptazer Reverser 4º Quantificar o cDNA com uma sonda fluorescente Leg.11: Procedimento do qRT-PCR Leg.10: Termociclador CONCLUSÃO No final deste estágio, compreendemos um pouco mais acerca do objecto e método de estudo da bioquímica. Foi deveras aliciante e enriquecedor uma vez que, além de aprendermos mais e vivenciarmos uma experiência universitária também convivemos e estabelecemos relações com outras pessoas. Leg. : Grupo “O papel dos miRNAs na activação da microglia
