Determinação da atividade antioxidante utilizando

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE UTILIZANDO
SISTEMA β-CAROTENO/ÁCIDO
LINOLÉICO E MÉTODO DE
SEQÜESTRO DE RADICAIS
DPPH
Joaquim Maurício DUARTE-ALMEIDA, Ricardo José dos SANTOS, Maria Inês
GENOVESE, Franco Maria LAJOLO
Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 26(2): 446-452, abr.-jun. 2006
Introdução:
 Radicais de oxigênio e ânion superóxido → papel importante nas
reações bioquímicas/fisiológicas do corpo humano;
 Produção excessiva
processos patofisiológicos ou fatores ambientais adversos
falta de antioxidantes disponíveis in vivo
podem ocorrer doenças e danos profundos em tecidos
Introdução:
 ANTIOXIDANTES → retardam a velocidade da oxidação, através de
um ou mais mecanismos, tais como inibição de radicais livres e
complexação de metais;
 Compostos fenólicos
potentes antioxidantes
 Acerola → ácido ascórbico
 Morango, amora e açaí → determinados grupos de flavonóides como
antocianinas, flavonóis e flavonas
Introdução:
 MÉTODO DE OXIDAÇÃO DO Β-CAROTENO/ÁCIDO LINOLÉICO
avalia a atividade de inibição de radicais livres gerados durante a
peroxidação do ácido linoléico
O método está fundamentado em medidas
espectrofotométricas da descoloração (oxidação) do βcaroteno induzida pelos produtos de degradação oxidativa
do ácido linoléico
Objetivo:
A proposta do presente trabalho foi avaliar a atividade
antioxidante de compostos puros e extratos de frutas, por
meio de dois métodos, com o objetivo de otimizar a
velocidade de aquisição de dados, reduzindo também as
quantidades de reagentes e de amostras.
Materiais e Métodos:
Frutos in natura
açaí (Euterpe oleracea Martius)
acerola (Malpighia glabra L.)
amora (Rubus L.) e morango (Fragaria x ananassa Duch.)
adquiridos na Ceagesp (Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São
Paulo)
estágio maduro
prontos para consumo
Materiais e Métodos:
 Após os frutos serem lavados em água corrente, foram cortados
em pedaços, imediatamente congelados em nitrogênio líquido e
armazenados em freezer a -80ºC até o momento das análises,
quando foram triturados e homogeneizados em gral com pistilo,
sob nitrogênio líquido;
 Preparo
dos extratos dos frutos:
extração realizada em duplicata;
homogeneizou-se 1 g de amostra + 20 mL de metanol 70%
em Ultra-Turrax por 1 min em velocidade média, em banho de
gelo;
filtrado em papel de filtro Whatman nº 6.
 refiltrado e os extratos obtidos foram reunidos, ajustando-se
o volume final para 50 mL com metanol 70%.
Materiais e Métodos:
 Determinação da atividade antioxidante
sistema β-caroteno/ácido linoléico:
utilizando-se
 Mistura reativa → 20 μL de ácido linoléico + 200 mg de Tween 40 + 25 μL
de solução de β-caroteno a 2 mg/mL em clorofórmio + 500 μL de clorofórmio em
erlenmeyer
Completa evaporação do clorofórmio sob N2
adicionou-se 25 mL de água previamente saturada com oxigênio durante
30 min
agitou-se vigorosamente
Materiais e Métodos:
 Determinação da atividade antioxidante
sistema β-caroteno/ácido linoléico:
utilizando-se
 Mistura reativa límpida com absorbância entre 0,6 e 0,7 em 470 nm;
 Determinação das absorbâncias → microplaca de poliestireno com 96
cavidades (λ entre 340 e 800 nm);
 Cada cavidade da microplaca → 250 μL mistura reativa + 10 μL de
metanol (controle) ou o mesmo volume para as soluções padrão ou
extratos das amostras;
Materiais e Métodos:
 Determinação da atividade antioxidante
sistema β-caroteno/ácido linoléico:
Placa incubada 45ºC
β-caroteno);
utilizando-se
(acelerar as reações de oxidação e iniciar o descoramento do
 Leituras realizadas imediatamente e com intervalos de 15 min, durante
120 min, em espectrofotômetro de microplaca Benchmark Plus;
 As curvas foram preparadas com 100, 200, 300, 400, 500 e 600
μmoles de ácido ascórbico, 25, 50, 100, 150 e 200 μmoles de BHA e
BHT e 150, 300, 450, 600 e 750 μmoles de quercetina.
Materiais e Métodos:
 Determinação da atividade antioxidante
sistema β-caroteno/ácido linoléico:
utilizando-se
 Resultados foram expressos como porcentagem de inibição da
oxidação, que foi calculada em relação ao decaimento da absorbância
do controle (Ac);
A queda da absorbância das amostras (Aam) foi correlacionada com a
queda do controle, obtendo-se a porcentagem da inibição da oxidação
(% I) através da equação:
Materiais e Métodos:
 Determinação da atividade antioxidante
sistema β-caroteno/ácido linoléico:
utilizando-se
 Eficiência do antioxidante → valores de F1 e F2 (YANISHILIEVA & MARINOVA)
calculados a partir da curva de oxidação (abs470 nm x tmin)
 Eficiência em bloquear a reação em cadeia (interação com
peróxidos) → mensurada na primeira parte da curva (15 e 45 min)
os radicais
A relação entre as tangentes das curvas da solução padrão e do
controle expressa a eficiência do antioxidante (F1) (Equação 2):
Materiais e Métodos:
 Determinação da atividade antioxidante
sistema β-caroteno/ácido linoléico:
utilizando-se
 Possibilidade de o antioxidante participar de outras reações durante o
processo oxidativo → medida durante a segunda parte da curva (75 e 90
min) (F2):
Materiais e Métodos:
 Determinação
da atividade antioxidante através do método
de seqüestro de radicais livres (DPPH):
 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE → capacidade dos antioxidantes em
seqüestrar o radical DPPH
 Foi utilizado metanol como CONTROLE e BHA, BHT, ácido ascórbico,
ácido clorogênico e quercetina como PADRÕES;
 Decaimento da absorbância das amostras (Aam) correlacionado ao
decaimento da absorbância do controle (Ac) → porcentagem de
seqüestro de radicais livres (% SRL), que pode ser expressa através da
equação:
Resultados e discussão:
da atividade antioxidante pelo sistema βcaroteno/ácido linoléico com microplaca de poliestireno e DPPH→
expressiva redução do uso de reagentes e de amostras (95%);
 Determinação
 Sistema β-caroteno/ácido linoléico → leituras no leitor de microplaca
são automáticas e seqüenciais → maior precisão e não requer a
presença do analista durante o ensaio;
da atividade antioxidante pelo sistema βcaroteno/ácido linoléico:
 Determinação
 BHA e BHT → ampla utilização na indústria alimentícia;
 QUERCETINA e ÁCIDO ASCÓRBICO → normalmente presentes em
frutas e vegetais;
Resultados e discussão:
Resultados e discussão:
Resultados e discussão:
 ÁCIDO ASCÓRBICO → conhecido por sua atividade antioxidante e por
isso é utilizado em cosméticos ou em tratamentos de doenças
degenerativas;
Após o Ác.
Ascórbico doar
os 2 H redutores,
ficou passível de
receber elétrons,
devido ao radical
ascorbila
formado, que é
um agente
oxidante
Resultados e discussão:
 Compostos fenólicos → antioxidantes e capazes de exercer seu papel
biológico → [ ] ↓ capazes de impedir, retardar e prevenir a auto-oxidação
ou oxidação mediada por radicais livres e que o produto formado após a
reação seja estável;
Resultados e discussão:
↓ atividade
antioxidante →
poucas OH
redutoras
Maior
percentagem
Estrutura de
inibição
em menor
semelhante
a
concentração
quercetina,
mas com
glicosídeo na OH →
Menor atividade
Resultados e discussão:
 Compostos fenólicos → antioxidantes e capazes de exercer seu papel
biológico → [ ] ↓ capazes de impedir, retardar e prevenir a auto-oxidação
ou oxidação mediada por radicais livres e que o produto formado após a
reação seja estável;
 Valores de F1 e F2 próximos de 1 → menor atividade antioxidante;
 F1 → ação sobre o BLOQUEIO DE PERÓXIDOS;
 F2 → ação antioxidante em outras reações durante a oxidação;
Resultados e discussão:
Resultados e discussão:
Resultados e discussão:
Atividade antioxidante através do método de seqüestro de
radicais livres (DPPH)
 Transferência de elétrons de um composto antioxidante para o DPPH,
que ao se reduzir perde sua coloração púrpura;
 Avalia apenas o poder redutor do antioxidante → não detecta
substâncias pró-oxidantes;
Resultados e discussão:
Radical ascorbila
não interfere na
reação nesse
sistema → Ação
antioxidante
Maior porcentagem
de seqüestro de
radicais livres em
comparação ao
BHA e o BHT.
Resultados e discussão:
Maior porcentagem
de seqüestro de
radicais livres →
ácido ascórbico →
ação antioxidante
Menor atividade
em ambos os
sistemas
Menor atividade
que acerola e
amora nesse
sistema
Conclusões:
 Atividade antioxidante dos extratos das frutas mostrou-se de acordo
com a dos padrões analisados;
 Sistema β-caroteno/ácido linoléico → extrato de ACEROLA comportouse como PRÓ-OXIDANTE e o AÇAÍ, a AMORA e o MORANGO
comportaram-se como ANTIOXIDANTES;
 Seqüestro de radicais livres (DPPH) → extrato de ACEROLA
apresentou a maior atividade antioxidante, seguido pelos extratos de
AMORA, AÇAÍ e MORANGO;
 ÁCIDO ASCÓRBICO → comportamento relacionado nos dois
sistemas;
Conclusões:
 Adaptações dos métodos utilizando microplacas permitiram a
realização de múltiplas análises, minimizaram o uso de reagentes e
reduziram significativamente a quantidade de amostra necessária;
 A automatização das leituras de absorbância simplificou e reduziu o
tempo e o trabalho despendido pelo analista, proporcionando também
grande precisão nos resultados.