Diapositivo 1 - Moodle @ FCT-UNL
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ACTIVIDADE ENZIMÁTICA Lisboa, 30 de Abril de 2009 Produção de alimentos e sustentabilidade • Propriedades das enzimas: relação enzima – substrato •Condições necessárias na actividade enzimática. • Mecanismos de inibição enzimática. • Síntese dos principais processos associados à Biotecnologia no diagnóstico e terapêutica de doenças. Professora estagiária Margarida Flores Martins Sumário ENZIMA Metabolismo celular A vida dos microrganismos, como aliás, a de todos os sistemas biológicos, depende de um conjunto de reacções que, de forma ordenada, ocorrem em cada instante e constituem o metabolismo celular. Catabolismo Anabolismo Há degradação de compostos orgânicos complexos em compostos orgânicos mais simples, com libertação de ATP. São reacções exoenergéticas. Há formação de substâncias mais complexas a partir de substâncias mais simples. Há consumo de ATP, que se libertou pelo catabolismo e que não foi usado. São reacções endoenergéticas. Ex: crescimento, síntese de proteínas Ex: digestão, renovação celular ENZIMA História Catálise biológica início séc. XIX digestão da carne: estômago; digestão do amido: saliva. Década de 50 Louis Pasteur - concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura era catalisada por “fermentos” = enzimas. Eduard Buchner (1897) extratos de levedo podiam fermentar o açúcar até álcool; enzimas funcionavam mesmo quando removidas da célula viva. James Sumner (1926) Isolou e cristalizou a urease; Cristais eram de proteínas; Postulou que “todas as enzimas são proteínas”. John Northrop (década 30) Cristalizou a pepsina e a tripsina bovinas; Década de 50 – séc. XX 75 enzimas isoladas e cristalizadas; Ficou evidenciado caráter protéico. Atualmente + 2000 enzimas são conhecidas ENZIMA/BIOCATALIZADOR Características Substâncias que aumentam a velocidade de uma reacção sem serem consumidas mecanismo: diminuição da barreira de energia de activação A adição de um catalisador não altera a posição de equilíbrio mas apenas a velocidade em que o equilíbrio é atingido. ENZIMA Estrutura • Estrutura Enzimática Holoenzima Proteína Cofator Cofator Ribozimas Apoenzima ou Apoproteína RNA Pode ser: • íon inorgânico • molécula orgânica Coenzima Se covalente Grupo Prostético ENZIMA Energia de activação ENZIMA Vias metabólicas ENZIMA Acção As enzimas... Aceleram reações químicas Ex: Decomposição do H2O2 Condições da Reação Energia livre de Ativação KJ/mol Kcal/mol Velocidade Relativa Sem catalisador 75,2 18,0 Platina 48,9 11,7 2,77 x 104 Enzima Catalase 23,0 5,5 6,51 x 108 1 ENZIMA Acção A catalase é um enzima; Não são consumidas na reacção….. • O enzima catalase decompõe o peróxido de hidrogénio em água e oxigénio molecular; • A polpa de batata contém catalase; Catalase + O H O H O 2 2 2 resulta 2 • A imersão de polpa de batata em peróxido de hidrogénio na libertação de bolhas gasosas. E+S E+P ENZIMA Acção ENZIMA Acção • Atuam em pequenas concentrações • 1 molécula de Catalase decompõe 5 000 000 de moléculas de H2O2 pH = 6,8 em 1 min Número de renovação = n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única molécula de enzima em uma dada unidade de tempo. ENZIMA Acção Não alteram o estado de equilíbrio •Baixam a energia de ativação; •Keq não é afetado pela enzima. Não apresenta efeito termodinâmico global •G não é afetada pela enzima. Diferença entre a energia livre de S e P S P Energia de ativação sem enzima Energia de ativação com enzima Caminho da Reação ENZIMA Características Apresentam alto grau de especificidade; São produtos naturais biológicos; Reações baratas e seguras; São altamente eficientes, acelerando a velocidade das reações (108 a 1011 + rápida); São econômicas, reduzindo a energia de ativação; Não são tóxicas; Condições favoráveis de pH, temperatura, polaridade do solvente e força iônica. ENZIMA Centro activo A reacção ocorre no centro activo: – contém os resíduos de aminoácidos directamente envolvidos na reacção; – ocupa uma parte relativamente pequena do volume total da enzima; – trata-se de uma entidade tridimensional; – corresponde, geralmente, a uma cavidade na molécula de enzima, com um ambiente químico muito próprio. – o substrato entra no sítio activo e liga-se à enzima através de interacções fracas, não covalentes ENZIMA Especificidade ENZIMA Especificidade A especificidade das enzimas varia muito de uma enzima para outra, sendo muito baixa para algumas enzimas e muito alta para outras. Especificidade relativa: Quando esta relação existe apenas em relação a tipos de ligação, como certas peptidases, fosfatases, podendo-se citar a lipase que hidrolisa as ligações ácido-alcóol de quase todos os ésteres orgânicos. Especificidade absoluta: Tipo de especificidade exclusiva, isto é, quando uma enzima actua somente sobre um determinado composto, como a urease que hidrolisa a ureia, mas nenhum dos seus derivados, ou a tripsina que hidrolisa apenas ligações peptídicas formadas por grupos carboxílicos dos aminoácidos básicos. ENZIMA Modelos • Modelo de Fischer ou Modelo Chave/Fechadura: prevê um encaixe perfeito do substrato no sítio de ligação, que seria rígido como uma fechadura. ENZIMA Modelos Modelo de Koshland ou Modelo do encaixe induzido: existe um sítio de ligação não totalmente préformado, mas sim moldável à molécula do substrato – a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença, sendo complementar ao seu estado de transição ENZIMA Modelos • Evidências experimentais sugerem um terceiro modelo que combina o ajuste induzido a uma "torção" da molécula do substrato, que o "activaria" e o prepararia para a sua transformação em produto. ENZIMA Componente não proteíco ENZIMA Inibição competitiva O inibidor liga-se ao centro activo, competindo com o substrato, e diminuindo a actividade da enzima. ENZIMA Inibição não competitiva O inibidor liga-se numa região distinta do centro activo, afectando-o, e diminuindo a actividade da enzima. ENZIMA Inibição alostérica A ligação do indutor provoca modificações no centro activo, permitindo a actuação enzimática. • Algumas enzimas além dos centros activos, possuem centros alostéricos (centros reguladores), onde se ligam inibidores que não têm estrutura semelhante ao substrato. ENZIMA Classificação • Século XIX - poucas enzimas identificadas • Adição do sufixo “ASE” ao nome do substrato: Ex: - gorduras (lipo - grego) – LIPASE - amido (amylon - grego) – AMILASE • Nomes arbitrários: - Tripsina e pepsina – proteases ENZIMA Classificação • 1955 - Comissão de Enzimas (EC) da União Internacional de Bioquímica (IUB) nomear e classificar. • Cada enzima código com 4 dígitos que caracteriza o tipo de reação catalisada: •1° dígito - classe •2° dígito - subclasse •3° dígito - sub-subclasse •4° dígito - indica o substrato ENZIMA Factores que influenciam actividade enzimática pH O efeito do pH sobre a enzima deve-se às variações no estado de ionização dos componentes do sistema à medida que o pH varia. Enzimas grupos ionizáveis, existem em ≠ estados de ionização. TEMPERATURA temperatura dois efeitos ocorrem: (a) a taxa de reação aumenta, como se observa na maioria das reações químicas; (b) a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica. O efeito da temperatura depende: - pH e a força iônica do meio; - a presença ou ausência de ligantes. A temperatura ótima para que a enzima atinja sua atividade máxima, é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma atividade cte. por um período de tempo. CONCENTRAÇÃO DAS ENZIMAS •Velocidade de transformação do S em P qtidade de E. • Desvios da linearidade ocorrem: • Presença de inibidores na solução de enzima; • Presença de substâncias tóxicas; • Presença de um ativador que dissocia a enzima; • Limitações impostas pelo método de análise. •Recomenda-se: • Enzimas com alto grau de pureza; • Substratos puros; • Métodos de análise confiável. CONCENTRAÇÃO DOS SUBSTRATOS • • [S] varia durante o curso da reação à medida que S é convertido em P. Medir Vo = velocidade inicial da reação. •[E] = cte. vo •[S] pequenas Vo linearmente. •[S] maiores Vo por incrementos cada vez menores. •Vmax [S] Vo insignificantes. •Vmax é atingida E estiverem na forma ES e a [E] livre é insignificante, então, E saturada com o S e V não com de [S]. Vmax INIBIDORES REVERSÍVEIS COMPETITIVOS IRREVERSÍVEIS NÃO COMPETITIVOS INCOMPETITIVOS ENZIMA Cinética enzimática • Victor Henri (1903): E + S ES • Em 1913: Leonor Michaelis -Enzimologista Maud Menten - Pediatra K1 E+S K-1 Etapa rápida ES Kp E+P Etapa lenta ENZIMA Enzimas Vs Catalisadores químicos Característica Enzimas Catalisadores Químicos alta baixa Natureza da estrutura complexa simples Sensibilidade à T e pH alta baixa suaves drástica (geralmente) alto moderado Natureza do processo batelada contínuo Consumo de energia baixo alto Formação de subprodutos baixa alta difícil/cara simples Atividade Catalítica (temperatura ambiente) alta baixa Presença de cofatores sim não Estabilidade do preparado baixa alta Energia de Ativação baixa alta Velocidade de reação alta baixa Especificidade ao substrato Condições de reação (T, P e pH) Custo de obtenção (isolamento e purificação) Separação catalisador/ produtos ENZIMA Aplicações TIPOS DE APLIÇÕES INDUSTRIAIS • Alimentos • Rações animais • Papel e celulose • Couro • Têxtil ALIMENTOS • Indústria de azeite de oliva: - Aplicação de polygalacturonase e pectinesterase na melhoria de aspectos organolépticos e estabilidade a longo prazo. • Panificação: - Melhoria de cor, sabor e estrutural através de preparado enzimático que contém alfa-amilase fúngicas. Atua sobre a farinha de trigo, acelerando o processo de fermentação devido a uma maior formação de açúcares para o fermento.
