TESTES IN VITRO NA SUPERFÍCIE BIOATIVA DO TITÂNIO

TESTES IN VITRO NA SUPERFÍCIE BIOATIVA DO TITÂNIO
PRODUZIDA POR OXIDAÇÃO ANÓDICA
Saico, K.Y.C¹ ; Pereira, B.L.¹ ; S. Blunk.¹ ; Kuromoto, N. K.¹; Soares, P.²
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Departamento de Física, Universidade Federal do Paraná, Curitiba(PR),Brasil
Departamento de Engenharia Mecânica, Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba(PR),Brasil.
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E-mail: [email protected]
Resumo. A bioatividade das superfícies podem ser avaliadas por meio de testes in vitro e in vivo. Testes de
bioatividade in vitro podem ser realizados através de cultura de células ou usando soluções que simulam o
fluido corpóreo (SBF). A resposta obtida na superfície que estava submersa na solução de SBF, durante
vários dias, é a formação de uma camada de apatita. De acordo com Kokubo, essa camada produzida é
semelhante à camada de apatita que é a responsável pela integração entre a superfície do implante e o
tecido ósseo. Assim, neste trabalho, as superfícies bioativas de titânio foram produzidas usando a técnica
de micro-arco oxidação e sua bioatividade foi avaliada usando a solução de SBF. Foi utilizada uma chapa
de titânio comercialmente puro com 2 mm de espessura e os filmes de óxido anódicos foram obtidos
utilizando o ácido fosfórico 1M e um eletrodo de titânio, com a aplicação de uma tensão de 200V/60s à
temperatura ambiente. Depois as amostras foram tratadas termicamente a 600ºC/1h e submersas em SBF,
durante 7, 15 e 30 dias a 37 º C. A morfologia da superfície e as mudanças estruturais foram analisadas
usando microscopia eletrônica de varredura e difração de raios X, respectivamente. Foi observado que a
superfície oxidada apresenta -se rugosa com poros arredondados e as fases presentes são de anatasio e de
rutilo. Após sete dias em SBF a superfície mostra a presença de pequenos núcleos que contém P e Ca. Esses
núcleos aumentam com o tempo de imersão em SBF e após 30 dias, observou-se uma camada de apatita
cobrindo toda a superfície do titânio. Estes resultados indicam que a superfície de titânio oxidada é bioativa.
Palavras-chave: Bioatividade, Oxidação Anódica, Titânio e Ácido Fosfórico.
1. INTRODUÇÃO.
Um biomaterial pode ser definido como qualquer material, natural ou sintético, e que
não seja droga ou fármaco, que é inserido no corpo humano, e que tem como principal
função substituir, em parte ou de todo, órgãos ou tecidos vivos(SEPÚLVEDA et al., 1999).
Para isto, é necessário que apresente algumas propriedades químicas, físicas e biológicas
compatíveis com os tecidos vivos em questão.
O titânio é um dos materiais mais empregados em implantes e próteses ortopédicas,
devido ao fato de ser um metal com alta biocompatibilidade, baixa tendência à corrosão e
boas propriedades mecânicas. A sua biocompatibilidade é originada pelo seu poder de
oxidação. Estando o titânio em contato com o oxigênio, ocorre uma reação com a sua
superfície, formando uma camada muito fina e protetora de óxido de titânio. A camada
funciona como uma barreira impedindo que íons metálicos oriundos do interior do metal
sejam liberados para o meio, e também previne a corrosão do metal (VELTEN et al.,
2002). Desta forma, esta camada protege seu interior do meio em que o titânio está imerso
e portanto, os tecidos vivos não entram em contato com o metal, mas sim com a camada de
óxido de titânio formada.
O melhoramento das características superficiais do titânio pode ser feito com o intuito
de torná-lo bioativo e induzir o crescimento da hidroxiapatita sobre sua superfície. A
hidroxiapatita, Ca10 (PO4)6(OH)2, é um dos principais componentes do material ósseo,
representando de 30 a 70% da massa dos dentes e ossos. Suas características químicas e
estruturais possibilitam seu uso na área médica como material biocompatível em implantes
e próteses (EANES et al., 1980). Na ortopedia existe um particular interesse em usá-la
como revestimento de próteses metálicas para promover a ligação interfacial estável entre
o tecido vivo e o material implantado. (FULMER et al., 1992). Desta forma, o crescimento
ósseo nos locais em que ela se encontra é favorecido, já que é estabelecido ligações entre a
hidroxiapatita e o tecido ósseo, permitindo assim a proliferação de osteoblastos,
fibroblastos e outras células ósseas responsáveis pela produção do tecido ósseo. Ao se
proliferarem, estas se diferenciam produzindo apatita e colágeno sobre a camada de
hidroxiapatita formada anteriormente, favorecendo a união do osso com o implante.
(KOKUBO et al., 2003).
Dentre os tratamentos utilizados para melhorar a bioatividade do titânio destaca-se a
oxidação anódica. Existem diferentes modos de se realizar uma oxidação anódica em uma
célula eletrolítica: galvanostático, onde a densidade de corrente é constante e
potenciostático, onde a tensão aplicada é constante. Vários trabalhos na literatura indicam
que a superfície do titânio oxidada em diferentes eletrólitos ácidos (YANG, 2004, CHEN
et al., 2009) e básicos (SUL et al., 2001, CUI et al., 2009) tornaram-se bioativas em
função das condições de anodização utilizadas. Entretanto existem poucos resultados que
associam boas propriedades mecânicas com bioatividade (SOARES JR et al., 2008; de
SOUZA, et al., 2011).
Uma maneira simples de testar a bioatividade in vitro das superfícies modificadas é
usar uma solução que simula a parte inorgânica do fluído corpóreo. Em 1991, KOKUBO
desenvolveu uma solução simuladora do fluido corpóreo, SBF (Solution Body Fluid), cuja
função é reproduzir a concentração iônica do plasma sanguíneo, ou seja, a porção acelular
do tecido sanguíneo. Atualmente são utilizadas também soluções de SBF modificadas
(ANDRADE, 1999; JONÁSOVÁ et al., 2004) , MULLER, 2006). Uma superfície é
considerada bioativa, se após dias imersas na solução SBF, apresentar uma camada de
hidroxiapatita sobre a sua superfície (Kokubo et al., 2004). A sua formação se deve à alta
energia de ativação para sua nucleação no fluido corpóreo, o qual é supersaturado quando
em condições normais. Quando um material tem um grupo funcional que poderia ser um
local efetivo de nucleação de hidroxiapatita, facilmente haverá sua nucleação sobre a
superfície.
Considerando o exposto acima de que para o material ser utilizado como implante, ele
precisa ter boas propriedades mecânicas e ser bioativo, o objetivo deste trabalho é produzir
filmes de óxido de titânio, usando a técnica de oxidação anódica, sobre as superfícies das
amostras lixadas e testar sua bioatividade.
2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
O material utilizado neste trabalho foi uma chapa de titânio (Ti) comercialmente
puro (Ti-cp), de grau 2, com as dimensões de (10x10 x 2) mm . As amostras foram lixadas
com lixas de papel de SiC de granulometria de 360, 400 e 600, respectivamente. Em
seguida, foram lavadas em um banho de ultrassom divididas em três etapas, onde cada
etapa teve duração de 15 minutos, e foi realizada na seguinte sequência: Acetona, Álcool
Etílico e Água Destilada. Após a lavagem, estas amostras ficaram armazenadas em uma
câmara climática a 40ºC por 24 horas.
Para a realização das oxidações anódicas utilizou-se uma cuba de acrílico, uma
fonte de tensão, um osciloscópio, um agitador magnético, uma haste titânio como contraeletrodo e o eletrólito de H3PO4 com concentração de 1,0 Molar. As amostras foram
fixadas na parede externa da cuba de acrílico, com o auxílio de um parafuso, Fig.(1).
(A)
(B)
Figura 1: Montagem experimental utilizada (A) detalhe da amostra, presa na parte externa
da cuba (B) montagem completa, com a cuba de acrílico, placa agitadora e fonte
de alimentação.
Durante o processo de oxidação, foi usada uma tensão constante de 200 V em um
intervalo de tempo de 60s. Logo após, as placas de titânio foram submetidas à um
tratamento térmico, com uma temperatura de 600ºC/1h.
Antes dos testes de bioatividade in vitro as amostras foram esterilizadas em uma
autoclave e, em seguida, submersas na solução de SBF. Cada amostra foi imersa em um
tubo de Falcon contendo 50 ml de solução SBF, e então em banho térmico a 37ºC, em três
tempos diferentes de imersão, 7 dias, 15 dias e 30 dias. A Tabela 1 mostra os reagentes
utilizados para a solução SBF.
A morfologia das amostras oxidadas e submetidas à testes in vitro foi analisada no
Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) da marca Jeol (JSM-6360LV), as fases
cristalinas dos filmes obtidos foram identificadas por difração de raios-X, com o
difratômetro Shimadzu XRD-7000, utilizando radiação de CuKα com potencial de 40kV e
20 mA na geometria -2. As propriedades mecânicas do titânio foram determinadas
através da técnica de indentação instrumentada, utilizando o equipamento Nanoindenter
XP(MTS). Utilizou-se uma ponta de diamante tipo Berkovich e carga máxima de 400mN.
Reagente
Nome
Quantidade/L
NaCl
Cloreto de sódio
8,035 g
NaHCO3
Bicarbonato de sódio
0,355 g
KCl
Cloreto de potássio
0,225 g
K2HPO4 3H2O
Potássio fosfato dibásico anidro
0,231 g
MgCl2 6H2O
Cloreto de magnésio
0,311 g
HCl 1mol/L
Ácido clorídrico
39 mL
CaCl2
Cloreto de cálcio
0,292 g
Na2SO4
Sulfato de sódio
0,072 g
C4H11NO3
Tris - (hidroximetil) amino metano
6,118 g
Tabela 1 - Reagentes químicos utilizados para preparação da solução SBF (KOKUBO e
TAKADAMA 2006)
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Por meio de imagens feitas pelo MEV foi possível verificar a característica da
superfície de titânio, após ter sofrido oxidação anódica com um eletrólito de ácido
fosfórico 1,0 M.
A Fig.(1) apresenta o aspecto da superfície de titânio lixado e a Fig.(2) a morfologia
da superfície oxidada, com seus respectivos espectros obtidos por dispersão de energia
(EDS), acessório acoplado ao MEV. Pode-se observar que a superfície oxidada tem uma
morfologia porosa com poros de forma arredondada e distribuídos uniformemente,
mantendo a topografia da superfície original, conforme observado na Fig.(1). Pelo espectro
de EDS pode-se observar que íons de fósforo ficaram incorporados no filme anódico. Ao
se comparar os dois espectros de EDS observa-se na superfície lixada Fig.(1)(B) a presença
de Ti e pequena quantidade de oxigênio. Após a oxidação pode-se verificar a presença do
elemento fósforo e uma maior quantidade de oxigênio. Esse aumento de oxigênio é
importante, pois quanto mais íons hidroxilas presentes, maior a interação da superfície com
o meio fisiológico, o qual favorecerá a nucleação da apatita.
(A)
(B)
Figura 1: Morfologia da amostra de titânio lixada usada como referência (A) e seu
respectivo espectro de (B).
(A)
(B)
Figura 2: Morfologia do filme anódico oxidado em ácido fosfórico sob modo
potenciostático (A) e seu respectivo EDS (B).
Resultados obtidos pela técnica de difração de raios-X mostram na Fig.(3), as
mudanças estruturais ocorridas nas superfícies submetidas à oxidação anódica e tratamento
térmico Observa-se que após a anodização, um filme amorfo é formado na superfície do
titânio metálico. Após o tratamento térmico o filme anódico se torna cristalino, com a
presença das fases anatásio e rutilo.
Ti Ti
Ti oxi +TT
Ti oxi
Ti ref
Ti
Ti
Intensidade(u.a)
1000
A R
Ti
R
A
Ti
R
A
Ti
0
20
40
60
80
2
Figura 3: Difratogramas de raios-x do titânio: Ti-cp, Ti-cp anodizado e Ti-cp anodizado e
submetido a tratamento térmico. Fases presentes na superfície da amostra oxidada
em H3PO4 1,0 M: Ti=titânio, A = Anatásio, R = Rutilo.
As medidas de dureza e o perfil de penetração da ponta, obtidos através dos testes
de nanoindentação, estão apresentados na Fig.(4) (A) e (B), respectivamente. Observa-se
que nas proximidades da superfície há um aumento da dureza e à medida que a
profundidade analisada aumenta, os valores da dureza tendem a se aproximar do valor do
titânio metálico.
Os testes de risco foram feitos com um comprimento de 700 µm. O perfil em preto,
primeiro perfil, corresponde a uma leve varredura para verificar a rugosidade inicial da
superfície. O último perfil, em vermelho, indica a profundidade de penetração à medida
que a carga aplicada aumenta até atingir o valor de 400mN, isto é, o quanto o material está
se deformando sob a aplicação da carga. O perfil médio, em verde, indica a profundidade
final, isto é, o quanto a amostra se deformou plásticamente. A diferença dos perfis
vermelho e verde mostra a recuperação elástica do material, que está em torno de 37%.
Este cálculo foi feito usando a Eq.(1).
Re 
H 2  H1
x 100%
H2
Considerando que H2= 1750 nm e H1 = 1100 nm.
Re = ((1750-1100)/1750)x100%
Re = 37%
Equação(1)
A recuperação elástica do filme foi de 37%.
Esses resultados mostram uma melhora nas propriedades mecânicas da superfície oxidada.
(A)
(B)
8,5
1500
8,0
7,5
1000
7,0
Profundidade do Risco (nm)
6,5
Dureza (GPa)
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
500
0
-500
-1000
-1500
-2000
Perfil Original
Perfil durante o Risco
Perfil Residual
-2500
1,0
0
500
1000
1500
Profundidade (nm)
2000
2500
-3000
0
200
400
600
Distância (um)
Figura 4: Gráfico da dureza em função da profundidade de penetração na superfície da
amostra oxidada (A) e perfil de penetração da ponta em um risco de 700 µm de
comprimento (B).
A figura 5 apresenta a morfologia da superfície de titânio após diferentes tempos de
imersão em solução de SBF com seus respectivos espectros obtidos por dispersão de
energia (EDS). Ao ser deixado imerso em solução de SBF (Solution Body Fluid), o titânio
oxidado apresentou uma boa resposta quanto à sua bioatividade. Através da técnica de
EDS, foram feitas análises que evidenciaram os elementos incorporados na nova
superfície.
Pode-se observar que ocorre a nucleação de uma nova camada sobre o filme
anódico e que esta camada, inicialmente localizada (7 dias de imersão, Fig.(5)(A)),
aumenta com o tempo de imersão (Fig.(5)(B)), sendo que após 30 dias, toda a superfície
fica recoberta com essa camada (Fig. (5)(C)). Verificou-se a presença de cálcio e fósforo
em todas as regiões analisadas, os quais evidenciam a presença da hidroxiapatita, pois
esses dois elementos fazem parte de sua composição. Portanto, pela análise da morfologia
e espectro de EDS, pode-se identificar essa nova camada como apatita. O pico de fósforo
tem maior intensidade que o do cálcio porque o filme anódico já contém uma certa
quantidade de fósforo.
A presença de fases de anatásio e rutilo, no filme anódico, podem ter contribuído
para favorecer a nucleação de hidroxiapatita, conforme indicam alguns autores (YANG et
al.,2004). Esses resultados são muito promissores uma vez que outros trabalhos realizados
com o mesmo eletrólito não mostraram esse grau de bioatividade (CUI et al, 2009).
(A) 7 dias em SBF
(B) 15 dias em SBF
(C) 30 dias em SBF
Figura 5: Morfologia do filme anódico após teste de bioatividade in vitro: (A) 7 dias de
imersão (B) 15 dias de imersão (c) 30 dias de imersão e seus respectivos
espectros de EDS.
4. CONCLUSÃO
A partir dos resultados apresentados podemos concluir que:

A superfície oxidada apresentou uma morfologia com pequenos poros
arredondados que se formaram seguindo a topografia inicial da superfície lixada.

Verificou-se por meio do difratograma de raios-X, que após as amostras terem sido
submetidas a um tratamento térmico, estas apresentaram as fases anatásio e rutilo.

Após testes de bioatividade in vitro verificou-se a presença de uma nova camada
sobre a superfície oxidada para todos os tempos de imersão. Através da análise
morfológica e do espectro de EDS pode-se concluir que essa fase corresponde à
apatita.
AGRADECIMENTOS
Ao Centro de Microscopia Eletrônica, Labnano e Fundação Araucária.
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Tests in vitro of titanium bioactive surface produced of by micro-arc oxidation
Saico, K.Y.C¹ ; Pereira, B.L.¹ ; S. Blunk.¹; Kuromoto, N. K.¹; Soares, P.²
1
Departament of Physics, Federal University of Paraná, Curitiba (PR), Brazil
Departament of Mechanical Engineering, Catholic University of Paraná, Curitiba (PR), Brazil
E-mail: [email protected]
2
Abstract. Bioactive surfaces can be evaluated using tests in vitro and in vivo. Bioactivity tests in vitro use
solutions that simulate the body fluid (SBF) or cell culture. The surface response soaked in SBF during
several days is the formation of an apatite layer. According (KOKUBO et al.,2003), this layer produced in
SBF is similar to apatite layer that is responsible of the integration between the implant surface and bone
tissue. So in this work titanium bioactive surface were produced by micro-arc oxidation and its bioactivity
were evaluated using SBF solutions. It was used a plate of commercially pure titanium with 2mm thickness
and anodic oxide films were obtained using 1M phosphoric acid using a platinum counter electrode,
200V/60s at room temperature. After that the samples were treated thermally at 600 oC/1h and soaked in SBF
during 7, 15 and 30 days at 37 oC . The surface morphology and structural changes were analyzed using
scanning electron microscopy and X-ray diffraction. It as verified that the oxidized surface presents a
roughness surface with round pores and the phases present are anatase and rutile. After seven days soaked
in SBF the surface shows the presence of small nuclei that contains P and Ca. These nuclei increase with the
soaked time in SBF and after 30 days it observed an apatite layer covered all the surface. These results
indicate that the oxidized titanium surface are bioactive.
Keywords: Bioactivity, Micro-arc oxidation, Titanium and Phosphoric Acid.