bactérias lácticas e fermentação maloláctica (fml)

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BACTÉRIAS LÁCTICAS E FERMENTAÇÃO MALOLÁCTICA (FML)
Aline Lonvaud
Faculté d'œnologie, 351 cours de la Libération, 33405 Talence - France
Tél. + 33 (0) 556846466, Fax. + 33(0) 556846468
A que chamamos FML em vinificação ?
A FML é uma etapa distinta da fermentação alcoólica, que lhe sucede após um período que
varia de alguns dias a alguns meses. Manifesta-se por uma libertação de gás carbónico bem
perceptível, mas muito inferior à da fermentação alcoólica. É unicamente devido a esta
semelhança que esta fase da vinificação tem o nome de fermentação.
No sentido bioquímico, o fenómeno principal não é uma fermentação (produção de energia a
partir da oxi-redução de substratos em ausência de oxigénio) mas uma reacção simples de
descarboxilação do ácido málico em ácido láctico.
COOH
|
HO – C-H
|
CH2
→
|
COOH
Acido L-málico
COOH
|
HO – C – H
|
CH3
+ CO2
Acide L-láctico
O ácido málico do mosto de uva (isómero L) é transformado molécula a molécula em acido
láctico (isómero L).
No mosto de uva, e depois no vinho antes da fermentação maloláctica a concentração em
acido málico é muito variável de 1g/L no mínimo até 8g/L ou mais.
Como se acompanha o inicio e a evolução da FML ?
A reacção de descarboxilação do ácido málico é o acontecimento marcante da FML, pela
quantidade de substrato que está em jogo e pelas repercussões sobre as características
principais do vinho (aumento do pH, diminuição da acidez total). Para o acompanhamento
da FML doseamos o desaparecimento do ácido málico.
-
Na adega : o método por cromatografia em papel é simples de realizar e
bem revelador do fenómeno. As gotas de vinho depositadas na base da
folha são submetidas a uma cromatografia graças à ascensão de um
solvente por capilaridade. A migração separa os ácidos, nomeadamente o
acido málico e o acido láctico; a revelação é feita por um indicador corado.
Ao longo da FML, a intensidade da gota de ácido málico diminui enquanto
que a de ácido láctico aumenta. Este teste não necessita de qualquer
equipamento sofisticado e oneroso. No entanto ele não é, nem sensível,
nem muito preciso, o que impõe o recurso à análise em caso de dúvida
sobre o início da FML e sempre no fim deste processo.
-
No laboratório : o ácido málico é mais frequentemente doseado pelo método
enzimático. A análise é muito fiável e sensível. A FML degrada a totalidade
do ácido málico. O mais frequente, na prática, é considerarmos que está
terminada quando a dosagem não excede os 100-200 mg/L de ácido
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málico. De qualquer modo, na maior parte dos casos, durante alguns dias
após a sulfitação mantém-se uma certa actividade bacteriana e a
degradação contínua até o seu termo.
Como o ácido málico é exclusivamente transformado em ácido láctico, um bom meio de
detectar o início da FML é também dosear este último. Se a sua concentração for superior a
200-300 mg/L é provável que a FML se tenha iniciado. Mas este resultado só é verdadeiro
se não existir qualquer actividade bacteriana durante a fermentação alcoólica.
Que transformações provoca a FML ?
Devido à degradação total do ácido málico (ácido dicarbóxilico) em ácido láctico
(monocarboxilico) e do desprendimento de CO2, a transformação essencial é a diminuição
da acidez. A FML é uma desacidificação biológica do vinho. O pH aumenta, a acidez total
diminui e o travo do ácido málico é substituído pelo gosto mais suave do ácido láctico. É
devido a esta suavização que a FML é procurada e é bem adaptada aos vinhos brancos das
regiões setentrionais, ao vinho de base do champanhe, aos vinhos brancos da Bourgogne e
praticamente generalizada para os vinhos da casta Chardonnay. A par dos vinhos
caracterizados pelos aromas varietais, numerosos vinhos brancos beneficiam com esta
fermentação. Mesmo com o Sauvignon, resultam vinhos mais intensos, complexos, macios
e estruturados. Para os vinhos tintos, a descida de acidez devida à FML é primordial para a
suavidade e sensação de redondez que esta lhes confere. Os vinhos tintos, com muito
poucas excepções, requerem uma FML.
Mas a desacidificação não é a única consequência. Numerosas transformações estão
implicadas na evolução gustativa e aromática. As substâncias voláteis são sintetizadas, e os
compostos da cor (para os vinhos tintos) são modificados. Estas alterações evidenciam-se
na análise organoléptica. Mas, até ao momento ainda não foram todas identificadas.
Uma das únicas alterações bem conhecidas é a do ácido cítrico em que a concentração
máxima inicial é da ordem dos 0,25g/L. Este conduz à formação do diacetilo (molécula com
aroma a manteiga) que participa de forma evidente no bouquet do vinho mas que em
quantidade excessiva nem sempre é apreciada. Os aldeídos e cetonas igualmente formadas
durante a FML através da reacção química com os ácidos aminados formam heterocíclos
aromáticos. Finalmente temos o metabolismo dos ácidos aminados, tais como, a metionina
e a cisteína produtoras de compostos voláteis interessantes, ou contrariamente, a evitar.
Ao longo da fermentação maloláctica o aumento da acidez volátil é sempre fraco, menos de
0,15g/L. Uma parte deste provem da fermentação dos açúcares residuais e da fermentação
alcoólica, outra parte provem da degradação do ácido cítrico.
A estabilidade microbiológica não deverá ser absolutamente considerada como sistemática
após a FML. A produção de substâncias tóxicas excretadas pelas bactérias, e a utilização
dos seus nutrientes essenciais durante a FML podem de uma forma eficaz, tornar agora o
meio mais hostil. Mas se o pH é muito elevado tais inibições não se cumprem, e o meio
torna-se sensível ás contaminações com bacterianas.
Acide citrique
Acide oxaloacétique
Acide acétique
Acide pyruvique
Diacétyle
Acétoine
Butanediol
ATP
Acide acétique
Acetyl CoA
Acides gras
Lipides
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CO2
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Porque ocorre a FML após a fermentação alcoólica ?
A FML é o resultado da actividade das bactérias lácticas que se vão multiplicando no vinho
atingindo uma população elevada.
As bactérias existem no mosto de uva, mas as condições de vinificação são tais que estas
praticamente não se desenvolvem durante a fermentação alcoólica. No mosto existe uma
grande variedade de bactérias. O meio rico em açúcares, em ácidos aminados e vitaminas
seria muito favorável ao seu crescimento se as leveduras não colonizassem o mesmo. Na
competição entre leveduras e bactérias, são as primeiras que ganham, já que estão melhor
adaptadas ao crescimento que as bactérias. O meio “ocupado” pela massa de leveduras em
fermentação torna-se progressivamente mais hostil para as bactérias. A variedade inicial em
espécies e estirpes vai diminuindo e a população cai até ao fim da fermentação alcoólica.
Neste momento o vinho aloja, uma outra população de leveduras em fase de declínio e de
autólise, e uma população de bactérias lácticas fraca, mas seleccionada pela sua tolerância
a numerosos inibidores que apareceram durante a fermentação alcoólica. A composição do
meio continua a mudar porque apesar da paragem da fermentação dos açúcares outros
fenómenos bioquímicos importantes se prosseguem : entre outros a autólise das leveduras
que libertam factores de crescimento e nutrientes para as bactérias lácticas. Por outro lado
as bactérias, por acção de proteases e de glucanases, aceleram esta autólise. Em suma um
conjunto de fenómenos bem orquestrados conduz ao crescimento das bactérias. Quando a
população atinge 106 UFC/ml a degradação de ácido málico torna-se visível, inicia-se assim
o início da FML. Uma vez iniciada esta vai até ao seu termo à excepção de alguns casos
raros em que ocorra um arrefecimento brutal.
Quais as bactérias que intervêm e quais são os factores do seu desenvolvimento?
Numa FML espontânea, as bactérias lácticas têm origem na contaminação natural do mosto
de uva. Mais de uma dezena de espécies de lactobacilos e de cocos foram identificados até
ao momento no mosto e nos vinhos.
Taxonomie des bactéries lactiques du vin
Genres :Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Oenococcus
Espèces : Lactobacillus plantarum, L.casei, L.hilgardii, L.brevis, L.fructivorans, L.kunkei, L.nageli,
L.diolivorans,…….
P.damnosus, P.cerevisiae, P.parvulus; L. mesenteroides ; Oenococcus oeni
Oenococcus oeni
P.damnosus
L.hilgardii
Os factores principais que actuam no crescimento bacteriano são o grau alcoólico, o teor em
dióxido de enxofre, a temperatura e o pH. O efeito de cada um deverá ser considerado em
função do nível dos outros três. Na prática, já se demonstrou que o vinho não deve ser
sulfitado após a fermentação alcoólica, e que a temperatura deverá ser controlada. O teor
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em SO2 livre deve ser o mais baixo possível ; este é geralmente nulo uma vez que o que se
adicionou na vindima estará combinado. A temperatura óptima para se conseguir o arranque
da FML é de 20 à 22°C. Um arrefecimento posterior não faz mais que atrasar o seu
processo, um aquecimento acelera o mesmo.
O etanol torna-se sensivelmente inibidor para as bactérias a partir de 10%. A FML é
portanto mais difícil para os vinhos de volume alcoólico mais elevado. Mas o factor mais
importante é o pH. Na zona de 3 a 4, quanto mais este é elevado mais propício se torna o
meio ao crescimento das bactérias. Abaixo do pH de 3, nos vinhos muito ácidos, a FML é
particularmente difícil, e o inverso, para além deste valor a FML é mais fácil. Mas isto
significa igualmente que quanto mais elevado é o pH maior é a variedade de bactérias
capaz de se multiplicar. A selecção exclusiva da espécie de Oenococcus oeni está deste
modo muito ligada ao pH.
Consideramos sempre que a espécie Oenococcus oeni é a mais favorável à qualidade dos
vinhos. Em todos os casos é a espécie dominante durante a FML provavelmente porque é a
mais bem adaptada ao meio vinho após a fermentação alcoólica.
Mas numa FML espontânea várias estirpes diferentes intervêm simultaneamente.
Diversité des souches d’Oenococcus oeni pendant la fermentation malolactique
D
B
F
B
E
G
A
A C
Profils de restriction de 18 isolats d’une cuve en FML : restriction par NotI
Nos vinhos de pH elevado, mesmo sendo O. oeni a preponderante durante a FML, esta não
está isolada. Todas as outras espécies transformam igualmente o ácido málico em ácido
láctico. Nestes vinhos, onde a selecção é menos eficaz, o pH normalmente próximo de 4,0
em fim de FML deixa o lugar ao crescimento de Lactobacilus ou Pediococos dos quais os
efeitos são por vezes desfavoráveis.
Como controlar as bactérias lácticas da FML ?
-Evitar FML : o método mais habitual é a sulfitação do vinho após a fermentação alcoólica. O
SO2 livre é muito eficaz contra as bactérias lácticas, tanto maior quanto mais baixo for o pH.
É efectivamente o SO2 molecular (ou SO2 “activo”) que é tóxico. Os vinhos brancos que não
se deseja que façam a FML, ou casos particulares de vinhos tintos, são geralmente
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sulfitados em fim de FA com a dose preconizada para o seu estágio e conservação
definitiva, ou seja 20 a 30 mg/l de SO2 livre.
-Retardar a FML : Não é fácil retardar o crescimento bacteriano se esta já tiver iniciado.
Após a FA na prática se não se mantém o vinho à temperatura de 18-20 º C há poucas
hipóteses de início da FML. Nesse caso o frio pode momentaneamente retardar o fenómeno
impedindo a multiplicação das bactérias. Um aquecimento posterior permite encontrar as
condições óptimas para a FML. Um atraso pode ser obtido por destruição de uma parte da
flora bacteriana. Esta operação é agora possível com a adição de lisozima. Esta enzima
hidroliza a parede das bactérias provocando a morte das células. Empregue na dose de 10
a 25g/hl após fermentação alcoólica permite retardar (ou prevenir) a FML. A sua eficácia é
todavia menor nos vinhos tintos devido à reacção dos polifenois com a proteína. A acção da
lisozima diminui com o tempo provavelmente por desnaturação da proteína. A lisozima pode
igualmente ser utilizada à entrada das massas na cuba para evitar o pico láctico resultante
da fermentação alcoólica e da FML realizadas em simultâneo.
-Desencadear a FML: A FML não se inicia espontaneamente enquanto as bactérias
indígenas não comecem a se multiplicar e atinjam a população de 106 UFC/ml. O que
significa que o valor dos quatro parâmetros principais, temperatura, etanol, pH e SO2 é
incompatível com o crescimento. Na maior parte dos casos basta agir sobre um deles para
se inverter a situação. Se o vinho não tiver sido sulfitado após a FA e como também não
podemos agir sobre o grau alcoólico, restam-nos somente dois factores, optimização da
temperatura e do pH.
A primeira precaução a ter é a de evitar um arrefecimento excessivo do vinho após a FA. Se
necessário o vinho deverá ser aquecido até aos 18-20ºC até que o ácido málico se comece
a degradar. No caso de vinhos ácidos, a desacidificação química com carbonato de cálcio
de um pequeno volume da cuba pode permitir obter um pé de cuba. Uma vez que se tenha
iniciado a FML este lote é reincorporado na cuba. É igualmente possível nalguns casos
arranjar vinhos de prensa em que a FML se inicia geralmente com mais facilidade. Mas a
incorporação de um vinho de prensa ao vinho de gota não é forçosamente uma boa solução
neste estado de elaboração do vinho.
O que é um fermento maloláctico ?
Mas a melhor solução actualmente, quando a fermentação maloláctica não se inicia apesar
de uma temperatura conveniente e da ausência de SO2 livre é a adição de fermentos
malolácticos. Trata-se de compensar a deficiência da população indígena. A adição massiva
de bactérias permite que se ultrapasse a fase de crescimento problemática. Estas
preparações são mais frequentemente utilizadas quando o fenómeno não se inicia
espontaneamente várias semanas ou meses após a FA. Ganharíamos portanto com uma
adição mais sistemática e efectuada mais cedo. Constata-se efectivamente, sem explicação,
que quanto maior o atraso após o fim de FA mais a sua eficácia diminui.
Os fermentos malolácticos são preparações concentradas de culturas liofilizadas de
Oenococcus oeni. Diversas preparações são comercializadas para inoculação dos vinhos,
seja directamente, seja após a reactivação. O seu primeiro critério de selecção é a sua
capacidade à sobrevivência após a inoculação do vinho. O protocolo de preparação pode
variar segundo as preparações comerciais. Em todos os casos a inoculação tem por
objectivo atingir a população de 106 UFC/mL para degradação do ácido málico, sem esperar
que a flora indígena se multiplique. Mesmo para as melhores preparações, as bactérias não
são capazes de se desenvolverem em condições difíceis. Quanto maior for a viabilidade da
biomassa mais activa será a degradação do ácido málico. Mesmo que o aumento da
população seja fraco ou nulo, este facto, não impedirá o início da FML. Mas os vinhos das
cubas em que a FML se tenha iniciado deste modo não deverão ser considerados como
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fermentos eficazes para outros vinhos difíceis. Contrariamente aos fermentos de leveduras
LSA que se podem multiplicar na cuba de fermentação, não é realmente possível disseminar
um fermento maloláctico em todas as cubas de uma adega.
Os insucessos dos anos 1975-1980 mostram que é bem mais difícil preparar um fermento
maloláctico eficaz que um fermento « LSA ». As leveduras são efectivamente muito bem
adaptadas ao crescimento no mosto de uva, enquanto que as bactérias deverão reencontrar
a adaptação ao vinho perdida no decurso do seu isolamento e da sua multiplicação. Por
este facto não existem ainda mais que um pequeno número de bactérias malolácticas
comercializadas.
As incidências organolépticas das diferentes estirpes são prováveis mas não existem
resultados fiáveis e pertinentes que permitam actualmente escolher um fermento pelas
características aromáticas conferidas. O desenvolvimento dos fermentos malolácticos
deverão primeiro passar por um melhor conhecimento dos meios exercidos
espontaneamente pela bactéria para se adaptar ao seu ambiente. Seguidamente será
importante avaliar objectivamente as transformações aromáticas em função das estirpes e
das castas vinificadas.
Em que momento se deve inocular as bactérias malolácticas ?
As preparações comerciais de bactérias malolácticas contêm uma população de O. oeni da
ordem de 5.106 a 107 UFC/ml, ou seja um número de bactérias suficiente para degradar o
ácido málico se as células permanecerem funcionais. A reacção maloláctica é independente
do crescimento. Uma célula bacteriana de O. oeni mesmo que esteja num meio que interdite
todo o crescimento, continua a transformação do ácido málico. Ao pH do vinho, o ácido
passa para o interior da célula, onde a enzima maloláctica assegura a reacção. A única
condição à actividade é que a célula conserve a membrana intacta, isolando o sistema
enzimático do ambiente, para manter o pH próximo do pH óptimo e assegurar a presença de
coenzimas indispensáveis. A integridade da membrana está estritamente correlacionada
com a viabilidade celular, o que significa que somente uma célula viável é activa. Um
fermento maloláctico é deste modo eficaz se as células conservarem a sua viabilidade. A
concentração do inoculo é suficiente para assegurar a FML mesmo que as bactérias não se
multipliquem, no entanto é necessário que estas que sobrevivam.
Inseminada no vinho O.oeni, metaboliza um número importante de substratos ; o ácido
málico é somente um entre outros. Esta transformação que gera a energia
«transmembranar » participa na vida da célula. Esta é fácil se o substrato é abundante. O
ácido cítrico é igualmente uma fonte de energia. Mas entre todos os substratos, os açucares
não transformados pelas leveduras são os mais enérgicos. Trata-se da glucose, da frutose e
das pentoses presentes nalgumas centenas de mg/L, até mais de 1 g/L mesmo no vinho
denominado de “seco”. A via metabólica utilizada por O. oeni (e de outras bactérias do
vinho) é a fermentação heteroláctica, em que o principal efeito é a produção de ácido
acético. Por esta razão é importante adicionar as bactérias somente no fim da fermentação
alcoólica.
Adicionar um fermento consiste em juntar uma quantidade massiva de bactérias em que a
primeira actividade é a de metabolizar todos os substratos donde elas possam retirar
energia. Antes do fim da fermentação alcoólica, os açúcares serão fermentados do mesmo
modo que o ácido málico será descarboxilado. Se o número de gerações que se
desenvolvem é limitado, a quantidade de açúcar fermentado também é. Podemos então
observar que todo o ácido málico é degradado sem aumento excessivo do ácido acético.
Mas esta situação não é absolutamente controlável. O equilíbrio que convém obter depende
de um número importante de factores sobre os quais o enólogo não tem qualquer acção.
Os incidentes ocorrem porque a população bacteriana atinge uma concentração muito
elevada (> 108 UFC/ml). O ácido málico é certamente degradado mas os danos são
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importantes : paragens de fermentação alcoólica por eliminação da população de leveduras
em fase de declínio, e aumento da acidez volátil. Poderemos esperar estas situações em
vinhos favoráveis pelo seu pH ou onde o inoculo se multiplique a partir dos açúcares, mas
este poderá também ser o caso noutros mais ácidos. Efectivamente a “fermentiscibilidade
maloláctica” não está somente ligada ao pH ; ela integra outros factores dos quais os limites
são interdependentes e que não são possíveis de se modificarem.
Numerosos ensaios descrevem a adição com sucesso de fermentos em diferentes estados
da fermentação alcoólica. Demonstrando que a competição leveduras/bactérias pelos
açucares e a viabilidade podem ser ajustados a um nível compatível à qualidade do vinho.
Mas o equilíbrio é muito frágil, mesmo para os pares levedura/bactéria descritos como
óptimos, é absolutamente imprevisível, porque nem todos os dados do sistema em
interacção podem ser conhecidos para cada vinho. A ausência de incidentes nos casos
experimentais descritos não permite realmente aconselhar esta prática; os riscos que se
correm não são justificados. Finalmente deveremos salientar que poucos ensaios com
utilização de fermentos no início da vinificação são acompanhados da verificação da
identidade da estirpe bacteriana responsável pela FML, ou seja do controlo de implantação
da bactéria inoculada.
Vérification de l’implantation d’un levain malolactique
A : levain
B et C : levain bien implanté
D, E F : microflore indigène
dominante
Em conclusão ?
Os fermentos malolácticos disponíveis são cada vez mais eficazes. Os industriais adquiriram
conhecimentos certos, até ao momento empíricos mas reais para a preparação desta
biomassa. Não há razão para se arriscar um pico láctico devido à inoculação precoce dos
vinhos. No entanto nunca se demonstrou concretamente que um vinho verdadeiramente
“resistente” à FML é mais facilmente vinificado com a adição de fermento durante a
fermentação alcoólica.
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