INDUÇÃO DE INIBIDORES DE TRIPSINA EM FOLHAS DE

INDUÇÃO DE INIBIDORES DE TRIPSINA EM FOLHAS DE
MARACUJÁ (Passiflora edulis f. flavicarpa) EM RESPOSTA AO
TRATAMENTO COM METIL JASMONATO E HERBIVORIA:
PURIFICAÇÃO PARCIAL E ESTUDO DO POTENCIAL
BIOINSETICIDA
SYLVIO BOTELHO JÚNIOR
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
DARCY RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
Março - 2008
INDUÇÃO DE INIBIDORES DE TRIPSINA EM FOLHAS DE
MARACUJÁ (Passiflora edulis f. flavicarpa) EM RESPOSTA AO
TRATAMENTO COM METIL JASMONATO E HERBIVORIA:
PURIFICAÇÃO PARCIAL E ESTUDO DO POTENCIAL
BIOINSETICIDA
SYLVIO BOTELHO JÚNIOR
“Tese apresentada ao Centro de Biociências e
Biotecnologia, da Universidade Estadual do Norte
Fluminense, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Biociências e
Biotecnologia”.
Orientadora: Dra Tânia Jacinto Freitas da Silva
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
DARCY RIBEIRO - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
Março - 2008
INDUÇÃO DE INIBIDORES DE TRIPSINA EM FOLHAS DE
MARACUJÁ (Passiflora edulis f. flavicarpa) EM RESPOSTA AO
TRATAMENTO COM METIL JASMONATO E HERBIVORIA:
PURIFICAÇÃO PARCIAL E ESTUDO DO POTENCIAL
BIOINSETICIDA
SYLVIO BOTELHO JÚNIOR
“Tese apresentada ao Centro de Biociências e
Biotecnologia, da Universidade Estadual do Norte
Fluminense, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Biociências e
Biotecnologia”.
Aprovada em 6 de março de 2008
Comissão examinadora:
Dra Antonia Elenir Amâncio Oliveira
Dra Cristiane Martins Cardoso de Salles
Dr José Roberto da Silva
Dra Tânia Jacinto de Freitas da Silva (orientadora)
Agradecimentos
A Deus, por todos os momentos de minha existência.
Aos meus pais, pelo amor, fé e paciência.
Ao meu filho Caio e minha esposa Bruna, que são as pessoas mais importantes
de minha vida.
A Tânia Jacinto, por toda dedicação depositada neste projeto.
A professora Olga Machado, cuja participação foi fundamental para a realização
deste trabalho.
Aos amigos da UENF, Mateus, prof Franzé e Fábio por todo o apoio e
camaradagem.
Ao meu amigo e considerado irmão Bruno, por estar junto comigo nesta
“caminhada”, nos momentos bons e ruins.
Aos companheiros de bancada, César, Viviane e Cristiane pela ajuda e os bons
momentos compartilhados.
Um agradecimento especial a João e Cristiane, pela amizade e companheirismo.
Aos amigos do LBT e LQFPP pela ajuda e amizade.
A UENF, CNPq , CAPES e FAPERJ pelo financiamento.
i
íNDICE
1 - INTRODUÇÃO
1
1.1 O maracujá ------------------------------------------------------------------- 1
1.2 Defesa vegetal -------------------------------------------------------------- 4
1.3 Os inibidores de proteinase ---------------------------------------------- 5
1.4 - Controle da síntese de inibidores de proteinase ------------------ 7
1.5 - Os inibidores de proteinase serínica --------------------------------- 10
1.6 - Diatraea saccharalis -----------------------------------------------------
12
2 – OBJETIVOS
14
3- MATERIAIS E MÉTODOS
15
3.1 - Cultivo de plantas de maracujá ---------------------------------------
15
3.2- Tratamento com MeJa ---------------------------------------------------
15
3.3 Exposição das folhas de maracujá a herbivoria -------------------- 15
3.4 Extração de proteínas foliares ------------------------------------------- 16
ii
3.5 - Dosagem do teor protéico ---------------------------------------------- 16
3.6 - Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
(SDS-PAGE 12,5%) ------------------------------------------------------------- 16
3.7 - Ensaio de inibição de atividade proteolítica da
tripsina in vitro -------------------------------------------------------------------- 17
3.8 - Purificação parcial dos inibidores de proteinase
Serínica ----------------------------------------------------------------------------
17
3.9 – Purificação dos inibidores de proteinase serínica
presentes na fração enriquecida com inibidor via RP – HPLC ------- 18
3.10 – Ensaio de inibição da atividade proteolítica
das enzimas digestivas de larvas de Diatraea saccharalis------------ 19
3.11 - Seqüênciamento da região N-terminal ----------------------------
19
4 – RESULTADOS
20
4.1- Indução de inibidores de tripsina em folhas de
maracujá em resposta ao tratamento com MeJa e herbivoria--------
20
iii
4.2- Purificação parcial do inibidor de proteinase
serínica de folhas de maracujá induzidos por metil jasmonato ------
23
4.3 – Seqüência N-terminal dos inibidores presentes na FECI------- 26
4.4 - Efeito inibitório da FECI contra enzimas digestivas
do intestino médio das larvas de Diatraea saccharalis-----------------
28
4.5 – Purificação dos inibidores presentes na FECI -------------------- 30
5 – Discussão
35
5.1 – Indução de inibidores de proteinase serínica em folhas
de maracujá em resposta a herbivoria e MeJa ------------------------------ 35
5.2 – Purificação e caracterização parcial dos inibidores
de proteinase serínicos em folhas de maracujá induzidos por
metil jasmonato ------------------------------------------------------------------ 37
5.2.1 – Purificação parcial dos inibidores de proteinase
serínica via cromatografia de gel filtração (SEPHADEX G-100) --------------
37
5.2.2 – Purificação dos inibidores de proteinase presentes
na FECI via cromatografia de fase reversa (RP-HPLC) --------------------------
38
iv
5.3 – Análise preliminar da atividade bioinseticida de
Inibidores de proteinase serínica presentes na FECI ------------------ 40
6 - Conclusões
42
7 - Referências Bibliográficas
43
v
Lista de Figuras
Figura 1A - Lagarta de Dione juno juno -------------------------------------------------
3
Figura 1B - Adulto de Dione juno Juno --------------------------------------------------
3
Figura 2A -Lagartas de Agraulis vanillae vanillae ------------------------------------
3
Figura 2B - Adulto de Agraulis vanillae vanillae ---------------------------------------
3
Figura 3 - Via Octadecanóide --------------------------------------------------------------
9
Figura 4A - Lagartas de Diatraea Saccharalis -----------------------------------------
13
Figura 4B - Adulto de Diatraea Saccharalis --------------------------------------------
13
Figura 5 - Indução de inibidores de tripsina em folhas de maracujá em
resposta ao tratamento com MeJa -------------------------------------------------------
21
Figura 6 - Indução de inibidores de tripsina em folhas de maracujá em
resposta ao tratamento com herbivoria --------------------------------------------------
22
Figura 7 - Cromatografia de filtração em gel SEPHADEX G-100 ----------------
24
Figura 8 - Análise eletroférica da FECI em gel de poliacrilamida
desnaturante 12,5% --------------------------------------------------------------------------
25
Figura 9: Análise da inibição da atividade do extrato do intestino médio de
larvas de Diatraea saccharalis in vitro ---------------------------------------------------
29
Figura 10: Análise da inibição da atividade de tripsina in vitro na presença
de FECI ------------------------------------------------------------------------------------------
31
Figura 11: Cromatografia de fase reversa em alta pressão (HPLC) -------------
32
Figura 12: Análise eletroforética (12,5% SDS-PAGE) das frações obtidas
através de cromatografia de fase reversa em alta pressão (HPLC) -------------
33
Figura 13: Análise da inibição da atividade de tripsina in vitro na presença
dos picos obtidos através da técnica de RP-HPLC ----------------------------------
34
vi
Lista de Tabelas
Tabela 1- Dados referentes à produção brasileira de suco de maracujá----2
Tabela 2 - Seqüência N-terminal dos inibidores presentes na FECI --------26
Abreviaturas
ABS---------------- Absorbância
BApNa------------- N ∝- BENZOIL –DL -ARGININE 4-NITROANILIDE
BSA---------------- Albumina de soro Bovino
HCl----------------- Ácido clorídrico
HPLC-------------- Cromatografia líquida de alta performance
DMSO-------------- Dimetil sulfóxido
EDTA--------------- Ácido etileno Diamino Tetracético
kDa----------------- KiloDalton
MeJa--------------- Metil Jasmonato
PAGE--------------- Eletroforese em gel de poliacrilamida
PVPP--------------- Polivinilpolipirrolidona
RP-HPLC---------- Cromatografia Líquida de alta performance – Fase reversa
SDS---------------- Dodecil Sulfato de Sódio
Temed------------- N’,N’,N’,N’, Tetrametil etileno diamina
Tris----------------- Tris (hidroximetil) Amino Etano
UI-------------------- Unidade de inibição
vii
Resumo
Inibidores de proteinase pertencem a uma classe muito importante de
proteína de defesa em plantas contra ataque de insetos herbívoros. O acúmulo de
inibidores de proteinase é induzido em resposta a vários estímulos, por exemplo,
ferimento mecânico e ataque de insetos e patógenos. Para coordenar respostas a
estresses ambientais, plantas possuem uma complexa sinalização celular. Entre
as moléculas sinalizadoras, o hormônio vegetal conhecido como metil jasmonato
(MeJa) possui uma importante função na ativação da reposta de defesa. MeJa é
um produto do metabolismo de ácidos fatídicos sendo produzida através da via
octadecanoide. Para estudar a indução de proteínas de defesa por MeJa em
plantas de maracujá, foi analisado a atividade inibitória do extrato foliar bruto
contra atividade de tripsina. Ensaios in vitro mostram uma indução da atividade
inibitória de até 6 vezes quando plantas de maracujá são expostas a MeJa. Para
analisarmos o efeito da herbivoria sobre a indução de inibidores, escolhemos o
lepidóptero especialista, Agraule vanillae vanillae. O dano causado pela
alimentação das larvas aumenta a atividade inibitória contra tripsina nos extratos
foliares nos tempos de 24 e 48 h após a agressão. Os níveis de inibição
aumentam tanto nas folhas agredidas como nas folhas não agredidas, indicando
uma indução sistêmica. Além disso, nós estendemos nossos resultados
purificando através de técnicas cromatográficas 5 possíveis isoinibidores induzidos
por MeJa. A seqüência N-terminal de 12 aminoácidos de dois destes inibidores foi
obtida a partir do resíduo #1. As seqüências revelaram que esses inibidores não
só apresentam mesma seqüência parcial, mas demonstram homologia com
inibidores da família Kunitz de diferentes tipos vegetais. Experimentos preliminares
mostraram o potencial inseticida destes inibidores contra Diatraea saccharalis uma
das maiores pragas da cultura de cana de açúcar. Em conjunto os dados obtidos
nesse projeto, reforçam o papel dos inibidores de proteinase serínica no
mecanismo de defesa vegetal contra o ataque de pragas.
viii
Abstract
PIs are one of the most important classes of antiherbivore defense proteins
in plants. The accumulation of PIs is elicited in response to various stimuli, for
example, mechanical wounding, insect pest and pathogen attacks. To coordinate
responses to environmental stresses, plants have envolved complex signaling
network. Among signaling molecules, the plant hormone methyl jasmonate (MeJa)
plays a very important function in triggering defense responses. MeJa is a product
of the octadecanoid pathway of fatty acid metabolism. In order to study defensive
proteins induced by methyl jasmonate (MeJa) in passion fruit, it was analyzed the
inhibitory activity of crude leaf extracts against trypsin activity. In vitro assay
showed a 6-fold induction of inhibitory activity in crude leaf extracts when passion
fruit plants were exposed to MeJa. To analyse the effect of herbivory upon
inhibitors induction we chose a specialist lepidopteran pest, Agraule vanillae
vanillae. Leaf damage caused by larvae feeding increased the inhibitory activity
against trypsin in leaf extracts 24 and 48 h after larvae have been placed on plants.
The inhibitory levels increased in both damaged and undamaged leaves, indicating
a systemic induction. Moreover, we extended our previously results and 5 methyl
jasmonate-inducible proteinase iso-inhibitors were purified using chromatography
techniques. Previously, the N-terminal sequence of 12 amino acids from two of
them were obtained from residue #1. The sequence data revealed that both
inhibitors not only present the same partial sequence, but also display homology
with Kunitz trypsin inhibitors from different plant sources. Preliminary experiments
showed the potential insecticide of these inhibitors against Diatraea saccharalis, a
major pest of sugarcane. Taken together, these observations reinforce the serine
proteinase inhibitors role on defense mechanisms in plants against attacks by
pests.
ix
1 - Introdução
1.1 - O maracujá
O termo maracujá é utilizado para designar o fruto e a planta de espécies
do Gênero Passiflora, sendo assim uma forma generalizada de referir-se a uma
das plantas mais atraentes, não só pela beleza de suas flores, mas também por
diversas qualidades atribuídas aos seus frutos (Almeida e Cunha, 2004).
O maracujazeiro é uma planta arbustiva, trepadeira de crescimento
contínuo e vigoroso podendo atingir até 10 metros de extensão. Após 160 dias de
idade os ramos passam a ter um crescimento linear e as raízes desenvolvem-se
rapidamente (Liberato e Costa, 2001). Este vegetal pertence a ordem
Passiflorales, família Passiflorácea, gênero Passiflora. O gênero Passiflora reúne
cerca de 450 espécies, a maioria delas originárias da América Tropical. Segundo
Meletti et al. (1994), mais de 200 espécies são nativas do Brasil. A espécie mais
cultivada no país é a Passiflora edulis flavicarpa, onde seus frutos são conhecidos
popularmente como maracujá amarelo ou maracujazeiro-azedo (Bruckner e
Picanço, 2001).
O Brasil é o maior produtor mundial de maracujá com boas perspectivas
para ampliação da área cultivada. Segundo dados da Emater-RJ (2007), o
maracujá é produzido em mais de 40 municípios do Rio de Janeiro e o estado está
entre os principais produtores, seguido da Bahia, Espírito Santo, Sergipe e São
Paulo (www.embrapa.com.br). O cultivo do maracujá tem contribuído de forma
positiva para o crescimento econômico brasileiro, gerando empregos no meio rural
e urbano, criando divisas através das exportações de suco. A popularidade dos
produtos do maracujá está crescendo no mercado externo, devido principalmente
ao sabor exótico e marcante que ele oferece aos consumidores (Almeida e Cunha,
2004).
Os frutos de maracujá no Brasil são destinados a dois setores: o mercado
de frutas frescas e para a industrialização, principalmente de sucos. Nos
processos de industrialização há um grande potencial para o processamento de
1
bebidas, doces, sorvetes, cosméticos, além da utilização da fruta in natura. Na
indústria farmacêutica utiliza-se o maracujá como calmante (Rizzi et al., 1998),
fonte de niacina, vitamina A e C (Sjostorm e Rosa., 1978). Observa-se também um
crescente interesse pelo maracujá para fins ornamentais e o uso da casca e das
sementes para utilização como ração animal (Liberato e Costa, 2001).
Segundo os dados disponíveis na ASNT, a produção nacional de suco de
maracujá evoluiu, no período 1993 - 2005, conforme a Tabela 1. Observa-se que
no ano de 1995 ocorreu uma queda nas exportações de maracujá devido ao plano
econômico vigente, o que não acarretou na diminuição da produção do fruto.
Ano
1993
1994
1995
1996
1997
2000
2005
Produção
(toneladas)
36.692,8
41.501,9
67.240,0
72.122,6
79.335,0
87.270,0
95.995,0
Mercado Interno
Toneladas
(%)
33.048,3
39.375,7
66.992,0
66.511,6
73.163,0
80.480,0
88.528,0
90,1
94,9
99,6
92,2
92,2
92,2
92,2
Mercado Externo
Toneladas
(%)
3.644,5
2.126,0
248,0
6.109,0
6.172,0
6.790,0
7.467,0
9,9
5,1
0,4
8,5
7,8
7,8
7,8
Tabela 1: Dados referentes à produção brasileira de suco de maracujá.
Fonte: ASNT
Apesar do crescimento gradual na produção de maracujá esta cultura sofre
alguns tipos de problemas no país. Um dos grandes problemas enfrentados pelos
produtores de maracujá no Brasil são as pragas, pois geralmente ocasionam
grandes perdas na produção, podendo chegar a comprometer até 100% da
produtividade da cultura em alguns casos (Bruckner e Picanço, 2001). Dentre os
locais com problemas de pragas, as culturas de maracujá da região Norte
Fluminense do estado do Rio de Janeiro têm sofrido ataques que aniquilam as
plantas logo aos quatro meses de cultivo (www.embrapa.com.br). O maracujá é
hospedeiro de diversas espécies de insetos, nematóides, bactérias, vírus e
fungos, os quais danificam diferentes partes da planta incluindo raízes, hastes,
folhas, botões florais, frutos e flores (São José, 1994).
2
No Brasil, as lagartas desfolhadoras da ordem Lepidópitera constituem-se as
pragas que mais atacam o maracujazeiro. As principais espécies que atacam a
cultura no país são Dionae juno juno (figura 1) e Agraulis vanillae vanillae (figura
2). O ataque desses insetos caracteriza-se pela existência de folhas danificadas,
com redução da área foliar, além da presença da lagarta em desenvolvimento
(Boiça Jr., 1998).
(A)
(B)
Figura 1: Lagarta (A) e adulto (B) de Dione juno juno. Fonte: Maracujá - Do plantio
à colheita (5º Simpósio Sobre a Cultura do Maracujazeiro).
(A)
(B)
Figura 2: Lagartas (A) e Adulto (B) de Agraulis vanillae vanillae Fonte: Maracujá Do plantio à colheita (5º Simpósio Sobre a Cultura do Maracujazeiro).
3
O desenvolvimento de pesquisas na área de melhoramento genético e a
adoção de melhores métodos de condução da cultura constituem pontos
fundamentais para o desenvolvimento sustentável da cultura do maracujá no
Brasil. O conseqüente incremento da produtividade e a redução dos custos levam
a uma expansão do mercado interno e crescimento das exportações (Brucker e
Picanço, 2001).
Os estudos dos mecanismos de defesa das plantas de maracujá frente a
diferentes tipos de estresse causados pelo ambiente são de grande importância
para a melhoria da produtividade do vegetal no Brasil, auxiliando nos processos
de cultivo e colheita, e conseqüentemente aumentando ainda mais sua relevância
econômica no país.
1.2 - Defesa vegetal
As plantas por serem organismos sésseis, ficam sujeitas a numerosos
fatores ambientais, tais como o ataque de patógenos, estresse a dissecação,
temperaturas baixas ou elevadas e ferimento causado por insetos herbívoros
(Wasternack et al., 2006). Nas últimas décadas observou-se um grande avanço
em nossa compreensão sobre os mecanismos que as plantas usam para se
defenderem destas agressões (Karban e Anurag, 2002).
Os mecanismos de defesa vegetal podem ser agrupados em duas
categorias: as defesas constitutivas e as defesas induzidas. As primeiras
englobam as defesas pré-existentes durante o desenvolvimento normal da planta.
As defesas constitutivas podem ainda envolver estruturas vegetais, como por
exemplo, a parede celular e a cutícula, haja visto que estas estruturas dificultam o
processo de lesão causado por insetos mastigadores e patógenos. Além disso, as
defesas constitutivas se manifestam também pela presença de compostos
inseticidas e antimicrobianos que têm ação preventiva contra as lesões causadas
por pragas e colonização do tecido por patógenos (Wittstock e Gershenzon, 2002).
As defesas induzidas estão envolvidas na resposta ao ataque de
predadores ou presença de patógenos. Podem ser caracterizadas por
modificações estruturais na parede celular da planta hospedeira associada à
4
deposição de calose, lignina e produção de compostos fenólicos que conferem
maior rigidez à parede celular vegetal. Desta forma, tem-se então uma espécie de
barreira adicional que previne a disseminação dos patógenos para outros tecidos
da planta (Wittstock e Gershenzon, 2002). Além disso, ocorre a produção de
compostos químicos em resposta a estímulos físicos e químicos, devido à lesão
provocada pela alimentação de insetos herbívoros ou ataque de patógenos
(Valueva et al., 2003)
A resposta induzida em plantas através do ataque de insetos herbívoros é
bem descrita na literatura e incluem a produção de proteínas defensivas e outros
aleloquímicos, mudanças na qualidade nutricional da planta, e a liberação de uma
mistura complexa de compostos voláteis (Hare e Walling, 2006). Muitas respostas
induzidas podem ser mediadas pela via de sinalização do ácido jasmônico, e em
muitos casos esta resposta pode ser induzida simplesmente pela exposição da
planta ao ácido jasmônico ou ao seu metil éster (metil jasmonato) na ausência de
qualquer contato prévio com um inseto Herbívoro (Hare e Walling, 2006). As
respostas induzidas são extensivamente estudadas em diversas espécies de
plantas e freqüentemente observa-s a produção de proteínas de transferência de
lipídios (LTP) (Kader et al., 1996), inibidores de proteinase (IPs), peroxidases,
polifenoloxidase e alguns alcalóides (Felton, 2005).
1.3- Os inibidores de proteinase
As plantas possuem a capacidade de sintetizar diversas substâncias
biologicamente ativas. Algumas delas têm importante papel na defesa contra o
ataque de insetos e microorganismos. Entre essas substâncias estão os inibidores
de proteinase (IP) que são produzidos na planta através de um estresse biótico,
tendo a função de proteger o tecido vegetal de maiores danos (Chougule et al.,
2003). O interesse em compreender o papel fisiológico dos IP é cada vez maior
devido a sua importância em regular processos diversos que envolvem
proteinases, tais como a transcrição, o ciclo celular (Kataoka et al., 2002) e a
apoptose (Thompson e Palmer, 1998).
5
IP são proteínas ou peptídeos capazes de inibir atividades catalíticas de
enzimas
proteolíticas.
Os
IP
já
foram
encontrados
e
extensivamente
documentados em plantas e animais (Macedo et al., 2000), e são geralmente
categorizados de acordo com a classe de proteinase sobre o qual eles exercem
sua ação. Quatro classes de proteinase são bem identificadas, sendo elas: as
proteinases serínicas, as proteinases cisteínicas, as proteinases aspárticas e as
metalo proteinases (Koiwa et al., 1997). No sítio de ligação do inibidor, ou próximo
a ele, há um resíduo de aminoácido que é especificamente reconhecido no sítio
ativo da enzima responsável pelo reconhecimento do substrato primário. Deste
modo o inibidor pode agir apenas em proteinases pertencentes a classe específica
que reconhece seu sítio ativo. O complexo formado entre o sítio de ligação do
inibidor e o sítio catalítico da enzima não possui atividade enzimática sobre
qualquer substrato (Norton et al., 1991).
IP podem ser encontrados em órgãos vegetativos e órgãos de
armazenamento de quase todas as plantas cultivadas importantes na agricultura
(Garcia et al., 2004). A função primordial dos inibidores de proteinase no
mecanismo de defesa de plantas contra o ataque de pragas é assumida por
provocar a interferência da digestão de proteínas. Além da inibição direta das
proteinases digestivas, a hiper-secreção de enzimas digestivas causada pela
presença de inibidores no trato digestivo resulta na baixa disponibilidade de
aminoácidos essenciais livres (Bazok et al., 2005). Conseqüentemente ocorre a
redução da síntese de proteínas necessárias aos processos de crescimento e
desenvolvimento, ou mesmo nos processos reprodutivos do inseto (Bazok et al.,
2005). Além dos IP estarem envolvidos no mecanismo de defesa de plantas contra
organismos nocivos, eles também possuem um papel regulador durante o
desenvolvimento vegetal. Estudos do polimorfismo e distribuição dos inibidores de
proteinase no tecido vegetal de várias espécies de plantas são relevantes para
compreensão dos processos de evolução dos mecanismos de resistência contra
organismos patogênicos (Konarev et al., 2002).
Alem de suas funções fisiológicas, os IP são utilizados como ferramenta
bioquímica e em estudos das funções das proteinases, como a purificação de
6
enzimas proteolíticas através de cromatografia de afinidade e a compreensão
destas enzimas no meio em que ocorrem (Pando et al., 2001).
1.4 - Controle da síntese de inibidores de proteinase.
No processo evolutivo, plantas desenvolveram estratégias químicas para
sua proteção diante de estresses bióticos e abióticos. Algumas de suas
estratégias são: a emissão de substancias voláteis que atraem insetos predadores
de herbívoros, a formação de compostos tóxicos como a nicotina e a produção de
proteínas de defesa como os inibidores de proteinase. Em todas essas respostas
os jasmonatos ocorrem como um componente essencial de sinalização
(Wasternack et al., 2007).
O termo jasmonatos refere-se ao ácido jasmônico e seus derivados ativos
como o metil jasmonato (MeJa) e conjugados de aminoácidos (como a valina,
leucina e isoleucina) (Bate e Rothstein, 1998). O ácido jasmônico e o MeJa
também são classificados como oxilipinas. As oxilipinas são substancias
produzidas por transformação de um ácido graxo insaturado via uma série de
diferentes vias metabólicas. Intrigantes analogias podem ser encontradas entre a
biosíntese e a função de oxilipinas em vertebrados e plantas. Em mamíferos,
oxilipinas são formados principalmente pela via de cascata do acido araquidônico,
tendo um importante papel em processos inflamatórios, resposta a estresse por
infecções, alergia e exposição a alimentos e drogas. Nos vegetais, oxilipinas como
o acido jasmônico e o MeJa são sintetizados através de uma via denominada de
octadecanoide (figura 3), culminando na expressão dos genes de defesa de
plantas em resposta ao ataque de insetos e patógenos (Turner et al., 2002).
Farmer e Ryan (1990) foram os primeiros pesquisadores a revelarem que o MeJa,
quando aplicado de forma exógena, é um potente indutor da formação de
inibidores de proteinase em folhas de tomate, alfafa e tabaco.
.
7
Ácido linolênico
cloroplasto
Citosol
peroxissomo
Figura 3: Via Octadecanóide (adaptado de Wasternack et al., 2006).
8
Além dos jasmonatos, outras moléculas sinalizadoras são bem conhecidas
em
vegetais
tais
como
fragmentos
da
parede
celular
vegetal
(oligogalactorunídeos), quitosana e quitina, ácido abiscísico e sistemina (Miersch e
Wasternack., 2000). Essas moléculas sinalizadoras podem ser transportadas
localmente por difusão através de fluidos intracelular e extracelular que permeiam
a ferida ou o sítio de infecção, como também sistemicamente através do sistema
vascular das plantas (Pearce et al., 1991), disparando uma cascata de eventos
que termina na síntese e acúmulo de inibidores de proteinase que podem
permanecer por períodos prolongados na planta (Norton et al., 1991).
Um dos modelos de estudo mais bem caracterizado quanto a ativação da
resposta de defesa induzida por sinais sistêmicos em resposta ao ataque de
insetos herbívoros é a expressão de inibidores de proteinase em espécies da
família Solanacea. O sinal sistêmico, elucidado em plantas de tomate por Pearce
et al. (1991), é dado por um polipeptídio de 18 aminoácidos denominado
sistemina. A interação deste hormônio com um receptor inicia uma cascata de
sinalização que inclui a liberação de ácido linolênico da membrana celular e sua
subseqüente conversão a ácido jasmônico através da via octadadecanoide (figura
3), ocorrendo assim a ativação de genes responsáveis pela síntese de IP (Farmer
e Ryan,1992). Esta via ocorre em duas regiões distintas na célula vegetal,
iniciando-se na membrana dos cloroplastos onde há a liberação de ácido
linolênico através da ativação de lipases. Ainda no cloroplasto o ácido linolênico é
convertido em ácido 12-octo-phytodienóico (OPDA) através da ação seqüencial de
três classes de enzimas, as lipoxigenase (LOX), as aleno óxido sintase (AOS) e
aleno óxido ciclase (AOC). Logo após, o OPDA é exportado para os
peroxissomos, onde é reduzido para ácido 3-octo-2(2´ [z]-pentenil)-ciclopentano-1octanoide (OPC8) através de uma enzima chamada OPDA-redutase. O OPC8
sofre β-oxidação através de uma reação em cascata tendo a remoção de
moléculas de carbono de sua cadeia principal, formando assim o ácido jasmônico
(Li et al., 2005).
9
1.5 - Os inibidores de proteinase serínica
Inibidores de proteinase serínica são amplamente distribuídos na natureza
e podem inibir a ação de enzimas em diferentes organismos (Teles et al., 2004).
Eles são encontrados em tecidos animais, microorganismo e também em tecidos
vegetais (Pando et al., 2001). Usualmente, eles estão presentes em múltiplas
formas e em diferentes tecidos dos organismos. Por muitos anos esses inibidores
têm sido investigados por várias razões, o qual se pode incluir sua utilidade nos
estudos das interações proteína-proteína (Rao e Suresh, 2007). Embora os
inibidores de proteinase serínica participem no controle da atividade de
proteinases em diferentes processos fisiológicos, suas funções nos organismos
onde são encontrados ainda não são totalmente compreendidas (Teles et al.,
2004).
Os inibidores de proteinase serínica são normalmente subdivididos dentro
de oito famílias, baseado na informação de sua seqüência primária. Apesar das
famílias possuírem seqüências primárias e estruturas diferentes, os mecanismos
de catálise e estrutura do local de reação do inibidor de proteinase serínica são
bem conservados, com exceção das proteínas da família das serpinas (Koiwa et
al., 1997).
Nos vegetais os inibidores de proteinase serínica estão agrupados nas
famílias Kunitz, Bowman Birk, Potato I e II e na família de inibidores “Squash”
(Bhattacharyya et al., 2006). Sementes e orgãos de armazenamento são uma rica
fonte de inibidores de proteinase, particularmente inibidores de proteinase
serínicas. Alguns desses inibidores, especialmente os de menor massa, como os
inibidores da família “Squash”, são de particular interesse como terapêuticos por
sua capacidade inibitória de tripsina, plasmina, catepsina G e fatores de
coagulação sangüinea do tipo Xa e XIIa (Kowalska et al., 2007). Em adição, tais
proteínas são modelos muito atrativos de moléculas com estrutura simplificada,
possuindo atividade seletiva contra quimiotripsina, elastase de leucócitos humanos
ou carboxipeptidase A. Sementes de leguminosas são particularmente ricas em
inibidores de proteinase das famílias Kuntiz e Bowman Birk (Bhattacharyya et al.,
2006), os quais são os mais bem estudados em vegetais (Teles et al., 2004).
10
Inibidores de proteinase serínica pertencentes a família Kunitz são proteínas de
aproximadamente 20 kDa, contendo quatro resíduos de cisteína e possuindo um
único sítio de reação, enquanto inibidores do tipo Bowman Birk possuem peso
entre 8 a 10 KDa, contendo alta quantidade de cisteína e dois sítios de reação
(Bhattacharyya et al., 2006).
Os inibidores de proteinase serínicas podem ser bifuncionais, possuindo
atividade inibitória contra a tripsina e quimiotripsina (Koiwa et al., 1997), tendo
importante potencial inibitório contra enzimas digestivas de insetos herbívoros de
plantas economicamente importantes. Estes inibidores formam um importante
componente na estratégia do mecanismo de defesa de várias espécies de planta.
Em geral, a taxa de síntese destes inibidores atinge o ápice em 12 horas e resulta
em níveis máximos de acumulação por volta de 24 a 48 horas após o ataque de
um inseto (Bhattacharyya et al., 2007).
Insetos lepidópteros possuem como maioria de suas enzimas digestivas
proteases serínicas, fazendo com que a produção de inibidores contra esta classe
de protease em plantas seja um importante mecanismo de defesa, atuando como
pesticida natural (Damle et al., 2005). Esses inibidores entram no trato digestivo
dos insetos juntamente com o alimento provocando bloqueio na digestão de
proteínas, em conseqüência, há uma privação de aminoácidos e energia,
resultando no retardamento do crescimento e no desenvolvimento destes insetos.
Com isso, surge o interesse de produzir cultivares transgênicos expressando
genes de inibidores de tripsina, tornando assim essas plantas resistentes a insetos
herbívoros (Yoshizaki et al., 2007). Por outro lado os insetos exibem mecanismos
para a produção de proteinases insensíveis a presença destes inibidores ou
capazes de degradá-los. Insetos capazes de se adaptar ao mecanismo de defesa
das plantas têm maior chance de sobrevivência e de emergir como uma potente
peste de culturas economicamente importantes (Damle et al., 2005)
Os inibidores de proteinase serínica são alvo de interesse não somente
pelo seu uso como bioinseticida, mas também por sua atividade antifúngica. Uma
outra aplicação biotecnológica desses inibidores é a capacidade de inibir o
crescimento de células transformadas. Por causa desta característica estes
11
inibidores podem apresentar propriedades anticarcinogênicas (Yoshizaki et al.,
2007).
O acúmulo de inibidores de proteinase serínica no tecido foliar em resposta
a ferimento é bem caracterizado em um grande número de plantas cultivadas
pertencentes a vários gêneros e famílias. Entre as plantas estudadas, folhas de
tomate, tabaco e batata, pertencentes a família solanácea, acumulam inibidores
de proteinase serínica tanto por injúria mecânica quanto por ataque de insetos
herbívoros e contato com microorganismos patogênicos (Valueva et al., 2003).
Contudo, muitos estudos sugerem que a resposta à injúria de plantas por insetos,
comparados com a resposta por injúria mecânica, resulta em diferentes respostas
bioquímicas e fisiológicas (Tamayo et al., 2000).
1.6 - Diatraea saccharalis
D. saccharalis também é conhecida popularmente como broca da cana-deaçúcar, sendo um lepidóptero existente nas Américas. Em sua fase adulta se
apresenta como uma mariposa de hábitos noturnos que faz a posturas de seus
ovos na parte dorsal das folhas de plantas como cana-de-açúcar, arroz, milho,
sorgo e outras gramíneas (Bortoli et al., 2004). O dano provocado pela lagarta de
D. saccharalis no cultivo destas plantas pode ser direto, por meio de abertura de
galerias no interior do colmo da planta, reduzindo o fluxo de seiva além de torná-la
mais suscetível ao tombamento pela ação do vento e chuvas; ou indireto, quando
os orifícios favorecem a penetração de microorganismo fitopatogênicos no interior
do colmo (Gallo et al., 2002).
A D. saccharalis têm importância econômica na maioria dos países onde a
cultura de cana-de-açúcar tem expressão. O Brasil é o maior produtor mundial de
cana-de-açúcar sendo que a D. saccaharalis é a praga que mais causa perdas à
cultura no país (www.embrapa.br). A produção brasileira de cana-de-açúcar
alcançou 475,7 milhões de toneladas na safra 2006/07 onde cerca de 86% da
produção foi concentrada no Centro-Sul, sendo 59,5%, ou 283 milhões de
toneladas em São Paulo, onde o plantio da cana ocupa 3,3 milhões de hectares.
Do total produzido, 89,6% são destinados à indústria sucro-alcooleira. A produção
12
total de álcool deve alcançar 17,6 bilhões de litros, sendo 9,2 bilhões do tipo
hidratado e 8,4 bilhões do anidro (www.folha.uol.com.br/folha/dinheiro).
Devido a crescente importância da cana-de-açúcar na economia, e sendo a
D. saccharalis a principal praga que acomete a cultura no Brasil, torna-se
interessante a utilização da D. saccharalis como inseto modelo para estudos do
potencial bioinseticida dos IP´s do maracujá.
(A)
Figura
4:
Lagarta
(B)
(A)
e
Adulto
(B)
da
Diatraea
saccharalis.
Fonte:
www.embrapa.br.
13
2 – Objetivos
Geral:
¾ Estudar o papel dos inibidores de proteinase serínica de folhas de maracujá
na resposta à defesa contra ataque de insetos herbívoros.
Objetivos específicos:
¾ Analisar a indução de inibidores de proteinase serínica em folhas de
maracujá em resposta ao tratamento com metil jasmonato e herbivoria,
¾ Purificação dos inibidores de proteinase serínica induzidos por metil
jasmonato em folhas de maracujá (Passiflora edulis f. flavicarpa) através de
técnicas cromatográficas.
¾ Determinar os inibidores através da obtenção das seqüências de
aminoácidos da região N-terminal.
¾ Estudar o potencial bioinseticida destes inibidores usando como inseto
modelo Diatraea sacaralis.
14
3- Materiais e métodos
3.1 - Cultivo de plantas de maracujá
Sementes de plantas de maracujá (Passiflora edulis f. flavicarpa), obtidas a
partir de frutos comprados em mercado local, foram germinadas em vermiculita e
depois transferidas para vasos de xaxim, onde permaneceram durante 20 dias em
câmara de crescimento com fotoperíodo de 17 h de luz, a 28 oC, e 7 h no escuro a
18 oC. Neste estágio de desenvolvimento as plantas possuem quatro folhas,
sendo duas expandidas e duas apicais ainda em desenvolvimento.
3.2- Tratamento com MeJa
Para o tratamento com metil jasmonato utilizamos metodologia descrita por
Rangel et al. (2002). Um μL de uma solução de MeJa 96% foi colocado na ponta
de um cotonete preso a parede de recipientes de vidro com volume de
aproximadamente 4000 cm3. Plantas intactas de maracujá foram colocadas nestes
recipientes e os mesmos foram fechados e vedados com parafilme, pois o MeJa é
uma substância volátil. Desta forma, as plantas ficaram expostas continuamente
ao vapor do MeJa. O conteúdo protéico foliar foi analisado após 24 h e 48 h de
indução. Essas plantas ficaram expostas à luz durante as primeiras 24 h, para
intensificar a resposta de defesa.
3.3 - Exposição das folhas de maracujá à herbivoria
Para o estudo da indução de inibidores de proteinase em folhas de
maracujá por herbívora utilizamos metodologia descrita por Haruta et al. (2001),
com modificações. Larvas de Agraulis vanillae vanillae (adquiridos de ovos
coletados no campo) no quarto instar de desenvolvimento, foram colocadas em
contato com folhas de planta de maracujá cultivadas como descrito no item 3.1
(uma larva por planta). Essas larvas permaneceram por um período de 4 horas em
contato com as plantas. Folhas feridas e sistêmicas (que não foram atacadas
15
pelas larvas) foram recolhidas nos tempos 24 h e 48 h contadas a partir do inicio
da exposição às larvas, sendo imediatamente mergulhadas em nitrogênio líquido.
3.4 Extração de proteínas foliares
Folhas de plantas de maracujá expostas às diferentes condições descritas
no item 3.2 e 3.3 foram maceradas, utilizando-se grau e pistilo, na presença de
nitrogênio líquido. Foram adicionados polivinilpolipirrolidona (10% do peso das
folhas) e o conteúdo protéico foi extraído pela adição de 3 mL de tampão de
extração (fosfato de sódio 50 mM, pH 6,5) para cada grama de folha. O material
foi homogeneizado suavemente durante alguns minutos e mantido no gelo, sendo
em seguida centrifugado durante 20 minutos, a 10.000g, 4
o
C. Após a
centrifugação, o sobrenadante foi coletado e o precipitado descartado.
3.5 - Dosagem do teor protéico
O teor protéico dos extratos foliares obtidos foi quantificado utilizando-se o
Método de Bradford (1976). Uma curva padrão utilizando Albumina de soro bovino
(BSA) foi feita de acordo com as instruções do ‘’Kit Bio-Rad Protein Assay’’. A
curva padrão foi projetada num gráfico de absorbância a 595 nm versus μg de
proteína. A massa de proteína correspondente a cada extrato foliar foi
determinada a partir do gráfico da curva padrão.
3.6 - Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDSPAGE 12,5%)
As proteínas foliares estudadas neste trabalho foram analisadas em géis de
poliacrilamida 12,5 % conforme metodologia descrita por Laemmli (1970). As
amostras protéicas foram preparadas previamente com tampão de amostra
contendo Tris-HCl 0,0625M, pH 6.8, glicerol 10%, ABF (azul de bromofenol)
0,001%, SDS 2% e β-mercaptoetanol 5%, aquecidas a 100 oC durante 3 minutos e
centrifugados por 10 segundos. Foi utilizado tampão de corrida constituído por Tris
0,025 M, glicina 0,192 M; SDS 0,1%. A corrida eletroforética foi realizada com
16
voltagem constante (100 V) por cerca de 1h. Em seguida, as proteínas foram
fixadas e coradas pela imersão do gel em solução contendo Coomassie Brilliant
Blue R 250 0,2%, metanol 45% e ácido acético 10% durante aproximadamente 30
min. Em seguida, os géis foram colocados em solução descorante contendo
metanol 5% e ácido acético 7%.
3.7 - Ensaio de inibição de atividade proteolítica da tripsina in
vitro
Para o estudo da atividade do(s) inibidor(es) de proteinase serínica
presente(s) em folhas de maracujá, foi utilizado enzima comercial tripsina, e como
substrato BApNA (N ∝- BENZOIL –DL -ARGININE 4-NITROANILIDE). O extrato
foliar foi pré-incubado com 10 μL de tripsina 100 μg/mL (W/V) diluída em tampão
de reação (Tris-HCl, 50 mM, pH 8.0, com CaCl2 20 mM). O volume foi ajustado
(100 μL) pela adição de tampão de reação, e em seguida, os tubos permaneceram
a 37 oC por 5 min. Logo após, a reação foi iniciada pela adição de 100 μL de
BApNA 2 mM em DMSO 10% e incubada a 37oC por 30 minutos. A reação foi
parada pela adição de 100 μL de ácido acético 30%. A atividade inibitória foi
avaliada através do declínio da hidrólise do BApNA pela tripsina quando a solução
contendo o inibidor encontrava-se presente. A leitura da absorbância foi feita em
espectrofotômetro no comprimento de onda de 405 nm. Em nossas análises, uma
unidade de inibição é a quantidade de inibidor que reduz a leitura da densidade
óptica da hidrólise de BApNA pela trypsina por 0.01.
3.8 - Purificação parcial dos inibidores de proteinase serínica.
A purificação parcial dos inibidores foi realizada conforme descrito por
Rangel et al. (2002), com algumas modificações. Para isso, plantas de maracujá
foram tratadas durante 4 dias com MeJa, para se obter um maior acúmulo do
inibidor. Após a extração das proteínas foliares, se iniciou um processo de
precipitação protéica, por sulfato de amônio. Foi adicionado inicialmente sulfato de
amônio numa concentração suficiente para se atingir uma saturação de 20%. A
17
solução permaneceu sob agitação suave durante 3 h a 4 oC. O material obtido foi
centrifugado a 10.000g por 20 min a 4 0C. Terminada a centrifugação, o
sobrenadante foi coletado e a ele foi adicionado sulfato de amônia para atingir
uma saturação de 55%. A solução permaneceu sob agitação suave durante 3 h a
4
0
C. O material foi centrifugado como descrito acima. O sobrenadante foi
descartado, e o precipitado foi coletado e ressuspenso em um menor volume
possível de tampão tris-HCl 50 mM, pH 8,0. A fração obtida após o processo de
precipitação foi submetida a uma cromatografia de filtração em gel (Sephadex G100) previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, sob um fluxo
de aproximadamente 1 mL por minuto. As frações coletadas foram monitoradas a
280 nm, para estimar a quantidade de proteínas, e foram submetidas a ensaio de
atividade inibitória in vitro avaliando quanto à atividade inibitória contra tripsina. As
frações que obtiveram maior atividade biológica foram reunidas e passaram por
processo de diálise e liofilização. O material liofilizado foi solubilizado em água
(10% do seu volume inicial) e seu perfil protéico foi observado através de
eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5% (SDS-PAGE).
3.9 – Purificação dos inibidores de proteinase serínica presentes
na fração enriquecida com inibidor via RP - HPLC.
Frações enriquecidas com inibidor de proteinase serínica obtidas através de
metodologia descrita no ítem 3.8, foram submetidas a uma cromatografia de fase
reversa em alta pressão (HPLC) conforme descrito por Garcia et al (2004) com
modificações. Utilizamos uma coluna C18 (ST, 18 μ, 4.6 x 250 mm, Amersham
Biosciences) sob um fluxo de 0,7 mL/min. A corrida cromatográfica foi iniciada
com 100% de solvente A [sulfato de potássio 10 mM, pH 6,0 em água] por 10 min
seguido por um gradiente linear (0% - 100%) do solvente B (sulfato de potássio 10
mM em acetonitrila, 50:50 v/v) por 55 min. Proteínas foram detectadas e coletadas
por monitoramento da absorbância a 220 nm. As frações obtidas foram
submetidas a ensaio de atividade inibitória in vitro conforme descrito no item 3.7 e
seu perfil protéico avaliado por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
(SDS-PAGE 12,5%).
18
3.10 – Ensaio de inibição da atividade proteolítica das enzimas
digestivas de larvas de Diatraea saccharalis.
Larvas de Diatraea saccharalis no quarto estádio de desenvolvimento foram
doadas pela Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), situada em
Campos dos Goytacazes. As larvas foram imobilizadas em gelo e o intestino
médio foi removido na presença de NaCl 150 mM a 4 0C. Dez intestinos médios
foram homogeneizados em 500 μL de NaCl 150 mM e centrifugados a 10.000g por
30 min a 4
0
C. Logo após a centrifugação coletamos o sobrenadante e
descartamos o precipitado. Após adquirirmos esse extrato, foi feita uma dosagem
do teor protéico como descrito no item 3.5 e em seguida, realizamos um ensaio da
atividade enzimática como descrito por Garcia et al (2004), com modificações.
O efeito da atividade proteolítica do extrato dos intestinos médios da larva
foi medido usando BApNA (1 mM) como substrato. Neste ensaio utilizamos TrisHCl 50 mM, pH 8,0 como tampão de reação. O extrato dos intestinos médios (80
μg) foi pré-incubado por 5 min a 37 oC na presença de diferentes concentrações
(0,2, 0,5, 1, 2 e 3 μg) da fração enriquecida com inibidor obtido como descrito no
item 3.8. Após este procedimento foi adicionado o substrato incubando a reação
por 30 min a 37 oC. A reação foi parada adicionando-se ácido acético 30% e a
leitura da absorbância foi feita em espectrofotômetro a 405 nm.
3.11 - Seqüênciamento da região N-terminal
O seqüenciamento dos aminoácidos da região N-terminal dos inibidores de
proteinase serínico, foram realizados pela Dra Ana Gisele C. Neves Ferreira do
laboratório de Toxinologia do Departamento de Fisiologia e Farmacodinamica no
Instituto de Pesquisa Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro
19
4 – Resultados
4.1- Indução de inibidores de tripsina em folhas de maracujá em
resposta ao tratamento com MeJa e herbivoria.
Ensaios enzimáticos in vitro utilizando BApNA como substrato, foram
realizados para averiguar a atividade inibitória contra tripsina em extratos foliares
de plantas controle, exposta ao MeJa e a herbivoria. A figura 5 mostra que o
tratamento com MeJa por 24 h causou um aumento na atividade inibitória de cerca
de 2,5 vezes quando comparado aos valores obtidos com plantas controle.
Enquanto plantas expostas ao MeJa por 48 horas apresentaram um aumento de
cerca de 6 vezes, em relação a plantas controle. Também avaliamos o efeito do
ferimento causado pela alimentação da larva de um inseto especialista (Agraulis
vanillae vanillae), nos níveis de inibidores de tripsina. Como podemos observar na
figura 6, 24 horas após o início do experimento as folhas atacadas pelas larvas
apresentaram um aumento de cerca de 3 vezes na atividade inibitória em relação
a atividade encontrada em plantas controles. Um dado interessante foi a
observação da indução a nível sistêmico, uma vez que as folhas não atacadas
também apresentaram aumento na atividade inibitória. Valores similares de
indução após herbivoria foram observados quando as plantas foram analisadas 48
horas após o início do experimento.
20
UI/ μg de proteina total
24 h
48 h
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
C
MeJa
C
MeJa
Tratamento
Figura 5: Análise da inibição da atividade de tripsina in vitro por extrato foliares de
planta de maracujá. C: folhas controle; MeJa: folhas tratadas com metil jasmonato.
Desvio padrão (n= 3). Uma unidade de inibição é a quantidade de inibidor que
reduz a leitura da densidade óptica da hidrólise de BApNA pela tripsina por 0,01.
21
UI/ μg de proteína total
24 h
48 h
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
C
H
S
C
H
S
Tratamento
Figura 6: Análise da inibição da atividade de tripsina in vitro por extrato foliares de
planta de maracujá. C: folhas controle; H: folhas expostas a injúria por herbívora;
S: Folhas não danificadas de plantas expostas a herbivoria (sistêmica). Desvio
padrão (n= 3). Uma unidade de inibição é a quantidade de inibidor que reduz a
leitura da densidade ótica da hidrólise de BApNA pela tripsina por 0.01.
22
4.2- Purificação parcial do inibidor de proteinase serínica de
folhas de maracujá induzidos por metil jasmonato.
As proteínas do extrato foliar de plantas expostas ao MeJa por um período
de 4 dias foram precipitadas pela adição de sulfato de amônio (20 e 55%),
solubilizadas em menor volume possível de tampão e submetido à cromatografia
de filtração em gel utilizando resina Sephadex G-100. A figura 7 mostra o perfil de
eluição das proteínas durante a corrida cromatográfica e a atividade inibitória
contra tripsina das frações coletadas.
Por esta análise pode-se constatar um único pico com atividade inibitória
entre as frações 45 e 65. Essas frações foram reunidas, dialisadas, liofilizadas e
ressuspensas em 10% do seu volume inicial em água destilada. Em seqüencia,
analisamos o conteúdo protéico das frações reunidas através de técnicas de
eletroforese (SDS-PAGE 12,5%). Porém, o extrato bruto foliar também foi aplicado
no gel para efeito de comparação. A figura 8 mostra que a fração enriquecida com
o inibidor (FECI) possui 3 bandas protéicas majoritárias na faixa de 20 a 25 kDa.
Além disso, também podemos observar que a FECI apresenta uma complexidade
protéica muito menor quando comparado ao extrato bruto.
23
0.7
0.6
0.6
0.5
0.4
0.4
0.3
0.2
0.2
0.1
0.0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0.0
180
Inibição (Δ405 nm)
Absorbância (280 nm)
0.8
0.8
Frações
Figura 7: Cromatografia de filtração em gel SEPHADEX G-100. A amostra
protéica foi aplicada na coluna previamente equilibrada em tampão Tris-HCl 50
mM, pH 8,0. Frações de 0,5 mL foram coletadas e analisadas quanto a presença
de proteínas (■ absorbância a 280 nm). A atividade de inibição de tripsina foi
analisada em todas as frações coletadas (● Δ405 nm).
24
ECCO
IA
PFI
EX
BR TR
UT AT
O O
PM
pã
o
Ta
m
94.0
∗
67.0
∗
43.0
30.0
1
2
3
20.1
14.4
Figura 8: Análise eletroférica da FECI em gel de poliacrilamida desnaturante
12,5%. Extrato bruto: extrato foliar induzido com metil jasmonato por 4 dias (45
μg); FECI: fração enriquecida com inibidores (5 μg); PM: peso molecular. As setas
indicam as bandas majoritárias presentes na FECI. OBS: As bandas de alto peso
(∗) são provenientes de contaminação no tampão de amostra como pode se
observar na primeira raia.
B
T
2
B
25
4.3 – Seqüência N-terminal dos inibidores presentes na FECI.
As 3 bandas majoritárias presentes na FECI foram nomeadas de 1, 2 e 3 e
enviadas após transferência para membrana de PVDF para Dra. Ana Gisele C.
Neves Ferreira para seqüenciamento, onde conseguimos obter a seqüência Nterminal das proteínas 2 e 3. A seqüência parcial encontrada (ELRTGVPYYLAR)
foi idêntica para ambas as proteínas. A tabela 2 mostra o alinhamento da
seqüência em questão com outras de inibidores de tripsina de origem vegetal. As
seqüências foram alinhadas automaticamente usando o sistema de pesquisa
NCBI-Blast. Todos os inibidores que apresentaram homologia com nossas
seqüências são inibidores de proteinase serínica pertencentes a família Kunitz.
Inibidores presentes em plantas do gênero Theobroma (Theobroma mammosum,
Theobroma subincanum e Theobroma sylvestre) apresentaram maior grau de
homologia com nossa seqüência. Dentre os inibidores que apresentaram
homologia também estão incluídos inibidores de plantas da família solanacea
(Solanum melongena e Nicotiana tabacum).
1
C
1a
26
2
3
88
88
Identidade
(%)
88
88
88
Positivos
(%)
Seqüencia/Homologia
88
100
Posição
inicial
83
87
Populus tremula trypsin inhibitor (CAI77814)
Theobroma sylvestre trypsin inhibitor (AAL85657)
Theobroma subincanum trypsin inhibitor (AAL85644)
4
37
8
GVPYYM
LRTGIDYY
ELRTGVPYYLAR
Solanum melongena trypsin inhibitor (BAA82843)
LRTGVDYY
1
ELRTGVPYYLAR
ELRTGVQYY
75
87
1
8
ELRTGVQYY
87
87
Lycopersicon esculentum trypsin inhibitor (AAC63057 ) 39
Theobroma mammosum trypsin inhibitor (AAL85652)
8
ELRTGVEYY
75
LRTGIDYY
(AAC49969)
39
Nicotiana tabacum trypsin inhibitor
Tabela 2: Seqüência parcial de inibidores de tripsina de folhas de maracujá alinhados com diferentes regiões de
inibidores conhecidos da família Kunitz.
27
4.4 - Efeito inibitório da FECI contra enzimas digestivas do
intestino médio das larvas de Diatraea saccharalis.
Para testarmos o potencial bioinseticida dos inibidores presentes na FECI,
utilizamos como inseto modelo a Diatraea saccharalis. Uma vez que esse
lepidóptero apresenta como maioria de suas enzimas digestivas proteases
serínicas e é uma praga de grande importância econômica, achamos importante
estudarmos o efeito biológico de nossos inibidores nesta espécie. Na figura 9
observamos que a atividade proteolítica do extrato protéico do intestino médio
diminuiu com o aumento da concentração de FECI. Com a concentração inicial de
0,2 μg de FECI já observamos a diminuição de 40% da atividade enzimática. A
atividade proteolítica é praticamente abolida adicionando-se 3 μg de FECI.
C
28
Atividade proteolítica residual (% )
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0,2
0,5
1
2
3
FECI (μg)
Figura 9: Análise da inibição da atividade do extrato do intestino médio de larvas
de Diatraea saccharalis in vitro pela fração enriquecida com inibidor (FECI). O
ensaio foi feito utilizando-se 80 μg do extrato do intestino médio. Desvio padrão
(n=3).
29
4.5 – Purificação dos inibidores presentes na FECI
Para darmos prosseguimento ao processo de purificação dos inibidores de
proteinase serínica obtidos através de cromatografia de filtração em gel conforme
descrito no item 3.8, utilizamos a técnica de cromatografia de fase reversa de alta
performance (HPLC). Inicialmente, nos baseamos em metodologia descrita na
literatura para purificação de inibidores de proteinase serínica. Utilizamos coluna
C4 com fluxo de 1 mL por minuto em um gradiente de 0-80% de acetonitrila com
TFA 0,1%. Dos picos coletados neste ensaio, 3 apresentaram proteínas
detectáveis, mas não foi observada atividade inibitória contra tripsina em nenhuma
das frações (dado não mostrado).
Para tentarmos elucidar a causa da perda de atividade biológica das
proteínas eluídas da RP-HPLC, investigamos a capacidade inibitória da FECI na
presença dos constituintes da fase móvel empregada, isto é, acetonitrila e TFA.
Foram realizados ensaios enzimáticos conforme descrito no item 3.7, utilizando
FECI após incubação com acetonitrila 40, 60 e 80% (figura 10, barra 2, 3 e 4) e
TFA 0,1% (figura 10, barra 5) e com os dois constituintes simultaneamente, TFA
0,1% acetonitrila 60% (figura 10, barra 6). Como podemos observar, a atividade
inibitória da FECI não foi afetada após incubação com as diferentes concentrações
de acetonitrila utilizadas. Em contraste, após incubação com TFA 0,1% a atividade
foi perdida por completo, o que se repetiu quando a FECI foi incubada com ambos
os reagentes da fase móvel.
Segundo nossas análises, a perda da atividade biológica dos inibidores
pode ser atribuída ao contato prévio com TFA. Com isso, modificamos nosso
processo de purificação, utilizando a técnica RP-HPLC, excluindo da fase móvel o
TFA, substituindo-o por sulfato de potássio 10 mM com o propósito de mantermos
a atividade biológica dos inibidores, e assim otimizar as condições de purificação.
A figura 11 mostra o perfil de eluição das proteínas da FECI utilizando esta nova
metodologia. Os picos desta cromatografia foram coletados e analisados quanto o
seu conteúdo protéico através de SDS – PAGE 12,5% (figura 12).
Dos picos coletados, 6 apresentaram proteínas detectáveis em nossas
análises e foram designados picos 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Como podemos observar as
30
proteínas presentes em cada pico estão praticamente homogêneas, com exeção
da amostra 4. É importante ressaltar que todas as bandas protéicas identificadas
estão dentro da faixa de peso das proteínas majoritárias observadas na FECI. Os
seis picos onde observamos proteínas detectáveis foram analisados quanto a sua
atividade biológica conforme descrito no item 3.7. Todas as amostras analisadas
apresentaram atividade inibitória contra tripsina, como podemos observar na figura
Atividade proteolítica residual (%)
13.
120
100
80
60
40
20
0
1
T
2
1
3
2
34
45
56
67
Figura 10: Análise da inibição da atividade de tripsina in vitro na presença de
FECI. T: Somente tripsina; 1: tripsina + FECI; 2: tripsina + FECI após contato com
acetonitrila 40%; 3: tripsina + FECI após contato com acetonitrila 60%; 4: tripsina +
FECI após contato com acetonitrila 80%; 5: tripsina + FECI após contato com TFA
0,1%; 6: tripsina + FECI após contato com TFA 0,1% e acetonitrila 60%.
Obs: Para cada ensaio foi utilizado 3 μg de FECI.
31
4
3
5
1
2
6
Figura 11: Cromatografia de fase reversa de alta performance (HPLC) em coluna
C4. Eluição: gradiente de acetonitrila (0-50%) em 10 mM de sulfato de potássio,
taxa de fluxo: 0,7 ml/min. Os picos contendo proteína detectável em nossas
condições de análises foram designados 1, 2 ,3, 4, 5 e 6.
32
Figura 12: Análise eletroforética (12,5% SDS-PAGE) das frações obtidas através
de cromatografia de fase reversa de alta performance (HPLC). Os números das
raias representam os 6 picos ressaltados na figura 10.
33
Figura 13: Análise da inibição da atividade de tripsina in vitro na presença dos
picos obtidos através da técnica de RP-HPLC. C: somente tripsina; 1: reação
acrescida de 30 μL da eluição do pico 1; 2: reação acrescida de 30 μL da eluição
do pico 2; 3: reação acrescida de 30 μL da eluição do pico 3; 4: reação acrescida
de 30 μL da eluição do pico 4; 5: reação acrescida de 30 μl da eluição do pico 5; 6:
reação acrescida de 30 μL da eluição do pico 6.
34
5 – Discussão
5.1 – Indução de inibidores de proteinase serínica em folhas de
maracujá em resposta a herbivoria e MeJa.
Entre os diferentes mecanismos de defesa vegetal em plantas de maracujá,
pouco é conhecido sobre as proteínas de defesa e seus correspondentes genes. A
presença de proteínas de defesa em células vegetais é uma estratégia importante
para a proteção de plantas contra patógenos (Broekaert et al., 1997). Dentre as
proteínas de defesa os inibidores de proteinase serínica têm sido alvo de estudo
devido o seu papel antinutricional provocando o retardo no desenvolvimento de
insetos herbívoros. Sua função defensiva já foi documentada em várias espécies
de plantas (Zavala et al., 2004) e sua produção pode ser aumentada através do
ataque de inseto herbívoro ou exposição ao metil jasmonato (Kessler et al., 2006).
Em geral, inibidores de proteinase serínica são freqüentemente expressos
constitutivamente em baixos níveis no tecido foliar (Hare e Walling, 2006). Em
1990, Farmer e Ryan demonstraram que vapores de metil jasmonato induzem a
produção de inibidores de proteinase serínicas em folhas de plantas de tomate,
tabaco e alfafa.
Com base nos dados bibliográficos acima descritos, iniciamos o estudo da
indução de inibidores de proteinase serínica em folhas de maracujá expostos ao
MeJa. Ensaios enzimáticos da atividade inibitória contra tripsina revelaram um
aumento da atividade inibitória de até seis vezes em plantas após 48 h de
tratamento com MeJa (figura 5). Estes resultados estão de acordo com os estudos
realizados por Valueva et al. (2003) que observaram valores de indução da
atividade inibitória em folhas de batata proporcionais aos encontrados em nossos
trabalhos. Moura e Ryan (2001) observaram um aumento de até duas vezes nos
níveis de inibidores de proteinase serínica em folhas de pimenta quando expostos
aos vapores de MeJa. KANG et al. (2001), identificaram um inibidor de proteinase
serínica com peso de 27 kDa em folhas de batata através da indução por ácido
abscísico, etileno e MeJa. O aumento dos níveis de outras classes de inibidores
35
de proteinase em folhas através da exposição ao MeJa também já foi descrito na
literatura em diferentes tipos vegetais. BOLTER (1993) estudou a indução de
inibidores de proteinase cisteínica em folhas de tomate através do contato com
MeJa, e indentificou dois inibidores com peso molecular de 80 e 90 KDa. Folhas
de batata também obtiveram altos níveis de inibidores de proteinase cisteínica e
aspártica quando expostos ao MeJA (BOLTER.,1995).
Complementando nossos estudos, analisamos a indução da atividade
inibitória contra tripsina em folhas de plantas de maracujá expostas à herbivoria.
Durante o ataque do inseto herbívoro, tanto o ferimento como elementos
eliciadores presentes na saliva do inseto ativam a expressão de genes de
inibidores de proteinase através da via octadecanóide (Kothekar et al., 1996.,
Major e Constabel., 2006). Em nossos experimentos, utilizamos como inseto
modelo larvas de Agraulis vanillae vanillae, sendo este um dos lepidópteros que
mais atacam a cultura do maracujá. Folhas feridas por herbivoria e sistêmicas
tiveram um aumento na atividade inibitória bastante expressiva comparadas com
plantas controle.
Diferentes grupos de pesquisa demonstraram a indução de inibidores de
proteinase em folhas de plantas através da agressão por insetos herbívoros. Por
exemplo, Tamayo et al. (2002), que através de técnica de northern blot
observaram o aumento da expressão de um gene de inibidor de proteinase
serínica (MPI) em folhas de arroz quando atacados por larvas de Spodoptera
littoralis. A indução de inibidores de proteinase serínica através de herbivoria
também foi estudada em folhas de plantas de Populus tremuloides, onde foram
demonstrados o aumento da atividade inibitória de tripsina in vitro e através da
expressão do gene PtTI2 (Haruta et al., 2001). Em folhas de tabaco (Nicotiana
attenuata), Kessler e Baldwin (2004) observaram a indução de inibidores de
proteinase serínica após o ataque contra dois insetos herbívoros, um especialista
(Manduca hornworms) e um generalista (Dicyphus minimus), tendo observado
diferentes níveis de expressão dos inibidores, onde o ataque de larvas de
Dicyphus minimus apresentaram os maiores valores de indução.
36
5.2 – Purificação e caracterização parcial dos inibidores de
proteinase serínicos em folhas de maracujá induzidos por metil
jasmonato.
5.2.1 – Purificação parcial dos inibidores de proteinase serínica via
cromatografia de gel filtração (SEPHADEX G-100).
Como próxima etapa de nossos estudos, iniciamos um procedimento de
purificação das proteínas com atividade inibitória contra tripsina em folhas de
maracujá. Para se obter um maior acúmulo desses inibidores, as folhas utilizadas
na purificação foram expostas a vapores de metil jasmonato durante quatro dias.
Como resultado obtivemos uma fração enriquecida com inibidores de proteinase
serínica ao qual denominamos de FECI (figura 7). A análise da FECI por SDSPAGE 12,5% nos revelou uma região de bandas protéicas majoritárias com peso
entre 20 e 25 kDa (figura 8). Inibidores de proteinase serínica nesta faixa de peso
já foram identificados em sementes de diferentes espécies de plantas, tais como:
Psophocarpus tetragonolobus que através de ensaios in vitro observaram uma
potente inibição ao trato digestivo do lepidóptero Helicoverpa armigera (Giri et al.,
2003)., Leucaena leucocephala (Oliva et al., 2000), Enterolobium contortisiliquum
(Batista et al., 1996), Dimorphandra mollis (Macedo et al. 2000) , Albizia julibrissin
(Odani et al., 1979), Prosopis juliflora (Negreiros et al. 1991), Adenanthera pavonia
(Richardson et al., 1986) e Acacia alata (Kortt and Jermyn, 1981). Todos esses
inibidores encontrados e identificados nessas plantas revelaram um alto grau de
homologia com vários membros da família kunitz.
Com o interesse de se identificar e caracterizar os inibidores de proteinase
serínica presentes na FECI, procuramos seqüenciar a região N-terminal de cada
uma de suas bandas majoritárias através da técnica de degradação de Edmam.
Das três bandas, conseguimos obter a seqüência N-terminal de apenas duas
delas (2 e 3), as quais apresentaram homologia com seqüências de inibidores da
família Kunitz de outros modelos vegetais tais como: Threoboma mammosum.
Threoboma Subincanum, Threoboma sylvestre, Populus tremula, Solanum
melogena, Lycopersicon esculentum e Nicotiana tabacum (tabela 2).
37
Inibidores da família Kunitz, são bem conhecidos na literatura por
apresentarem proteínas por volta de 20 kDa (Bhattacharyya et al, 2006). Esses
inibidores são proteínas com quatro resíduos de cisteína formando duas pontes
disulfeto e um único sítio de reação, o qual é geralmente um resíduo de arginina
localizado em uma das alças da proteína (Yoshizaki et al., 2007). A atividade
biológica dos inibidores de proteinase serínica da família Kunitz pode variar em
relação ao tipo de proteinase com o qual se interagem. Poucos inibidores dessa
família são específicos contra quimiotripsina e não inibem tripsina (Joulbert et al.,
1981). Alguns desses inibidores são potentes inibidores de tripsina, mas também
inibem quimiotripsina em graus variados (Odani et al., 1979). As pontes de sulfeto
são provavelmente responsáveis pela estabilidade funcional dos inibidores do tipo
Kunitz na presença de vários desnaturantes físicos e químicos, tais como,
temperatura, pH e agentes redutores (Mello et al., 2001).
5.2.2 – Purificação dos inibidores de proteinase presentes na FECI via
cromatografia de fase reversa (RP-HPLC).
Para purificarmos os inibidores de proteinase serínica presentes na FECI,
inicialmente utilizamos técnica de cromatografia de fase reversa de alta
performance utilizando como fase móvel acetonitrila e TFA. Contudo, o TFA aboliu
a atividade biológica dos inibidores, não sendo possível prosseguir com a
purificação com este procedimento. Com isso, estabelecemos um protocolo para a
purificação dos inibidores substituindo TFA por sulfato de potássio. Através desta
metodologia obtivemos 6 picos com atividade inibitória contra tripsina (figura 13)
que apresentaram no total 7 bandas protéicas (figura 11 e 12). Essas proteínas
apresentam faixa de peso muito próximas entre elas (20 a 25 kDa), sendo
possíveis isoinibidores.
A purificação de isoinibidores de proteinase serínica induzidos no tecido
foliar de algumas espécies de plantas já foi descrita na literatura. Em 1993 Pearce
et al., utilizando as mesmas técnicas cromatográficas utilizadas em nosso
trabalho, purificaram 6 isoinibidores de proteinase serínica pertencentes a família
potato II em folhas de tabaco induzidos através de ferimento mecânico. Moura e
38
Ryan (2001) também conseguiram isolar sete isoinibidores de folhas de pimenta
induzidos por MeJa utilizando cromatografia de fase reversa. Dois isoinibidores de
baixo peso molecular (5,1 e 5,7 kDa) de tubérculos de batata foram purificados por
Pearce et al (2001) e apresentaram um alto grau de identidade imunológica,
inibindo tripsina e quimiotripsina. Três isoinibidores de proteinase serínica foram
purificados e caracterizados do látex de Hevea brasiliensis por Sritanyarat et al.
(2006).
Para darmos continuidade ao nosso trabalho de caracterização dos
inibidores presentes nas folhas de maracujá, é necessário prosseguirmos com a
purificação destes inibidores até obtermos a homogeneidade de todas as bandas
apresentadas.
5.3 – Análise preliminar da atividade bioinseticida de inibidores
de proteinase serínica presentes na FECI.
A ingestão de inibidores de proteinase pelos insetos herbívoros interfere no
processo de degradação de proteínas no intestino médio. Assim sendo, os
inibidores são considerados agentes antimetabólicos, pois levam a uma
deficiência protéica dos insetos. A atividade antimetabólica dos inibidores de
proteinase é atribuída à sua interferência na digestão protéica que diminui a
disponibilidade de aminoácidos, prejudicando a síntese de proteínas necessárias
ao crescimento, desenvolvimento e reprodução. Diferentes grupos de pesquisa
avaliaram o potencial bioinseticida de inibidores de proteinase de origem vegetal,
por exemplo: Bhattacharyya et al. (2007) demonstraram os efeitos de um inibidor
de tripsina de plantas de Archidendron ellipticum sobre proteinases serínicas de
Spodoptera litura. Enquanto Garcia et al. (2004) analisaram os efeitos inibitórios
de um inibidor de tripsina de sementes de Poecilanthe parviflora (PPTI) sobre
enzimas digestivas presentes no intestino médio de larvas de Diatraea
saccharalis, Anagasta kuehniella, Spodoptera frugiperda e Corcyra cephalonica,
sendo essas inibidas com eficiência por PPTI. Com o objetivo de testar os efeitos
in vitro dos inibidores de proteinase presentes na FECI sobre a atividade de
proteinases serínicas contidas no homogenato intesinal de insetos lepdópiteros,
39
utilizamos larvas de Diatraea saccharalis no quarto estádio de desenvolvimento.
Os resultados obtidos indicam uma efetiva inibição da atividade proteolítica do
trato digestivo das larvas de D. saccharalis (figura 9). O trabalho realizado por
Pompermayer et al. (2001) demonstraram o potencial bioinseticida de inibidores
de soja do tipo Kunitz (SKTI). Estes inibidores impediram a atividade proteolítica
de enzimas digestivas de D. saccharalis. Este resultado demonstrou bastante
similaridade com os nossos resultados. Eles ainda analisaram o desenvolvimento
de larvas alimentadas com dieta artificial acrescida de SKTI observando um
retardo significante no crescimento desta praga. A utilização de inibidores de
proteinase na transformação de plantas tem sido muito utilizada com a finalidade
de se obter plantas resistentes ao ataque de insetos herbívoros. Falco e SilvaFilho (2003) superexpressaram dois inibidores de proteinase serínica de sementes
de soja (SKTI e SBBI) em cana-de-açúcar, obtendo plantas com a capacidade de
retardar o desenvolvimento das larvas de D. saccharalis.
40
6 - Conclusões
¾ Plantas de maracujá expostas aos vapores de metil jasmonato e herbivoria
por Agraulis vanillae vanillae acumulam inibidores de proteinase serínica
em tecido foliar. Estes inibidores apresentaram uma indução mais forte
mediante tratamento com metil jasmonato.
¾ A purificação parcial dos inibidores de proteinase serínica através de
cromatografia de exclusão em gel nos revelou uma fração enriquecida com
inibidor (FECI) com 3 bandas protéicas majoritárias na faixa de peso entre
20-25 kDa. O seqüenciamento N-terminal de duas destas bandas revelaram
alto grau de homologia com inibidores da família Kunitz
¾ O potencial bioinseticida da FECI foi indicado pela sua atividade inibitória
sobre as proteinases serínicas contidas no homogenato intestinal de larvas
de quarto estádio do inseto lepdóptero Diatraea saccharalis.
¾ A purificação de inibidores de proteinase serínica presentes na FECI
através de cromatografia de fase reversa apresentou 7 possíveis
isoinibidores.
41
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