Análise de Diferentes Mutações no Gene da Distrofia Muscular de

ANÁLISE DE DIFERENTES MUTAÇÕES NO GENE DA DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE E BECKER ATRAVÉS DA TÉCNICA DE MLPA
Aluno: JAN CARLOS SANTANA DOS SANTOS
Colaboradores: ALEXANDRA PUFER ARAÚJO, PEDRO HERNÁN CABELLO E VERÔNICA ZEMBRZUSKI
Orientador: VIVIANNE GALANTE RAMOS
Curso / Instituição de Ensino Superior: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS/ UNIGRANRIO
Introdução / Objetivos / Material e Métodos / Conclusões / Resultados / Referências Bibliográficas
Introdução
O projeto configura uma abordagem multidisciplinar sobre a fisiopatologia de distrofias musculares associadas a
mutações do gene da distrofina, com o propósito de proporcionar uma melhora na qualidade de vida dos pacientes, já
que a distrofia muscular de Duchenne é a mais comum das doenças musculares degenerativas em crianças.
Objetivo
A padronização da técnica MLPA e possível conclusão de diagnóstico de pacientes com distrofia, onde a alteração da
doença não é detectada pela metodologia tradicional. A inserção desta técnica ao diagnóstico molecular tradicional
possivelmente reduzirá o número de casos inconclusivos, motivo que contribui para o atraso na inserção do tratamento
adequado, antecipando complicações no curso da doença.
Material e Métodos
A análise do gene da distrofina foi inicialmente feita pelo método de PCR Multiplex, após extração de DNA de 219
pacientes e para os casos que não se conseguiu fechar o diagnóstico pelo método tradicional, foi realizada a técnica de
MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) um método que detecta números de cópias de mais de 45
sequências específicas em uma única reação. Essa técnica não foi utilizada para todos os pacientes por apresentar ainda
um elevado custo.
Resultados
Foram coletados e analisados 219 pacientes, essas amostras foram processadas pelos alunos no Labgen para obtenção
de DNA. Esses pacientes foram analisados pelo método tradicional (PCR Multiplex de 18 éxons). Na segunda etapa do
projeto, todos os casos que foram inconclusivos pelo método tradicional (PCR Multiplex), foram analisados pela técnica
de MLPA, para pesquisar outras deleções ou duplicações, por uma dosagem multiplex dos éxons. Nos experimentos
foram usados controles para podermos normalizar os picos de todas as amostras, ou seja, as áreas dos picos são
normalizadas contra a soma das áreas observadas nas sondas controle para cada paciente. O valor normalizado foi
comparado com o principal valor do grupo de controles para gerar a razão que representa o relativo número de cópias.
O valor de 1 ou próximo de 1 é o normal, ou seja, 2 cópias. Valores abaixo de 0,65 são deleções e 1,35-1,65 são
duplicações. Valores de 0,8-1,2 representam o normal, de 0,65-0,8 e 1,25-1,35 são ambíguos (melhor repetir). Os dados
foram gerados usando o programa GeneMarker. Onde encontamos pacientes com outras deleções e duplicações.
Conclusões
A caracterização molecular de cada doença específica no menor tempo possível pode gerar grandes benefícios, na
escolha do tratamento mais adequado, acarretando uma melhora na qualidade de vida dos pacientes. Uma das principais
dificuldades no diagnóstico da DMD/DMB é diferenciá-las de outras doenças neuromusculares que cursam um quadro
clínico bastante semelhante, com hipotonia e prejuízo no desenvolvimento motor, por isso a associação das técnicas
PCR Multiplex e MLPA proporcionaram um diagnóstico molecular mais completo.
Referências Bibliográficas
KERR R, ROBINSON C, ESSOP FB, KRAUSE A. Genetic testing for Duchenne/Becker muscular dystrophy in
Johannesburg, South Africa. S Afr Med J. 2013. 103: 999-1004.
Bolsa de Iniciação Científica: FUNADESP
Bolsa de Iniciação Científica (IC):
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PROPEP 2014