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TÍTULO: INFLUÊNCIA DE DIFERENTES FOTOPERÍODOS SOBRE O METABOLISMO DE CARBONO
EM PLANTAS DE SETARIA ITALICA
CATEGORIA: CONCLUÍDO
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
SUBÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
AUTOR(ES): KEILA SUEMI KAWAKAMI
ORIENTADOR(ES): MARINA CÂMARA MATTOS MARTINS
COLABORADOR(ES): LUCIA DANIELA WOLF
Influência de diferentes fotoperíodos sobre o metabolismo de carbono em
plantas de Setaria italica
1. Resumo
As plantas são consideradas os sistemas químicos mais sofisticados
existentes no planeta, capazes de utilizar a luz solar para converter CO 2 em
carboidratos nas folhas durante o dia pelo processo de fotossíntese. Durante a noite,
o metabolismo e crescimento vegetal dependem das reservas de carboidratos,
acumuladas geralmente na forma de amido. Pelo seu estilo de vida séssil, as plantas
necessitam adaptar-se às flutuações ambientais diárias, sincronizando eventos
internos e externos. Neste projeto estudamos a influência de diferentes fotoperíodos
no metabolismo de carbono (C) na gramínea Setaria italica, considerada uma planta
modelo de fotossíntese C4. Flutuações na síntese e degradação de amido, açúcares
solúveis e açúcares fosforilados foram avaliadas em dois fotoperíodos: natural (13 h
luz/11 h escuro) e de dias curtos (8 h luz/16 h escuro). Foi possível verificar que
essa espécie possui níveis de amido nas folhas similares aos descritos para a planta
modelo C3 Arabidopsis thaliana e também consegue se adaptar em relação à
mudança no fotoperíodo, alterando a velocidade de degradação de amido conforme
o comprimento da noite, de maneira a evitar privação de C. Essa gramínea acumula
grandes quantidades de açúcares solúveis nos caules, que se comportam como
órgão de armazenamento.
2. Introdução
Devido seu estilo de vida séssil, as plantas necessitam adaptar-se às
flutuações ambientais diárias, sincronizando eventos internos como suprimento de
carbono (C) e externos como mudanças de luz e temperatura. As plantas são
consideradas os sistemas químicos mais sofisticados existentes no planeta (Stitt et
al. 2010a) e durante o dia utilizam a luz solar para converter CO2 em carboidratos
nas folhas pelo processo de fotossíntese, geralmente acumulando parte dos
fotoassimilados
na
forma
de
amido
transitório
(Stitt
&
Zeeman
2012).
Resumidamente, o amido é sintetizado nos cloroplastos a partir de frutose-6P, um
dos intermediários do ciclo de Calvin-Benson, que é convertida em diferentes
reações a ADP-glicose, utilizada na formação de novas ligações glicosídicas para
alongar cadeias de glicanos (para informação detalhada sobre a fixação de C e
síntese de amido ler Stitt et al. 2010b, Zeeman et al. 2010). Durante a noite, o
amido é degradado de maneira tão controlada que as reservas disponíveis
sustentam as atividades metabólicas (crescimento, respiração e exportação de C na
forma de sacarose para outros órgãos da planta) durante toda a noite, e apenas uma
pequena porcentagem de amido resta no final da noite. Esse controle do “turnover”
de amido permite que a planta evite períodos recorrentes de privação de C durante a
noite, e maximiza a disponibilidade de reservas para o crescimento (Smith& Stitt
2007, Stitt et al. 2007, Graf et al. 2010).
O padrão aparentemente simples de assimilação, acúmulo e utilização de C
durante o ciclo diuturno depende de uma complexa e flexível rede de controle,
importante para manter um balanço apropriado de C (Smith & Stitt 2007).
Parâmetros de comprimento de onda, intensidade, direção e duração da luz podem
alterar a quantidade de C fixado no ciclo de 24 h. Alguns exemplos seriam a
estimulação da síntese de amido em plantas crescidas em períodos curtos de luz e o
fato da degradação de amido ser afetada pelo comprimento do fotoperíodo
(Chatterton & Silvius 1980, Gibon et al. 2004).
As diferentes espécies de plantas podem armazenar diferentes quantidades
de amido em suas folhas, dependendo de sua estratégia e/ou mecanismos para
sobreviver o período de escuro. O controle eficiente do uso das reservas de amido é
um fator importante na determinação do crescimento e da biomassa da planta
(Sulpice et al. 2009). A biomassa vegetal é a matéria prima para a produção de
biocombustíveis e compreender como as plantas crescem em resposta a diferentes
estímulos ambientais e como o metabolismo se adéqua frente a estes estímulos é
de extremo interesse para a conversão de biomassa em biocombustíveis.
O presente projeto teve por objetivo estudar a influência de diferentes
fotoperíodos no metabolismo de C em plântulas de Setaria italica, uma gramínea
diplóide com sistema de fotossíntese C4 que tem se destacado como planta modelo
(Li & Brutnell 2011, Lata et al. 2013) devido ao tamanho pequeno do genoma
(aproximadamente 515 Mb) já sequenciado, ciclo de vida curto e estreita relação
filogenética
com
gramíneas
amplamente
utilizadas
biocombustíveis, como milho, sorgo e cana-de-açúcar .
para
a
produção
de
3. Objetivos
O projeto teve por objetivo geral estudar a influência de diferentes
fotoperíodos no metabolismo de carbono em plântulas de Setaria italica, uma
gramínea diplóide com sistema de fotossíntese C4 que tem se destacado como
planta modelo. Os objetivos específicos foram: avaliar os conteúdos de amido,
açúcares solúveis e fosforilados em dois fotoperíodos distintos.
4. Metodologia e Desenvolvimento
4.1. Cultivo de Plantas
Sementes de Setaria italica foram cultivadas em duas condições: (a)
fotoperíodo natural (13 h luz/11 h escuro) e (b) dias curtos (8 h luz/ 16h escuro), em
casa de vegetação. Após cerca de 30 dias de cultivo, quatro replicatas (compostas
por 4 plântulas cada) foram coletadas em diferentes períodos do ciclo diuturno
sendo imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e conservadas a -80ºC.
4.2. Extração e quantificação de açúcares solúveis
Alíquotas de aproximadamente 20 mg de matéria fresca foram extraídas com
etanol de acordo com Cross et al. (2006). Os extratos etanólicos foram secos em
concentrador a vácuo e ressuspendidos em água Mili Q. As amostras foram filtradas
e analisadas por cromatografia de troca aniônica de alta resolução com detector de
pulso amperométrico (HPAEC/PAD) em sistema Dionex (modelo ICS-3000),
utilizando-se coluna CarboPac PA-1. Identificação, integração e quantificação de
açúcares foram realizadas pela comparação com padrões externos utilizando o
software Chromeleon (versão 6.8, Dionex).
4.3. Determinação de amido
O amido foi determinado na fração insolúvel após a extração etanólica de
acrodo com Hendriks et al. (2003). Após a digestão do amido, o conteúdo de glicose
foi ensaiado enzimaticamente, acoplando a redução de NADP+ a NADPH em leitor
de microplacas (Stitt et al. 1989).
4.4. Extração e quantificação de hexoses fosfato
Alíquotas de 100 mg de de matéria fresca extraídas com ácido tricloroacético
em éter conforme Jelitto et al. (1992). Hexoses-fosfato foram determinadas por
espectrofotometria através de ensaio enzimático sensível acoplando a redução de
NADP+ a NADPH (Bergmeyer 1988, Stitt et al. 1989).
5. Resultados
Para o experimento de fotoperíodo natural, plantas de S. italica foram
cultivadas entre os meses de setembro e outubro de 2013. Após 30 dias de cultivo,
as plantas possuíam uma altura média de 10,4 cm e cerca de 11 folhas. As plantas
do experimento de dias curtos foram cultivadas nos meses de janeiro e fevereiro de
2014. A coleta foi realizada após apenas 24 dias de cultivo, devido ao intenso calor
que ocasionou o florescimento prematuro das plantas. Devido ao fato das plantas
mudarem seu metabolismo e o modo de gerenciar as reservas de C durante a
floração, este estudo teve como prioridade a análise no período vegetativo. No
momento da coleta, plantas de dias curtos apresentavam uma altura média de 9,6
cm e 9 folhas.
Os níveis de amido apresentaram padrão de acúmulo durante o dia e
degradação linear durante a noite em folhas, com consumo quase total das reservas
ao final da noite (Fig. 1A e B). Pelo fato dos experimentos terem sido realizados em
condições naturais de luminosidade, foi possível notar um atraso de algumas horas
para o início significativo do acúmulo de amido nas folhas, provavelmente devido à
baixa intensidade luminosa durante as primeiras horas do dia. Como esperado, no
cultivo em fotoperíodo natural houve uma maior produção de amido (71,8 µmol por
grama de peso fresco às 12h de luz) quando comparado aos dias curtos (43,8 µmol
por grama de peso fresco às 8h de luz), devido ao maior tempo de luz para
realização da fotossíntese e acúmulo de reservas. Nas folhas de plantas de S. italica
cultivadas em fotoperíodo natural, ocorreu uma maior taxa de síntese de amido entre
4h e 8h de luz, que se manteve constante até às 12h. A degradação de amido
começou já no final do período de luz, indicando que a intensidade de luz ao final do
dia não era suficiente para suprir a demanda energética da folha. No final da noite,
as folhas de S. italica de fotoperíodo natural continham cerca de 7% (5,1 µmol por
grama de peso fresco) de amido remanescente.
Nas plantas expostas a dias curtos, a concentração de amido nas folhas
aumentou consideravelmente entre 6h e 8h de luz. Essas plantas já começam o
período noturno com quantidade menor de amido em relação ao fotoperído natural
(39% a menos), e a taxa de degradação de amido necessita ser ajustada de forma a
garantir que as reservas durem até o amanhecer. Entretanto, essa diminuição na
taxa de degradação de amido é geralmente acompanhada por um decréscimo no
consumo de carbono utilizado para o crescimento (Sulpice et al. 2014). No final da
noite, o amido remanescente correspondeu a 2,4% (1,05 µmol por grama de peso
fresco) do conteúdo no final do dia.
No caule, em ambos os tratamentos, o conteúdo de amido se manteve
relativamente constante ao longo do dia e da noite (Fig. 1A e B).
A
B
Figura 1. Comparação do teor de amido em folhas e caules de S. italica cultivadas
em fotoperíodo natural (13 h luz/11 h escuro) (A) e dias curtos (8 h luz/16 h escuro)
(B). Dados mostrados são média ± desvio padrão (n=4), em µmol por grama de peso
fresco.
A análise de açúcares solúveis revelou uma tendência geral de acúmulo de
açúcares durante o dia, com pico às 8 h de luz, e decréscimo durante a noite, em
todos os órgãos e tratamentos (Fig. 2). A exceção foi a sacarose em folhas de
plantas cultivadas em dias curtos, que apresentou maiores teores às 6 h de luz.
O carboidrato encontrado em maior quantidade em folhas e caules de S.
italica, em ambos os tratamentos, foi a sacarose (Fig. 2A e B), um dissacarídeo
considerado produto final da fotossíntese e também sintetizado durante a noite a
partir dos produtos de degradação de amido (glicose e maltose) (Smith & Stitt 2007).
Enquanto nas plantas cultivadas em fotoperíodo natural o conteúdo de sacarose nos
diferentes órgãos foi similar (com exceção de 8 h de luz, em que as folhas
apresentaram mais sacarose que os caules) (Fig. 2A), plantas cultivadas em dias
curtos apresentaram maior quantidade de sacarose nos caules em relação às folhas
(Fig. 2B). É importante destacar que várias gramíneas armazenam o excesso de
carboidratos solúveis nas células do parênquima que circundam os feixes vasculares
localizados nos entrenós do caule (Slewinski 2012) e esta observação é clara para
plantas de S. italica cultivadas em dias curtos.
Os níveis de glicose foram geralmente superiores nos caules, quando
comparados às folhas, em ambos os fotoperíodos. Contudo, em condição de
fotoperíodo natural a diferença entre os órgãos foi mais expressiva que em dias
curtos (Fig. 2C e D).
A
B
C
D
Figura 2. Comparação de açúcares solúveis em folhas e caules de S.italica
cultivadas em fotoperíodo natural (13 h luz/11 h escuro) (A e C) e dias curtos (8 h
luz/16 h escuro) (B e D). (A) e (B) Sacarose, (C) e (D) Glicose. Dados mostrados são
média ± desvio padrão (n=4), em µmol por grama de peso fresco.
Devido à importância dos açúcares fosforilados como intermediários não
apenas da via glicolítica, mas também para a síntese e degradação de carboidratos
como sacarose e amido, foi utilizado um ensaio enzimático específico para verificar
as flutuações diárias nos conteúdos de glicose-6-P (Glc6P), frutose-6-P (Fru6P) e
glicose-1-P (Glc1P). Os níveis hexoses-fosfato estiveram mais elevados em
fotoperíodo natural quando comparado a dias curtos, com exceção da Glc1P (Fig.
3). Em dias curtos, as folhas apresentaram maiores teores de açúcares fosforilados
e o inverso foi detectado em fotoperíodo natural, no qual estes açúcares foram
encontrados em maior quantidade no caule (Fig. 3). Nas folhas das plantas
cultivadas em fotoperíodo natural, houve uma tendência de um pico de hexoses
fosfato às 8 h de luz. Após esse período, os níveis decaem e permanecem baixos ao
longo do período noturno (Fig. 3A, C e E). Nos dias curtos foi observado um padrão
de açúcares fosforilados em níveis constantes ao longo do ciclo diuturno no caule
(Fig. 3B, D e F). Já nas folhas, foi possível verificar um pico às 6 h de luz, seguido de
queda e níveis baixos de hexoses fosfato ao longo da noite. A exceção foi a Fru6P,
que se manteve elevada até 8 h de luz e após o início da noite decaiu de maneira
quase linear (Fig. 3D). Tanto a Glc6P quanto a Glc1P apresentaram um acúmulo
gradativo ao longo do dia nas folhas em dias curtos e decréscimo rápido já nas
primeiras horas da noite, permanecendo sem grandes flutuações (Fig. 3B e F).
A
B
C
D
E
F
Figura 3. Comparação do conteúdo de hexoses-fosfato presentes em folhas e
caules de S. italica cultivadas em fotoperíodo natural (13 h luz/11 h escuro) (A, C e
E) e dias curtos (8 h luz/16 h escuro) (B, D e F). (A) e (B) Glicose-6-P, (C) e (D)
Frutose-6-P, (E) e (F) Glicose-1-P. Dados mostrados são média ± desvio padrão
(n=4), em nmol por grama de peso fresco.
6. Conclusão
Em conjunto, esses resultados mostram as diferenças no metabolismo de C
em folhas e caules de S. italica ao longo do ciclo diuturno e a flexibilidade das
plantas para se adaptarem a diferentes situações ambientais, como por exemplo,
mudanças no comprimento do dia e da noite. As folhas suprem a demanda por
energia de todos os órgãos da planta através da exportação de fotossiamilados
durante o dia, que são convertidos em carboidratos de reserva na forma de amido,
consumido para seu próprio metabolismo e crescimento durante a noite. Quanto
maior o tempo de luz, maior o acúmulo de amido nas folhas. Quanto maior o tempo
de escuro, mais lentamente as plantas precisam degradar as reservas de amido. É
sabido que o relógio circadiano controla a regulação temporal de diversos processos
moleculares e fisiológicos ao longo do ciclo diuturno, incluindo a degradação do
amido. Entretanto estudos mais aprofundados são necessários para desvendar o
exato mecanismo pelo qual o relógio determina a velocidade da degradação de
amido.
7. Agradecimentos
KSK foi bolsista de iniciação científica no laboratório Nacional de Ciência e
Tecnologia do Bioetanol e agradece ao CNPq pelo financiamento concedido (PIBIC
162864/2013-2).
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