Dependência do Grau de Ativação do Músculo

Arq Bras Cardiol
volume 75, (nº 5), 2000
Rassier DJE
Atualização
Grau de ativação do músculo cardíaco e comprimento muscular
Dependência do Grau de Ativação do Músculo Cardíaco do
Comprimento Muscular
Dilson J. E. Rassier
São Leopoldo, RS
A lei de Frank-Starling do coração 1-3 pode ser descrita
na relação entre força e comprimento do músculo cardíaco.
Com o advento da teoria das pontes cruzadas de contração
muscular 4,5 e o clássico estudo de Gordon e cols. 6, descrevendo a adequação desta teoria à relação força-comprimento no músculo esquelético, vários investigadores passaram
a estudar esta relação no músculo cardíaco.
A relação força-comprimento no músculo cardíaco é
observada em uma pequena variedade de comprimentos de
sarcômero, aproximadamente entre 1,8µm a 2,3µm. Esta região corresponde a parte ascendente da relação força-comprimento do músculo esquelético, investigada por Gordon e
cols. 6, e os níveis de força do miocárdio variam de zero
(1,8µm) até valores de força máxima (2,3µm). Esta grande
variação de força resulta em uma relação força-comprimento
de inclinação muita acentuada, principalmente quando comparada ao músculo esquelético (fig. 1). Para se ter uma idéia,
quando a tensão desenvolvida pelo miocárdio em diferentes comprimentos de sarcômero é normalizada em relação à
sua força máxima (Fmáx) no comprimento em que ocorre
(Lmáx), a tensão desenvolvida é de aproximadamente 10-15%
quando o miocárdio é medido a 80% de Lmáx. Já no músculo
esquelético, a força normalizada nas mesmas condições seria de aproximadamente 80-85% de Fmáx 7 (fig. 1).
Esta diferença entre os músculos esquelético e cardíaco evidencia que a relação força-comprimento no miocárdio
não é uma função simples do grau de superposição dos filamentos actina e miosina, já que comprimento desses filamentos são semelhantes nos dois músculos; outros fatores
devem estar envolvidos na relação força-comprimento muscular. Nos últimos anos, esta diferença na relação força-comprimento nos dois músculos passou a ser atribuída a uma
dependência do grau de ativação muscular do comprimento
dos sarcômeros 8.
Ativação muscular tem sido utilizada na literatura para
referir-se coletivamente a diversos processos que podem
Universidade do Vale do Rio dos Sinos (UNISINOS) – São Leopoldo
Correspondência: Dilson J. E. Rassier - UNISINOS - Centro de Ciências da Saúde
(02) – Av. Unisinos, 950 - 93022-000 - São Leopoldo, RS
Recebido para publicação em 14/10/99
Aceito em 29/12/99
dar início à contração muscular, modificando o estado muscular de “inativo” para “ativo”. Assim, a ativação muscular
tem sido associada à freqüência de estimulação muscular
ou de potenciais de ação das membranas, para descrever a
concentração intracelular de Ca2+ [Ca2+]i, ou para descrever
a ocupação da proteína troponina C (TnC) com o Ca2+. Neste
artigo, o termo ativação muscular será utilizado para descrever a proporção de TnC associada ao Ca2+. Esta associação
TnC/Ca2+ representa um evento fundamental na contração
muscular e, portanto, a sensibilidade da TnC ao Ca2+ será
discutida em maiores detalhes no contexto deste artigo.
Além disso, esta escolha é proveniente a mudanças de força
do miocárdio causadas pelas alterações no comprimento
muscular não relacionadas à concentração de [Ca2+]i 9,10.
Este artigo revisa os estudos relacionados à dependência da força e, mais importante, do processo de ativação
muscular do miocárdio do comprimento muscular. Especificamente, este artigo pretende investigar mecanismos propostos na literatura que sejam os responsáveis pela dependência da sensibilidade dos filamentos ao Ca2+ do comprimento muscular.
Dependência da sensibilidade dos filamentos ao Ca2+
do comprimento muscular - Evidências de que a ativação
do miocárdio é dependente do comprimento muscular são
encontradas em estudos demonstrando que intervenções
inotrópicas (por exemplo, aumento da freqüência de estimulação muscular) induzem um deslocamento da relação forçacomprimento do miocárdio à esquerda. Como resultado de
tal deslocamento, a inclinação da relação força-comprimento muscular assemelha-se à relação observada no músculo
esquelético (fig. 1) 7,11,12.
Três linhas principais de investigação têm sido utilizadas na avaliação da dependência da ativação e sensibilidade do sistema regulatório ao Ca2+ do comprimento muscular:
1) estudos com a utilização de marcadores intracelulares de
Ca2+ e encurtamento rápido de fibras intactas do miocárdio;
2) estudos com a utilização de fibras sem membrana; e 3)
estudos com marcadores isótopos de proteínas.
Os estudos com a medição de [Ca2+]i após mudanças
bruscas no comprimento de fibras são utilizados para avaliar a afinidade da TnC ao Ca2+. Nesses estudos, substâncias
fluorescentes marcadoras de Ca2+ são introduzidas nas células cardíacas e, quando estimuladas adequadamente, for449
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Força
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Grau de ativação do músculo cardíaco e comprimento muscular
Fig. 1 - Ilustração esquemática da relação força-comprimento dos músculos esquelético (linha cheia) e cardíaco (linha tracejada) a partir de 80% Lmáx. Neste ponto, o músculo esquelético produz 80-85% Fmáx, enquanto que o músculo cardíaco produz 1015% Fmáx . Em 90% Lmáx o músculo esquelético produz força próxima à Fmáx, enquanto o
músculo cardíaco produz 50% Fmáx. Isto é traduzido em uma inclinação aumentada do
ramo ascendente da relação força/comprimento muscular no miocárdio (a zona em que
o miocárdio normalmente opera) quando comparada ao músculo cardíaco.
necem informações referentes à quantidade intracelular de
Ca2+. Esses estudos assumem que uma redução da afinidade TnC/Ca 2+ resultaria em uma maior concentração de
[Ca2+]i, já que uma menor quantidade de [Ca2+]i estaria associada à TnC. Por sua vez, isto induziria uma menor ativação
muscular (conforme conceito utilizado neste artigo).
Diferentes autores demonstram que um encurtamento abrupto do músculo cardíaco intacto em estágios finais de
uma contração resultam em uma diminuição de tensão muscular, acompanhada de um aumento nos níveis de [Ca2+]i.
Esta observação sugere uma diminuição da associação
TnC/Ca2+, i.e. a afinidade da TnC ao Ca2+ é diminuída quando o músculo é encurtado 10,13-15.
Nos estudos com fibras sem membranas, as células do
miocárdio são estudadas sem o sarcolema que envolve as
proteínas responsáveis pela contração muscular. Neste tipo
de preparação, a contração muscular é iniciada pela adição
de Ca 2+ ao meio líquido no qual as fibras estão sendo
investigadas (que contém várias substâncias para manter a
viabilidade dos experimentos, e.g., a glicose). Desta forma,
a ativação induzida por Ca2+ pode ser controlada pelo investigador através das concentrações extracelulares de Ca2+, e
é possível estabelecer-se a relação força/Ca2+ em diferentes
situações (fig. 2).
A relação força/Ca2+ é extremamente eficiente no estudo do músculo cardíaco, uma vez que permite a investigação da sensibilidade do sistema regulatório ao Ca2+. De
acordo com essa relação, uma quantidade aumentada de
Ca2+ é associada com um aumento na força desenvolvida
pelo miocárdio, até um determinado platô. Se a quantidade
de Ca2+ necessária para produzir um determinado nível de
450
Fig. 2 - A relação força/Ca2+. Ca2+ é representado por pCa2+ ((-log10(Ca2+)). A figura demonstra que a quantidade de Ca2+ necessária para produção de força é diminuída
quando a relação força/pCa2+ é deslocada à esquerda (seta direcionada do círculo
vazio para o círculo cheio). Este deslocamento da relação força/pCa2+ para a esquerda
é um indicativo de aumento na sensibilidade do sistema muscular ao Ca2+.
força é diminuída, a relação força/Ca2+ é deslocada à esquerda
(fig. 2), e a sensibilidade do sistema ao Ca2+ fica aumentada.
Neste contexto, estudos têm demonstrado que a
quantidade de Ca2+ necessária para a obtenção de determinada força é diminuída quando a resposta é avaliada em sarcômeros alongados 16,17. Por exemplo, em um destes estudos
Hibberd e Jewell 16 demonstraram que a quantidade de Ca2+
necessária para que a força do miocárdio chegasse a 50% da
Fmáx em sarcômero fixado com comprimento de ~2,5µm era
significativamente menor do que quando o sarcômero estivesse fixado em um comprimento de ~1.9µm. De acordo com
esses resultados, Kentish e cols. 17 demonstraram que cada
aumento no comprimento de sarcômero era seguido por
aumento na força muscular em paralelo a um pequeno deslocamento da relação força/pCa para a esquerda, que significa
uma menor quantidade de Ca2+ necessária para a mesma
produção de força.
Finalmente, alguns estudos utilizam marcadores isótopos específicos para analisar o grau de associação TnC/
Ca2+, e relacioná-lo ao comprimento muscular 18,19. Estes
isótopos unem-se a determinadas moléculas da proteína
TnC e fornecem informações referentes ao grau de associação TnC/Ca2+. Em um desses estudos 19, os autores utilizaram fibras sem membranas do ventrículo de bovinos marcadas com estes isótopos, e os resultados do estudo demonstraram uma forte associação de Ca2+ à TnC durante geração
de força. Entretanto, esta associação foi relacionada diretamente ao comprimento muscular: em sarcômeros mais curtos, uma redução da associação TnC/Ca2+ foi observada.
Estes resultados estão de acordo com os estudos citados
anteriormente, nos quais a dependência da sensibilidade do
Ca2+ do comprimento muscular é relacionada à TnC.
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A principal questão a ser respondida seria como a
TnC, uma subunidade protéica associada a ligação de íons
Ca2+ e Mg2+, recebe informações a respeito das mudanças
estruturais no comprimento muscular? Para responder
esta pergunta, existem diferentes linhas de investigação e
hipóteses sendo testadas atualmente. Alguns autores sugerem que a própria TnC seria o aparelho sensor das mudanças no comprimento muscular 20-22. Esta hipótese é baseada nas diferenças moleculares que existem entre a TnC
do músculo cardíaco e do músculo esquelético, que estariam associadas à diferença na relação força-comprimento
nos dois músculos. Entretanto, vários estudos têm rechaçado esta hipótese 23,24.
Em um deste estudos, Moss e cols. 23 caracterizaram a
relação entre força produzida e ativação induzida por Ca2+
em fibras musculares sem membrana do músculo esquelético do coelho, em comprimentos de sarcômeros de 2.32µm e
1.87µm. Essas medidas foram realizadas antes e após a TnC
ser substituída por TnC do músculo cardíaco, para provar
se essa era a principal razão das diferenças na relação forçacomprimento nos músculos esquelético e cardíaco. Quando
>95% de substituição das fibras esqueléticas com a TnC cardíaca foi realizada, mudanças significativas na sensibilidade ao Ca2+ não foram observadas nos comprimentos investigados. Portanto, a TnC não é o principal mecanismo responsável pela dependência da sensibilidade do sistema
muscular à força do comprimento muscular.
A outra hipótese que vem sendo testada com sucesso
é a de que a associação das pontes cruzadas da miosina
com a actina e, conseqüente geração de força, é responsável pela dependência do grau de ativação do comprimento
muscular 18,19,25-29. A justificativa e trabalhos relacionados a
esta hipótese serão apresentados a seguir.
Relação força-comprimento do músculo cardíaco e
associação das pontes cruzadas com a actina - Quando o
músculo cardíaco é alongado no ramo ascendente da relação força-comprimento, existe um aumento da superposição dos filamentos de actina e miosina. Com isto a possibilidade de interação entre as pontes cruzadas e a actina, e conseqüente geração de força, é aumentada. Atualmente, existem fortes evidências favorecendo um sistema no qual esta
associação aumenta a sensibilidade do sistema regulador de
força ao Ca2+ e, conseqüentemente, a ativação muscular.
Esta hipótese tem sido testada detalhadamente nos
elegantes estudos de Fuchs e cols. 18,19,26,27. Em um desses
estudos, Hofmann e Fuchs 18 mediram a associação TnC/
Ca2+ em fibras cardíacas sem membrana com a utilização de
isótopos (como explicado anteriormente). Como esperado,
os resultados confirmam que a associação TnC/Ca2+ é dependente do comprimento muscular na faixa de sarcômeros
compreendida entre 1,7µm to 2,4µm. Entretanto, em alguns
experimentos, os autores utilizaram uma substância análoga
ao fosfato (Pi), o vanadato de sódio (Vi). Esta substância
atua como uma enzima ATPase e deprime a interação associação das pontes cruzadas com a actina, formando um complexo estável miosina·ADP·Vi. Quando utilizada esta subs-
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tância, a relação entre a associação TnC/Ca2+ e comprimento do sarcômero foi deprimida, e o grau de ativação muscular
não apresentou dependência do comprimento do sarcômero. Desta forma, a dependência da afinidade de Ca2+ à TnC
do comprimento muscular seria na verdade uma dependência do número de pontes cruzadas em associação à actina.
Outra evidência da associação pontes cruzadas e afinidade TnC ao Ca2+ é o estudo de Saeky e cols.30 que utilizaram fibras musculares cardíacas intactas. No estudo, as fibras foram injetadas com substâncias marcadoras de Ca2+,
para realizar as manobras de encurtamento muscular rápido,
como já explicado. Em um grupo de experimentos extra Ca2+
não foi detectado quando a fibra foi encurtada, partindo de
um estado de relaxamento muscular (sem a produção de força). Em outro grupo de experimentos onde o ciclo das pontes cruzadas foi bloqueado por substância química específica (2,3 butaneodione monoxime), foi constatado que mudanças no comprimento muscular também não resultaram
na aparição de extra Ca2+ no espaço intracelular, embora a
força tenha sido diminuída de forma considerável. Em outras palavras, quando a associação entre pontes cruzadas e
actina foi bloqueada, pelo estado de relaxamento muscular
ou por substância química específica, a associação TnC/
Ca2+ não dependente do comprimento muscular.
Desta forma, conclui-se que o aumento da sensibilidade do sistema regulador ao Ca2+ induzido por um aumento
no comprimento do sarcômero é relacionado a um número
aumentado de pontes cruzadas associadas à actina, tanto
em fibras cardíacas sem membrana, como em fibras cardíacas com as membranas intactas.
Pontes cruzadas e regulação da atividade da troponina
C - Embora a associação das pontes cruzadas, a força e a
sensibilidade da TnC ao Ca2+ estejam relacionados, cabe
ainda estudar-se a natureza desta relação. Em outras palavras, como a associação das pontes cruzadas da miosina
com a actina aumenta a afinidade da TnC ao Ca2+, e conseqüentemente a sensibilidade do sistema muscular ao Ca2+?
Estudos nos quais a TnC é marcada em alguns de seus domínios reguladores com provas fluorescentes, através de
substituição de moléculas específicas, fornecem algumas
evidências neste sentido 31-33.
Hannon e cols. 33 utilizaram TnC cardíaca marcada com
as provas fluorescentes específicas que fornecem informações a respeito da estrutura da TnC resultantes da associação
TnC/Ca2+. Ainda os autores mediram as respostas da sensibilidade do sistema muscular ao Ca2+ relacionadas com a
associação de pontes cruzadas, para associar com alterações
na estrutura da TnC, e observaram que a associação entre
pontes cruzadas e actina induziu a modificações na conformação de TnC, e que esta alteração foi acompanhada de um aumento da sensibilidade do sistema muscular ao Ca2+.
Na mesma linha de investigação, Liou e Fuchs 31 marcaram dois resíduos da TnC de fibras cardíacas de bovinos
com alguns compostos reativos. Medindo os sinais fluorescentes destes compostos, os autores observaram que pontes cruzadas “in rigor” e pontes cruzadas cíclicas têm efei451
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tos diferenciados na conformação da TnC, sugerindo que
mecanismos pelos quais as pontes cruzadas afetam TnC
são através de conformações moleculares.
Esses dois estudos sugerem uma explicação para o
mecanismo responsável pela dependência da sensibilidade
ao Ca2+ do comprimento muscular, no qual um aumento no
comprimento muscular induz alterações na conformação
molecular da TnC, resultando em um aumento de sua afinidade ao Ca2+.
Evidências para outros mecanismos responsáveis pela dependência da ativação do miocárdio do comprimento
muscular - Embora as evidências apontem para um mecanismo envolvendo as pontes cruzadas, como mecanismo
responsável pela dependência da força e sensibilidade dos
filamentos ao Ca2+ do comprimento muscular, esta hipótese
encontra uma dificuldade óbvia. A sensibilidade ao Ca2+ é
aumentada em fibras cardíacas sem membranas 34 quando
estas são alongadas na porção descendente da relação força-comprimento, onde o potencial para a interação miosinaactina está diminuído.
A hipótese levantada na literatura é que, além da associação de pontes cruzadas, força e afinidade TnC/Ca2+,
as mudanças no comprimento de sarcômero per se são
responsáveis por alterações na sensibilidade do sistema
muscular ao Ca2+. Essas mudanças seriam evidenciadas
no espaço entre os filamentos musculares compostos de
miosina e actina. Estudos que utilizam difração de raio-x
têm demonstrado que os filamentos de actina e miosina
são posicionados mais próximos quando o músculo é
alongado e o volume muscular não é modificado 35,36. É razoável supor-se que a probabilidade de interações entre
pontes cruzadas e actina seria aumentada nesta situação,
onde a distância para a associação entre os filamentos é
diminuída. Esta possibilidade aumentada de interação en-
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tre os filamentos aumentaria a força em determinada concentração de Ca2+, aumentando a sensibilidade do sistema
muscular ao Ca2+.
Nesta linha de investigação, diferentes autores estudaram os efeitos de compressão osmótica dos filamentosa
miosina e actina, utilizando o polímero de alto peso molecular dextran T-5000, polyvinylpyrrolidone-40. Este composto
não penetra no espaço compreendido entre os filamentos
miosina e actina, mas causa aproximação lateral entre eles.
Alguns autores 26,37 observaram que após a utilização desta
substância, a sensibilidade ao Ca2+ foi aumentada de forma
significativa no músculo cardíaco.
Wang e Fuchs 26 investigaram especificamente a hipótese de que alterações no espaço entre os filamentos miosina e actina contribuem para a dependência da sensibilidade
do miocárdio ao Ca2+ do comprimento muscular. Esses autores estudaram simultaneamente os efeitos de compressão
osmótica (Dextran T-5000, 5 e 10%), comprimento de sarcômero (1,7µm a 2,3µm) e o grau de associação TnC/Ca2+. Os
resultados são convincentes: a utilização de 5% dextran na
fibra estabilizada em um comprimento de sarcômero de
1.7µm resultou em uma redução no diâmetro (~13%) da fibra
muscular, equivalente a situação na qual o sarcômero é
alongado a um comprimento de 2,3µm. Mais importante,
esta intervenção foi acompanhada de um aumento significativo na sensibilidade muscular ao Ca2+ [alteração de ~0,25
pCa2+, (fig. 2)] e na associação TnC/Ca2+ nos níveis de ativação compreendidos entre 6,0 e 5,0 pCa.
Conclusão - Os estudos revisados neste artigo sugerem que a dependência da sensibilidade ao Ca2+ do comprimento muscular é um resultado associado da interação de
pontes cruzadas e actina, que induzem alterações na afinidade TnC/Ca2+, e de mudanças no espaço entre os filamentos,
que aumenta a probabilidade de interação miosina/actina.
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