distribuição intracelular e fotocitotoxicidade da nitrofurantoína em

XIX CONGRESSO BRASILEIRO DE FÍSICA MÉDICA
17 A 20 DE AGOSTO DE 2014
GOIÂNIA – GO
DISTRIBUIÇÃO INTRACELULAR E FOTOCITOTOXICIDADE
DA NITROFURANTOÍNA EM CULTURA CELULAR
NEOPLÁSICA
Lucimara P.F. Aggarwal1, Gustavo G. Parra1, Roberto S. da Silva2 e Iouri Borissevitch1
1
Departamento de Física, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto,
Universidade De São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil.
2
Departamento de Física e Química, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto,
Universidade De São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil.
Resumo: Neste trabalho foi avaliada a dinâmica de distribuição e localização intracelular da
nitrofurantoína (NFT) em células de melanoma murino B16F10. Foi observada que a acumulação da
NFT nas células aumenta durante as primeiras 12 horas de incubação, atingindo a saturação após
este intervalo. Este parâmetro está intimamente relacionado ao elevado grau de fototoxicidade da
NFT induzido pela irradiação deste composto com luz UV (λ = 385 nm). As imagens da distribuição
intracelular da NFT obtidas por microscopia de fluorescência indicam que este composto se localiza
preferencialmente numa região associada às mitocôndrias, evitando o espaço nuclear.
Palavras-chave: nitrofurantoína, fotoquimioterapia, melanoma murino, localização intracelular,
microscopia de fluorescência.
Abstract: In this work was evaluated the intracellular distribution of Nitrofurantoin (NFT) in cells of
murine melanoma B16F10. It was observed that the uptake of NFT in these cells increases during the
first 12 hours, reaching the saturation after this period. This parameter is in agreement with the high
photocytotoxicity of NFT towards B16F10 cells induced by UV light irradiation (λ = 385 nm). The
images of NFT intracellular distribution obtained by fluorescence microscopy show its preferential
localization in the region of mitochondrias, avoiding the nuclear space.
Keywords: nitrofurantoin, photochemotherapy, murine melanoma, intracellular localization,
fluorescence microscopy.
Introdução: A Nitrofurantoína (NFT, figura 1) é um derivado de nitrofurano amplamente utilizada
como agente bactericida no tratamento de infecções do trato urinário [1]. Recentemente constatamos
que este composto possui uma alta fotocitotoxicidade contra células neoplásicas induzida por
irradiação com luz UV. Este efeito depende da concentração da NFT, tempo de incubação e dose de
irradiação.
O mecanismo de ação da NFT em células neoplásicas provavelmente está relacionado à
produção de óxido nítrico (NO) no meio intracelular, o qual foi detectado durante a irradiação da NFT.
Uma vez que espécies radicalares possuem um curto raio de ação devido a sua alta reatividade em
meio biológico, é de grande relevância conhecer os parâmetros que definem a distribuição e a
localização intracelular dos compostos fotoativos (fotossensibilizador, FS), uma vez que os principais
mecanismos de morte celular (necrose e apoptose) são fortemente modulados pelo dano a estruturas
celulares específicas como, por exemplo, membrana celular externa e mitocôndrias.
O interesse em utilizar compostos que podem produzir espécies citotóxicas sob irradiação
com luz UV-visível tem aumentado significativamente devido ao sucesso obtido no tratamento de
câncer com o uso da Fotoquimioterapia na sua versão denominada Terapia Fotodinâmica (do termo
inglês Photodynamic Therapy – PDT). Entretanto, a PDT possui algumas limitações intrínsecas como,
por exemplo, a formação de oxigênio singleto, espécie produzida pela transferência de energia do
estado excitado do FS ao oxigênio molecular. Em alguns tumores a concentração de oxigênio é
reduzida, o que diminui a eficiência desta terapia. Além disso, há possibilidade do FS dissipar a
energia de excitação através de processos não radiativos que competem com a transferência de
energia, reduzindo a eficácia da PDT. Estes fatos estimulam a busca de mecanismos alternativos da
Fotoquimioterapia, baseados na produção de espécies reativas não excitadas como os radicais livres
(ânion superóxido, óxido nítrico, radical hidroxila, etc).
Neste trabalho foram avaliados os processos de internalização, distribuição e localização
intracelular da NFT e sua relação com a citotoxicidade deste fármaco em células de melanoma
murino B16F10.
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Figura 1. Estrutura molecular da Nitrofurantoína.
Método: As análises da acumulação da NFT em cultura celular foram realizadas por espectroscopia
de absorção ótica e fluorescência. As células B16F10 foram incubadas durante 4, 6, 12 e 24 horas
com 50 µM de NFT em meio de cultura contendo soro fetal bovino (10%). Após o período de
incubação o meio de cultura foi removido e as células foram lavadas 2 vezes com PBS. A lise celular
foi realizada com a utilização de uma solução NaOH+SDS1% e os espectros de absorção e
fluorescência da solução contendo células+NFT foram medidos. A distribuição intracelular da NFT foi
obtida através de imagens de microscopia de fluorescência após incubação das células com NFT em
RPMI nas concentrações de 20, 40 e 60 µM, utilizando o Microscópio Nikon Eclipse Ti e marcadores
padrão de organelas intracelulares. Os testes padronizados de citotoxicidade foram realizados no
2
escuro e na presença de luz, com doses de irradiação de 2, 6 e 12 J/cm , utilizando uma placa de 96
LEDs com emissão em 385 nm. O efeito citotóxico percentual (ECT%) foi obtido da seguinte forma:
 Abs amostra 
ECT (%)  1 
 *100
 Abs controle 
pela análise da absorbância em 492 nm utilizando o leitor de placas Thermoplate.
Resultados: Foi observado que a acumulação máxima da NFT em células de melanona murino é um
processo lento e ocorre após 12 horas de incubação deste fármaco nas células. Os testes de
citotoxicidade da NFT no escuro e na presença de luz demonstraram uma maior eficácia deste
composto na destruição de células tumorais após 24 horas de incubação numa elevada concentração
do fármaco (20 - 40µM). Estes fatos indicam que as caraterísticas temporais da acumulação
intracelular da NFT estão diretamente relacionadas ao efeito citotóxico observado na utilização deste
composto como agente fotoativo. As imagens da distribuição intracelular da NFT mostram que ela se
localiza preferencialmente numa região associada às mitocôndrias, evitando o espaço nuclear.
Discussão e Conclusões: O efeito fotocitotóxico induzido pela NFT em células B16F10
provavelmente está relacionado à liberação de NO por este composto após sua irradiação com luz
UV. A quantidade de fármaco internalizada aumenta com o aumento no período de incubação, o que
consequentemente aumenta a produção de NO intracelular. Foi observado que a morte celular é
maximizada quando foram utilizadas concentrações de NFT acima de 20 µM. Portanto, uma alta
acumulação deste fármaco em células neoplásicas é o fator primordial para a obtenção do efeito
citotóxico. A localização da NFT na região correspondente às mitocôndrias pode indicar que o
processo de morte celular por apoptose seja favorecido. É conhecido que o NO possui caráter tanto
tumorigênico como tumoricida, e que o último é favorecido quando existe uma alta concentração de
NO no ambiente celular [2]. Desta forma, pode-se concluir que a NFT pode atuar como um eficiente
agente fotoativo na destruição de células neoplásicas cujo mecanismo de ação envolve a formação
de espécies reativas não excitadas e, portanto, não limitadas pelos seus curtos tempos de vida. Estes
resultados indicam que a fotoativação da NFT pode servir como método alternativo para o tratamento
de neoplasias, o que faz deste composto um potencial FS para utilização em Fotoquimioterapia.
Agradecimentos: À CAPES e FAPESP pelo suporte financeiro.
Referências:
1. Cunha BA. New uses for older antibiotics: nitrofurantoin, amikacin, colistin, polymyxin B, doxycycline and minocycline
revisited. The Medical Clinics of North America, 2006, 90: 1089-1107.
2. Wink DA, Ridnour LA et al. The reemergence of nitric oxide and cancer. Nitric Oxide, 2008, 19(2): 65-67.