Uso do leite na detecção sorológica e molecular da CAE em
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DANILO SARAIVA ARAÚJO USO DO LEITE NA DETECÇÃO SOROLÓGICA E MOLECULAR DA CAE EM ANIMAIS NATURALMENTE INFECTADOS. FORTALEZA 2012 DANILO SARAIVA ARAÚJO USO DO LEITE NA DETECÇÃO SOROLÓGICA E MOLECULAR DA CAE EM ANIMAIS NATURALMENTE INFECTADOS. Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes. Orientadora: Profa.Drª. Maria Fátima da Silva Teixeira FORTALEZA 2012 Dados Internacionais de Cataloga€•o na Publica€•o Universidade Estadual do Cear‚ Biblioteca Central Prof. Antƒnio Martins Filho Bibliotec‚ria Respons‚vel – Leila S‚tiro – CRB-3 / 544 A663u Ara€jo, Danilo Saraiva. Uso do leite na detec•‚o sorolƒgica e molecular da CAE em animais naturalmente infectados / Danilo Saraiva Ara€jo. — 2012. CD-ROM : 64f. il. (algumas color.) ; 4 … pol. “CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acad‡mico, acondicionado em caixa de DVD Slin (19 x 14 cm x 7 mm)”. Disserta•‚o (mestrado) – Universidade Estadual do CearŠ, Faculdade de VeterinŠria, Curso de Mestrado Acad‡mico em Ci‡ncias VeterinŠrias, Fortaleza, 2012. ‹rea de Concentra•‚o: Reprodu•‚o e sanidade de pequenos ruminantes. Orienta•‚o: ProfŒ. DrŒ. Maria FŠtima da Silva Teixeira. 1. CAEV. 2. IDGA. 3. Leite. 4. PCR. 5. Sangue. I. T•tulo. CDD: 636.089 DANILO SARAIVA ARAÚJO USO DO LEITE NA DETECÇÃO SOROLÓGICA E MOLECULAR DA CAE EM ANIMAIS NATURALMENTE INFECTADOS. Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Aprovada em: ____/_____/_____ BANCA EXAMINADORA _________________________________ Profa. Drª. Maria Fátima da Silva Teixeira Universidade Estadual do Ceará Orientadora ________________________________ ________________________________ Profª Drª. Edmara Chaves Costa Examinadora Universidade da Integração Internacional da Lusofonia AfroBrasileira Prof. Dr. Isaac Neto Goes da Silva Examinador Universidade Estadual do Ceará DEDICO \Em especial, a você Ana Luisa, por ser minha força e fonte de inspiração. AGRADECIMENTOS A Funda•‚o Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cient•fico e Tecnolƒgico, CAPES, pela bolsa concedida durante os anos do curso. A Universidade Estadual do CearŠ – UECE e ao Programa de Pƒs-Gradua•‚o em Ci‡ncias VeterinŠrias – PPGCV. E de forma particular: Agrade•o e ofere•o esta disserta•‚o ao Deus grandioso que criou os elementos bŠsicos para o desenvolvimento desta pesquisa (as cabras, o leite, a mim, a minha orientadora etc) e a voc‡ que me ajudou a constru•-la. A todos os meus amigos que, de uma forma ou de outra, contribu•ram com sugestŽes efetivas para a concretiza•‚o desta pesquisa, gostaria de anunciar a minha gratid‚o. Agrade•o aos meus pais (Antonio Alcy e Angela Maria) por serem meus primeiros orientadores e que de uma forma muito particular estimularam-me e guiaram-me a este mundo cient•fico. Agrade•o tamb•m de forma muito carinhosa, a atua•‚o da minha querida esposa Ana Luisa, no per•odo de constru•‚o deste trabalho e aos meus grandes amigos Carlos (Schucruta) e Larissa por atuarem como conselheiros, psicƒlogos e amigos. Aos “Labovirenses” (minha fam•lia) Rosivaldo, Ronaldo, Lu•s, DŠvila, Kelma, Gabrielle, Apoliana, Rebeca, Igor, Allan, Victor, Steffi, Expedito e a grande amiga Maria Moura (Ely) pela cobertura direta ou indireta, que me deram nesse projeto. • Professora DrŒ. Maria FŠtima da Silva Teixeira que, com sua dedica•‚o ‘ Universidade e ao LABOVIR, ensinou-me preciosas li•Žes. Sou grato por seu esfor•o, carinho e preocupa•‚o para comigo. "N€o atar•s a boca do boi quando debulha” (Deuteronƒmio 25:4) RESUMO A Artrite Encefalite Caprina (CAE) é uma doença infecciosa, multissistêmica, causada por um lentivírus, pertencente à família Retroviridae, que acomete caprinos de todas as idades. É uma enfermidade de caráter crônico que ocasiona prejuízos econômicos à caprinocultura. A falta de uma vacina eficaz contra o vírus faz com que se adote um conjunto de medidas preventivas para controlar a disseminação da CAE. Os testes diagnósticos da CAE mais utilizados atualmente são os sorológicos: imunodifusão em gel de agarose (IDGA), ensaio imunoenzimático (ELISA), e os moleculares: Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Western Blotting, todos eles tendo como principal insumo o sangue. O uso do leite como material biológico no exame diagnóstico traria vantagens ao pequeno e médio produtor, como a facilidade na coleta e redução de custos. Esta pesquisa teve como objetivo comparar o desempenho do leite no diagnóstico da artrite e encefalite caprina utilizando IDGA e PCR em relação ao sangue. A PCR leader gag, das amostras de sangue e leite, detectou 100 e 96,7% respectivamente, dos animais infectados enquanto que o IDGA detectou 60 e 16,6%. Os resultados obtidos confirmam a possibilidade de utilização do leite como insumo para a realização da PCR. Palavras-chave: CAEV. IDGA. Leite. PCR. Sangue ABSTRACT The caprine arthritis encephalitis (CAE) is an infectious disease, multisystem, caused by a lentivirus belonging to the Retroviridae family, which affects goats of all ages. It is a chronic disease that causes economic losses in goat farming. The lack of an effective vaccine against the virus that causes adopt a set of preventive measures to control the spread of CAE. The most widely used diagnostic tests of CAE are the serologic agarose gel immunodiffusion (AGID), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the molecular Polymerase Chain Reaction (PCR) Western Blotting, all with the primary sample the blood of infected animals. The use of milk as biological material in diagnostic test would bring some advantages to small and medium producers, such as ease of collection and reduce costs. This study aimed to compare the performance of milk in diagnosis of caprine arthritis and encephalitis using PCR and AGID in relation to blood. PCR gag leader, samples of blood and milk, detected 100 and 96.7% respectively of animals infected while the AGID detected 60 and 16.6%. The results confirm the possibility of using milk as material for the PCR. Keywords: AGID, Blood, CAEV, Milk, PCR LISTA DE FIGURAS Figura 1: Estrutura do vírus da artrite encefalite caprina...........................................21 Figura 2: Genoma do vírus da artrite encefalite caprina............................................22 Figura 3: Reação de precipitação de IDGA ...............................................................31 Figura 4: Concordância (%) dos resultados das amostras de sangue e leite utilizando os testes de IDGA e PCR..........................................................................................31 Figura 5: Eletroforese em gel de agarose 1% PCR leader gag (nested) de amostras de leite.......................................................................................................................31 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Sigla Nome Ac Anticorpo Ag Antígeno AIEV Vírus da Anemia Infecciosa Equina CAE Artrite Encefalite Caprina CAEV Vírus da Artrite Encefalite Caprina CEUA Comitê de Ética para Uso de Animais DNA Ácido desoxirribonucléico ELISA Ensaio Imunoenzimático env gene que codifica as proteínas do envelope viral FAO Food and Agriculture Organization FIV Vírus da Imunodeficiência Felina xg Unidade da força centrífuga relativa gag Gene viral que codifica as proteínas interna do vírus Glicoproteína gp Glicoproteína HIV Vírus da Imunodeficiência Humana ICTV The Universal Database of the International Committee on Taxonomy of Viruses IDGA Imunodifusão em gel de agarose LABOVIR Laboratório de Virologia LTR Sequências longas repetidas LVPR Lentivírus de pequenos ruminantes MVV Vírus Maedi-Visna nm Nanômetro ºC Graus Celsius OIE Organização Internacional de Epizootias PBS Solução de tampão de fosfato PCR Reação em Cadeia de Polimerase pH Potencial Hidrogeniônico pol Gene encontrado no genoma retroviral que codifica a transcriptase reversa PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias rev Gene de regulação viral RNA Ácido ribonucléico SDS Dodecil sulfato de sódio SIV Vírus da imunodeficiência símia tat Gene de regulação viral tm Trademark TNE Tampão Tris -HCl UECE Universidade Estadual do Ceará vif Gene de regulação viral WB Western Blot µg Micrograma µL Microlitro µm Micrômetro SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................15 2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................16 2.1 Caprinocultura leiteira e características do leite caprino..................................16 2.2 Artrite encefalite caprina ..................................................................................20 2.2.1 Histórico..................................................................................................20 2.2.2 Agente etiológico ....................................................................................20 2.2.3 Sinais clínicos .........................................................................................23 2.2.4 Transmissão ...........................................................................................23 2.2.5 Controle e prevenção..............................................................................24 2.2.6 Epidemiologia .........................................................................................25 2.3 Testes diagnósticos .........................................................................................26 2.3.1 Principais testes......................................................................................26 2.3.2 IDGA .......................................................................................................27 2.3.4 PCR ........................................................................................................28 3. JUSTIFICATIVA ....................................................................................................31 4. HIPÓTESE CIENTÍFICA .......................................................................................32 5. OBJETIVOS ..........................................................................................................33 5.1 Objetivos gerais ..............................................................................................33 5.2 Objetivos específicos .......................................................................................33 CAPITULO I: Diagnóstico Sorológico e Molecular da CAE a Partir de Amostras de Leite de Cabras Naturalmente Infectadas. .......................................................34 Resumo .....................................................................................................................34 Introdução .................................................................................................................35 Materiais e Métodos ..................................................................................................37 Animais e amostras ...............................................................................................37 Processamento das amostras ...............................................................................37 IDGA ......................................................................................................................38 PCR .......................................................................................................................38 Análise Estatística..................................................................................................39 Resultados e Discussão ............................................................................................39 Conclusão .................................................................................................................41 Referências ...............................................................................................................41 6. CONCLUSÕES .....................................................................................................45 7. PERSPECTIVAS ...................................................................................................46 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..........................................................................47 ANEXOS ...................................................................................................................63 Anexo 1: Comprovante de submissão de artigo ....................................................64 Anexo 2: Declaração do Comitê de Ética ..............................................................65 1. INTRODUÇÃO A Artrite Encefalite Caprina conhecida como “CAE”, abrevia•‚o do ingl‡s “caprine arthritis-encephalitis”, foi descrita pela primeira vez por Cork, 1974 e, somente alguns anos depois, foi identificado o seu agente etiolƒgico. A CAE • uma doen•a de carŠter cr’nico que ocasiona preju•zos econ’micos ‘ caprinocultura mundial. A falta de uma vacina eficaz contra o v•rus faz com que se adote um conjunto de medidas preventivas para controlar a dissemina•‚o da CAE, instituindo-se um Plano de Saneamento da CAE o qual tem como meta a forma•‚o de rebanhos livres da doen•a. Esse plano • baseado em exames sorolƒgicos de todos os caprinos da propriedade, realizados a cada seis meses sob o acompanhamento de um m•dico veterinŠrio. VŠrios s‚o os m•todos diagnƒsticos utilizados, sendo o IDGA o mais simples e exequ•vel, com alta especificidade e baixa sensibilidade, por•m com boa aplicabilidade na triagem de rebanhos por ser de fŠcil execu•‚o e n‚o exigir equipamentos nem instala•Žes sofisticadas, sendo recomendada pela OIE (Oficce International dês Epizooties, 2004). O IDGA • o teste diagnƒstico mais utilizado em todo mundo, principalmente em programas de controle da doen•a que jŠ s‚o empregados em vŠrios pa•ses (Moojen, 2001). Outras t•cnicas mais precisas v‡m sendo usadas, como a rea•‚o em cadeia de polimerase (PCR) que consegue detectar a infec•‚o logo no in•cio, no entanto o seu uso n‚o se justifica para rebanhos, e sim, em situa•Žes espec•ficas de monitoramento de rebanhos negativos. Geralmente temos uso do sangue como material biolƒgico de elei•‚o para exames diagnƒsticos da CAE, o qual requer pessoa qualificada para realiza•‚o da coleta, trata-se de um m•todo invasivo e muitas vezes estressante para o animal. O uso do leite como material biolƒgico para diagnƒstico • mais uma alternativa diagnƒstica na avalia•‚o da CAE em rebanhos caprinos, sendo um avan•o no controle e preven•‚o dessa enfermidade, por n‚o ser considerado um m•todo invasivo, e n‚o requerer pessoa qualificada para a coleta das amostras. 15 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Caprinocultura leiteira e características do leite caprino A cabra foi o primeiro animal a ser domesticado para fins subsistenciais, desde a produção de leite assim como a produção da carne e obtenção da pele. A cabra doméstica de hoje é a Capra hircus. Provavelmente os ancestrais mais antigos dessa cabra sejam dois: a Capra sivalencis e Capra perimensis, conhecidos apenas em forma de fósseis. Os ancestrais que ainda são encontrados vivos e que formaram as nossas cabras são: a Capra aegagrus, da qual descende a maioria das raças (Alpina, Angorá etc.), da região da Pérsia e da Ásia Menor; e a Capra falconezi que resultou nas cabras de cachemira, da região do Egito (Lev-Yadun et al.,2000). No Brasil os caprinos foram introduzidos com os colonizadores portugueses, franceses e holandeses. Porém, somente em 1910 é que figuram importações de animais com maior potencial de produção (Campos et al., 2003;Egito et al.,2002). No Brasil a Região Nordeste é detentora de grande parte do rebanho caprino do país, aproximadamente 91,4% dos 9.450 milhões de caprinos existentes segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2007), correspondente a 1,1 % do rebanho mundial (FAO, 2008). Em 2007 o Brasil ocupou a 19º posição na produção de leite de cabra mundial, segundo a FAO. A Bahia é o grande estado produtor de caprinos no Brasil, detendo 33,7% do efetivo nacional. Não por coincidência, dos dez principais municípios produtores, sete são da Bahia. A criação deste rebanho é direcionada economicamente para a produção de pele e carne, mas a produção de leite tem sua taxa de participação neste processo, mesmo que ínfima (apenas 1,3% da produção total de leite produzida no mundo, aproximadamente 141 toneladas). Muito dos produtores têm a produção de leite como uma atividade secundária, mas que de certa forma tem alcançado uma participação importante na economia do país, sendo considerada em algumas áreas a atividade principal (FAO, 2008). 16 A criação de caprinos na Região Nordeste visando à produção leiteira tem gerado emprego e renda no setor rural, com alto impacto social e econômico para o crescimento da região. De acordo com Costa (2005) a produção nacional diária de leite de cabra é de 22.000 litros, sendo a produção mensal de 660.000 litros e a produção anual de 7.920.000 litros. O potencial de demanda, mesmo se considerando que a clientela para o leite de cabra é formada por um público diferenciado é, com certeza, o dobro destes valores de produção, havendo, portanto, um déficit de oferta de 22.000 litros de leite por dia e 660.000 litros de leite por mês. A região Nordeste produz diariamente 10.000 litros de leite de cabra, 45.4% da produção nacional. O Estado do Rio Grande do Norte é o principal produtor, com 8.500 litros-dia. No Estado do Ceará, a produção de leite diária chega aos 1.000 litros, sendo que a região Norte do Estado apresenta um potencial de produção de 400 litros de leite por dia. A produção do Sudeste é de 12.000 litros, 54.6% de todo o leite de cabra que é produzido no País, e por apresentar uma cadeia produtiva organizada, com processamento industrial e a garantia de comercialização do leite e de seus derivados, o que assegura a evolução do setor. O mercado está subdividido em venda de leite fluído (93%), venda de leite em pó (4%) e venda de queijos, doces e iogurtes (3%). O preço médio do leite in natura adquirido aos produtores é de R$ 0,70 e o leite pasteurizado chega aos varejistas com o preço médio de R$ 1,30 e estes repassam aos consumidores a um preço médio de R$ 1,80 (Costa, 2005). Em propriedades com exploração leiteira, o período de lactação e a produção de leite diária são características obviamente importantes e são influenciadas por vários fatores referentes ao indivíduo e ao meio onde ele está inserido. Neste, pode ser incluídos os fatores reprodutivos como número de parições e número de cabritos nascidos. Também vale ressaltar que a manutenção prolongada da lactação resultará em redução na eficiência reprodutiva da cabra no decorrer da sua vida produtiva. Todas as raças leiteiras carecem de um período de repouso entre as lactações, que é cerca de 60 dias antes da provável data do parto. Essa interrupção na lactação tem resultado positivo no acúmulo de colostro na glândula mamária, no 17 desenvolvimento do feto, no ganho nutricional da m‚e e na sua lacta•‚o subsequente (Andrioli et al., 2006b). A lacta•‚o • a fase final do ciclo reprodutivo dos mam•feros, sendo que seu desencadeamento ocorre nas proximidades do parto e sua dura•‚o varia de forma considerŠvel nas diferentes esp•cies animais. Logo apƒs o parto a secre•‚o • de colostro, que • rico em gorduras, prote•nas e imunoglobulinas, por•m pobre em lactose, a mudan•a da sua composi•‚o para o leite normal se dŠ na maioria dos casos em torno do terceiro ao quarto dia da lacta•‚o (Hafez, 1988). As gl“ndulas mamŠrias s‚o ƒrg‚os especializados da pele originados embriologicamente pela invagina•‚o de brotos ectod•rmicos para o interior do mesoderma subjacente. Seu desenvolvimento come•a no embri‚o e continua de modo muito lento, durante o per•odo pr•-puberal. Na f‡mea, o seu crescimento aumenta, apƒs a puberdade, como resultado da estimula•‚o hormonal c•clica (Dellmann e Brown, 1982). A gl“ndula mamŠria consiste em gl“ndula t€bulo-alveolar composta. A unidade secretora consiste em um alv•olo e um ducto, ambos com estrutura semelhante (Dellmann e Brown, 1982). As por•Žes secretoras t€bulos-alveolares da gl“ndula mamŠria s‚o constitu•das por um epit•lio glandular que varia de c€bico a cil•ndrico, e c•lulas mioepiteliais. O l€men apresenta at• 1 mm de largura. As c•lulas epiteliais apresentam um abaulamento apical que se projeta para dentro da luz, qual se dispŽem got•culas lip•dicas de at• 5 μm de di“metro, secretadas de modo apƒcrino. No l€men encontram-se frequentemente glƒbulos de gordura de leite e material basƒfilo finamente floculado (prote•nas do leite). O citoplasma • basƒfilo (rico em RE granular, onde s‚o produzidas a prote•nas do leite) (Welsch, 2003). A gl“ndula mamŠria • dotada da capacidade bioss•ntetizadora de todos os seus componentes maiores, que s‚o as prote•nas, lactose e gorduras (Bacila, 2003), possui uma alta atividade metabƒlica e os produtos secretados s‚o os mesmos para outros tecidos do organismo (Fonseca, 1995). O leite de cabra possui valor nutritivo e • conhecido contendo os elementos necessŠrios ‘ nutri•‚o humana, como a•€car (lactose), prote•nas, gorduras, 18 vitaminas, ferro, cálcio, fósforo e outros minerais. O produto tem reação alcalina e dificilmente azeda no estômago humano, tornando-se assim, um fator de alta eficiência no tratamento de cólicas em crianças. Ocupa lugar de destaque dentre os alimentos de origem animal utilizados na alimentação humana, uma vez que fornece também calorias e aminoácidos essenciais em proporções iguais ou superiores aos recomendados pela OMS (Gomes et al., 2004). Sua digestibilidade é elevada e ocorre pelo tamanho reduzido e fácil dispersão dos seus glóbulos de gordura e pela sua proteína de coagulação que forma uma coalhada fina, macia e com perfeita digestão em um curto espaço de tempo (Costa, 2002). Em função disso trata-se de um alimento que não vai ficar muito tempo no trato digestivo (cerca 30-40 de minutos) evitando ocorrência de azedamento deste no trato e, como consequência, ocorrência de cólicas. Diferente do leite caprino, o leite bovino leva em média duas horas ou mais para ser digerido. Em geral, trata-se de um alimento de alta digestibilidade e com excelente valor nutricional. O leite caprino quando comparado ao leite bovino é menos alérgeno, sendo indicado na alimentação de crianças, pessoas idosas e/ou que apresentem sensibilidade a algumas proteínas encontradas no leite de vaca, como a caseína e a lactoalbumina, que podem provocar asma brônquica, eczemas na pele, dores abdominais e diarréias. O leite de cabra também é indicado para pessoas alérgicas à proteína do leite de vaca ou que estejam com problemas nutricionais ou gastrointestinais (Silveira, 2008). Constitui um líquido branco, puro, de odor e sabor especiais e agradáveis. A cor se deve ao fato de não apresentar caroteno e sim a pró-vitamina A. Possui um gosto típico que, dependendo de onde os animais estão instalados e da alimentação que recebem, pode se apresentar mais forte, muitas vezes indesejável. O mau cheiro, denominado hírcino, é transmitido pelo bode quando este se encontra perto das cabras em lactação, impregnando-as, além de poder transmiti-lo diretamente ao leite (Quadros, 2008). Um dos componentes mais abundantes do leite é a gordura e é o que mais sofre variação, pois ao contrário da lactose e da proteína do leite, a concentração de 19 gordura estŠ intimamente ligada ‘ nutri•‚o, as condi•Žes ambientais e a a•‚o de alguns microrganismos, como o CAEV, que reduz os n•veis de gordura do leite, principalmente de cabras infectadas, que apresentam mastite indurativa (Birgel J€nior et al., 2007). Cerca de 50% da gordura do leite • produzida no €bere e • composta por Šcidos graxos, que s‚o sintetizados na gl“ndula mamŠria e por Šcidos graxos de cadeia longa, com mais de 18 carbonos, provenientes do plasma sangu•neo (Bacila, 2003). O leite caprino • tamb•m naturalmente rico nos Šcidos graxos volŠteis caprƒico, capr•lico e cŠprico, comumente utilizados em tratamentos de pessoas com problemas de mŠ absor•‚o, pela habilidade de fornecer energia, al•m de inibir e limitar a deposi•‚o de colesterol nos tecidos e dissolver as placas deste (Haenlein, 2004). • importante que esse leite tenha boa preced‡ncia, ou seja, proveniente de um rebanho livre de doen•as, entre elas principalmente a CAE (MAPA, 2000). 2.2 ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA 2.2.1 Histƒrico Inicialmente, a CAE foi caracterizada por artrite progressiva em animais adultos e encefalomielite desmielinizante em cabritos com idade menor que seis meses (Cork et al., 1974). O reconhecimento internacional da CAE como uma virose ocorreu em 1980, apƒs a identifica•‚o do agente, classificado como um lentiv•rus da fam•lia Retroviridae, denominado CAEV (Crawford et al., 1980; Narayan et al., 1980). No Brasil, a primeira descri•‚o foi feita no Rio Grande do Sul, com identifica•‚o de caprinos soropositivos (Moojen et al., 1986). A presen•a do v•rus foi confirmada atrav•s de posterior isolamento do v•rus de caprinos (H–tzel et al., 1993; Castro et al., 1999). 2.2.2 Agente etiolƒgico O v•rus da Artrite-Encefalite Caprina • complexo, n‚o oncog‡nico, esf•rico e envelopado (Figura 1), possui di“metro de aproximadamente 80 a 100 ηm e um 20 n€cleo c’nico e denso (Gonda et al., 1986; Joag et al., 1996; Jones et al., 2000), no qual estŠ inserido o RNA gen’mico (Figura 2) que tem aproximadamente 10 Kilobase (Kb), sendo formado por genes estruturais gag (do ingl‡s “group especific antigens”, ant•genos espec•ficos de grupo), pol (polimerase) e env (envoltƒrio); genes que regulam a express‚o do genoma viral (tat, rev e vif); e n‚o possui os genes auxiliares (vpr/vpx, vpu e nef) encontrados no v•rus da Imunodefici‡ncia Humana e no v•rus da Imunodefici‡ncia S•mia (Narayan et al., 1997; Zee; Hirsh, 2003; Rea-Boutrois et al., 2009). Figura 1: Estrutura do v•rus da artrite encefalite caprina. (Coffin, 1996) Adaptado. 21 Figura 2: Genoma do vírus da artrite encefalite caprina. (Pinheiro 2001) Adaptado. Segundo Leroux et al. (1997), a enzima transcriptase reversa (RT) apresenta uma baixa fidelidade, a qual não apresenta atividade de reparo (exonuclease) e aliada à recombinação com o genoma de células co-infectadas, contribuiria para uma elevada taxa de mutação viral. O ciclo de replicação do CAEV pode ser dividido em duas etapas principais: infecção e expressão. A fase de infecção dá origem ao provírus e a fase de expressão resulta na produção do RNA viral e formação de vírions (Gonda, 1994). O ciclo de replicação do CAEV consiste, resumidamente, na ligação do vírus pelas glicoproteínas do seu envelope aos receptores da superfície celular; fusão do envelope à membrana celular; liberação do RNA viral no citoplasma da célula, onde é transcrito em DNA por ação enzimática da transcriptase reversa; trânsito do DNA pró-viral para o núcleo da célula parasitada; integração desse DNA em sítios do DNA celular por meio da enzima integrase, para a formação do provírus; síntese do RNA viral pela RNA polimerase II celular, utilizando o provírus como molde; transcrição do genoma em RNA-mensageiros (RNAm); síntese das proteínas virais; montagem; construção do capsídeo e brotamento do vírus (Coffin, 1996; Perturson; Andrésdótir; Andrésson, 1992). 22 O provírus, uma vez integrado, é estável, não existindo evidência de qualquer mecanismo para remoção dos provírus do DNA celular, transposição direta dele para outro sítio ou replicação independente (Coffin, 1996). A integração do DNA proviral ao DNA celular não é essencial à replicação dos lentivírus, mas é fundamental para a persistência da infecção (Haase, 1986). 2.2.3 Sinais clínicos A forma articular é a mais comum e se manifesta essencialmente nos adultos (Russo, 1984), bem como a forma pulmonar e mamária. O sistema respiratório e a glândula mamária foram considerados como passíveis de comprometimento durante a evolução da CAE, causando, respectivamente, pneumonia intersticial crônica, frequentemente denominada por pneumonia progressiva dos caprinos, e mamite intersticial (Lara et al., 2005). A forma mamária da CAE é frequente e apresenta grande significado econômico em rebanhos caprinos leiteiros devido ao comprometimento da produção de leite e predisposição a infecções secundárias da glândula mamária. As cabras afetadas poderão apresentar mastite aguda ou crônica, sendo que na aguda, geralmente observada antes da lactogênese, há endurecimento não edematoso do úbere e uma baixa ou nenhuma produção leiteira. Já na crônica, observada durante a lactação, há endurecimento e assimetria da mama e o leite aparece com aspecto normal. Em ambas as formas há hipertrofia persistente dos linfonodos retromamários e histologicamente se observa mastite intersticial com presença de nódulos linfóides (Callado et al., 2001). A sintomatologia nervosa, causada pela encefalite, é a mais rara e ocorre com maior frequência em cabritos, o que leva a quadros de ataxia secundária e paresia. Muitos animais infectados não apresentam sintomatologia clínica, porém permanecem soropositivos durante toda a sua existência (Cutlip et al., 1992). 2.2.4 Transmissão 23 Caprinos infectados funcionam como reservatório e fonte de infecção do vírus. A transmissão ocorre por meio de secreções ou excreções ricas em células do sistema monocítico-fagocitário, principalmente macrófagos, caracterizado pelo tropismo peculiar do vírus por estas células (Gorrel et al., 1992). A replicação viral acontece nos macrófagos produzindo lesões do tipo inflamatória. No entanto, outros tipos de células, como fibroblastos, células epiteliais e células endoteliais também são suscetíveis à infecção in vivo (Carrozza et al., 2003). A principal via de transmissão que corresponde a um total de 69% segundo os apontamentos de Rowe et al. (1991) é a digestiva, geralmente, no período neonatal, através do leite e ou colostro de cabras infectadas, onde o vírus pode se encontrar tanto livre como em células somáticas. A infecção dos cabritos pode ocorrer pelo contato vaginal com a cria, ingestão acidental de colostro de cabras infectadas ou transmissão pela mãe para cria através da saliva ou secreções respiratórias durante a limpeza do neonato (Rowe; East, 1997). 2.2.5 Controle e Prevenção Não há tratamento especifico para a CAE (East, 1993). A maioria dos animais que apresentam sintomatologia clínica são descartados ou sacrificados devido à claudicação, decúbito, perda de peso e redução da produção (Reilly et al., 2002), sendo que a única forma de evitar sua transmissão é estabelecer medidas de controle e prevenção da doença. A maneira mais efetiva de controlar a infecção consiste em se proceder à remoção dos animais infectados e interromper a difusão do agente. As medidas sanitárias adotadas para o controle e a erradicação da infecção pelo CAEV estão diretamente relacionadas com o tamanho, o tipo de exploração, o manejo e o grau de infecção dos rebanhos. Ademais, incluem medidas, como aplicação de testes sorológicos sensíveis e específicos a serem realizados semestralmente em todos os caprinos. O controle e erradicação do CAEV são, principalmente, baseados na substituição do colostro de cabras infectadas, separação das crias e controle sorológico regular. Na Suíça, um programa de erradicação do CAEV foi iniciado em 24 1984, e levou à redução da soroprevalência de mais de 60% para menos de 5% no ano de 1996 (Zanoni et al., 1998). 2.2.6 Epidemiologia O CAEV foi isolado de caprinos em 1980, embora a artrite-encefalite caprina (CAE) tenha sido descrita pela primeira vez na década de 1970, nos EUA (Cork, 1974). A partir de então, essa enfermidade se distribuiu mundialmente. Com isso, diversas técnicas sorológicas são empregadas, com o objetivo de realizar um levantamento epidemiológico, para se ter conhecimento da prevalência ou da ocorrência do vírus da CAE (Pinheiro, 2001). No Brasil, em estudos realizados na região Nordeste, a ocorrência de caprinos soropositivos para o CAEV no Ceará foi de 40,73% (Melo; Franke, 1997). Em outro estudo nesse mesmo Estado, foi verificada uma prevalência da infecção pelo CAEV de 1% (40/ 4019) e, quando os caprinos soropositivos foram agrupados em faixas etárias, observou-se que aqueles com mais de três anos representaram 32,5% dos animais soropositivos; os de dois a três anos representaram 25%; de um ano e meio a dois anos, 15%; de um ano a um ano e meio, 20% e, de seis meses a um ano, 7,5% (Pinheiro; Gouveia; Alves, 2001). Avaliando somente os reprodutores caprinos desse Estado, Pinheiro; Gouveia; Andrioli, (1999) verificaram 13,20% de soropositividade e alertaram para o fato de que a contaminação do rebanho nativo estava ocorrendo por meio da compra de machos melhorados, que apresentavam anticorpos para o vírus da CAE, mas que não tinham confirmação diagnóstica para a CAE. Caminha et al, (2008) realizaram o levantamento sorológico por IDGA, de CAEV, na região metropolitana de Fortaleza e encontraram 16 (12,8%) positivos entre os 125 caprinos testados. Nos outros estados da região Nordeste, a prevalência encontrada foi de 13,40%; 0,73% e 26,1% na Bahia (Almeida et al., 2001; Oliveira et al., 2006; Tigre et al., 2006), de 4,4% e 2,5% no Piauí (Pinheiro et al., 1996; Batista et al., 2004), de 2,2% e 8,2% na Paraíba (Castro et al., 2002; Bandeira et al., 2008), de 11,0% no Rio Grande do Norte (Silva et al., 2005), de 50,6% no Maranhão (Alves; Pinheiro, 1997), 25 de 17,7% e 3,9% em Pernambuco (Castro et al., 1994; Castro et al., 2002) e de 4,25% em Sergipe (Melo et al., 2003). Silva, et al. (2005) analisaram amostras de soro caprino no Estado do Rio Grande do Norte, verificando na ocasião que, do total dos 184 animais testados, 2,71 % foram positivos. Em Pernambuco, Oliveira et al. (2006), analisando amostras de soro caprino, provenientes de abatedouros, notificaram o fato de que 3,8% eram positivos a CAEV. Nos estados da região Sudeste do Brasil, a ocorrência de animais com CAE observada em São Paulo foi de 43,01% e 34,93% (Leite et al., 2004; Madureira; Gomes, 2007), em Minas Gerais de 33,3% e 23,6% (Assis; Gouveia, 1994; Gouveia et al., 1998), Espírito Santo de 47,5% (Gouveia et al., 1998) e no Rio de Janeiro de 29,7%; 21,0% e 10,6% (Assis; Gouveia, 1994; Cunha; Nascimento, 1995; Gouveia et al., 1998). Na região Sul do Brasil a prevalência encontrada no Paraná foi de 28,2% (Sotomayor; Milczewski, 1997). No Rio Grande do Sul, de 6,0% (Moojen et al., 1986) e em Santa Catarina de 6,72% (Sell, 2000). Em estados de outras regiões brasileiras como, Goiás, a prevalência relatada foi de 10,0% (Gouveia et al., 1998) e no Pará de 40,0% (Ramos et al., 1996). 2.3 TESTES DIAGNÓSTICOS 2.3.1 Principais testes Uma vez que não há nenhum tratamento eficaz ou vacina para CAE, medidas profiláticas devem ser tomadas para reduzir ou eliminar os danos causados pela doença, tais como a baixa produção de leite, o abate prematuro e perda de potencial genético de animais afectados. As medidas são baseadas na identificação precisa dos animais infectados através de testes sorológicos e moleculares adequados, segregação ou abate dos soropositivos, e controle de colostro e leite destinados à animais jovens (Callado et al. 2011). Varios métodos podem ser utilizados no diagnostico da doença sendo eles: Ensaio Imunoenzimático (ELISA), Reação em cadeia da polimerase (PCR), Reação 26 de Imunofluorescência Indireta (RIFI), Hibridização in situ (HIS), Radioimunoprecipitação (RIPA), Western Blot (WB) e Isolamento Viral. Vários estudos têm descrito o uso da PCR como metodologia para detectar lentivírus de pequenos ruminantes (LVPR) no sangue e outros tecidos, embora poucas estimativas de sensibilidade e especificidade tenham sido feitas. As duas principais dificuldades no desenvolvimento de testes de PCR adequados para LVPR são a variação da cepa e carga viral baixa in vivo. As sequências alvo para primers são por toda extensão do genoma e incluem os genes das regiões LTR, gag, pol e env (De Andrés et al., 2005). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido aplicada para a pesquisa do DNA proviral de lentivírus caprinos em diferentes amostras, tais como: sangue, líquido sinovial, leite e soro do leite, tecidos e sêmen (Reddy et al., 1993; Rimstad et al., 1994; Barlough et al., 1994; Clavijo, Thorsen, 1996; Andrioli et al., 2006). 2.3.2 IDGA Para o diagnóstico sorológico, o teste de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA) é recomendado pela OIE (2004), por ser de fácil aplicabilidade e não exigir equipamentos nem instalações sofisticadas. Este método é a forma diagnóstica mais utilizada em todo mundo, principalmente em programas de controle da doença que já são empregados em vários países (Moojen, 2001). Além da fácil aplicabilidade, o IDGA tem alta especificidade o que acaba credenciando-o para a realização dos diagnósticos de triagem nos programas de controle da enfermidade (Varea et al., 2001). O IDGA utiliza a partícula viral íntegra concentrada a partir de sobrenadantes de cultura ou parte do vírion (proteínas virais) adquiridas pela ação de detergentes ou outros tratamentos. O IDGA detecta anticorpos contra a proteína p28 do capsídeo do CAEV e contra a glicoproteína de superfície gp135. A técnica baseia-se na migração radial dupla de antígeno (Ag) e anticorpo (Ac), através da agarose. O encontro dos reagentes, em proporções ótimas, leva à formação de complexos AgAc insolúveis que precipitam, tornando-se visíveis sob a forma de uma linha ou banda de precipitação (Figura 03). 27 Figura 03. Reação de precipitação de IDGA A sensibilidade e a especificidade do teste IDGA para CAEV foram relatadas sendo 91% e 100%, respectivamente, em relação à Radioimunoprecipitação (RIPA) utilizando 218 amostras de cabra campo (Knowles et al., 1994). Um recente estudo examinou 1.941 soros de 693 ovelhas em sequência, no período de 3-4 anos e encontraram sensibilidade e especificidade para 76,3% e 98,3%, respectivamente, em relação aos escores consenso obtido pelo Teste Imunoenzimático (ELISA) e Western Blot (WB) (Varea et al. 2001). 2.3.3 PCR A detecção de DNA proviral pode ser feita também através da PCR. Esta é sensível na detecção de pequenas quantidades de ácidos nucléicos virais e é utilizada para demonstrar a presença de DNA proviral tanto in vivo, como in vitro. Vários trabalhos têm demonstrado, com sucesso, o uso da técnica de PCR na detecção do DNA proviral dos LVPR. A PCR permite por amplificação direta de parte do ácido nucléico viral específica de fluidos e tecidos de um animal infectado (Zanoni et al.,1990; Reddy et al., 1993; Rimstad et al., 1993; Wagter et al., 1998). DNA proviral pode ser detectado em células mononucleares e granulócitos presentes no 28 soro de leite, inferindo que o soro lácteo pode ser infectante, difundindo, consequentemente, os vírus (Russo et al., 1997). As variações de PCR já estão sendo aplicadas, tais como PCR quantitativa, desenvolvida por Zhang et al (2000), real-time PCR que foi desenvolvida e caracterizada in vitro (Gudmundsson et al., 2003) e semi-nested PCR utilizando primers degenerados, desenvolvida por Eltahir et al. (2006). Reddy et al. (1993) verificaram também que três animais negativos por IDGA foram positivos por PCR, enquanto dois animais positivos por IDGA apresentaram resultado negativo por PCR. Devido à alta variabilidade genômica dos lentivírus, a escolha dos primers em genes relativamente conservados como pol, gag e da LTR, combinado a com as condições de reação para a máxima sensibilidade é decisiva para detecção de um grande espectro de cepas de campo de ambos CAEV e MVV (Zanoni, 1998). Wagter e colaboradores (1998) através de PCR, utilizando um mix de seis primers de três cepas de lentivírus ovino e um de caprino da região conservada do gene gag, encontraram resultados discordantes com quantidades diferentes de amostras de sangue (monócitos) demonstrando que a sensibilidade do teste é limitada ao tamanho da amostra. Verificaram que quando amostraram 1 mL de sangue de seis animais nenhum reagiu positivamente, entretanto quando aumentaram a alíquota para 5 mL, cinco dos seis animais foram positivos e quando utilizaram 10 mL de sangue todos os animais foram positivos. De 60 animais soropositivos pela IDGA, o PCR do sangue detectou somente 53. Observaram, também, que a resposta sorológica pode ser bem lenta até 18 meses após a detecção pelo PCR ou até mesmo não soroconverter e que o PCR é mais eficiente em detectar DNA no sangue nos estágios iniciais da doença. A detecção de infecção por LVPR através de PCR é indicativa de uma infecção persistente e é dependente da quantidade amplificada da sequência alvo e da especificidade do primer. Entretanto esta técnica poderá ser utilizada em programas de erradicação, quando estiver disponível rotineiramente, para identificar os animais não 29 diagnosticados por sorologia. É recomendado que esta técnica seja empregada para esclarecer resultados sorológicos indeterminados ou negativos, devido ao alto custo e aos resultados discordantes entre testes sorológicos e PCR (Knowles, 1997). 30 3. JUSTIFICATIVA A busca por métodos diagnósticos que tornem mais eficaz a aplicação de medidas de prevenção e controle é uma constante, sendo a utilização do soro extraído do leite mais uma possibilidade na execução do IDGA e PCR. O uso do soro extraído do leite consiste em um método não invasivo, simples e exequível, com potencial de produzir respostas nos testes diagnósticos iguais ou superiores quando comparadas soro sanguíneo. O emprego do leite como material biológico no exame diagnóstico traria vantagens ao pequeno e médio produtor, como: facilidade na coleta e redução de custos, visto que não se faz necessária a mão de obra especializada, onde até o próprio produtor poderia fazer a coleta das amostras do leite; permitiria a análise individual e/ou em um pool de amostras de leite de um rebanho; o fato de ser um método não invasivo mostra uma preocupação com o bem-estar animal; e apresentar uma sensibilidade semelhante ao método convencional. Desta forma, este trabalho propõe elucidar e desenvolver uma metodologia diagnóstica complementar as vigentes, mas que ao mesmo tempo seja de fácil execução, acessível ao produtor e que tenha acurácia semelhante ou superior à metodologia convencional. 31 4. HIPÓTESE CIENTÍFICA O uso do leite de cabras tem aplicação e eficácia semelhante à apresentada pelo sangue na realização de métodos diagnósticos (IDGA e PCR) para a CAE. 32 5. OBJETIVOS 5.1 Objetivo geral Utilizar o leite caprino como amostra clínica para diagnóstico sorológico e molecular do vírus da CAE. 5.2 Objetivos específicos Sugerir um protocolo de IDGA para o soro do leite como amostra diagnóstica em rebanhos caprinos leiteiros; Realizar os testes sorológico e molecular dos rebanhos envolvidos no projeto para detecção de anticorpos anti CAEV e DNA proviral no leite e no sangue, visando medidas de controle preventiva desta enfermidade; Comparar a eficácia do IDGA e PCR em amostras de soro sanguíneo e leite no diagnóstico da CAE. 33 CAP˜TULO I: Diagnóstico sorológico e molecular da CAE a partir de amostras de leite de cabras naturalmente infectadas Danilo Saraiva Ara€jo 1, Kelma Costa de Souza1, Apoliana de Sousa Rodrigues1, Victor Manoel de Lacerda Freitas1, Maria FŠtima da Silva Teixeira1 1 Laboratƒrio de Virologia - Faculdade de VeterinŠria – Universidade Estadual do CearŠ – Fortaleza,CE. Av. Paranjana, 1700, 60740-903, e-mail: [email protected] Resumo A Artrite encefalite caprina (CAE) • uma doen•a infecciosa, multissist‡mica, causada por um lentiv•rus, pertencente ‘ fam•lia Retroviridae, que acomete caprinos de todas as idades. • uma enfermidade de carŠter cr’nico que ocasiona preju•zos econ’micos na caprinocultura. A falta de uma vacina eficaz contra o v•rus faz com que se adote um conjunto de medidas preventivas para controlar a dissemina•‚o da CAE. Os testes diagnƒsticos da CAE mais utilizados atualmente s‚o os sorolƒgicos: imunodifus‚o em gel de agarose (IDGA), ensaio imunoenzimŠtico (ELISA), e os moleculares: Rea•‚o em Cadeia da Polimerase (PCR) Western Blotting, todos eles tendo como principal insumo o sangue. O uso do leite como material biolƒgico no exame diagnƒstico traria vantagens ao pequeno e m•dio produtor, como a facilidade na coleta e redu•‚o de custos. Esta pesquisa teve como objetivo comparar o desempenho do leite no diagnƒstico da artrite e encefalite caprina utilizando IDGA e PCR em rela•‚o ao sangue. A PCR leader gag, das amostras de sangue e leite, detectou 100 e 96,7% respectivamente, dos animais infectados enquanto que o IDGA detectou 60 e 16,6%. Os resultados obtidos confirmam a possibilidade de utiliza•‚o do leite como insumo para a realiza•‚o da PCR. Palavras-chave: CAEV, IDGA, Leite, PCR, Sangue 34 Abstract The caprine arthritis encephalitis (CAE) is a multisystemic infectious disease, caused by lentivirus belonging to the Retroviridae family, which affects goats of all ages. It is a chronic disease that causes economic losses in goat farming. The lack of an effective vaccine against the virus that causes adopt a set of preventive measures to control the spread of CAE. The most widely used diagnostic tests of CAE are the serologic agarose gel immunodiffusion (AGID), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the molecular Polymerase Chain Reaction (PCR) Western Blotting, all with the primary sample the blood of infected animals. The use of milk as biological material in diagnostic test would bring some advantages to small and medium producers, such as ease of collection and reduce costs. This study aimed to compare the performance of milk in diagnosis of caprine arthritis and encephalitis using PCR and AGID in relation to blood. PCR gag leader, samples of blood and milk, detected 100 and 96.7% respectively of animals infected while the AGID detected 60 and 16.6%. The results confirm the possibility of using milk as material for the PCR. Keywords: AGID, Blood, CAEV, Milk, PCR, 1. Introdução A Artrite encefalite caprina (CAE) é uma doença infecciosa, multissistêmica, causada por um lentivírus, pertencente à família Retroviridae, que acomete caprinos de todas as idades. É uma doença de caráter crônico que ocasiona prejuízos econômicos na caprinocultura. A falta de uma vacina eficaz contra o vírus faz com que se adote um conjunto de medidas preventivas para controlar a disseminação da CAE. As principais manifestações clínicas da doença são a leucoencefalomielite que acomete caprinos jovens (Cork et al., 1974) e artrite mais frequente nos adultos (Crawford et al., 1980). Existem registros que pulmões e glândulas mamárias também podem ser afetados, causando, respectivamente, uma pneumonia crônica 35 intersticial, denominada por pneumonia progressiva dos caprinos, e uma mamite intersticial endurativa (Sims et al., 1983; Lerondelle, et al., 1989). Dentre as principais vias de transmissão a ingestão de colostro e de leite de cabras infectadas são as formas mais importantes de transmissão da doença (Crawford e Adams, 1981; Adams et al., 1983; East et al., 1987; Rowe et al., 1992). O diagnóstico laboratorial pode ser realizado por técnicas diretas ou indiretas. A detecção direta da presença do vírus pode se dar tanto pelo isolamento em cultura celular e evidenciação do vírus em microscopia eletrônica, como também através da reação em cadeia da polimerase e da hibridização in situ. A determinação indireta da infecção pelo CAEV se faz pela detecção da presença de anticorpos por técnicas sorológicas como: imunodifusão em gel de agarose (IDGA), ensaio imunoenzimático (ELISA), imunofluorescência indireta (IFI) e Western Blotting (WB) (Reischak, 2000). Embora a IDGA seja a principal forma de detecção de animais infectados pelo CAEV e o teste indicado pela World Organization for Animal Health (OIE), possui um valor limitado na identificação de animais em fase inicial da infecção (Frota et al., 2005). Por isso, para o diagnóstico precoce da enfermidade técnicas moleculares de detecção viral têm sido aplicadas, dentre elas a PCR, cujo objetivo é a amplificação in vitro dos ácidos nucleicos, permitindo a obtenção de milhares de cópias de uma sequência específica de DNA (Frota et al., 2005; Andrioli et al., 2006). De acordo com Brinkhof et al.(2010), grande parte dos custos dos testes estão relacionados à coleta das amostras de sangue que em muitos países é legalmente restrito à veterinários. O uso do leite como material biológico no exame diagnóstico traria vantagens ao pequeno e médio produtor, como: facilidade na coleta e redução de custos, já que não se faz necessária à mão de obra especializada, onde até o próprio produtor poderia fazer a coleta das amostras do leite. Diante do exposto, esta pesquisa teve como objetivo comparar o desempenho do leite no diagnóstico do vírus da artrite e encefalite caprina utilizando IDGA e PCR em relação ao sangue. 36 2. Material e Métodos 2.1 Animais e amostras Amostras de sangue e leite oriundas de cabras Saanen e mesti•os f1 Saanen x Anglo nubiana naturalmente infectadas com CAEV (n=30) foram coletadas em uma propriedade leiteira na regi‚o metropolitana de Fortaleza, CearŠ. O sangue foi coletado por venopun•‚o da jugular em dois tipos de tubos, um contendo anticoagulante (heparina) e outro com ativador de coŠgulo, e mantido sob refrigera•‚o em caixas isot•rmicas. As amostras de leite foram coletadas em tubos tipo falcon de propileno de 50mL diretamente do teto higienizado (pr• dipping). 2.2 Processamento das Amostras a. Sangue As amostras de sangue foram submetidas ‘ centrifuga•‚o a 1500g durante 10 minutos. As amostras contendo heparina que foram centrifugadas tiveram a fra•‚o de leucƒcitos removida para extra•‚o do DNA. Os soros das amostras sem o anticoagulante foram removidos e conservados a -20™C at• a realiza•‚o do IDGA. Para a extra•‚o do DNA proviral das amostras foi utilizado o protocolo descrito por Caldas e colaboradores (2000), onde a fra•‚o de leucƒcitos (≅ 100šL) foi transferida para um tubo de 1,5 mL contendo 500šL de TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) e centrifugada a 2700g por cinco minutos. O sobrenadante foi descartado e a opera•‚o repetida. Em seguida o pellet foi ressuspenso em 500šL de tamp‚o k (10mM de Tris HCl pH 8,0; 50mM de KCl; 2mM de MgCl2; 0,5% de Tween 20; 100μg/mL de proteinase K= 0,1μg/μL) agitado em vƒrtex, incubado a 56› C por 45minutos e para inativa•‚o da proteinase K, a amostra foi submetida a 95› C durante 10 minutos. b. Leite 37 As amostras de leite foram aliquotadas em dois tubos tipo Falcon de 15 mL sendo o primeiro destinado à sorologia e o segundo à PCR. Para a utilização do soro do leite, as amostras foram centrifugadas a 1500g durante 10 minutos sendo o soro removido com micropipeta e submetido à repetição deste procedimento por mais duas vezes. Ao final, o soro do leite foi transferido para tubos de 1,5 mL e armazenados a -4º C até a utilização. As amostras de leite foram diluídas 1:3 em solução salina tamponada (PBS) e submetidas a centrifugação a 1500 g por dez minutos. Após a centrifugação a gordura foi mecanicamente removida com o auxílio de algodão e o sobrenadante desprezado. Este procedimento foi repetido por duas vezes. O sedimento foi diluído em 100µL de PBS e destinado à extração (Caldart, 2011). Posteriormente, as amostras foram submetidas à extração do DNA proviral utilizando o mesmo protocolo das células sanguíneas. 2.3 IDGA Para o diagnóstico do CAEV foi utilizado o kit de IDGA (Biovetech®). As placas tiveram suas leituras realizadas após 48 horas de incubação em câmara úmida, de acordo com as recomendações do fabricante. 2.4 PCR Foram realizadas duas rodadas de amplificação (PCR-Nested) para amplificar os fragmentos de 187 pb do DNA proviral, correspondente a sequência leader gag do genoma do CAEV. Os primers utilizados com base na sequência publicada das cepas CAEV-Co, conforme descrito por Saltarelli et al. (1990) e adaptado por Feitosa (2007). Os primers GEX5 (5-CAAGCAGCAGGAGGGAGAAGCTG-3) e GEX3 (5TCCTACCCCCATAATTTGATCCAC-3) correspondentes às bases 953-975 foram e utilizados o para complemento a de amplificação, 1249-1226, respectivamente. Os primers GIN5 (5-GTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATG-3) e GIN3 (5-ACCTTTCTGCTTCTTCATTTAATTTCCC-3) foram utilizados para a segunda amplificação, correspondendo às bases 997-1024 e o complemento de 38 1181-1154, respectivamente. A amplificação foi realizada utilizando um termociclador MG96+ (Biocycler). O primeiro e o segundo round da PCR foram realizadas utilizando 35 ciclos de.: 5 min a 94°C, 1 min a 94°C, 1 min a 56°C, 45 s em 72°C, após o último ciclo, as amostras foram incubadas a 72°C por 7 min. Após a amplificação, os produtos de PCR de cada amostra foram visualizados por eletroforese em gel de agarose 1,0% contendo brometo de etídio em tampão TBE(Tris-borato-EDTA) 1X. 2.5 Análise Estatística Os dados foram tabulados no programa Microsoft Office Excel 2007 e, posteriormente, processados utilizando, estatística descritiva. Sendo distribuídos em tabelas, gráficos e figuras. 3. Resultados e Discussão As amostras de sangue e leite na PCR leader gag detectaram o vírus em 100 e 96,7%,respectivamente, dos animais infectados (Fig.1).O desempenho do leite na PCR leader gag foi semelhante ao sangue. Entretanto, esses dados diferem dos resultados encontrados por Brinkhof et al. (2010) que obteve 39% de sensibilidade nas amostras de sangue e 61% de sensibilidade nas amostras de leite. Figura 1-Concordância (%) dos resultados das amostras de sangue e leite utilizando os testes de IDGA e PCR. Outro estudo realizado por Gregory et al. (2009) utilizando amostras de leite oriundas de caprinos infectados detectou apenas 22,6% dos animais positivos 39 utilizando PCR nested. Os resultados do PCR utilizando o leite como insumo foram equivalentes aos observados no sangue, divergindo em apenas um animal. Os dados, com PCR do leite, obtidos nesse estudo apresentam subs•dios para utiliza•‚o do leite em programas de monitoramento podendo reduzir significativamente os custos, aumentando sua viabilidade (Bartels et al., 2005; van Weering et al., 2007; Kramps et al., 2008). Figura 2-Eletroforese em gel de agarose 1% PCR leader gag (nested) de amostras de leite. L-Marcador molecular 1-6- amostras de leite positivas, 7- amostra de leite negativa, - controle negativo e + controle positivo. A imunodifus‚o em gel de agarose para o sangue apresentou um desempenho inferior a PCR, detectando apenas 18 dos 30 animais positivos, como descritos em outro estudos (Modolo et al., 2009; Wagter et al., 1998) (Tabela 01). Tabela 01- Compara•‚o dos testes IDGA e PCR utilizando leite e sangue. IDGA PCR Sangue 18/30* 30 /30* Leite 5 /30* 29 /30* *Animais positivos/Total de animais A utiliza•‚o de leite no IDGA detectou apenas 5 dos 30 animais positivos (Tabela 01). O leite de cabra possui em m•dia 3,3g de prote•nas: case•na, Lactoalbumina, β-Lactoglobulina dentre outras (Hafez, 1988; Bacila, 2003). A presen•a de outras prote•nas e outros debris podem interferir diretamente na difusibilidade dos anticorpos presentes no soro do leite. Outros fatores como o 40 per•odo de lacta•‚o e per•odo de infec•‚o podem ainda influenciar a elimina•‚o de anticorpos no leite (Tizard, 1998). O IDGA necessita de uma quantidade de anticorpos relativamente alta (30 šg/cm•) para ser identificado (Tizard, 1998). Wagter et al., (1998) afirmam que a produ•‚o de anticorpos detectŠveis pelo IDGA • lenta, podendo ocorrer em per•odos maiores que um ano apƒs a detec•‚o pelo PCR ou at• mesmo n‚o acontecer. Esses dados corroboram com os achados desse estudo em rela•‚o a utiliza•‚o do leite como insumo do teste de IDGA. Diante disso a perspectiva do uso de leite em IDGA com resultados mais prƒximos dos obtidos com o sangue deve ser investigada para elucidar os fatores que podem influenciar esse teste. 4. Conclusão Os resultados obtidos confirmam a possibilidade de utiliza•‚o do leite como insumo da PCR. Entretanto, outros estudos s‚o necessŠrios para validar seu uso em programas de monitoramento. 5. Referências ADAMS, D.S.; KLEVJER-ANDERSON, P.; CARLSON, J.L.; MCGUIRE, T.C.; GORHAM, J. R. Transmission and control of caprine arthritisencephalitis virus. Am. J. Vet. Res., V. 44, p.1670–1675, 1983. BACILA, M. Bioqu•mica VeterinŠria S‚o Paulo: ROBE Editorial, 2003, p. 429-447. BARTELS, C.J., VAN MAANEN, C., VAN DER MEULEN, A.M., DIJKSTRA, T., WOUDA, W., 2005. Evaluation of three enzyme-linked immunosorbent assays for detection of antibodies to Neospora caninum in bulk milk. Vet. Parasitol. 131, 235– 246 41 BRINKHOF, J. M.; HOUWERS, D. J.; MOLL, L.; DERCKSEN, D.; VAN MAANEN, C. 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Surge também a perspectiva da utilização de um pool de amostras de leite como uma forma de aumentar a viabilidade financeira dos testes de PCR. 46 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADAMS, D.S; CRAWFORD, T.B.; BANKS, K.L.; MCGUIRE, T.C.; PERRYMAN, L.E. Immune responses of goats persistently infected with caprine arthritis-encephalitis virus. Infect. Immun., v.28, n.2, p.421-427, 1980. ADAMS, D.S.; KLEVJER-ANDERSON, P.; CARLSON, J.L.; MCGUIRE, T.C.; GORHAM, J. R. Transmission and control of caprine arthritisencephalitis virus. Am. J. Vet. Res., V. 44, p.1670–1675, 1983. ALMEIDA, M. G. A. R.; ANUNCIA ¡O, A. V. M.; FIGUEREDO, A.; MARTINEZ, T. C. N.; LABORDA, S. S. Dados sorolƒgicos sobre a presen•a e distribui•‚o da Artrite Encefalite Caprina (CAE) no estado da Bahia, Brasil. Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal, v. 1, n. 3, p. 78 – 83, 2001. ALVES, F. S. F.; PINHEIRO, R. R. A import“ncia do leite de cabra na nutri•‚ohumana. Revista Agropecuária Catarinense, v. 16, n. 1, 2003. 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