programa de pós-graduação em biodiversidade e
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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIODIVERSIDADE E BIOTECNOLOGIA DA REDE BIONORTE PROCESSOS INFLAMATÓRIOS, NOVAS PERSPECTIVAS: ESTUDO E ADAPTAÇÃO DE MODELO EXPERIMENTAL E ESTUDO DE DROGAS ANTIINFLAMATÓRIAS Paulo Eduardo Santos Avila BELÉM - PA 2016 Paulo Eduardo Santos Avila PROCESSOS INFLAMATÓRIOS, NOVAS PERSPECTIVAS: ESTUDO E ADAPTAÇÃO DE MODELO EXPERIMENTAL E ESTUDO DE DROGAS ANTIINFLAMATÓRIAS Tese de doutorado apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Rede Bionorte, Universidade Federal do Pará, como requisito para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia. Orientador (a): Prof. Dr. José Luiz Martins do Nascimento Coorientador (a): Prof.ª Dr.ª Gilmara de Nazareth Tavares Bastos BELÉM - PA 2016 A958p Avila, Paulo Eduardo Santos. Processos inflamatórios, novas perspectivas: estudo e adaptação de modelo experimental e estudo de drogas anti-flamatórias/Paulo Eduardo Santos Avila; Orientador, José Luiz Martins do Nascimento; Coorientador, Gilmara de Nazareth Tavares Bastos. — Belém, Pa, 2015. 86f. Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Rede Bionorte. Doutorado em Bioctenologia. 1. Inflamação. 2. Ágar. 3. Analgesia. 4. Anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs). I. Nascimento, José Luiz Martins do. II. Bastos, Gilmara de Nazareth Tavares. III. Universidade Federal do Pará. IV. Título CDD: 21. ed. 615.1 Paulo Eduardo Santos Avila PROCESSOS INFLAMATÓRIOS, NOVAS PERSPECTIVAS: ESTUDO E ADAPTAÇÃO DE MODELO EXPERIMENTAL E ESTUDO DE DROGAS ANTIINFLAMATÓRIAS Tese de doutorado apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-graduação em Biodiversidade e Biotecnologia da Rede Bionorte, Universidade Federal do Pará, como requisito para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia. Banca Examinadora: ______________________________________________________ Prof. Dr. José Luiz Martins do Nascimento Orientador- Presidente da banca Universidade Federal do Pará (UFPA) ______________________________________________________ Profª. Drª. Gilmara de Nazareth Tavares Bastos Co-orientadora Universidade Federal do Pará (UFPA) ______________________________________________________ Prof.ª Dr.ª Cristine Bastos do Amarante Membro da Banca Avaliadora Museu Paraense Emílio Goeldi (MPEG) ______________________________________________________ Prof.ª Dr.ª Barbarella de Matos Macchi Membro da Banca Avaliadora Universidade Federal do Pará (UFPA) _____________________________________________________ Prof. Dr. Moisés Hamoy Membro da Banca Avaliadora Universidade Federal do Pará (UFPA) ______________________________________________________ Prof.ª Dr.ª Valéria Marques Ferreira Normando Membro da Banca Avaliadora Universidade do Estado do Pará (UEPA) BELÉM - PA 2016 DEDICATÓRIA Este trabalho é dedicado a todos aqueles que estiveram ao meu lado em mais esta jornada, sempre confortando, acalmando, ajudando por meio de orientações e intuições..., com palavras, abraços ou simples toques de carinho e força. Muito obrigado por sua presença, companhia, ensinamentos, alegria, amor e, sobretudo, paciência: Meu pai, Neide Sebastião Avila; Minha mãe, Margarida Avila; Minha irmã, Ana Avila; Meus amigos... E é dedicado, principalmente, àquelas que chegaram durante essa experiência. Meus maiores presentes e melhores companheiras: Minha esposa, Malu Andrade; Minha filha, Maria Sofia. Paulo Eduardo Santos Avila AGRADECIMENTOS À Deus, por me conceder o dom da vida e ter iluminado meus caminhos. Ao Professor José Luiz Martins do Nascimento, que desde o começo acreditou e me incentivou em busca de novos conhecimentos com conselhos e orientações, contribuindo para meu crescimento profissional e pessoal. À Professora Gilmara Bastos, por toda a paciência, incentivo, conhecimentos e, sobretudo, pela amizade. Você, minha amiga, foi fundamental para esta conquista. Agradeçolhe de coração. À Bionorte e ao Museu Goeldi, incluindo seus Professores Mário Jardim e Lourdes Ruivo e, também, ao amigo Oberdan, que me acolheram de maneira atenciosa e profissional, permitindo a realização deste sonho. Aos amigos Anderson Bentes e Luís Maués, por toda enorme contribuição nesta etapa vencida. Obrigado, sobretudo por sua amizade. Aos Professores Chubert Sena, Barbarella Macchi, Rosivaldo Borges e Moisés Hamoy, pela imensa ajuda durante toda a pesquisa com seus conhecimentos e orientações. À Neide, por toda a ajuda. Sem você, todos nós não sairíamos do lugar, minha amiga. Aos amigos Trovão, Maurício, Gabriel, Tiago, Amanda Mota, Amanda Pâmela, Aline, Gustavo, Ronald, Lebrego, Érica, Dayane, Karla, Ana Júlia, Dhara, Alda, Robson, Lílian, Patrícia, Jéssica, Gisele, Rafael, Pedro, Cláudia Bobadilha, Igor, Reinaldo, pelo apoio e amizade nesta longa caminhada. Ressalto que a ordem não é de importância, pois todos foram fundamentais. Aos colegas de doutorado Sandra Layse, Neves, Márcia, Sandra Kariny, Antônio, Laíce, Carlos, Leonardo e Letícia, pelos momentos, apoio e amizade. A todos os professores e pessoas, das quais não tenha recordado o nome, mas que colaboraram com seus conhecimentos. Paulo Eduardo Santos Avila EPÍGRAFE Em ciência, o crédito vai para o homem que convence o mundo de uma ideia, não para aquele que a teve primeiro. (WILLIAN OSLER) RESUMO AVILA, Paulo Eduardo Santos. Processos inflamatórios, novas perspectivas: estudo e adaptação de modelo experimental e estudo de drogas anti-inflamatórias. Tese (Doutorado em Biotecnologia) – Rede Bionorte, Universidade Federal do Pará (UFPA), Belém, 2015. Inflamação é uma tentativa do organismo de remover estímulos nocivos e iniciar, assim, uma cascata de respostas com intuito de promover a cura. Existe uma variedade de mecanismos inflamatórios envolvidos em infecções, doenças crônicas e outras lesões teciduais. O entendimento desses mecanismos e a busca de novos medicamentos anti-inflamatórios com maior especificidade e menos efeitos colaterais fundamentam o desenvolvimento e aperfeiçoamento de novos protocolos e a padronização de modelos inflamatórios experimentais para compreender melhor essas questões. O objetivo do presente estudo foi avaliar o ágar como agente flogístico em modelo experimental de bolsa de ar em ratos Wistar e a atividade anti-inflamatória e analgésica do ácido 3-benzoil-propiônico (A3BP) e seu potencial efeito toxicológico. Utilizamos o modelo de bolsa de ar, nas doses 1%, 2%, 3% e 4% de ágar e comparamos com 1% de carragenina, um modelo previamente estabelecido. Foi possível determinar a dose mais efetiva de ágar e buscar seu mecanismo de ação. Para isso, foram utilizados fármacos anti-inflamatórios convencionais Celecoxib (200 mg/kg) ou ácido acetilsalicílico (ASA; 100mg/kg) uma hora antes da injeção de ágar. Para obtenção dos resultados, foram feitas análises morfométricas da bolsa de ar, medida da atividade nitrérgica e dos níveis de PGE2, migração celular e contagem diferencial de células leucocitárias no exsudado inflamatório. O ágar 2% foi capaz de promover aumento da microvasculatura na bolsa de ar, dos níveis de NO e PGE2 e do processo de migração celular. A contagem diferenciada de células leucocitárias mostrou prevalência de neutrófilos. Celecoxib e ASA inibiram os efeitos inflamatórios do ágar, reduzindo a área da microvasculatura no tecido, assim como os níveis de nitrito e PGE2 e o número de células inflamatórias no exsudado. Para testar o A3BP como nova droga anti-inflamatória e analgésica, usamos o modelo de bolsa de ar com carragenina 1% em modelo in vitro de cultura de células para testar a genocitotoxicidade. No modelo in vitro, o A3BP apresentou baixo grau de risco genotóxico e baixa citotoxicidade, mostrado pelo ensaio do cometa, e nenhum dano à membrana plasmática pelo teste hemolítico em eritrócitos. No estudo da atividade anti-inflamatória in vivo pelo método de bolsa de ar, foram realizados ensaios de dosagem de nitrito, níveis de PGE2 e migração celular. Para verificar efeitos analgésicos da droga A3BP, foram feitos testes in vivo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético e formalina. Quanto à atividade anti-inflamatória, o A3BP apresentou intensa atividade, demonstrada na redução acentuada da migração celular e níveis de NO, com grande população de neutrófilos e redução dos valores de PGE2 na dose de 0,5mg/kg. Nos estudos da atividade antinociceptiva, o A3BP reduziu o número de contorções abdominais e o tempo de lambida nas fases neurogênica e inflamatória do teste de formalina. Os resultados obtidos com o ágar como agente flogístico em modelo experimental de bolsa de ar demonstraram que o protocolo descrito neste trabalho fornece uma alternativa para estudos que envolvam a inflamação, sendo útil no screening de novas drogas anti-inflamatórias como uma alternativa simples e barata. O presente estudo também avançou substancialmente em relação às propriedades anti-inflamatórias e analgésicas do A3BP, ao fornecer evidências do seu provável mecanismo de ação, por meio da avaliação da atividade antinociceptiva, assim como da atividade anti-inflamatória in vitro e in vivo, em que o A3BP não mostrou efeito genotóxico. Palavras-Chave: inflamação, ágar, analgesia, anti-inflamatórios não esteróides. ABSTRACT AVILA, Paulo Eduardo Santos. Inflammatory processes, new perspectives: study and adaptation of experimental model and study of anti-inflammatory drugs. Thesis (Doctorate in Biotechnology) – Rede Bionorte, Universidade Federal do Pará (UFPA), Belém, 2015. Inflammation is an attempt by the body to remove noxious stimuli and initiate thus a cascade of responses in order to promote healing. There are a variety of inflammatory mechanisms involved in infections, chronic diseases and other tissue damage. Understanding these mechanisms and the search for new anti-inflammatory drugs with greater specificity and fewer side effects, underlying the development and improvement of new protocols and standardization of experimental inflammatory models to understand better these issues.The aim of this study was to evaluate the agar as phlogist on agent in experimental air pouch model in Wistar rats, and evaluate the anti-inflammatory and analgesic activity of 3-benzoyl-propionic acid (A3BP) and its potential toxicological effect. We use the air pouch model at doses 1%, 2%, 3% and 4% of agar, and compared with 1% carrageenan, a previously established model. It was possible to establish the most effective dose of agar and seek its mechanism of action. For this, they were used conventional anti-inflammatory drug Celecoxib (200mg/kg) or Acetylsalicylic acid (ASA; 100mg/kg) 1 hour before injection of the agar. To obtain the results, morphometric analysis of the air pouch were made, measure of the nitrergic activity and PGE 2 levels, cell migration and differential leukocytes cells in the inflammatory exudate.The 2% agar was able to promote increase of the microvasculature in the air pouch, the levels of NO and PGE2, and the cell migration process. The differentiated cells leukocyte count showed a prevalence of neutrophils. Any Celecoxib or ASA inhibit the inflammatory effects of agar, reducing the area of microvasculature in the tissue as well as the nitrite and PGE 2 levels and the number of inflammatory cells in the exudate. To test the A3BP as new anti-inflammatory and analgesic drug, the use carrageenan air pouch model 1% by in vitro model of cell culture to test genocytotoxicity. In the in vitro model the A3BP presented low level of genotoxic and low cytotoxicity risk, shown by comet assay and no damage to the plasma membrane by hemolytic test erythrocytes. In the study of anti-inflammatory activity in vivo by the air pouch method were conducted nitrite dose trials, PGE 2 levels and cell migration. To verify analgesic effects of A3BP drug in vivo tests of abdominal contortions induced by acetic acid and formalin were performed. Regard to the anti-inflammatory activity, A3BP showed intense activity shown in marked reduction of cell migration and levels of NO, with large populations of neutrophils and reduction of PGE2 values at a dose of 0.5mg/kg. In studies of antinociceptive activity, A3BP reduced the number of writhes and the time lick the neurogenic and inflammatory phases of the formalin test.The results of the agar as phlogistic agent in an air pouch experimental model shown that the protocol described in this paper provides an alternative for studies involving inflammation and is useful in screening of new anti-inflammatory drugs such as simple and cheap alternative. This study also advanced substantially with respect to antiinflammatory and analgesic properties of A3BP by providing evidence of their likely mechanism of action, through the evaluation of antinociceptive activity, as well as the anti-inflammatory activity in vitro and in vivo, where the A3BP showed no genotoxic effect. Keywords: inflammation, agar, analgesia, anti-inflammatory steroids LISTA DE FIGURAS Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 15 Figura 16 Figura 17 Figura 18 Figura 19 Figura 20 Figura 21 Primeiras manifestações locais da inflamação aguda comparadas com o tecido normal........................................................................................ Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e suas principais atividades................................................................................................. Estrutura molecular do Ibuprofeno (a), Naproxeno (b), Cetoprofeno (c) e Fenbufeno (d)....................................................................................... Estrutura molecular do ácido 3-benzoil-propiônico.................................. Composição do ágar (Agarose e Agaropectina)...................................... Microvasculatura presente no interior da bolsa de ar.............................. Quantificação da área média da microvasculatura em milímetros (mm2) presente na bolsa de ar na inflamação induzida por ágar....................... Microvasculatura presente no interior da bolsa de ar.............................. Quantificação da área média da microvasculatura em milímetros (mm2) presente na bolsa de ar na inflamação pré-tratada com drogas antiinflamatórias convencionais e induzida por ágar 2%............................... Efeitos do ágar, da carragenina (a) e de drogas anti-inflamatórias convencionais na inflamação induzida por ágar 2%(b) na produção de NO2-.......................................................................................................... Efeitos do ágar, da carragenina (a) e de drogas anti-inflamatórias convencionais na inflamação induzida por ágar 2%(b) na migração celular...................................................................................................... Contagem diferencial de células leucocitárias por ml do exsudato inflamatório induzido por ágar 2%........................................................... Valores de PGE2 na carragenina e em drogas anti-inflamatórias convencionais na inflamação induzida por ágar 2%................................ Classificação visual dos danos, representados em uma escala de 0-4, sugeridos por Collins e col.(1997)........................................................... Viabilidade de células J774 sob tratamento com A3BP durante 24 (a) e 48 (b) horas.............................................................................................. Viabilidade de macrófagos de peritônio após tratamento com A3BP por 3h seguido de incubação com LPS por 24 (a) e 48 (b) horas................. Produção de nitrito em macrófagos peritoneais tratados com A3BP e estimulados com LPS (1 µg/ml)............................................................... Avaliação do índice de dano ao DNA de células MRC-5 (PD19) tratadas com A3BP por 72 h, analisado pelo ensaio de Cometa versão alcalina..................................................................................................... Teste hemolítico com o A3BP em células de eritrócitos de camundongos Mus musculus swiss não mostrando qualquer atividade hemolítica................................................................................................. A3BP inibindo a produção de NO2- na inflamação induzida por carragenina 1%........................................................................................ A3BP inibindo a migração celular na inflamação induzida por carragenina 1%........................................................................................ 17 23 26 28 30 37 38 38 39 40 41 42 42 52 56 57 58 58 59 59 60 Figura 22 A3BP na contagem diferencial de células leucocitárias: neutrófilos (a), linfócitos (b), monócitos (c) e eosinófilos (d) na inflamação induzida por carragenina 1%........................................................................................ Figura 23 A3BP nos valores de PGE2 na inflamação induzida por carragenina 1%............................................................................................................ Figura 24 Efeito do A3BP e da Indometacina sobre o estímulo nociceptivo induzido pela injeção intraperitoneal de ácido acético 0,6% em camundongos.......................................................................................... Figura 25 Efeito do A3BP, da Indometacina e da Morfina sobre o estímulo nociceptivo induzido pela injeção intraplantar de formalina a 1% em camundongos.......................................................................................... 61 62 63 63 LISTA DE ABREVIATURAS µL A3BP AA DNA AINEs AINEs-NO ANOVA RNAm ASA CEPAE CO2 Col. COX COX-1 COX-2 COX-3 cPLA2 D.C DMSO DP EDRF EDTA ELISA EUA I.p. ID IL-1 IL-18 IL-6 iNOS iPLA2 IκB kg LOX LPS LRR LTs mg MIP mM mm2 MTT MyD88 NaCl NaOH NF-kB nm NO NO2NO3NOS NOSe Microlitro Ácido 3-benzoil-propiônico Ácido araquidônico Ácido desoxirribonucleico Anti-inflamatórios não esteroidais Óxido nítrico em anti-inflamatórios não esteroides Análise de Variância Ácido ribonucleico mensageiro Ácido Acetilsalicílico Comitê de Ética em Pesquisa com Animais Experimentais Dióxido de carbono Colaboradores Ciclo-oxigenases Ciclo-oxigenase 1 Ciclo-oxigenase 2 Ciclo-oxigenase 3 Fosfolipase Ca+2 dependente Depois de Cristo Dimetil sulfóxido Desvio padrão Fator de relaxamento derivado do endotélio Ácido etilenodiaminotetracético Enzyme-linked immunosorbent assay Estados Unidos da América Intraperitoneal Índice de dano Interleucina 1 Interleucina 18 Interleucina 6 Óxido nítrico sintase induzida Fosfolipase Ca+2 independente Inhibitor of kappa B Quilograma Lipoxigenase Lipopolissacarídeos Repetições ricas em leucina Leucotrienos Miligrama Medicamentos Isentos de Prescrição Milimolar Milímetros quadrados Sal de tetrazólium Fator de diferenciação mieloide 88 Cloreto de sódio Hidróxido de sódio Fator nuclear kappa B Nanômetros Óxido nítrico Nitrito Nitrato Óxido nítrico sintase Óxido nítrico sintase endotelial NOSi NOSn ºC OD PAMP’s PBS PG PGD2 PGE2 PGF2α PGG2 PGH2 PGHS PGI2 PMNs PRR’s rpm s TIR TIR TLR TNF- TXA2 TXs UFPA V.o. VCAM-1 Óxido nítrico sintase induzida Óxido nítrico sintase neuronal Graus Celsius Densidade óptica Padrões moleculares associados aos patógenos Phosphate buffered saline Prostaglandinas Prostaglandina D2 Prostaglandina E2 Prostaglandina F2α Prostaglandina G2 Prostaglandina H2 Prostaglandinas G/H sintase Prostaciclinas Polimorfonucleares Receptores de reconhecimento padrão Rotações por minuto Segundos Família de receptores Toll-IL1 Família de receptores Toll-IL1 Receptores toll like Fator de Necrose Tumoral Tromboxano A2 Tromboxanos Universidade Federal do Pará Via oral Molécula de adesão celular vascular 1 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO............................................................................................................... 15 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA......................................................................................... 17 2.1 INFLAMAÇÃO............................................................................................................. 2.1.1O sistema imune e o processo inflamatório........................................................ 2.1.1.1 Migração Celular................................................................................................... 2.1.2 Mediadores do processo inflamatório................................................................. 2.1.2.1 Derivados do Ácido Araquidônico (AA)................................................................. 2.1.2.2 Óxido Nítrico (NO).................................................................................................. 2.2 DOR............................................................................................................................. 2.3 FÁRMACOS ANTI-INFLAMATÓRIOS......................................................................... 2.4 ÁCIDO 3-BENZOIL-PROPIÔNICO (A3BP)................................................................. 2.5 ÁGAR........................................................................................................................... 2.5.1 Estrutura Química do Ágar.................................................................................... 3 JUSTIFICATIVA............................................................................................................. 17 18 20 20 20 22 23 24 26 28 29 31 CAPÍTULO I – ALTERAÇÕES VASCULARES E INFLAMAÇÃO AGUDA INDUZIDA POR ÁGAR EM MODELO DE BOLSA DE AR................................................................ 1 OBJETIVOS................................................................................................................... 1.1 OBJETIVO GERAL..................................................................................................... 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS....................................................................................... 2 MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................................. 2.1 ASPECTOS ÉTICOS................................................................................................... 2.2 REAGENTES............................................................................................................... 2.3 ANIMAIS...................................................................................................................... 2.4 PREPARAÇÃO DA BOLSA DE AR E INDUÇÃO DO PROCESSO INFLAMATÓRIO 2.5 COLETA DAS AMOSTRAS......................................................................................... 2.6 ANÁLISE MORFOMÉTRICA....................................................................................... 2.7 DOSAGEM DE NITRITO............................................................................................. 2.8 CÉLULAS DO EXSUDATO INFLAMATÓRIO.............................................................. 2.9 UTILIZAÇÃO DE FÁRMACOS ANTI-INFLAMATÓRIOS PADRÕES.......................... 2.10 NÍVEIS DE PGE2........................................................................................................ 2.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................................ 3 RESULTADOS............................................................................................................... 3.1 MICROVASCULATURA NA INFLAMAÇÃO INDUZIDA POR ÁGAR E EM INTERVENÇÕES FARMACOLÓGICAS COM ANTI-INFLAMATÓRIOS CONVENCIONAIS............................................................................................................. 3.2 CONCENTRAÇÃO DE NITRITO NA INFLAMAÇÃO INDUZIDA POR ÁGAR E EM INTERVENÇÕES FARMACOLÓGICAS COM ANTI-INFLAMATÓRIOS CONVENCIONAIS............................................................................................................. 3.3 MIGRAÇÃO CELULAR NA INFLAMAÇÃO INDUZIDA POR ÁGAR E EM INTERVENÇÕES FARMACOLÓGICAS COM ANTI-INFLAMATÓRIOS CONVENCIONAIS............................................................................................................. 32 33 33 33 34 34 34 34 34 34 35 35 35 36 36 36 37 37 39 40 3.4 CONTAGEM DIFERENCIAL DE CÉLULAS LEUCÓCITÁRIAS NA INFLAMAÇÃO INDUZIDA POR ÁGAR...................................................................................................... 3.5 VALORES DE PGE2 EM INTERVENÇÕES FARMACOLÓGICAS COM ANTIINFLAMATÓRIOS CONVENCIONAIS NA INFLAMAÇÃO INDUZIDA POR ÁGAR.......... 4 DISCUSSÃO................................................................................................................... 5 CONCLUSÃO................................................................................................................. CAPÍTULO II – ESTUDO DAS PROPRIEDADES ANTI-INFLAMATÓRIAS E ANALGÉSICAS DO ÁCIDO 3-BENZOIL-PROPIÔNICO................................................. 1 OBJETIVOS.................................................................................................................... 1.1 OBJETIVO GERAL...................................................................................................... 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................................ 2 MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................................. 2.1 ASPECTOS ÉTICOS................................................................................................... 2.2 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA IN VITRO....................................... 2.2.1 Reagentes................................................................................................................ 2.2.2 Animais.................................................................................................................... 2.2.3 Cultivo celular da linhagem J774.......................................................................... 2.2.4 Cultivo celular de macrófagos peritoneais.......................................................... 2.2.5 Tratamento celular de macrófagos peritoneais................................................... 2.2.6 Viabilidade celular pelo método do MTT.............................................................. 2.2.7 Dosagem de nitrito.................................................................................................. 2.2.8 Dano ao DNA pelo ensaio cometa......................................................................... 2.2.9 Dano à membrana plasmática – teste hemolítico em eritrócitos....................... 2.3 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA IN VIVO......................................... 2.3.1 Reagentes................................................................................................................ 2.3.2 Animais.................................................................................................................... 2.3.3 Preparação da bolsa de ar e indução do processo inflamatório....................... 2.3.4 Coleta das amostras............................................................................................... 2.3.5 Dosagem de nitrito.................................................................................................. 2.3.6 Células do exsudato inflamatório.......................................................................... 2.3.7 Níveis de PGE2......................................................................................................... 2.4 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA.......................................................... 2.4.1 Reagentes................................................................................................................ 2.4.2 Animais.................................................................................................................... 2.4.3 Testes de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético...................... 2.4.4 Teste da formalina.................................................................................................. 2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA.............................................................................................. 3 RESULTADOS............................................................................................................... 3.1 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA IN VITRO....................................... 3.1.1 Viabilidade celular pelo método do MTT.............................................................. 3.1.1.1 Genotoxicidade em linhagem de J774-A1............................................................. 3.1.1.2 Genotoxicidade em macrófagos peritoniais........................................................... 3.1.2 Concentração de nitrito........................................................................................... 3.1.3 Dano ao DNA pelo ensaio cometa.......................................................................... 3.1.4 Dano à membrana plasmática – teste hemolítico em eritrócitos......................... 3.2 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA IN VIVO......................................... 3.2.1 Concentração de nitrito.......................................................................................... 3.2.2 Migração celular...................................................................................................... 3.2.3 Contagem diferencial de células leucocitárias.................................................... 41 42 43 46 47 48 48 48 49 49 49 49 49 49 50 50 50 50 51 52 53 53 53 53 53 54 54 54 54 54 54 54 55 55 56 56 56 56 57 57 58 58 59 59 60 60 3.2.4 Valores de PGE2...................................................................................................... 3.3 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA.......................................................... 3.3.1 Atividade analgésica periférica............................................................................. 3.3.2 Teste de Formalina................................................................................................. 4 DISCUSSÃO.................................................................................................................. 5 CONCLUSÃO................................................................................................................. 62 62 62 63 64 69 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................. APÊNDICES...................................................................................................................... APÊNDICE 1 – CARTA DE ACEITE DE ORIENTAÇÃO.................................................. APÊNDICE 2 – CARTA DE ACEITE DE CO-ORIENTAÇÃO........................................... ANEXOS............................................................................................................................ ANEXO A – PARECER CEPAE 111-13............................................................................ ANEXO B – PARECER CEPAE 228-14............................................................................ 70 81 82 83 84 85 86 15 1 INTRODUÇÃO Clinicamente, a inflamação é caracterizada por apresentar cinco sinais cardinais: eritema, edema, calor, dor e perda da função (HEIDLAND e col., 2006). Porém, esse processo pode ser definido como uma cascata inflamatória, pela qual ocorre a ativação de mediadores e células que tem como objetivo o reparo do tecido lesado (SUZUKI e col., 2003; SCHMIDSCHÖNBEIN, 2006). O processo inflamatório é relacionado a diversas patologias, o que torna importante a realização de pesquisas mais avançadas acerca da relação dessa condição com um tratamento eficaz. Ocorre como resposta do tecido à injúria celular e se caracteriza por um fenômeno complexo e dinâmico desencadeado por diferentes estímulos. Envolve uma complexa cascata de eventos bioquímicos e celulares, que incluem: extravasamento de fluídos, ativação enzimática, migração celular, liberação de mediadores, sensibilização e ativação de receptores (AMARAL e col., 2016). No estudo da inflamação, diversos modelos animais são utilizados para avaliar a eficácia de novos fármacos para o tratamento de doenças inflamatórias (SUE e col., 2016). Isto se deve ao fato de que, apesar da maioria das reações inflamatórias apresentarem características comuns, a etiologia e as manifestações clínicas diferem significativamente, necessitando, portanto, de modelos específicos que reproduzam as características básicas. Neste trabalho, a carragenina, agente flogístico amplamente utilizado em diferentes modelos experimentais, entre eles, no modelo de bolsa de ar (air pouch) em ratos, foi substituída pelo ágar. Deve-se ressaltar que o modelo de bolsa de ar descrito por Selye (1953) e adaptado por Ghosh e col. (2000) já é largamente utilizado. O ágar, assim como a carragenina, é um hidrocoloide extraído de algas vermelhas, do filo das carragenas, o filo rodhophyta (SORIANO, 2001), largamente utilizado na indústria alimentícia, farmacêutica e cosmética; é proveniente da família das gomas e pectinas, de origem puramente vegetal. Em 2007, Okoli e col. utilizaram o ágar como agente flogístico no modelo de indução de edema de pata, com o intuito de avaliar a sua ação edematogênica, pela primeira vez, entretanto, nunca foi usado em outro modelo de inflamação. O uso de substâncias químicas para amenizar e controlar os diversos mecanismos inflamatórios envolvidos em infecções, doenças crônicas e outras lesões teciduais é uma necessidade para assegurar melhor bem estar aos pacientes. Esses mecanismos e a busca de novas drogas anti-inflamatórias e analgésicas com maior especificidade e menos efeitos colaterais justificam o desenvolvimento de novos protocolos e a padronização de modelos inflamatórios experimentais que compreendam melhor essas questões (KENNETH; HAJIME, 2008). 16 Os processos de dor e inflamação são combatidos constantemente, tendo como medicamento mais prescrito para esse fim os anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), cuja ação é dupla: em primeiro lugar, interferem no sistema das prostaglandinas; em segundo lugar, a maioria desses fármacos reduz a inflamação, o edema e a irritação que está em torno da ferida e que aumenta a dor devido à elevação de pressão no local (ESPINOSA e col., 2014). O mercado global de analgésicos e anti-inflamatórios cresceu de US$ 20.520 bilhões em 2006 para 26.150 em 2010 (DEZEM, 2011). Nos Estados Unidos da América (EUA), 70% dos indivíduos acima de 65 anos fazem uso de anti-inflamatórios pelo menos uma vez por semana e, pelo menos 34%, diariamente (LAINE, 2003; INOTAI; HANKO; MESZAROS, 2010). Em 2012, foram vendidos cerca de 2,5 milhões de caixas de medicamentos antiinflamatórios no Brasil. Aumento de 25% em relação a 2010 (SINDUSFARMA in KONDO, 2015). Sua comercialização atinge um montante de cerca de 73 milhões de prescrições anuais em todo o mundo (HAHN, 2006). Os AINEs, devido a diferenças nas estruturas químicas, são subdivididos em grupos, entre eles, encontram-se os derivados do ácido 2-aril-propiônico, que constituem um grupo importante de AINEs (COSTA e col., 2006), fazendo parte dele o ácido 3-benzoil-propiônico (A3BP), objeto de estudo desta pesquisa na busca por novos fármacos. 17 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 INFLAMAÇÃO A inflamação é uma das mais antigas doenças registradas; o escritor romano Aulus Cornelius Celsus, século I D.C., foi o primeiro a descrever os quatro sinais cardinais da inflamação: rubor, calor, edema e dor. Posteriormente, Galeno descreveu o quinto sinal clínico: a perda de função (KENNETH; HAJIME, 2008; KENNETH e col., 2010). A maioria dos sinais e sintomas da inflamação é causada por alterações na vascularidade local do tecido afetado. O rubor e o calor são resultantes do aumento do fluxo sanguíneo local; o primeiro, também chamado de eritema, é produzido por uma intensa dilatação arteriolar, em que, nesse processo, contribuem decisivamente dois mediadores vasodilatadores: a prostaglandina E2 (PGE2) e as prostaciclinas (PGI2) (DHALL e col., 2015). Com isso, o músculo liso das arteríolas relaxa, levando à vasodilatação e ao aumento da pressão hidrostática através do leito vascular que, junto com as mudanças na permeabilidade da barreira endotelial vascular, ocasiona o extravasamento de fluidos ricos em proteínas dentro do tecido, causando assim o edema (FIGURA 1). Figura 1: Primeiras manifestações locais da inflamação aguda comparadas ao o tecido normal. (1) vasodilatação dos vasos sanguíneos locais, com consequente excesso de fluxo sanguíneo local (causando eritema e calor). (2) Aumento da permeabilidade dos capilares, com extravasamento de plasma e proteínas para os espaços intersticiais (edema). (3) Migração de grande número de granulócitos e monócitos para o tecido. Fonte: KUMAR; ABBAS; FAUSTO; MITCHELL, 2005 (adaptado). Já as células endoteliais das vênulas expressam moléculas de adesão, como integrinas e selectinas, que permitem que os neutrófilos e, posteriormente, os monócitos 18 possam aderir e migrar para o espaço entre as células endoteliais no tecido (KENNETH e col., 2010; PARKIN; COHEN, 2001). Na dor, os metabólitos do AA liberados no processo inflamatório têm um efeito hipersensibilizante nos receptores álgicos com consequente ativação e sensibilização de fibras nervosas aferentes primárias. Caso não haja resolução do processo, pode ocorrer a formação de um quinto sinal: a perda da função do órgão (LAWRENCE; WILLOUGHBY; GILROY, 2002; SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). No início da inflamação, o AA é metabolizado por meio de ciclo-oxigenases (COX), para a produção de prostaglandinas (PGs) e tromboxanos (TXs), ou por lipoxigenases, para gerar leucotrienos (LTs). Esses eicosanoides induzem e ajudam a estabelecer o infiltrado inflamatório. No entanto, em algum momento, durante a cascata inflamatória, ocorre a inibição e, finalmente, a resolução da resposta inflamatória; caso contrário, a inflamação pode persistir, caracterizando a inflamação crônica (HAWORTH; BUCKLEY, 2007). A inflamação pode ser dividida em duas fases com eventos distintos; durante a fase aguda, há um aumento do fluxo sanguíneo e da permeabilidade vascular com o acúmulo de fluídos, leucócitos e mediadores inflamatórios, como as citocinas. A fase crônica é caracterizada pelo desenvolvimento de uma resposta imune celular e humoral específica aos agentes agressores (DHALL e col., 2015). 2.1.1 O sistema imune e o processo inflamatório Os seres humanos estão continuamente expostos a organismos que são inalados, ingeridos ou que habitam nossa pele e membranas mucosas. Se esses organismos penetram e causam doenças, isso é resultado de dois fatores: a patogenicidade do organismo e a integridade dos mecanismos de defesa do hospedeiro. O sistema imunológico é uma rede interativa de órgãos linfoides, células, fatores humorais e citocinas. A principal função do sistema imunológico é defender o organismo do hospedeiro (PARKIN; COHEN, 2001). A imunidade é dividida em dois tipos: a inata e a adaptativa, determinadas pela velocidade e especificidade da reação gerada. A imunidade inata inclui as barreiras físico-químicas (pele e membranas mucosas) e elementos do sistema imune (neutrófilos, monócitos, macrófagos, sistema complemento, citocinas e proteínas da fase aguda) que providenciam a imediata defesa do hospedeiro (PARKIN; COHEN, 2001). Segundo o mesmo autor, a imunidade adaptativa, portanto, é a defesa mais desenvolvida dos organismos. Essa resposta consiste em reações antígeno-específico através de linfócitos T e B. Ainda para o autor acima, ao considerar que a resposta imune inata é rápida, apesar de algumas vezes causar danos à célula do hospedeiro, a resposta imune adaptativa é precisa; contudo, essa resposta pode demorar a se desenvolver, quando em contato pela 19 primeira vez com o patógeno (antígeno), mas, em um segundo contato, ocorre uma resposta rápida e vigorosa devido às células de memória da imunidade adaptativa. O sistema imune inato é a primeira linha de defesa do organismo contra patógenos microbianos, como células Gram-Positivas e Gram-Negativas, fungos e vírus. Em outras circunstâncias, essa resposta de defesa pode ser desencadeada inapropriadamente devido a outros tipos de lesões, como as causadas por substâncias químicas, luz ultravioleta ou calor, substâncias estranhas inócuas (como o pólen, por exemplo) ou contra os próprios tecidos do corpo (doenças autoimunes) (HUHTA e col., 2016). Macrófagos e células dendríticas envolvidas na resposta imune inata são estimuladas por receptores de reconhecimento padrão (PRR’s) presentes em sua superfície. Os PRR’s reconhecem padrões moleculares associados aos patógenos (PAMP’s). Os PAMP’s são componentes altamente conservados, comuns a classes inteiras de patógenos (vírus, fungos e bactérias), tais como: lipopolissacarídeos (LPS), peptideoglicanos, zymosan, flagelos de bactérias, entre outros (ALBERT e col., 2004). Os PRR’s interagem com anticorpos naturais (opsoninas, por exemplo) para promover o reconhecimento dos micro-organismos e fagocitose. A segunda categoria de PRR’s consiste de receptores internos, como o receptor de manose, presente em macrófagos, que se liga aos receptores de manose comumente presente em micro-organismos e receptores scavengers, os quais reconhecem polímeros aniônicos ou lipoproteínas acetiladas de baixa densidade encontradas na superfície de bactérias danificadas (FALGARONE; JAEN; BOISSIER, 2005). Para o autor acima, a terceira categoria de PRR’s é a família de receptores Toll Like (TLR), que contribui para a transdução do sinal. Esses receptores são glicoproteínas integrais e estão ancorados na membrana celular, caracterizados por um domínio extracelular rico em repetições de leucina (LRR). Seu domínio intracelular compartilha homologia com o receptor para interleucina-1 (IL-1) e constitui a família de receptores Toll-IL1 (TIR). TLR’s e receptores de IL-1 e interleucina-18 (IL-18) ativam o fator de diferenciação mieloide 88 (MyD88), uma quinase que ativa a transdução do sinal intracelular. Após a ativação dos TLR’s pelos PAMP’s, ocorre a estimulação das células dendríticas ou dos macrófagos para que haja resposta imediata; vias de sinalização intracelulares ativam a produção de enzimas, como a ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e a óxido nítrico sintase induzida (iNOS), as quais atuarão na indução da inflamação, além de citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral- (TNF-) e a IL-1, e outros mediadores (prostaglandinas e histamina) que atuam sobre as células endoteliais, provocando a expressão de moléculas de adesão e um aumento da permeabilidade vascular. Isto permite a exsudação de líquido para o espaço extravascular, o qual contém componentes das cascatas de enzimas, que levam à produção de mais mediadores inflamatórios (HUHTA e col., 2016). O sistema imune inato produz mediadores que têm como uma de suas funções o recrutamento de células que pertencem à resposta imune adquirida, subdividida em 20 imunidade celular e humoral. A imunidade celular caracteriza-se pela produção de células especializadas (linfócitos T); já a humoral, principalmente pela produção de imunoglobulinas ou anticorpos, proteínas especializadas na ação específica contra determinados antígenos. As células desse tipo de resposta estão presentes no sangue e na linfa como células circulantes (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI,2008). 2.1.1.1 Migração Celular A inflamação é um processo caracterizado pela migração de leucócitos do sangue para o órgão ou tecido afetado pelo trauma, infecção ou reação autoimune. Os leucócitos aderem às células endoteliais por meio de interações entre suas integrinas de superfície celular e as moléculas de adesão das células endoteliais (GAFVELIN e col., 2016). Durante a inflamação, mediadores quimiotáticos são liberados, além de citocinas, como a IL-1 e o TNF-, e substâncias autacoides, como a histamina, bradicinina e outras pequenas moléculas. O TNF- e IL-1 agem localmente alterando o espaço entre as células do endotélio, para que, posteriormente, ocorra o movimento dos leucócitos para fora do vaso, denominado diapedese (HUHTA e col., 2016). Para o autor acima, os autacoides causam vasodilatação local, aumento do volume de sangue no local da inflamação, mas, simultaneamente, diminuem a velocidade do fluxo dentro dos microvasos, especialmente nas vênulas pós-capilares. Os neutrófilos são os primeiros leucócitos sanguíneos a alcançar a área da inflamação. Primeiramente, rolam ao longo do endotélio ativado, então, aderem e migram para fora do vaso sanguíneo em direção ao espaço extravascular. Eles são atraídos para o patógeno invasor através de substâncias químicas denominadas quimiotaxinas e são capazes de englobar, matar e digerir micro-organismos (DALE, 2016). 2.1.2 Mediadores do processo inflamatório 2.1.2.1 Derivados do Ácido Araquidônico (AA) O AA (ácido 5, 8, 11, 14-eicosatetraenóico) é um graxo poli-insaturado de vinte átomos de carbono, cuja cadeia possui quatro ligações duplas. É encontrado na membrana plasmática, sendo um componente de grande importância para a fluidez desta. As duplas ligações desse fosfolipídio são sítios comuns de atuação de radicais livres, de enzimas, como a ciclo-oxigenase (COX) e lipoxigenase (LOX), e do citocromo P450 (BRASH, 2001). Em condições fisiológicas, uma fosfolipase Ca +2 independente (iPLA2) é a principal enzima relacionada à liberação de AA, porém, sua função é a de remodelagem da membrana celular e manutenção do equilíbrio homeostático do organismo, e não a de induzir a síntese de prostanoides. As moléculas de AA são reincorporadas, todavia, quando ocorre aumento de Ca+2 intracelular, uma fosfolipase Ca+2 - dependente é ativada (cPLA2), atuando na posição 21 sn-2 do glicerol, liberando o AA, alterando o equilíbrio de liberação-captação, o que deixa o AA livre para ser metabolizado (FITZPATRICK; SOBERMAN, 2001). O AA é alvo de metabolismo de enzimas prostaglandinas (PG) G/H sintases (PGHS), também conhecidas como ciclo-oxigenases (COX), lipoxigenases e epoxigenases, para a formação de produtos biologicamente ativos. As enzimas COX são proteínas bifuncionais, pois possuem atividade ciclo-oxigenase e hidroperoxidase, catalisando a transformação do AA nas PG endoperóxidos, intermediários Prostaglandina G2 (PGG2) e Prostaglandina H2 (PGH2). Estes sofrem ação de isomerases e sintases, tendo como produtos finais PGs e tromboxano A2 (TXA2). Todos esses produtos agirão via receptores ligados à proteína G (GROSSER; FRIES; FITZGERALD, 2006). Existem três subtipos de COX: ciclo-oxigenase-1 (COX-1), ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e ciclo-oxigenase-3 (COX-3). A COX-1 é constitutivamente expressa em órgãos e tecidos e age formando mediadores que atuarão em diversas funções homeostásicas, como a proteção do trato gastrintestinal, influenciando no fluxo renal e na agregação plaquetária (WARNER; MITCHEL, 2004). A COX-2 é expressa em resposta a estímulos inflamatórios, estímulos fisiológicos e fatores de crescimento, estando envolvida na síntese de prostaglandinas que medeiam a dor e atuam no processo inflamatório. São expressas por macrófagos, sinoviócitos e células endoteliais (DANNHARDT; KIEFER, 2001). A COX-3 tem origem no Ácido ribonucleico mensageiro (ARNm) da COX-1, que manteria o íntron 1. A diferença no número de aminoácidos é de 30-34, dependendo da espécie estudada (mamíferos), ou seja, é uma isoforma da COX-1 e também é uma enzima constitutiva. Os primeiros estudos mostraram que tal enzima é sensível a fármacos analgésicos e antipiréticos, como o Acetoaminofen, Fenacetina e Dipirona, e essa sensibilidade explicaria o efeito de fármacos não esteroides na dor e na febre (WARNER; MITCHEL, 2004). Em relação aos produtos da COX, ambas formas atuam formando PGG 2 (uma vez que haja AA disponíveis), que é reduzido ao endoperóxido instável PGH 2. Este é substrato para outras enzimas que são responsáveis pela produção das cinco principais prostaglandinas bioativas: Prostaglandina E2 (PGE2), Prostaglandina F2α (PGF2α), Prostaglandina D2 (PGD2), PGI2 e TXA2 (HATA; BREYER, 2004). Estas atuam em seus receptores específicos na membrana plasmática da célula alvo: DP para PGD 2, EP para PGE2, FP para PGF2α, IP para PGI2 e TP para TXA 2 (WARNER; MITCHEL, 2004). As prostaglandinas são potentes mediadores inflamatórios, podendo induzir febre, aumentar a sensibilidade à dor e estimular numerosas funções celulares (VILLAREAL; ZAGORSKI; WAHL, 2001). 22 2.1.2.2 Óxido Nítrico (NO) Em 1980, Furchgott descobriu um fator liberado das células endoteliais que causava vasodilatação e que anteriormente era denominado fator de relaxamento derivado do endotélio (EDRF) (PALMER; FERRIGE; MONCADA, 1987). Tratava-se do óxido nítrico (NO), um gás solúvel, produzido não apenas por células endoteliais, mas também por macrófagos e neurônios específicos no cérebro, atuando de maneira parácrina sobre células-alvo. Ele é constituído pela clivagem do aminoácido essencial L-arginina, formando NO e L-citrulina (MONCADA; PALMER; HIGGS, 1991). O NO é um gás simples e instável com meia vida de poucos segundos (IGNARRO, 1990). O NO está envolvido nos processos fisiológicos de vasodilatação, neurotransmissão e inflamação. É gerado pela atividade da enzima óxido nítrico sintase (NOS), que pode ser encontrada em três isoformas, uma induzida e duas constitutivas (BREDT; SNYDER, 1994). Segundo os mesmos autores, a óxido nítrico sintase endotelial (NOSe) é dependente de cálcio e é expressa constitutivamente por células endoteliais e não endoteliais; a óxido nítrico sintase neuronal (NOSn) também é expressa constitutivamente e é predominantemente encontrada em tecido neural; a óxido nítrico sintase induzida (NOSi) é induzida por lipopolissacarídeo de bactéria ou citocinas, como por exemplo, fator de necrose tumoral (TNF). É proposta uma diversidade de atividades biológicas para esse gás e bem estabilizado o papel do NO no endotélio vascular que medeia o relaxamento da musculatura vascular pelo aumento da formação de monofosfato de guanilato ciclase. No cérebro este atua como neurotransmissor, mediando a ativação de glutamato (MONCADA; PALMER; HIGGS, 1991). Em processo inflamatório, o NO modula reação inflamatória aguda e crônica e outros processos do sistema imunológico (GOODWIN; LANDINO; MARNETT, 1999), como por exemplo, a sua atividade antimicrobiana e citotóxica, quando liberado por macrófagos (LASKIN, 2001). Nas reações biológicas, a enzima NOS tende sempre a produzir complexos químicos mais estáveis, como a formação de peróxido nítrico, grupos tióis em proteínas e a nitração de resíduos de tirosina em proteínas, com o intuito de diminuir a toxidade dentro da célula (BREDT; SNYDER, 1994). Os produtos finais da formação do NO in vivo são o nitrito (NO2-) e o nitrato (NO3). A proporção de NO2 é encontrada no meio reacional em quantidade suficiente para ratificar a presença de NO (MARLETTA, 1993). A formação de espécies reativa de nitrogênio é importante na determinação das atividades anti-inflamatórias e inflamatórias do óxido nítrico (SAUTEBIN, 2000). O NO e seus derivados, nitrito e peroxinitrito, são importantes agentes próinflamatórios, também úteis como índices de avaliação da inflamação e para o acompanhamento da resposta terapêutica às drogas anti-inflamatórias. Durante o processo 23 inflamatório, as células fagocíticas (neutrófilos e macrófagos) secretam substâncias oxidantes, radicais livres e compostos eletrofílicos, gerados por enzimas NOSi produzidas por macrófagos, como é mostrado na Figura 2 (DEDON; TANNENBAUM, 2004). Figura 2: Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e suas principais atividades. Fonte: DEDON; TANNENBAUM, 2004 (adaptado). 2.2 DOR A dor é uma sensação de experiência desagradável que acontece quando o tecido é lesionado. Desse modo, tal sensação protege o corpo de uma possível ameaça ou lesão. A transdução do estímulo doloroso ocorre nas terminações nervosas das fibras C não mielinizadas e nas fibras Aδ mielinizadas. A maioria dos nociceptores responde a estímulos mecânicos, térmicos e químicos, razão pela qual são chamados de nociceptores polimodais (YUNJONG e col., 2005). O estímulo nóxico pode apresentar uma intensidade suficiente para causar lesão tecidual associada à liberação de numerosos mediadores inflamatórios. Alguns desses mediadores estimulam diretamente nociceptores periféricos. Recentes avanços na pesquisa com canais iônicos em neurônios sensoriais revelaram mecanismos moleculares essenciais para a transmissão de vários tipos de sinais neurais, os quais são conduzidos do encéfalo para o local de percepção da dor (JULIUS; BASBAUM, 2001). Vários mediadores químicos conhecidos presentes no local lesado podem estimular os nociceptores e, portanto, promover a dor. Dentre os mediadores inflamatórios incluídos neste grupo estão a histamina (que também causa prurido) e a bradicinina (DAVIDSON e col., 2014). A bradicinina estimula atividade enzimática da fosfolipase A 2 ligada à membrana que, por sua vez, provoca a desesterificação da membrana, levando à liberação do AA livre (ácido ecosatetraenoico) e à biossíntese subsequente de prostaglandinas (por exemplo, PGE 2 e 24 PGI2) pela COX. As prostaglandinas são potentes vasodilatadoras e importantes mediadores na dor inflamatória (DAVIDSON e col., 2014). A dor é desencadeada pela ativação de nociceptores específicos (dor nociceptiva). Entretanto, ela pode ser resultante de lesão de fibras sensoriais ou de dano ocasionado no sistema nervoso central (CHAHINE; O'LEARY, 2014). Pode ser subdividida em aguda e crônica; a primeira é de curta duração, geralmente persistente apenas no período de duração do dano tecidual e representa uma reação fisiológica natural do organismo; a crônica é evidente quando cessa a função dos mecanismos normais de cicatrização e, em doenças como artrite reumatoide, pode persistir por semanas, meses ou até mesmo anos (ALMANSA; VELA, 2014). A dor pode resultar de vários fatores, como aumento da pressão, devido ao edema, sobre tecidos e terminações nervosas; de lesão das fibras nervosas; da irritação tóxica produzida por micro-organismos ou extravasamento de substâncias intracelulares de células lesadas e também por cininas que afetam terminações nervosas. As prostaglandinas intensificam a dor associada à inflamação (DAVIDSON e col., 2014). A dor não é uma entidade isolada, difere essencialmente nas causas, que variam de acordo com sintomas e mecanismos neurobiológicos. Em curso de escala, três formas de dor podem ser distinguidas (ZEILHOFER, 2007). A dor nociceptiva originada da ativação de neurônios nociceptivos primários, os quais têm função fisiológica importante, como a proteção da lesão tecidual. A de origem inflamatória origina todas as formas de inflamação. Finalmente, a neuropática proveniente de uma lesão tecidual de origem periférica ou de nervos e neurônios centrais; é acompanhada por dor espontânea intensa e dor provocada por leve estímulo. A inflamatória e a neuropática podem exceder a duração da causa primária da dor. Elas podem se tornar síndromes de dor crônica (ZEILHOFER, 2007). A dor é combatida constantemente, tendo como medicamento mais prescrito para este fim os AINEs. A ação deles é dupla: em primeiro lugar, interfere no sistema das prostaglandinas, um grupo de substâncias que interagem e são em parte responsáveis pela sensação dolorosa. Em segundo lugar, a maioria desses fármacos reduz a inflamação, o edema e a irritação, que muitas vezes rodeiam uma ferida e aumentam a dor (ESPINOSA e col., 2014). 2.3 FÁRMACOS ANTI-INFLAMATÓRIOS O uso de substâncias químicas para amenizar a dor e a inflamação é uma das necessidades mais antigas da humanidade. Desde o isolamento da salicilina e a demonstração dos seus efeitos antipiréticos em 1829 por Leraux, um longo caminho de pesquisa sobre o processo inflamatório vem sendo trilhado (OLIVEIRA JR. e col., 2007; SOLOMON, 2007; CHAHDE; GIORGI; SZAJUBOK, 2008). 25 Segundo os autores acima, o salicilato de sódio foi usado para tratar a febre reumática como agente antipirético e no tratamento da gota em 1875. O enorme sucesso do fármaco levou à produção do ácido acetilsalicílico; em 1899, este foi introduzido por Dresser com o nome de Aspirina®. Porém, devido à toxicidade gastrointestinal causada pelo ácido acetilsalicílico, procurou-se sintetizar outras substâncias com menores efeitos adversos e, assim, desenvolveu-se o primeiro anti-inflamatório não salicilato, a fenilbutazona, no início de 1950 (CHAHADE; GIORGI; SZAJUBOK, 2008). Diversos fármacos, divididos em dois grandes grupos, têm sido utilizados como potenciais agentes anti-inflamatórios, os esteroidais e os não esteroidais. O principal mecanismo de ação dos esteroidais acontece pelo antagonismo de fatores de transcrição nucleares que consequentemente inibem a expressão da fosfolipase A 2, enzima necessária para liberação de AA, inibindo assim a formação de prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos (VANE; BOTTING, 1987). Os AINEs integram um grupo heterogêneo de compostos, que consiste de um ou mais anéis aromáticos ligados a um grupamento ácido funcional. São ácidos orgânicos fracos que atuam principalmente nos tecidos inflamados e se ligam, significativamente, à albumina plasmática, sendo convertidos em metabólitos inativos pelo fígado e, predominantemente, excretados pela urina (KLIPPEL; WEYAND; WORTAMANN, 2001). Esses medicamentos são largamente usados para combater a febre e a dor aguda ou crônica. São as medicações mais vendidas em todo o mundo e, em conjunto com os analgésicos e antitérmicos, correspondem a aproximadamente 30% dos medicamentos utilizados (HILÁRIO; TERRERI; LEN, 2006). Os AINEs apresentam basicamente três tipos de efeitos: anti-inflamatório (modificação da reação inflamatória), analgésico (redução da dor do tipo inflamatória) e antipirético (redução da temperatura elevada) (WANNMACHER; PASSOS, 2010). Seus efeitos devem-se principalmente a sua capacidade de inibir a produção de prostaglandinas através da inibição da enzima fosfolipase A2 envolvida na síntese destes compostos, a síntese dos endoperóxidos das prostaglandinas, também conhecida como ciclooxigenase (CARVALHO; CARVALHO; RIOS-SANTOS, 2004; AMARAL e col., 2016). O principal mecanismo de ação dos AINEs ocorre por meio da inibição específica da COX e consequente redução da conversão do AA em prostaglandinas. Reações mediadas pelas COX, a partir do AA, produzem PGG2 que, sob ação da peroxidase, forma PGH2, sendo então convertidas a prostaglandinas, prostaciclinas e tromboxanos (OLIVEIRA JR. e col., 2007). Os prostanoides PGE2, PGI2, PGD2, PGF2α e o tromboxano A2 constituem os produtos mais importantes da via da COX. Ao inibirem a enzima ciclo-oxigenase e a produção de prostaglandinas, os AINEs não inibem a via das lipoxigenases e, portanto, não suprimem a 26 produção de leucotrienos. Com exceção do ácido acetilsalicílico, os AINEs atuam como inibidores competitivos reversíveis da atividade da ciclo-oxigenase (CARVALHO; CARVALHO; RIOS-SANTOS, 2004; AMARAL e col., 2016). 2.4 ÁCIDO 3-BENZOIL-PROPIÔNICO (A3BP) O A3BP, também conhecido como ácido 4-Oxo-4-fenil-butírico, é um derivado do ácido 2-aril-propiônico. Os AINEs derivados desse ácido representam um grupo de fármacos que apresentam vantagens em relação à aspirina®, à indometacina e aos derivados pirazólicos, pois são de um modo geral, melhor tolerados (VANE, 1971; IGARZA; SORACI, 2007). Modificações geradas nas interações dos derivados do ácido 2-aril-propiônico visam elevar a seletividade e ampliar também a potência por meio do aumento de suas interações. A exploração dos métodos de planejamento e desenvolvimento racional dessa classe de fármacos produziu conjuntos de derivados analgésicos e anti-inflamatórios por meio da variação estrutural, da associação molecular e do isomerismo, apresentam potente e significativa atividade, bem como elevada segurança, comparados às diversas drogas padrões (KAMEO e col., 1988). Dentro desse subgrupo, podemos distinguir primeiro o Ibuprofeno (a), o primeiro de uma série em que hoje se encontram o Naproxeno (b), o Cetoprofeno (c) e o Fenbufeno (d), o Flurbiprofeno, entre outros (LEVOIN e col., 2004) (FIGURA 3). a) b) c) d) Figura 3: Estrutura molecular do Ibuprofeno (a), Naproxeno (b), Cetoprofeno (c) e Fenbufeno (d). Fonte: http://www.sigmaaldrich.com/brazil.html 27 O Ibuprofeno é um derivado do ácido 2-aril-propiônico, ácido iso-butil-propinóicofenólico. Apresenta meia-vida de somente 2,2 horas e se liga fortemente a proteínas plasmáticas (90%-99%) (RAINSFORD, 2009). O pico máximo na concentração plasmática é alcançado em aproximadamente 1-2 horas após a administração oral, com rápida excreção por via renal de metabólitos hidroxilatos ou carboxilatos (KALE, 2014). Essa droga é utilizada na terapêutica há mais de 30 anos, indicada para dores moderadas e inflamações em diversas condições, como dores de cabeça, febre, dismenorreia, desordens musculoesqueléticas (DIAN e col., 2013), além de melhorar aprendizado e memória (HASHMI; YAQINUDDIN; AHMED, 2014) e induzir a neuroproteção pelas propriedades antioxidantes (ZAMINELLI e col., 2014). Dentre os AINEs tradicionais, o Naproxeno é um anti-inflamatório não seletivo da COX e, portanto, atua inibindo, em diferentes graus, as duas isoformas da enzima, tendo sido relacionado à maior índice de efeitos adversos gastrointestinais (HOWARD; DELAFONTAINE, 2004). Em ensaios clínicos realizados em pacientes com artrite reumatoide, osteoartrite e artrite juvenil, o Naproxeno demonstrou efeitos comparáveis à aspirina e à indometacina, mas apresentou menor incidência de efeitos indesejáveis em nível do sistema nervoso (BALI e col.,2016). O Cetoprofeno é um AINE altamente eficaz como antipirético e analgésico para o tratamento sintomático da dor e febre em adultos e crianças. Age inibindo a síntese de prostaglandinas por meio do bloqueio das enzimas ciclo-oxigenases (KOKKI; KOKKI, 2010). É conhecido por sua dupla ação sobre a COX-1 e COX-2. Aparentemente pode estabilizar as membranas lisossômicas e antagonizar as ações da bradicinina. É absorvido rapidamente pela via oral e atinge pico de concentração plasmática em uma ou duas horas. Liga-se 99% às proteínas plasmáticas e é conjugado ao ácido glicurônico no fígado, eliminado na urina. Sua ação analgésica é central e atravessa a barreira hematoencefálica. Quimicamente, trata-se de um derivado do ácido arilcarboxílico, pertencente ao grupo do ácido 2-aril-propiônico (KOKKI; KOKKI, 2010), e é indicado para o tratamento de sinais e sintomas da inflamação, como por exemplo, traumas e fraturas, artrites e artroses, contusões, lombalgia e cervicalgias, além de inflamação da garganta, sendo também efetivo no alívio dos sintomas da dismenorreia (WANG; DASGUPTA; WARD, 2015). O Fenbufeno é um AINE com propriedades analgésicas e antipiréticas, que atua como inibidor da enzima ciclo-oxigenase na síntese das prostaglandinas, utilizado para tratar patologias agudas e crônicas, indicado no tratamento de doenças reumáticas, nomeadamente a artrite reumatoide, a osteoartrite e a espondilite anquilosante, assim como na dor aguda ou, também, em estados inflamatórios na generalidade (MOORE; DERRY; MCQUAY, 2009). As características farmacodinâmicas de todos esses produtos são similares, 28 apresentando diferentes graus de atividade anti-inflamatória, antipirética, analgésica e antiplaquetária, sendo todos inibidores não seletivos da COX-1 e COX-2 (FLORES, 1993). Não são muitas as pesquisas com o A3BP. A empresa Takeda Chemical Industries, em 1975, requereu patente de invenção para novo método de preparação do A3BP no tratamento das colecistopatias, com ação espasmolítica e relaxante da vesícula biliar, assim como forte atividade colérica e baixa toxicidade. Kameo e col. (1988) relataram a síntese da atividade inibitória de derivados do A3BP no tratamento da artrite adjuvante induzida em ratos. Em pesquisa posterior, Kawashima e cols (1992) mostraram a atividade imunomoduladora dos derivados do A3BP, por meio da substituição do anel benzênico, sintetizando quatro compostos adicionais, testados no tratamento da artrite adjuvante induzida em ratos, mostrando potente atividade supressora. Akahane, Kimura e Tsutomi (1994) citaram o A3BP como molécula sem o grupo fenil do composto Fenbufeno, um conhecido AINE do subgrupo dos Ácidos 2-aril-propiónicos (FIGURA 4). Figura 4: Estrutura molecular do A3BP Fonte: http://www.sigmaaldrich.com/brazil.html 2.5 ÁGAR O ágar é uma substância que pode ser extraída da parede celular de macroalgas, tendo sido descoberto por volta de 1658, no Japão, por Tarazaemon Minoya. Seu uso é mais antigo do que qualquer outro, como alginatos ou carragenanos, os quais são usados há pouco mais de 200 anos (ARMISEN; GALATAS, 2009). A produção do ágar por modernas técnicas de congelamento industrial foi iniciada na Califórnia por Matsuoka, que registrou sua patente entre 1921 e 1922, nos Estados Unidos (TSENG, 1946; SELBY, 1954; SELBY; WYNNE, 1973). Esse trabalho foi financiado pelo governo americano, que queria que o país fosse autossuficiente em suas necessidades estratégicas, especialmente no que tange ao meio de cultura bacteriológica (FAO, 1987). Fao (1987) ainda relata que o ágar é um hidrocoloide derivado de uma família de polissacarídeos que se acumula nas paredes celulares de algas marinhas vermelhas denominadas agarófitas, do filo Rodophyta, embutido em uma estrutura de fibras de celulose cristalizado, constituindo uma reserva de polissacarídeo. Por essa razão, o conteúdo de ágar varia de acordo com as estações do ano. Os gêneros Gelidium, Pterocladia e Gracilaria predominam na produção de ágar. 29 Os hidrocoloides são polissacarídeos que apresentam a propriedade de reter moléculas de água, formando soluções coloidais e controlando desse modo a atividade de água de um sistema. Proveniente da família das gomas e pectinas, de origem puramente vegetal, o ágar é um produto natural, rico em iodo, sais minerais e fósforo, com alto poder digestivo e nutritivo, quando ingerido com frequência. É ainda formado por substâncias mucilaginosas polissacarídeas, como a galactose associada a um baixo teor de sulfato (RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2005). Segundo o autor acima, o ágar apresenta sabor neutro, alta transparência e pode ser adicionado com facilidade a corantes, aromas, sucos ou frutas desidratadas, funcionando como espessante e conservante temporário para carnes e peixes. Também é emulsificante, agente de suspensão homogeneizante e aglutinante, podendo ser utilizado para fazer cápsulas de vitaminas e drogas, moldes dentários, servindo de base para cosméticos e como meio de cultura microbiana. Já a agarose extraída do ágar é utilizada na eletroforese, na experimentação bioquímica (RAMSEY; RUSHTON; EHRE, 2016). O ágar é insolúvel em água fria, mas solúvel em água fervente; quando é resfriado a 34-43 °C, forma um gel firme que não derrete novamente abaixo de 85 °C (FAO, 1987). 2.5.1 Estrutura Química do Ágar Acreditava-se que o ágar era formado por uma única estrutura, com grupos semi-éster sulfatos ligado a uma galactose. Choji Araki, em 1937, mostrou que o ágar é formado por pelo menos dois polissacarídeos, que ele chamou de agarose e agaropectina. Em 1938, Percival, Sommerville e Forbese, no mesmo ano, Peat, descobriram a existência da 3,6 anidro-Lgalactose como parte da molécula de ágar (ARMISEN; GALATAS, 2009) (FIGURA 5). Atualmente, considera-se que tanto agaranas como carragenanas são compostas de uma cadeia linear, formada por unidades de β-D-galactose ligadas 1→3 (unidade A) a α-D/Lgalactose ligados nas posições 1→4 (unidade B) arranjadas na forma de uma unidade de repetição (AB)n. As unidades α-D-galactose no dissacarídeo podem ser biologicamente convertidas no derivado 3,6 anidro pela eliminação de grupos sulfato na posição 6. Nas agaranas, a unidade B está presente como α-L-galactose, que pode estar na forma de 3,6anidro ou pode ser substituída na posição 6 por grupos sulfato. As carragenanas diferenciamse das agaranas por possuírem a unidade B na forma de α-D-galactose (STEPHEN; PHILLIPS; WILLIAMS, 2006). 30 AGAROSE AGAROPECTINA Figura 5: Composição do ágar (Agarose e Agaropectina) Fonte:SIGMA CHEMICAL (1996). Em seu estado natural, o ágar é um carboidrato estrutural da parede celular das algas agarófitas, existindo na forma de sais de cálcio ou mistura de sais de cálcio e magnésio. Inicialmente apresenta uma forma intermediária com baixo peso molecular e bastante sulfato, sendo secretado pelo Complexo de Golgi da célula. Matsuhashi (1990) sugeriu que o ágar ligado às fibras de celulose por íons de cálcio explicaria muitos fenômenos ocorridos durante o processo de extração. Uma vez depositado na parede celular, enzimaticamente polimeriza e perde sulfato, sendo convertido na maior parte em agarose, que confere ao ágar poder de gelificação, produzido exclusivamente por ligações de hidrogênio. O resto permanece na forma de agaropectina (BASTIOLE, 2000 apud RAPHAEL, 2010). O ágar é um polímero de agarobiose, dissacarídeo composto de D-galactose e 3,6anidro-L-galactose. Agarobioses são frações de ágar essencialmente gel. Essas frações têm alto peso molecular, acima de 100.000 Daltons e que, frequentemente, ultrapassam 150.000 Daltons, com baixo teor de sulfato, geralmente abaixo de 0,15%. O resto das frações é conhecido como agaropectina, que tem menor peso molecular, geralmente abaixo de 20.000 Daltons, com 14.000 Daltons sendo a mais usual, com conteúdo de sulfatos muito mais elevado, por vezes, registrando 5% a 8% (ARMISEN; GALATAS, 2009). Quando diversos tipos de ágares foram cuidadosamente estudados, a presença de 11 agarobioses foram comprovadas, podendo ser produzidas em muitas formas variáveis pelas diferentes agarophytas em função do sexo e das espécies que dependem das suas características genéticas. Tais características são influenciadas por uma série de fatores ecológicos, como disponibilidade de nutriente, composição do substrato onde eles crescem e condições hidrodinâmicas do habitat (LAHAYNE; ROCHAS, 1991 apud ARMISEN; GALATAS, 2009). 31 3 JUSTIFICATIVA A inflamação é um efeito do organismo para remover estímulos nocivos e iniciar sua cura. Há muitos mecanismos inflamatórios envolvidos em infecções crônicas, doenças e outras lesões dos tecidos. Esses mecanismos ainda são pouco entendidos e a busca de novos medicamentos anti-inflamatórios com maior especificidade e menos efeitos colaterais justificam o desenvolvimento de novos protocolos e a padronização de novos modelos inflamatórios experimentais para compreender melhor essas questões. Além disso, alguns modelos experimentais de inflamação que são comumente usados para testes farmacológicos utilizam equipamentos de alto custo e necessitam de agentes flogísticos de valor elevado, o que aumenta os custos de aplicação da pesquisa. Nesse contexto, o ensaio de bolsa de ar com carragenina usada como agente flogístico foi desenvolvido como típico modelo de inflamação in vivo (EDWARDS; SEDGWICK; WILLOUGHBY, 1981; TAO e col., 1999; ELLIS e col., 2000; BASTOS e col., 2008), sendo um dos mais utilizados por ser desprovido de efeitos sistêmicos, por ser de fácil execução e pela possibilidade de retirada do exsudato produzido. Esse modelo é útil para a remoção de células inflamatórias, para medições da quimiotaxia e da produção de mediadores químicos inflamatórios (EDWARDS; SEDGWICK; WILLOUGHBY, 1981; TAO e col., 1999; ELLIS e col., 2000; BASTOS e col., 2008). Outro fator importante que norteia a pesquisa é baseado nos diversos efeitos indesejáveis dos AINEs, como efeitos gastrointestinais, propensão à trombose, perda do efeito protetor da regulação superior da COX-2 na isquemia miocárdica e no infarto agudo do miocárdio, insuficiência renal aguda e elevação da pressão arterial média, entre outros (OLIVEIRA JR. e col., 2007), que resultam em mais de 100.000 hospitalizações com um custo anual de US$1.6 bilhões de dólares e 17.000 mortes por ano nos EUA, a um custo de 3.9 bilhões de dólares por ano (COELHO, 2001; INOTAI; HANKO; MESZAROS, 2010). Entre os AINEs, ao qual pertencem os derivados dos Ácidos 2-aril-propiônicos, encontram-se o Ibuprofeno, o Naproxeno, o Cetoprofeno, o Fenbufeno, o Flurbiprofeno e o A3BP (AKAHANE; KIMURA; TSUTOMI, 1994; KAMEO e col., 1988; LEVOIN e col., 2004). Entretanto, são poucos estudos que mencionam o A3BP como composto analgésico e anti-inflamatório, destacando-se pesquisas no tratamento das colecistopatias e, principalmente, no tratamento da artrite adjuvante (KAWASHIMA e col., 1992). Com isso, é necessária a busca de estudos da toxicidade, anti-inflamatórios e analgésicos desse composto, a fim de verificar sua administração segura e direcionamento a alvos específicos durante o processo inflamatório. 32 CAPÍTULO I ALTERAÇÕES VASCULARES E INFLAMAÇÃO AGUDA INDUZIDA POR ÁGAR EM MODELO DE BOLSA DE AR 33 1 OBJETIVOS 1.1 OBJETIVO GERAL - Avaliar o ágar como agente flogístico em modelo experimental de bolsa de ar em ratos Wistar. 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Avaliar o modelo experimental de bolsa de ar induzida por ágar como uma alternativa simples e barata em estudos de inflamação; - Avaliar o efeito dose dependente da atividade flogística induzida por ágar no modelo de bolsa de ar; - Avaliar os efeitos de fármacos anti-inflamatórios convencionais na inflamação induzida por ágar no modelo de bolsa de ar. 34 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 ASPECTOS ÉTICOS O estudo iniciou após o aceite do orientador e da co-orientadora (APÊNDICE A e B) e da submissão e aprovação do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais Experimentais (CEPAE) da Universidade Federal do Pará (ANEXO A). O presente estudo foi conduzido de acordo com as orientações do CEPAE sob o número de protocolo UFPA-CEPAE 111-13. Foram feitos todos os esforços para minimizar o número de animais utilizados, bem como o seu sofrimento. 2.2 REAGENTES Os reagentes utilizados foram: ágar (A5306), k-carragenina (C22048), celecoxib (PZ0008), ácido acetilsalicílico® (A5376), ácido fosfórico (V000145), sulfanilamida (S33626), N-(1-naftil), dicloridrato de etilenodiamina ® (E222488) e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, E9884), todos comprados da Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, EUA). 2.3 ANIMAIS Ratos Wistar machos (120-150 g) foram adquiridos do Centro de Animais da Universidade Federal do Pará (Belém, Pará, Brasil) e mantidos na unidade de animal experimental do Laboratório de Neuroinflamação. Os animais foram alojados sob temperatura controlada (22 ± 1ºC), em ciclo de 12 h dia/noite e água ad libitum. 2.4 PREPARAÇÃO DA BOLSA DE AR E INDUÇÃO DO PROCESSO INFLAMATÓRIO As bolsas de ar foram realizadas como descrito por Tao e col. (1999) e Bastos e col. (2008). O ar estéril foi obtido por meio de captação dentro de uma câmara de fluxo laminar para evitar a contaminação. As bolsas foram insufladas com 20 ml de ar injetado na área intraescapular e, em seguida, re-insufladas com mais 10 ml de ar por 2 dias. Após a preparação das bolsas de ar, a inflamação foi induzida por diferentes concentrações de ágar e diferentes fármacos anti-inflamatórios padrões. 2.5 COLETA DAS AMOSTRAS As amostras foram obtidas 16 h após a administração do agente flogístico. Uma pequena incisão foi feita na parede da bolsa e seu conteúdo foi cuidadosamente removido com uma pipeta Pasteur estéril. Para aumentar o volume total de exsudato e melhorar assim a precisão da medida, 1 ml de Tampão salina fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2.7 mM, e um pH de 7.4) foi previamente injetado na bolsa de ar. Em seguida, os animais foram submetidos à eutanásia por meio de câmara de CO2, em que foram avaliados a 35 microvasculatura, a atividade nitrérgica, a migração celular, a contagem de células leucocitárias e os níveis de PGE2. 2.6 ANÁLISE MORFOMÉTRICA A análise morfométrica e a quantificação automática foram utilizadas para determinar características do processo inflamatório, por meio da quantificação da extensão da microvasculatura na bolsa de ar. A área média da extensão da microvasculatura foi medida com o NeuronJ (Departments of Medical Informatics and Radiology Rotterdam, The Netherlands) (MEIJERING e col., 2004; MEIJERING, 2010), um pacote de software semi automatizado de rastreamento de nervos, módulo plug-in do ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA), software de análise de imagens baseado no Java. A extensão da microvasculatura foi quantificada em imagens gravadas em resolução de 345x440 pixels, cobrindo uma área de 625x525 milímetros. As fotografias foram tiradas com câmera digital (DSC-H200; Sony, Tóquio, Japão), suportada sobre um minitripé à distância constante de 20 cm acima do rato. A microvasculatura marcada foi traçada manualmente, e um algoritmo foi utilizado para comparar a intensidade de pixels com pixels de áreas adjacentes. O cursor mostrava automaticamente o caminho previsto com precisão de rastreio. Após a microvasculatura ter sido traçada, um arquivo de texto foi gerado contendo área média da extensão dela. Após a marcação dos traçados dos vasos, que aparecem coloridos (rosa), os dados de medição foram gerados a partir de uma imagem em formato TIFF de 8 bits, previamente gerada e armazenada. O próprio programa (NeuronJ) executou cálculos aritméticos sobre os dados da medição e transportou os cálculos diretamente para uma planilha do Excel (Microsoft, Bellevue, WA, EUA), preenchida com a área média de cada vaso em milímetros quadrados (mm 2). 2.7 DOSAGEM DE NITRITO As amostras foram inicialmente diluídas 1:20 em PBS e, em seguida, 500 µL de cada amostra diluída foram misturadas com o mesmo volume de reagente de Griess (0,1% naphtylethylen e 1% de sulfanilamida em 5% de ácido fosfórico) (GREEN e col., 1982). Os valores de absorbância foram medidos em densidade óptica (OD) 570 nm e comparados a uma curva padrão (solução de nitrito de sódio), a fim de determinar a concentração de NO2-. 2.8 CÉLULAS DO EXSUDATO INFLAMATÓRIO O exsudato inflamatório foi obtido pelo método de MayGrünwald-Giemsa para contagem diferencial de células. A diferença na densidade de células foi determinada pela contagem em microscópio de 400 células por campo, identificadas por critérios padrões de 36 morfologia, pela morfologia dos núcleos e pela granulação citoplasmática. A contagem de células foi expressa em porcentagem de células totais e valores absolutos (10 6/mL). 2.9 UTILIZAÇÃO DE FÁRMACOS ANTI-INFLAMATÓRIOS PADRÕES Depois de verificar a concentração ideal a ser usada, foi conduzido experimento para análise do mecanismo de ação da substância ágar, em que os animais receberam a solução de 2% de ágar e solução de 2% de ágar associados aos anti-inflamatórios Celecoxib (dosagem de 200mg/kg), inibidor seletivo da COX-2, e Ácido Acetilsalicílico® (ASA) (dose de 100mg/kg), inibidor não seletivo da COX. 2.10 NÍVEIS DE PGE2 Amostras de exsudato foram diluídas 1:10 em PBS. O nível de PGE 2 foi quantificado com kit ELISA específico para PGE2 (GE Healthcare UK Limited Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido). Os valores de absorbância foram medidos em OD 570nm conforme manual de instruções do fabricante. 2.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA Todos os valores experimentais foram apresentados em médias ± desvio padrão (DP); o estudo foi do tipo experimental, em que foi usada a estatística descritiva para caracterização da amostra, a Análise de Variância (ANOVA) de um critério para as análises intergrupos, seguida de múltiplas comparações pelo teste de Tukey's. A análise estatística foi realizada com o GraphPad Prism 5.0. O valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os resultados foram colocados em planilhas de cálculos e os gráficos criados com o GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego Califórnia, EUA). 37 3 RESULTADOS 3.1 MICROVASCULATURA NA INFLAMAÇÃO INDUZIDA POR ÁGAR E EM INTERVENÇÕES FARMACOLÓGICAS COM ANTI-INFLAMATÓRIOS CONVENCIONAIS Para determinar se o ágar poderia provocar vasodilatação como agente flogístico, um painel de fotografias da microvasculatura da bolsa de ar foi criado com a ajuda de um rápido e simples programa, o NeuronJ (FIGURA 6). Como mostrado na Figura 6a e 6b, o grupo controle (saline 0,9%) apresentou características normais da microvasculatura induzida pela bolsa de ar. A Figura 6c e 6d demonstrou uma visão macroscópica da bolsa de ar com aumento da microvasculatura induzida pela carragenina 1%. Na Figura 6e e 6f, 6g e 6h, 6i e 6j, 6k e 6l, observa-se maior vascularização relacionada a inflamação estabelecida da microvasculatura induzida por ágar 1%, 2%, 3% e 4%, respectivamente. Curiosamente, a concentração de ágar 4% provocou pontos isquêmicos e odor fétido, observados após abertura da bolsa de ar. Figura 6: Microvasculatura presente no interior da bolsa de ar. O painel mostra fotografias da microvasculatura presente no interior da bolsa de ar na inflamação induzida por ágar, onde a Figura 6 (a, c, e, g, I, k) mostra fotografias usadas para demarcação da microvasculatura, enquanto a Figura 6 (b, d, f, h, j, l) mostra as imagens coloridas (rosa) para cálculo da área média da microvasculatura pelo programa NeuronJ. (a) e (b) grupo controle (salina 0,9%), (c) e (d) grupo carragenina 1%, (e) e (f) 1%, (g) e (h) 2%, (i) e (j) 3%, (k) e (l) 4% grupos ágar. A Figura 7 demonstra a área média dos traços mostrados nas imagens. A área média aumenta duas vezes no grupo carragenina 1% (0.889 mm2) quando comparada ao grupo 38 controle (0.314 mm2). Do mesmo modo, a área média aumenta significativamente em três vezes no grupo ágar 2% (1.211 mm2) quando comparada ao grupo controle. Curiosamente, os resultados obtidos com ágar 1%, 3% e 4% (0.545 mm2, 0.547 mm2 e 0.563 mm2) mostraram apenas um pequeno aumento da área inflamada. Figura 7: Quantificação da área média da microvasculatura em milímetros (mm2) presente na bolsa de ar na inflamação induzida por ágar. Os valores são expressos em média ± S.E.M. de quatro ratos cada grupo. Grupo controle (solução salina 0,9%); grupo carragenina 1%; grupo ágar 1%; grupo ágar 2%; grupo ágar 3%; grupo ágar 4%. Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle. Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. Para avaliar o efeito vascular após intervenções farmacológicas com drogas convencionais na inflamação induzida por ágar, a análise morfométrica da vasodilatação foi realizada por meio da identificação da microvasculatura na área da bolsa de ar (FIGURA 8). O painel de fotografias mostra o processo de vasodilatação induzida por solução salina 0,9% (FIGURA 8a e 8b), ágar 2% (FIGURA 8c e 8d), ágar 2% pré-tratado com Celecoxib 200 mg/kg (FIGURA 8e e 8f) ou ágar 2% pré-tratado com ASA 100 mg/kg (FIGURA 8g e 8h). Figura 8: Microvasculatura presente no interior da bolsa de ar. O painel mostra fotografias da microvasculatura presente no interior da bolsa de ar na inflamação induzida por ágar e pré-tratada com drogas anti-inflamatórias convencionais, onde a Figura 8 (a, c, e, g) mostra fotografias usadas para demarcação da microvasculatura, enquanto a Figura 8 (b, d, f, h) mostra as imagens coloridas (rosa) para cálculo da área média da microvasculatura pelo programa NeuronJ (adaptado). (a) e (b) grupo controle (salina 0,9%), (c) e (d) grupo ágar 2%, (e) e (f) grupo ágar 2% pré-tratado com 200mg/kg de Celecoxib, (g) e (h) grupo ágar 2% pré-tratado com 100mg/kg de ácido acetilsalicílico (ASA). 39 A Figura 9 demonstra a área média dos traços marcados nas imagens. Há redução significativa (P<0,05) da área no grupo Celecoxib (0.393 mm2) e no grupo ASA (0.300 mm2), quando comparados ao grupo ágar 2% (1.176 mm2). No entanto, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos induzidos por ágar 2% e pré-tratados com Celecoxib ou ASA. Figura 9: Quantificação da área média da microvasculatura em milímetros(mm2) presente na bolsa de ar na inflamação pré-tratada com drogas anti-inflamatórias convencionais e induzida por ágar 2%. Os valores são expressos em média ± S.E.M. de quatro ratos cada grupo. Grupo controle (solução salina 0,9%); grupo ágar 2%; grupo ágar 2% pré-tratado com Celecoxib 200mg/kg; grupo ágar 2% pré-tratado com ácido acetilsalicílico (ASA) 100mg/kg. Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle e com o grupo ágar 2%. Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. 3.2 CONCENTRAÇÃO DE NITRITO NA INFLAMAÇÃO INDUZIDA POR ÁGAR E EM INTERVENÇÕES FARMACOLÓGICAS COM ANTI-INFLAMATÓRIOS CONVENCIONAIS A fim de determinar se a via de NO desempenha um papel importante na resposta da inflamação induzida por ágar, a produção de NO2- foi medida no exsudado inflamatório. Como observado na Figura 10a, o ágar aumentou significativamente (P<0,05) a concentração de NO2-. Controle (salina 0,9%) (1,78 μM ± 1,05); carragenina 1% (25,76 μM ± 3,58); ágar 1% (13,71 μM ± 1,79); ágar 2% (22,90 μM ± 1,52); ágar 3% (32,77 μM ± 1,77); ágar 4% (26,87 μM ± 0,48). Todos os grupos tratados apresentaram diferença estatisticamente significativa quando comparados ao grupo controle (P<0,05). Porém, na comparação entre os grupos ágar 2% e 4% com o grupo de carragenina, não foram observadas diferenças estatísticas. Para avaliar o efeito das drogas anti-inflamatórias convencionais na inflamação induzida por ágar 2%, os níveis de NO2- foram verificados em animais pré-tratados com Celecoxib ou ASA. Como apresentado na Figura 10b, o Celecoxib (200 mg/kg) promoveu diminuição de 85% (6,1 μM ± 2,2) nos níveis de NO2-, enquanto o ASA (100 mg/kg) inibiu em 81% (7,7 μM ± 5,1) quando comparado ao grupo ágar 2% (27,9μM ± 6,9). 40 a) b) Figura 10: Efeitos do ágar e da carragenina (a) e de drogas anti-inflamatórias convencionais na inflamação induzida por ágar 2%(b) na produção de NO2-. Os valores são expressos em média ± S.E.M. de quatro ratos cada grupo. Grupo controle (solução salina 0,9%); grupo carragenina 1%; grupo ágar 1%; grupo ágar 2%; grupo ágar 3%; grupo ágar 4% (a). Grupo controle (solução salina 0,9%); grupo ágar 2%; grupo ágar 2% pré-tratado com Celecoxib 200mg/kg; grupo ágar 2% pré-tratado com ácido acetilsalicílico (ASA) 100mg/kg (b). Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle (a) e com os grupos controle e ágar 2% (b). Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. 3.3 MIGRAÇÃO CELULAR NA INFLAMAÇÃO INDUZIDA POR ÁGAR E EM INTERVENÇÕES FARMACOLÓGICAS COM ANTI-INFLAMATÓRIOS CONVENCIONAIS Para verificar se a migração de células inflamatórias ocorreu no local da lesão, foi avaliado o número total de células presentes no exsudado induzido por ágar. Como mostrado na Figura 11a, o ágar promoveu aumento na migração celular: controle (salina 0,9%) (1x10 7 ± 0,3 células/ml); carragenina 1% (8.1x107 ± 0,9 células/ml); ágar 1% (7x107 ± 1,9 células/ml); ágar 2% (9x107 ± 2,8 células/ml); ágar 3% (15x10 7 ± 2,4 células/ml); ágar 4% (13x10 7 ± 2,5 células/ml). Foram observadas diferenças estatisticamente significativas (P<0,05) entre o grupo controle e os grupos ágar e carragenina e, em particular, entre os grupos ágar 3% e 4%. A análise do número total de células foi realizada em animais pré-tratados com Celexicob 200 mg/kg ou ASA 100 mg/kg a fim de avaliar os efeitos do ágar sobre a migração celular. Como apresentado na Figura 11b, o ágar 2% foi capaz de induzir a migração celular na bolsa de ar (15,23x107 ± 3,0 células/ml). A migração de células nos grupos tratados com ASA (3,73x107 ± 2,8 células/ml) e Celecoxib (8,02x107 ± 2,2 células/ml) foram inibidas 73% e 47%, respectivamente. Não existem diferenças significativas entre ASA e Celecoxib, e ambos promoveram inibição significativa (P<0,05) quando comparado ao grupo ágar 2%. 41 a) b) Figura 11: Efeitos do ágar e da carragenina (a) e de drogas anti-inflamatórias convencionais na inflamação induzida por ágar 2% (b) na migração celular. Os valores são expressos em média ± S.E.M. de quatro ratos cada grupo. Grupo controle (solução salina 0,9%); grupo carragenina 1%; grupo ágar 1%; grupo ágar 2%; grupo ágar 3%; grupo ágar 4% (a). Grupo controle (solução salina 0,9%); grupo ágar 2%; grupo ágar 2% pré-tratado com Celecoxib 200mg/kg; grupo ágar 2% pré-tratado com ácido acetilsalicílico (ASA) 100mg/kg (b). Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle (a) e com os grupos controle e ágar 2% (b). Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. 3.4 CONTAGEM DIFERENCIAL DE CÉLULAS LEUCÓCITÁRIAS NA INFLAMAÇÃO INDUZIDA POR ÁGAR A contagem diferencial de leucócitos foi realizada para identificar tipos de células induzidas com a solução de ágar 2%. Na análise dos dados da Figura 12, observa-se o aumento da migração da população de neutrófilos e monócitos, seguido por pequena quantidade de linfócitos e eosinófilos: Neutrófilos (63,3x10 6 ± 23,4 células/ml); eosinófilos (8,7x106 ± 10,1 células/ml); linfócitos (9,3x106 ± 11,1 células/ml); monócitos (27,3x10 6 ± 2,5 células/ml). 42 Figura 12: Contagem diferencial de células leucocitárias por ml do exsudato inflamatório induzido por ágar 2%. Os valores são expressos em média ± S.E.M. de quatro ratos cada grupo. Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle. Diferenças entre os grupos foram examinadas usando a análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. 3.5 VALORES DE PGE2 EM INTERVENÇÕES FARMACOLÓGICAS COM ANTIINFLAMATÓRIOS CONVENCIONAIS NA INFLAMAÇÃO INDUZIDA POR ÁGAR Como observado na Figura 13, a análise dos valores de PGE 2 foi realizada em grupos induzidos por carragenina 1% (30605,5 pg/ml ± 4335,7), ágar 2% (31373,4 pg/ml ± 5176,8), Celecoxib 200 mg/kg (15529,3 pg/ml ± 6287,2) e ASA 100 mg/kg (18131,6 pg/ml ± 4329,5). Os valores de PGE2 foram inibidos em 50% (Celecoxib) e 42% (ASA), respectivamente. Não houve diferenças significativas (P<0,05) entre Celecoxib e ASA, sendo que ambos promoveram inibição significativa (P<0,05) quando comparados ao grupo ágar 2%. Figura 13: Valores de PGE2 na carragenina e em drogas anti-inflamatórias convencionais na inflamação induzida por ágar 2%. Grupo controle (solução salina 0,9%); grupo carragenina 1%; grupo ágar 2%; grupo ágar 2% prétratado com Celecoxib 200mg/kg; grupo ágar 2% pré-tratado com ácido acetilsalicílico (ASA) 100mg/kg. Os valores são expressos em média ± S.E.M. de quatro ratos cada grupo. Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle e com o grupo ágar 2%. Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. 43 4 DISCUSSÃO A inflamação é parte da resposta biológica complexa de tecidos vasculares a estímulos nocivos, tais como agentes patogênicos, células danosas ou compostos irritantes. Modelos experimentais de inflamação são importantes para a descoberta de novos medicamentos. Aqui foi caracterizado o efeito flogístico do ágar como agente alternativo em modelos de inflamação em bolsa de ar. Para verificar se o ágar apresentava atividade flogística, foram avaliados a atividade nitrérgica, a migração celular, os valores de PGE 2, a contagem de leucócitos e alterações vasculares por meio de fotografias da microvasculatura do tecido de revestimento da bolsa de ar. O estabelecimento de um modelo de inflamação experimental por procedimentos diferentes provou ser uma ferramenta útil na compreensão dos mecanismos de sinais envolvidos na inflamação (inchaço, calor, dor, vermelhidão e perda de função) (PARNHAM, 2008). O modelo de bolsa de ar com a injeção de carragenina é um dos métodos mais utilizados porque permite uma análise mais abrangente dos sinais inflamatórios (JAIN; PARMAR, 2011; LECLERC; PAWELZIK; IDBORG, 2013). A hipótese foi suportada por Okoli e col. (2007), que utilizaram ágar no edema de pata em ratos. Assim, esta pesquisa será a primeira a usar o ágar no modelo de bolsa de ar. O ágar a 2% foi escolhido como a melhor concentração neste protocolo, visto que o ágar a 4% provocou pontos isquêmicos e causou odor desagradável quando da abertura da bolsa de ar. A presença desses sinais é evidência de perda de função, sinal negativo para o modelo de inflamação, já que a morte de células é capaz de ativar o sistema imune inato e de induzir resposta inflamatória intensa (FREIRE; VAN DYKE, 2013). Além disso, o ágar promoveu aumento da microvasculatura na bolsa de ar e da concentração de NO2-. O NO aumenta a permeabilidade vascular como potente vasodilatador (DAVIS; MARTIN; FERID, 2001). Os resultados aqui são confirmados por Szabo apud Horton (2003), que mostrou que, durante as primeiras horas após uma lesão capaz de iniciar um processo inflamatório, a produção de NO mediada por óxido nítrico sintase (iNOS) pode ser regulada. Em casos de grande liberação, como consequência dessa regulação, ocorreria extenso dano à célula. O processo de migração celular pode ser outra ação importante no processo inflamatório induzido pelo ágar. De acordo com Szabó e Bechara (1999), durante o processo inflamatório agudo, o diâmetro do vaso, o fluxo de sangue e a permeabilidade vascular são modificados, o que provoca a migração celular. NO pode promover diretamente o agravamento da microvasculatura periférica e resultar em descompensação vascular; esse 44 efeito pode ser desencadeado pela via de sinalização de Fator nuclear kappa B (NF-kB) que conduz à produção de citocinas pró-inflamatórias (HORTON, 2003). Em outro trabalho, Salvemini, Doyle e Cuzzocrea (2006) utilizaram inibidores de iNOS no modelo de bolsa ar, observando que houve ação anti-inflamatória, não só por causa da iNOS bloqueada, mas também por uma diminuição na infiltração celular. Portanto, os níveis de nitrito e os efeitos da vascularização coincidem com os obtidos em nosso estudo. Além disso, a contagem diferenciada de células leucocitárias do grupo ágar 2% mostrou prevalência de neutrófilos, seguidos por monócitos e pequenas quantidades de linfócitos e eosinófilos. Estudos feitos por Garcia-Ramalho e col. (2002) demonstraram o papel de células residentes na inflamação indutoras da liberação de TNF-, responsável pela síntese de quimiocinas e, consequentemente, para a migração de leucócitos. Outras citoquinas, tais como IL-1 e Interleucina 6 (IL-6), também participam desse processo (MICHAUD; BALARDY; MOULIS, 2013). Durante o desenvolvimento da inflamação, a migração celular de leucócitos é iniciada por um número significativo de neutrófilos seguido por monócitos (COX; KITHCART; PITT, 2013). O aumento da migração de leucócitos pode ser devido à indução da expressão de moléculas responsável pelo "rolamento" de leucócitos ao longo do endotélio (MARTIN e col., 2000). Esse processo pode ser explicado pela ativação de fatores de transcrição nucleares, tais como NF-κB, encarregado da transcrição do gene de iNOS, COX-2 e molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1) (KIM; HEO; YOON, 2010). Os mediadores inflamatórios ligados aos receptores dos macrófagos resultam na fosforilação e degradação de IκB e translocação de NF-κB para o núcleo ao se ligar às regiões promotoras de ácido desoxirribonucleico (DNA), o que iniciará a transcrição de outros mediadores inflamatórios (LASKIN; LASKIN, 2001). O celecoxib e o ASA foram usados no modelo de bolsa de ar induzida por ágar. Os resultados demonstraram que o Celecoxib (inibidor seletivo da COX-2) e o ASA (inibidor não seletivo da COX), anti-inflamatórios não esteroidais, inibem a inflamação induzida por ágar. O efeito do ASA pode ser atribuído à inibição da prostaglandina e tromboxano na atividade catalítica da COX-1 (LIU e col., 2012). O ASA e outros derivados de fármacos AINEs não inibem a lipoxigenase e, portanto, não suprimem a formação de leucotrienos (KÖHNKE; GOMOLKA; BILAL, 2013). O celecoxib exibe propriedades anti-inflamatórias, antipirética e analgésica relacionadas à inibição seletiva da COX-2 (PRICE; JORGENSEN, 2001; PARK; LEE, 2005). Os resultados do estudo confirmam dados da literatura, demonstrando que os AINEs causam inibição significativa da dor induzida (BASTOS, 2006). Mediadores químicos, incluindo a histamina, NO, PGE 2 e PGI2, promovem aumento da vasodilatação e microvasculatura. Além disso, PGE 2 e PGI2 causam vermelhidão e calor no tecido devido estimular o aumento do fluxo sanguíneo local (CAMARGO e col., 2007). Komaki, Arimura e Koves (1992), em resposta a um estímulo inflamatório/infeccioso, demonstraram a síntese de PGE2 na microvasculatura cerebral, bem como no parênquima 45 cerebral. No teste qualitativo, foram observadas maiores microvasculatura e vermelhidão no grupo de ágar 2% em comparação ao grupo de carragenina, o que sugere maior libertação de mediadores inflamatórios induzidos pelo ágar, assim como os níveis de PGE2 foram semelhantes em ambos os grupos, ao mostrar igual probabilidade de ação. Nos grupos tratados com celecoxib e ASA, a microvasculatura e a vermelhidão foram reprimidas pela ação dessas drogas. A atividade do Celecoxib sugere que o ágar pode induzir a enzima COX-2 na inflamação (HILÁRIO; TERRERI; LEN, 2006). Esses resultados demonstraram que os fármacos anti-inflamatórios convencionais podem ser utilizados para bloquear a atividade nitrérgica e os valores de PGE2 induzida por ágar. Jung e col. (2011) analisaram a ação anti-inflamatória de n-Propil Gallato através da down-regulação de NF-κB na cultura de macrófagos de linhagem RAW 264.7; concluíram que há uma diminuição na concentração de nitrito em células tratadas com substâncias que têm atividade anti-inflamatória. Essa redução é provavelmente resultado da inibição de NF-κB. Em modelos de inflamação na bolsa de ar induzida por carragenina, há aumento da ativação de NF-κB nos animais tratados com dexametasona (esteroide anti-inflamatório) e coloração reduzida para NF-κB no ensaio histoquímico imunológico realizado no tecido removido da área de bolsa (ELLIS e col.,2000; CRIPPEN, 2006). Meacock e Kitchen (1976) testaram o desempenho de vários AINEs, tais como Indometacina, Fenilbutazona, Cetoprofeno, Ibuprofeno, Aspirina, Naproxeno, Fenbufeno no processo de migração celular e chegaram à conclusão de que nenhum dos fármacos testados impediu a migração de PMNs na inflamação induzida pela carragenina, embora alguns AINEs tenham suprimido a migração de células mononucleares (monócitos). A diminuição da migração de leucócitos observada nos resultados pode ser devida ao bloqueio da expressão de moléculas de adesão responsáveis pelo "rolamento" de leucócitos ao longo do endotélio. Esse bloqueio na expressão dessas moléculas pode ser explicado pela inibição de fatores de transcrição, tais como NF-κB, encarregado da transcrição do gene de iNOS, do COX-2 e da molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1) (KÖHNKE e col., 2013; PARK; LEE, 2005). 46 5 CONCLUSÃO Os resultados obtidos com o protocolo descrito na pesquisa por meio do modelo experimental de inflamação de bolsa de ar com a injeção de ágar em substituição à carragenina mostrou que o ágar, como agente flogístico, fornece uma alternativa para estudos que envolvam a inflamação, no rastreio de novas drogas anti-inflamatórias como alternativa simples e barata. Deve-se ressaltar que não foi encontrado efeito dose dependente da atividade flogística induzida por ágar no modelo de bolsa de ar nas concentrações testadas, sendo o ágar a 2% escolhido como a melhor concentração neste protocolo, por promover aumento da microvasculatura, da concentração de NO2-, da migração celular e ao mostrar prevalência de neutrófilos no processo de contagem diferencial celular. Os AINEs, Celecoxib e ASA foram usados no modelo de bolsa de ar, a fim de verificar o potencial alvo de ação do ágar, inibiram a inflamação induzida por esse agente, sendo que a microvasculatura e a hiperemia foram reduzidas pela ação dessas drogas. Além disso, os resultados mostraram que os fármacos anti-inflamatórios convencionais podem ser utilizados para bloquear a atividade nitrérgica, os valores de PGE 2 e diminuir a migração de leucócitos. 47 CAPÍTULO II ESTUDO DAS PROPRIEDADES ANTI-INFLAMATÓRIAS E ANALGÉSICAS DO ÁCIDO 3-BENZOIL-PROPIÔNICO 48 1 OBJETIVOS 1.1 OBJETIVO GERAL - Avaliar a atividade anti-inflamatória e analgésica do ácido 3-benzoil-propiônico e seu potencial efeito genotóxico. 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Avaliar a atividade anti-inflamatória e analgésica do ácido 3-benzoil-propiônico no modelo de inflamação de bolsa de ar induzida por carragenina, modelos in vivo; - Avaliar a atividade anti-inflamatória, citotóxica, genotóxica e hemolítica do ácido 3benzoil-propiônico em modelos in vitro. 49 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 ASPECTOS ÉTICOS O estudo iniciou após o aceite do orientador e da co-orientadora (APÊNDICE A e B) e da submissão e aprovação do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais Experimentais (CEPAE) da Universidade Federal do Pará (ANEXO A). A presente pesquisa foi conduzida de acordo com as orientações do CEPAE, sob o número de protocolo UFPACEPAE 228-14 e UFPA-CEPAE 111-13. Foram feitos todos os esforços para minimizar o número de animais utilizados, bem como o seu sofrimento. 2.2 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA IN VITRO 2.2.1 Reagentes Os reagentes utilizados foram: Penicilina-estreptomicina (P4333), Soro bovino fetal (F2442), Ácido 3-benzoil-propiônico (B13802), Lipopolissacáridos de Escherichia coli0111: B4 (LPS, L4391), PMA (P1585), Ácido fosfórico (V000145), Sulfanilamida (S33626), N-(1-naftil), dicloridrato de etilenodiamina® (E222488), Azul de Tiazolil Tetrazólio (MTT, M2128),Sal de sódio Resazurina (R7017), Agarose (A9539), NaCl (S7653), Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, E9884), Tris (T1503), Triton X-100 (X100), Dimetil sulfóxido (DMSO, D2650), N-lauroil sarcosinato de sódio (L9150), NaOH (S8045), Cloridrato de doxorrubicina (D1515), Brometo de etídio (E7637) e MRC-5 PD 19 (05072101), todos procedentes da Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, EUA). 2.2.2 Animais Camundongos Mus musculus swiss machos (40-45g) foram adquiridos a partir do Centro de Animais da Universidade Federal do Pará (Belém, Pará, Brasil) e mantidos na unidade de animal experimental do Laboratório de Neuroinflamação. Os animais foram alojados sob temperatura controlada (22 ± 1 ºC), em ciclo de 12 h dia/noite e água ad libitum. 2.2.3 Cultivo celular da linhagem J774 Essa linhagem celular de macrófagos proveniente de camundongo foi cultivada em meio DMEN suplementado com 10% de soro bovino fetal, 1% de penicilina e estreptomicina, mantidas em estufa a 37 ºC com 5% de CO2. Os repiques foram realizados quando a cultura atingiu 80% de confluência. Para os ensaios, as células foram plaqueadas na concentração de 0,6x106 células/ml em placas de 24 poços. 50 2.2.4 Cultivo celular de macrófagos peritoneais Macrófagos peritoneais foram obtidos a partir de camundongos Swiss. Os animais foram sacrificados por meio de deslocamento cervical para a coleta das células, feita por lavagem da cavidade peritoneal com meio de cultura DMEN estéril e sem soro, com seringa e agulhas estéreis. O material aspirado foi centrifugado a 1500 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. As células foram ressuspendidas em meio de cultura sem soro para contagem em Câmara de Neubauer e o número de células foi ajustado para 2x106 células/ml. Os macrófagos foram plaqueados em placa de 24 poços em meio DMEN e mantidos a 37 ºC em estufa com 5% de CO2 e 95% de ar, durante duas horas para adesão. 2.2.5 Tratamento celular de macrófagos peritoneais Após 2 h de incubação para adesão celular, a cultura foi lavada com PBS e os macrófagos aderidos foram tratados com o A3BP em diferentes concentrações. Os macrófagos foram expostos por 1 h ao A3BP, lavados e incubados com LPS a 1 µg/ml por 24 ou 48 horas em estufa de CO2. 2.2.6 Viabilidade celular pelo método do MTT Para análise da viabilidade celular, foi seguido o método de Mosmann (1983), que consiste na clivagem do sal de tetrazólium (MTT), somente realizada por mitocôndrias de células viáveis, tendo como produto o composto formazan. A quantidade deste é mensurada por análise colorimétrica proporcional ao número de células viáveis. Após o tratamento com o A3BP nas concentrações de 1, 10, 25, 50 e 100 µM por 24 e 48 horas, as células foram incubadas em 0,5 mg/ml de MTT diluído em meio de cultura por 2 horas. Após o período de incubação, o meio foi retirado e o sal depositado foi solubilizado em 500 µl de DMSO. A leitura foi realizada em placas de 96 poços no leitor Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), com comprimento de onda de 570 nm. 2.2.7 Dosagem de nitrito Determinada indiretamente a partir da medida de concentração de nitrito no sobrenadante das células pela reação de Griess (GREEN e col., 1982). Os macrófagos foram tratados como descrito anteriormente e, o sobrenadante, coletado e centrifugado a 3500 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente. Foi adicionado 100 μl da amostra em 100 μl do reagente de Griess (0,1% nafitil e 1% de sulfanilamida em 5% de ácido fosfórico) em placa de 96 poços. Os valores de absorbância foram medidos em OD 570 nm e comparados a uma curva padrão (solução de nitrito de sódio), a fim de determinar a concentração de NO2-. 51 2.2.8 Dano ao DNA pelo ensaio cometa Desenvolvido por Singh e col.(1988) e, posteriormente, modificado por Anderson e col.(1994), é uma importante ferramenta utilizada nos estudos de biomonitoramento populacional. É um teste muito sensível para a detecção de vários tipos de danos causados no DNA (quebra de fitas dupla ou simples, danos oxidativos e ligações cruzadas) induzidos por compostos genotóxicos (FAUST e col., 2004). Para realização do cometa, foram preparadas previamente lâminas cobertas por solução de agarose de ponto de fusão normal a 1,5%. Posteriormente, foram mantidas em temperatura ambiente até a solidificação da agarose. Essa camada foi utilizada para promover a adesão da segunda camada de agarose de baixo ponto de fusão. As células MRC-5 PD 19 foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 2,5x105 células/poço e mantidas por 24 horas na estufa com atmosfera de 5% de CO 2 a 37 ºC. Após esse tempo, foi realizado o tratamento com o A3BP nas concentrações 31 µM, 62 µM e 124 µM por 3 horas. Após o tratamento, as células foram lavadas para obtenção das células aderidas, transferidas para um tubo de 15 mL e centrifugadas por 5 minutos a 1000 rpm. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em aproximadamente 20 µL, da qual foi retirado 15 µL de suspensão e misturados a 300 µL de agarose de baixo ponto de fusão a 0,8%. Em seguida, a suspensão de células foi aplicada rapidamente sobre a primeira camada de agarose, sendo a lâmina, então, coberta com a lamínula (24x60 mm) e mantida em baixa temperatura por 7 minutos até solidificar a agarose. Depois, a lamínula foi retirada e a lâmina mergulhada na posição vertical em solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100, 10% DMSO e 1% n-lauroil sarcosinatode sódio; pH 10) a 4 ºC e protegida da luz por um período de 24 horas. Em seguida, as lâminas foram dispostas horizontalmente em cuba de eletroforese e preenchida com tampão de eletroforese (1 mM EDTA, 300 mM NaOH; pH ≥ 13). As lâminas foram mantidas em repouso por vinte minutos antes de dar início à eletroforese, a fim de se permitir o desnovelamento do DNA, o afrouxamento de suas ligações e a exposição dos sítios álcali-lábeis. Após esse processo, a eletroforese foi conduzida em baixa luminosidade por vinte minutos, com 34 V e uma corrente de 300 mA. Depois da corrida eletroforética, as lâminas foram retiradas e mergulhadas rapidamente em água destilada gelada (4 ºC) para a remoção da solução de eletroforese. Elas foram fixadas mergulhando-as em etanol absoluto por três minutos. As células foram contadas em microscópio de fluorescência com 50µL de Brometo de etídio (20 µg/mL). A análise foi realizada de acordo com o padrão de escores previamente determinado pelo tamanho e intensidade da cauda do cometa (BURLINSON e col., 2007). Foram contadas 100 cometas/lâmina e classificadas de acordo com a porcentagem de DNA na cauda do 52 cometa, ao indicar o grau de quebra do DNA, onde, 0 = sem danos (<5%), 1 = baixo nível de danos (5-20%), 2 = médio nível de danos (20-40%), 3 = alto nível de danos e 4 = dano total (>95%) (FIGURA 14). A doxorrubicina a 1µM foi usada como controle positivo de citotoxicidade e o controle negativo corresponde ao não tratado. Figura 14: Classificação visual dos danos, representados em uma escala de 0-4, sugeridos por Collins e col.(1997). Imagens de cometas (a partir de linfócitos), coradas com Brometo de Etídio. (Adaptado) Fonte: BURLINSON e col., 2007. Após a contagem das células e atribuição de escores nas duas lâminas de cada amostra, foi estabelecido um índice de dano (ID) e obtida uma média final para cada amostra. O cálculo do índice de dano foi feito através da soma dos produtos do escore como número de danos respectivo a cada nível, como mostra a seguinte fórmula: ID = (0 x n) + (1 x n) + (2 x n) + (3 x n) + (4 x n) Onde: ID é o índice de dano, n é a quantidade de danos obtida por escore. Os dados foram analisados a partir da média ± erro padrão da média de três experimentos independentes. Para verificar a ocorrência de diferença significativa entre os grupos, os dados foram comparados por ANOVA seguida por Teste de Tukey, com nível de significância de 95% (P<0,05). 2.2.9 Dano à membrana plasmática – teste hemolítico em eritrócitos Este método permite avaliar o potencial da substância teste em causar danos na membrana celular, seja pela formação de poros ou pela ruptura total, pela presença de hemoglobina em solução (DOBROVOLSKAIA e col., 2008). Quando a amostra testada causa hemólise em até 1 h de incubação, o mecanismo de ação citotóxica é considerado inespecífico por causar dano direto à membrana. Nesse teste foi avaliada a atividade citotóxica do A3BP na concentração de 250 µg/mL. Para o teste de hemólise, foi utilizado sangue venoso de camundongos Mus musculus Swiss, retirado por punção cardíaca, colocado em solução salina e centrifugado a 1500 rpm por 5 minutos para o preparo de solução de eritrócito a 2%. Desta solução foram utilizados 100 μL em placas de 53 96 poços e mais 100 μL de cada amostra (concentração de 250 μg/mL), Triton X-100 (controle positivo) e DMSO (controle negativo) e 100 μL de salina (branco) em triplicata. A placa foi incubada à temperatura ambiente por 1 hora e centrifugada a 1500 rpm por 5 minutos. A leitura do sobrenadante foi realizada em leitor de placas a 541nm. 2.3 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA IN VIVO 2.3.1 Reagentes Os reagentes utilizados foram: k-carragenina (C22048), Celecoxib (PZ0008), Ácido acetilsalicílico (A5376), Ácido 3-benzoil-propiônico (B13802), Ácido fosfórico (V000145), Sulfanilamida (S33626), N-(1-naftil), dicloridrato de etilenodiamina® (E222488), Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, E9884), todos comprados da Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, EUA). 2.3.2 Animais Ratos Wistar machos (120-150 g) e camundongos Mus musculus swiss machos (4045 g) foram adquiridos a partir do Centro de Animais da Universidade Federal do Pará (Belém, Pará, Brasil) e mantidos na unidade de animal experimental do Laboratório de Neuroinflamação. Os animais foram alojados sob temperatura controlada (22 ± 1 ºC), em ciclo de 12 h dia/noite e água ad libitum. 2.3.3 Preparação da bolsa de ar e indução do processo inflamatório As bolsas de ar foram realizadas como descrito por Tao e col. (1999) e Bastos e col. (2008). O ar estéril foi obtido por meio de captação dentro de uma câmara de fluxo laminar para evitar a contaminação. As bolsas foram insufladas com 20 ml de ar injetado na área intraescapular e, em seguida, re-insufladas com mais 10 ml de ar por 2 dias. Após a preparação das bolsas de ar, a inflamação foi induzida por diferentes concentrações de carragenina e tratada com diferentes fármacos anti-inflamatórios padrões. 2.3.4 Coleta das amostras As amostras foram obtidas 16 h após a administração do agente flogístico. Uma pequena incisão foi feita na parede da bolsa e seu conteúdo foi cuidadosamente removido com uma pipeta Pasteur estéril. Para aumentar o volume total de exsudato e melhorar a precisão da medida, 1 ml de PBS (NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2.7 mM, e um pH de 7.4) foi previamente injetada na bolsa de ar. Em seguida, os animais foram submetidos à eutanásia por meio de câmara de CO2, em que foram realizadas avaliações da microvasculatura, da atividade nitrérgica, da migração celular, da contagem de células leucocitárias e dos níveis de prostaglandinas (PGE 2). 54 2.3.5 Dosagem de nitrito As amostras foram inicialmente diluídas 1:20 em PBS e, em seguida, 500 µL de cada amostra diluída forammisturadas com o mesmo volume de reagente de Griess (0,1% nafitileno e 1% de sulfanilamida em 5% de ácido fosfórico) (GREEN e col., 1982). Os valores de absorbância foram medidos em OD 570 nm e comparados a uma curva padrão (solução de nitrito de sódio), a fim de determinar a concentração de NO2-. 2.3.6 Células do exsudato inflamatório O exsudato inflamatório foi obtido pelo método de MayGrünwald-Giemsa para contagem diferencial de células. A diferença de células foi determinada pela contagem em microscópio de 400 células por campo, identificadas por critérios padrões de morfologia, pela morfologia dos núcleos e pela granulação citoplasmática. A contagem de células foi expressa em porcentagem de células totais e valores absolutos (10 6/mL). 2.3.7 Níveis de PGE2 Amostras de exsudato foram diluídas 1:10 em PBS. O nível de PGE 2 foi quantificado com kit ELISA específico para PGE2 (RPN222), GE Healthcare UK Limited Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido). Os valores de absorbância foram medidos em OD 570 nm e a avaliação do desempenho do método do ensaio por enzimas imunoadsorvidas foi utilizada de acordo com o protocolo do manual de instruções do fabricante. 2.4 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA 2.4.1 Reagentes Os reagentes utilizados foram: Ácido 3-benzoil-propiônico (B13802), Ácido acético (1005706), Indometacina (I7378), Solução de Morfina (M-0050) e Solução de Formalina (HT501128), todos obtidos da Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, EUA). 2.4.2 Animais Camundongos Mus musculus swiss machos (40-45 g) foram adquiridos a partir do Centro de Animais da Universidade Federal do Pará (Belém, Pará, Brasil) e mantidos na unidade de animal experimental do Laboratório de Neuroinflamação. Os animais foram alojados sob temperatura controlada (22 ± 1 ºC), em ciclo de 12 h dia/noite e água ad libitum. 2.4.3 Testes de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético Os animais (n=4) foram tratados com o A3BP nas doses de 0,003, 0,03 e 0,3 mg/kg (v.o.). Um grupo de animais recebeu solução salina 0,9% (v.o., grupo controle). O fármaco padrão indometacina (5 mg/kg; v.o.) foi utilizado como controle positivo. Sessenta minutos 55 após cada tratamento foi, administrado o ácido acético (0,6%; 0,1 mL de solução/10 g de animal; i.p.). A reação do animal a esse estímulo foi o desenvolvimento de movimentos repetidos de contração da parede abdominal, rotação do corpo e extensão das patas traseiras. Esse conjunto de reações é denominado contorções abdominais e a intensidade da nocicepção é quantificada como o número total de contorções abdominais durante o período de observação de 20 minutos, iniciando-se 10 minutos após a administração do ácido acético. Os animais, durante o tempo de observação, foram contidos em funis de vidro com diâmetro de aproximadamente 22 centímetros (KOSTER e col., 1959). 2.4.4 Teste da formalina Os animais (n=4) foram tratados com o A3BP nas doses de 0,003, 0,03 e 0,3 mg/kg (v.o.). Sessenta minutos após cada tratamento, os camundongos (n=5) receberam uma injeção intraplantar de formalina a 1% (20 µL/ animal). Após a administração da formalina, o tempo (s) em que o animal passou lambendo a pata traseira direita foi cronometrado em duas fases (0-5 min primeira fase; 20-30 min; segunda fase), sendo considerado tempo zero o momento imediatamente após a administração da formalina. O grupo controle recebeu apenas veículo (salina 0,9%, v.o.). O fármaco padrão morfina (4 mg/kg, i.p.), 30 min antes da formalina, e a Indometacina (10 mg/kg; v.o.), foram utilizados como controles positivos (DUBUISSON; DENNIS, 1977). 2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA Todos os valores experimentais foram apresentados em médias ± DP; o estudo foi do tipo experimental, em que foi usada a estatística descritiva para caracterização da amostra, a Análise de Variância (ANOVA) de um critério para as análises intergrupos, seguida de múltiplas comparações pelo teste de Tukey's. A análise estatística assim como a colocação dos resultados em planilhas de cálculos e a criação de gráficos foram realizadas por meio do GraphPad Prism, versão 5.0 (GraphPad Software, San Diego Califórnia, EUA). O valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. 56 3 RESULTADOS 3.1 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA IN VITRO 3.1.1 Viabilidade celular pelo método do MTT Para assegurar que possíveis mudanças no perfil oxidativo não sejam atribuídas à morte celular, foi testada a citotoxicidade em dois tipos de macrófagos: linhagem J774-A1 e macrófagos de peritônio de camundongos, ambos tratados com o A3BP em 24 e 48 horas. 3.1.1.1 Citotoxicidade em linhagem de J774-A1 A toxicidade do A3BP foi analisada em linhagem de células J774-A1, a fim de verificar se a substância promoveu efeito citotóxico quando tratadas durante 24 e 48 horas. Observouse que, nas concentrações utilizadas (1, 10, 25, 50 e 100 µM), não houve efeito citotóxico (FIGURA 15). Controle (100,0% ± 13,3), A3BP 1 µM (102,1% ± 9,5),10 µM (110,1% ± 15,8), 25 µM (107,6% ± 18,4), 50 µM (106,8% ± 11,2) e 100 µM (112,1% ± 14,1) em 24 horas (a). Controle (100,0% ± 3,8), A3BP 1 µM (112,5% ± 2,0),10 µM (107,4% ± 11,9), 25 µM (96,2% ± 11,1), 50 µM (106,1% ± 5,6) e 100 µM (104,8% ± 2,7) em 48 horas (b). Figura 15: Viabilidade de células J774 sob tratamento com A3BP durante 24 (a) e 48 (b) horas. Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle e o grupo carragenina 1%. Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. 57 3.1.1.2 Citotoxicidade em macrófagos peritoniais A citotoxicidade do A3BP foi analisada em macrófagos obtidos da lavagem peritoneal de camundongos. O tratamento foi realizado durante um período de 24 e 48 horas. Verificouse que a droga não promoveu morte celular em nenhuma das concentrações utilizadas (1, 10, 25, 50 e 100 µM) (FIGURA 16). Controle (100,0% ± 6,9), A3BP 1 µM (82,7% ± 21,5),10 µM (94,0% ± 5,6), 25 µM (110,2% ± 7,1), 50 µM (101,6% ± 5,0) e 100 µM (107,2% ± 10,1) em 24 horas (a). Controle (99,5% ± 7,1), A3BP 1 µM (90,7% ± 8,0),10 µM (93,8% ± 4,9), 25 µM (108,0% ± 9,4), 50 µM (101,0% ± 5,0) e 100 µM (105,8% ± 8,9) em 48 horas (b). Figura 16: Viabilidade de macrófagos de peritônio após tratamento com A3BP por 3h seguido de incubação com LPS por 24 (a) e 48 (b) horas. Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle. Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. 3.1.2 Concentração de nitrito A concentração de nitrito formada foi quantificada em sobrenadante de macrófagos peritoneais tratados com A3BP por 4 horas e estimulados com Lipopolissacáridos de Escherichia coli 0111: B4 (LPS) (1 µg/ml) por 24 horas. Verificou-se que o grupo apenas estimulado com LPS produziu em média 3,42 vezes a mais que o grupo controle (4,6 µM ± 2,0 e 1,0 µM ± 0,5, respectivamente). O A3BP na concentração 25 µM inibiu significativamente a produção de NO2- 49,32% em relação ao grupo apenas estimulado com o LPS (2,3 µM ± 1,3 e 4,6 µM ± 2,0, respectivamente). Na concentração 10 µM o decréscimo foi de 45,6% em relação ao LPS (2,5 µM ± 0,6 e 4,6 µM ± 2,0, respectivamente) (FIGURA 17). 58 Figura 17: Produção de NO2- em macrófagos peritoneais tratados com A3BP e estimulados com LPS (1µg/ml). Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle e o grupo carragenina 1%. Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. 3.1.3 Dano ao DNA pelo ensaio cometa Para avaliar se o tratamento com A3BP poderia causar dano ao DNA, foi realizado o ensaio de cometa versão alcalina em células MRC-5 (PD 19) tratadas por 72 h com A3BP nas concentrações de 31, 62 e 124 µM. Como demonstrado na Figura 18, o tratamento com A3BP em nenhuma das concentrações testadas demonstrou índice de dano ao DNA significativo em comparação ao controle não tratado (P >0,05). O tratamento com doxorrubicina (Doxo 1,0 μM) foi efetuado como controle positivo de indução de dano ao DNA, o qual demonstrou índice significativo em comparação ao controle negativo (*P < 0,05). Figura 18: Avaliação do índice de dano ao DNA de células MRC-5 (PD19) tratadas com A3BP por 72 h analisado pelo ensaio de Cometa versão alcalina. O tratamento com A3BP não demonstrou diferença significativa em comparação ao controle negativo. A doxorrubicina (Doxo 1.0 μM) foi utilizada como controle positivo. Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey, com *P<0,05 em comparação ao controle negativo. 3.1.4 Dano à membrana plasmática – teste hemolítico em eritrócitos O A3BP foi submetido ao teste hemolítico em células de eritrócitos de camundongos Mus musculus swiss, in vitro, para avaliar a viabilidade das células eritrocitárias na presença da droga. As células foram incubadas com A3BP 250 µg/mL por 1 hora. Conforme a Figura 19, o material testado não mostrou qualquer atividade hemolítica: controle (Salina 0,9%, 0,1 59 nm ± 0,0), controle + (Triton X-100, 0,3 nm ± 0,0), controle – (DMSO, 0,1 nm ± 0,0) e A3BP 250 µg/mL (0,1 nm ± 0,0). Figura 19: Teste hemolítico com o A3BP em células de eritrócitos de camundongos Mus musculus swiss não mostrou qualquer atividade hemolítica. As misturas foram centrifugadas para detectar a presença de hemoglobina (vermelho) por absorção a 541 nm. Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle. Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. 3.2 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA IN VIVO 3.2.1 Concentração de nitrito A fim de determinar se a via de NO desempenha um papel importante na resposta inflamatória induzida com a solução de carragenina 1% e no pré-tratamento da inflamação com o A3BP nas doses de 0,005, 0,05 e 0,5mg/kg, a produção de NO2- foi medida no exsudado inflamatório. Como demostrado na Figura 20, a carragenina aumentou significativamente (P<0,05) a concentração de NO2- comparada ao grupo controle. Todos os grupos pré-tratados com o A3BP e Ibuprofeno promoveram diminuição nos níveis de NO2-. Controle (salina 0,9%) (0,87 μM ± 0,87); carragenina 1% (11,57 μM ± 0,89); A3BP 0,005 mg/kg (3,64 μM ± 0,34); A3BP 0,05 mg/kg (1,97 μM ± 0,70); A3BP 0,5 mg/kg (1,01 μM ± 0,30); Ibuprofeno 10 mg/kg (1,20 μM ± 0,48). Todos os grupos tratados apresentaram diferença estatisticamente significativa quando comparados ao grupo carragenina (P<0,05). Figura 20: A3BP inibiu a produção de NO2- na inflamação induzida por carragenina 1%. Valores são expressos em média ± S.E.M. de 4 ratos cada grupo. Grupo controle (solução salina 0,9%); grupo carragenina 1%; grupo carragenina 1% pré-tratado com 0,005 mg/kg de A3BP; grupo carragenina 1% pré-tratado com 0,05 mg/kg de A3BP; grupo carragenina 1% pré-tratado com 0,5 mg/kg de A3BP. Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle e o grupo carragenina 1%. Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. 60 3.2.2 Migração celular A fim de determinar se a migração de células inflamatórias ocorreu no local da lesão, foi avaliado o número total de células presentes no exsudado induzido com a solução de carragenina 1% e no pré-tratamento da inflamação com o A3BP nas doses de 0,005, 0,05 e 0,5 mg/kg. Como mostrado na Figura 21, a carragenina aumentou significativamente (P<0,05) a migração celular comparada ao grupo controle. Todos os grupos pré-tratados com o A3BP e Ibuprofeno promoveram diminuição na migração celular: controle (salina 0,9%) (18,50x10 7 ± 1,91 células/ml); carragenina 1% (270,25x10 7 ± 11,32 células/ml); A3BP 0,005 mg/kg (86,33x107 ± 23,29 células/ml); A3BP 0,05 mg/kg (59,50x107 ± 23,44 células/ml); A3BP 0,5 mg/kg (36,00x107 ± 28,18 células/ml); Ibuprofeno 10 mg/kg (27,75x107 ± 13,02 células/ml). Todos os grupos tratados apresentaram diferença estatisticamente significativa quando comparado ao grupo carragenina (P<0,05). Figura 21: A3BP inibiu a migração celular na inflamação induzida por carragenina 1%. Valores são expressos em média ± S.E.M. de 4 ratos cada grupo. Grupo controle (solução salina 0,9%); grupo carragenina 1%; grupo carragenina 1% pré-tratado com 0,005 mg/kg de A3BP; grupo carragenina 1% pré-tratado com 0,05 mg/kg de A3BP; grupo carragenina 1% pré-tratado com 0,5 mg/kg de A3BP. Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle e o grupo carragenina 1%. Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. 3.2.3 Contagem diferencial de células leucocitárias A contagem diferencial de leucócitos foi realizada para identificar tipos de células induzidas com a solução de carragenina 1% e no pré-tratamento da inflamação com o A3BP nas doses de 0,005, 0,05 e 0,5 mg/kg. A análise dos dados da Figura 22 mostra grande população de neutrófilos (FIGURA 22a), seguida por linfócitos (FIGURA 22b), monócitos (FIGURA 22c) e eosinófilos (FIGURA 22d): Neutrófilos (58,7x10 6 ± 3,7 células/ml); linfócitos (14,5x106 ± 1,3 células/ml); monócitos (7,0x106 ± 1,0 células/ml); eosinófilos (1,0x10 6 ± 0,4 células/ml). 61 a) b) c) d) Figura 22: A3BP na contagem diferencial de células leucocitárias: neutrófilos (a), linfócitos (b), monócitos (c) e eosinófilos (d) na inflamação induzida por carragenina 1%. Os valores são expressos em média ± S.E.M. de 4 ratos cada grupo. Grupo controle (solução salina 0,9%); grupo carragenina 1%; grupo carragenina 1% pré-tratado com 0,005 mg/kg de A3BP; grupo carragenina 1% pré-tratado com 0,05 mg/kg de A3BP; grupo carragenina 1% pré-tratado com 0,5 mg/kg de A3BP. Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle e o grupo carragenina 1%. Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. 62 3.2.4 Valores de PGE2 Avaliação do efeito do A3BP nos valores do mediador anti-inflamatório PGE2 na inflamação induzida com carragenina 1%. Como mostrado na Figura 23, a análise dos valores de PGE2 foi realizada em grupos induzidos por carragenina 1%. A carragenina aumentou significativamente (P<0,05) os valores de PGE2 comparado ao grupo controle. Todos os grupos pré-tratados com o A3BP e Ibuprofeno promoveram diminuição nos valores de PGE 2: controle (salina 0,9%) (460,96 pg/ml ± 62,64); carragenina 1% (39845,55 pg/ml ± 2120,25); A3BP 0,005 mg/kg (35872,83 pg/ml ± 562,28); A3BP 0,05 mg/kg (32612,05 pg/ml ± 1738,89); A3BP 0,5 mg/kg (18336,12 pg/ml ± 6991,81); Ibuprofeno 10 mg/kg (14928,56 pg/ml ± 3113,35). Os grupos tratados com A3BP 0,5 mg/kg e Ibuprofeno 10 mg/kg apresentaram diferença estatisticamente significativa quando comparado ao grupo carragenina (P<0,05). Figura 23: A3BP nos valores de PGE2 na inflamação induzida por carragenina 1%. Valores são expressos em média ± S.E.M. de 4 ratos cada grupo. Grupo controle (solução salina 0,9%); grupo carragenina 1%; grupo carragenina 1% pré-tratado com 0,005 mg/kg de A3BP; grupo carragenina 1% pré-tratado com 0,05 mg/kg de A3BP; grupo carragenina 1% pré-tratado com 0,5 mg/kg de A3BP; grupo carragenina 1% pré-tratado com 10 mg/kg de Ibuprofeno. Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle e o grupo carragenina 1%. Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. 3.3 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA 3.3.1 Atividade analgésica periférica A atividade analgésica periférica foi avaliada pelo número total de contorções abdominais após a administração do ácido acético 0,6% no tratamento com o A3BP nas doses 0,003 e 0,03 mg/kg (FIGURA 24). As doses 0,003 e 0,03 mg/kg reduziram o número de contorções abdominais em 54,5% e 65,2%, respectivamente, quando comparadas ao grupo controle (salina 0,9%). A indometacina (5 mg/kg), AINEs utilizado como droga padrão nesse teste, diminuiu em aproximadamente 79,1% o número de contorções abdominais quando comparada ao grupo controle. 63 Figura 24: Efeito do A3BP e da Indometacina sobre o estímulo nociceptivo induzido pela injeção intraperitoneal de ácido acético 0,6% em camundongos. Observa-se redução significativa nos grupos A3BP (0,003 e 0,03 mg/kg) e indometacina (5 mg/kg) comparados ao grupo controle. Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle. Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. 3.3.2 Teste de Formalina Para confirmação do efeito antinociceptivo do A3BP, foi utilizado o teste de nocicepção induzida pela injeção intraplantar de formalina (FIGURA 25). O A3BP nas doses 0,003 e 0,03 mg/kg reduziu de maneira significante o tempo de lambida em relação ao grupo controle do teste da formalina na fase 1 (fase neurogênica) em 42 e 62%, respectivamente, e, na fase 2 (fase inflamatória), em 39 e 45%, respectivamente. A Morfina (4 mg/kg), analgésico opioide, reduziu de maneira significante as duas fases em 82,6 e 85,3%, assim como a Indometacina (10 mg/kg) também reverteu o efeito da formalina a 1% nas duas fases em 56 e 55% (FIGURAS 25a e 25b). Figura 25: Efeito do A3BP, da Indometacina e da Morfina sobre o estímulo nociceptivo induzido pela injeção intraplantar de formalina a 1% em camundongos. Observa-se redução significativa nos grupos A3BP (0,003 e 0,03 mg/kg) e indometacina (5 mg/kg) comparados ao grupo controle. Foi adotado um P<0,05 na comparação com o grupo controle. Diferenças entre os grupos foram examinadas por meio da análise de variância (ANOVA) e a correção por meio do Teste de Comparação Múltipla de Tukey. 64 4 DISCUSSÃO Cirino e col. (1996), em pesquisa da viabilidade celular com células da linhagem J774, tratadas com os AINEs Flurbiprofeno, Aspirina ®, Cetoprofeno, Naproxeno, Diclofenaco e Ketorolac, mostraram que nenhum desses compostos afetou significativamente a membrana mitocondrial na viabilidade celular pelo método de MTT, sugerindo que esses AINEs não são citotóxicos para as células J774, mesmo na maior concentração utilizada; assim como os AINEs acima citados, o A3BP também não mostrou efeito citotóxico nas concentrações utilizadas durante 24 e 48 horas na mesma linhagem celular. A análise da viabilidade de macrófagos peritoneais foi realizada, pois é comum o uso desse tipo celular em testes in vitro para demonstrar a ação anti-inflamatória de drogas em cultura, na qual foi utilizado o LPS como agente ativador dos macrófagos e avaliado se a exposição à droga teste foi capaz de inibir essa ativação, aferida pela medição de metabólitos do processo inflamatório, tal como a de NO2- liberado no meio de incubação (ADAMS; HAMILTON, 1984). Por essa razão, foi avaliada a viabilidade de macrófagos peritoneais pelo método do MTT; o resultado mostrou que o tratamento por 3h com A3BP em diferentes concentrações, seguido pela incubação com LPS por 24h ou 48h, não prejudicou a viabilidade celular. Nesse teste foi realizada a incubação com A3BP em diferentes concentrações até 100 μM e mostrar assim que tais concentrações puderam ser testadas quanto à capacidade de inibição da ativação do macrófago, sem correr o risco de um falso resultado como agente antiinflamatório. Na aferição de metabólitos da ativação dos macrófagos pelo LPS no meio de cultura, tais como NO2-, o A3BP nas concentrações utilizadas na pesquisa inibiu significativamente, cerca de 50% e 45%, a produção de nitrito em relação ao grupo estimulado com o LPS. Cirino e col. (1996), em pesquisa relacionada à produção dos níveis de óxido nítrico em antiinflamatórios não esteroides (AINEs-NO) sobre a indução de óxido nítrico (NO) sintase em células tratadas com Flurbiprofeno, Aspirina ®, Cetoprofeno, Naproxeno, Diclofenaco e Ketorolac, mostraram marcada redução, cerca de 40%, dos níveis de nitrito em células da linhagem J774 estimuladas com LPS. Para confirmar então se o tratamento com A3BP de fato poderia causar a morte de células MRC-5 PD19, foi realizado o ensaio cometa, capaz de demonstrar dano ao material nuclear. Em diversos eventos de morte celular programada, ocorre fragmentação do DNA; desse modo, um índice elevado de dano ao DNA poderia sugerir maior taxa de morte por apoptose provocada pela droga (VANDGHANOONI; ESKANDANI, 2011). Outra possibilidade de índice elevado de dano ao DNA seria por ação genotóxica diretamente da droga no DNA da célula (AZQUETA; COLLINS, 2013). Nossos resultados 65 mostraram que o tratamento com A3BP não causou aumento no índice de dano ao DNA, sendo sugestivo que a redução na viabilidade verificada no ensaio Cometa não foi por induzir apoptose, o que reforça a ideia de que a diminuição na viabilidade verificada decorreu principalmente de um efeito sobre a proliferação celular. Em geral, o ensaio para avaliação da capacidade hemolítica in vitro é utilizado como método de triagem tóxica ao estimar o dano eritrocitário que poderá induzir in vivo (APARICIO e col., 2005). Tal parâmetro vem sendo utilizado pela comunidade científica para avaliação toxicológica de diferentes plantas, drogas ou compostos (OLIVEIRA e col., 2009). Assim como Andrade (2012), em pesquisa da atividade hemolítica do Ibuprofeno associado à Metilcelulose MCM-41, a análise da biodisponibilidade desse derivado do ácido 2-arilpropiônico não mostrou qualquer atividade hemolítica das amostras estudadas independente da associação do Ibuprofeno; o resultado com o A3BP, também um derivado do ácido 2-arilpropiônico, não evidenciou qualquer atividade hemolítica em células eritrocitárias. No estudo da atividade anti-inflamatória in vivo, o uso da bolha de ar subcutânea como modelo experimental tem sido descrito em diversos trabalhos (EDWARDS; SEDGWICK; WILLOUGHBY, 1981; BASTOS e col., 2008). Esse modelo é utilizado para realizar análise quantitativa dos fatores envolvidos no processo inflamatório, por meio da formação de um espaço elíptico simétrico, criado pela injeção de ar no tecido subcutâneo de ratos (SELYE, 1953). O exame dessa cavidade durante os dias subsequentes à primeira injeção de ar demonstra a presença de uma superfície contendo células conjuntivas com estrutura e aspectos histoquímicos semelhantes aos encontrados em cavidades sinoviais. Essa semelhança tem sido observada utilizando-se um modelo experimental de no máximo seis dias (EDWARDS; SEDGWICK; WILLOUGHBY, 1981). Embora existam outros modelos experimentais para estudar a resposta inflamatória aguda, como a cavidade pleural e cavidade peritoneal, a bolha de ar subcutânea apresenta a vantagem de ser de fácil aplicação técnica, a análise do fluído é simples, podendo ser repetida com traumas mínimos (SEDGEWICK e col., 1985). Esse modelo é útil para a remoção de células inflamatórias, para medições da quimiotaxia e da produção de mediadores químicos inflamatórios, tais como o NO, as células inflamatórias e a PGE2 (EDWARDS; SEDGWICK; WILLOUGHBY, 1981; TAO e col., 1999; ELLIS e col., 2000; BASTOS e col., 2008). O NO é uma molécula lipofílica pequena que pode ser rapidamente difundida através das barreiras da membrana celular e alcançar os compartimentos intracelulares de células adjacentes com funções diversificadas (IGNARRO, 1990). O NO produzido pela enzima NOS tem seu papel na inflamação e na neuromodulação estudada extensivamente (GRIFFITH; STUEHR, 1995), ao participar de diversas funções biológicas, desde a formação de um 66 mecanismo de proteção contra microrganismos até a regulação da pressão sanguínea e o processo de neurotransmissão (ALDERTON e col., 2001). Masukawa, Nakanishi e Natsuki (1998) consideram o NO como mensageiro neuronal do sistema nervoso central e modulador de várias funções cerebrais, tanto que diversas pesquisas relacionam a enzima NOS ao uso do Fenbufeno em potenciais atividades convulsivas em ratos (KOHNO e col., 1997; MASUKAWA; NAKANISHI; NATSUKI, 1998; ABDEL-ZAHER e col., 2012). Sautebin (2000) demonstrou que esse radical livre possui atividade regulatória antiinflamatória por meio das formas constitutivas, ou seja, em concentrações basais; entretanto, quando o NO é gerado pela forma induzida da enzima NOS (iNOS), promove a inflamação e disfunção tecidual, e, portanto, possui propriedades pró-inflamatórias e deletérias que, para Costa e col. (2006), os efeitos pró-inflamatórios desse radical incluem o aumento da permeabilidade vascular dos tecidos inflamados. A determinação dos níveis dos produtos finais NO na resposta inflamatória induzida com a solução de carragenina foi medida no exsudado inflamatório, ao mostrar que, em todos os grupos pré-tratados com as doses do A3BP, assim como com outro derivado do ácido 2-aril-propiônico, o Ibuprofeno promoveu diminuição dos níveis de NO2-. O recrutamento de leucócitos da circulação sanguínea é uma reação crucial para o processo inflamatório. Esta ação ocorre por meio de diversos passos em que o leucócito interage com o endotélio (CREWS, 2006). Os leucócitos se aderem ao endotélio microvascular e, por conseguinte, ocorre a transmigração dessas células através da parede dos vasos, as quais extravasam atingindo desta forma o tecido extravascular. Diversos fármacos têm objetivado impedir a migração celular como forma de amenizar o processo inflamatório (ULBRICH e col., 2003). Porém, quando se trata da inflamação, também é importante lembrar que a transmigração de leucócitos através do endotélio vascular e seu acúmulo nos tecidos inflamados são os principais eventos de uma resposta inflamatória eficaz (DOMÍGUEZ-LUIS e col., 2013). Na avaliação da migração de células inflamatórias presentes no exsudado induzido com a solução de carragenina, todos os grupos pré-tratados com as três doses do A3BP e com o Ibuprofeno promoveram diminuição na migração celular, concordando com Benez e col.(2013), os quais relataram a grande capacidade do Ibuprofeno na redução do edema com consequente redução na migração de leucócitos em estudo comparativo das atividades citotóxicas e ulcerogênicas das formas do Ibuprofeno racêmico e “S” na inflamação presente na bolsa de ar. A avaliação das células que atuam no processo inflamatório tem sido alvo de diversos estudos (SHALABY e col.,1989; DEFORGE e col., 1992). A migração celular em resposta a processos inflamatórios é vista em poucas horas após o estímulo que está causando a injúria tecidual, havendo recrutamento de neutrófilos para o local onde está ocorrendo o dano 67 tecidual (BRESNIHAN, 2002; SHIN e col., 2009). Os efeitos do A3BP não demonstraram curva dose-resposta nos resultados de migração celular e de avaliação dos níveis de NO, visto o platô da curva farmacológica presente nesses resultados; isso pode ser devido à janela terapêutica da droga ou às doses utilizadas na pesquisa. Em relação à contagem diferencial de leucócitos realizada para identificar tipos de células induzidas com a solução de carragenina no pré-tratamento da inflamação, o A3BP mostrou grande população de neutrófilos em todas as amostras estudadas, seguido por pequena quantidade de linfócitos, monócitos e eosinófilos, concordando com o estudo de Jiang e col.(1997), os quais relataram que, na maioria das formas de inflamação aguda, os neutrófilos predominam no infiltrado inflamatório durante as primeiras 6 a 24 horas. Muito embora os neutrófilos sejam as primeiras células na remoção de agentes patogênicos como bactérias, eles também contribuem para o processo inflamatório, ao liberar mediadores inflamatórios, incluindo os que atraem macrófagos para o local da inflamação (CHABAUD, 1998). Os macrófagos, por sua vez, liberam citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α (Day, 2002 apud Shin e col., 2009). Este é um estimulador de iNOS em certos tipos celulares e induz a quimiotaxia de neutrófilos e linfócitos T e a expressão de moléculas de adesão (XIE; WHISNANT; NATHAN, 1993; ADAMS e col., 2002; SHIN e col., 2009). As pesquisas com os derivados do ácido 2-aril-propiônicos, como o Ibuprofeno e o Cetoprofeno, fazem comparação, principalmente, nos níveis de PGE 2, entre as formas “S” e racêmica, onde a redução nos níveis de PGE 2 foi encontrada na inflamação presente na bolsa de ar em estudo comparativo das atividades citotóxicas e ulcerogênicas nas formas do Ibuprofeno racêmico e S-Ibuprofeno (BENEZ e col., 2013). Outro estudo realizado, desta vez com Cetoprofeno racêmico e S-Cetoprofeno, também mostrou redução da atividade de PGE 2 nas duas formas na inflamação da mucosa intestinal em ratos (ALARCON DE LA LASTRA e col., 2002). Assim como nas pesquisas com os dois derivados do ácido 2-aril-propiônicos acima mostradas, houve redução nos níveis de PGE2; nos resultados aqui apresentados, também houve redução significativa dos valores de PGE2 com as doses de Ibuprofeno e A3BP na dose de 0,5 mg/kg. Em relação à nocicepção, o estímulo da dor pode apresentar intensidade suficiente para causar lesão tecidual associada à liberação de numerosos mediadores inflamatórios (JULIUS; BASBAUM, 2001). A dor combatida constantemente tem como medicamento mais prescrito para este fim os AINEs com sua dupla ação de interferir no sistema das prostaglandinas, grupo de substâncias que interagem e são em parte responsáveis pela sensação de dor; e também, de reduzir a inflamação, o edema e a irritação que muitas vezes rodeia uma ferida e aumenta a dor (ESPINOSA e col., 2014). Com o intuito de avaliar a atividade antinociceptiva do A3BP, vários testes foram realizados, entre eles, o de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético 0,6%, modelo experimental usado para avaliar possíveis efeitos antinociceptivos periféricos de natureza 68 anti-inflamatória, uma vez que o ácido acético, na concentração usada, induz a dor indireta que ocorre em consequência de uma inflamação aguda no peritônio (IKEDA e col., 2001). Por conseguinte, a inflamação provocada ocasiona a liberação de prostaglandinas, o suficiente para produzir espasmos traduzidos em contorções (MIRANDA e col., 2001; LAPA e col., 2003; CUNHA; SILVA; TURATTI, 2003). Acredita-se ainda que o ácido acético atue indiretamente ao causar a liberação de mediadores endógenos envolvidos na modulação da nocicepção, incluindo bradicinina, serotonina, histamina e prostaglandinas (WHITE, 1964; LEI e col., 2008). Além disso, a nocicepção induzida pelo ácido acético depende da liberação de citocinas como IL-1, TNF-α e a IL-8, a partir de macrófagos e basófilos residentes na cavidade abdominal e, em conjunto com outros mediadores, podem induzir a nocicepção característica observada nesse modelo (RIBEIRO; VALE; THOMAZZI, 2000; IKEDA e col., 2001). As doses testadas do A3BP reduziram o número de contorções abdominais em relação ao grupo controle. A dose 0,03 mg/kg foi tão eficaz quanto a indometacina, um AINEs, utilizado como droga padrão neste teste, na capacidade de reduzir as contorções abdominais em camundongos. O teste de formalina talvez seja o modelo mais utilizado de dor clínica, em que a primeira fase parece ser devida à estimulação química direta dos nociceptores, enquanto a segunda fase é dependente da inflamação periférica e modificações no processamento central (TJOLSEN; BERGE; HUNSKAAR, 1992; CAPONE; ALOISI, 2004). Esse teste permite evidenciar duas fases de sensibilidade dolorosa: - a primeira fase que ocorre durante os primeiros cinco minutos após a injeção da formalina (nocicepção de origem neurogênica) resulta de estímulo químico direto de fibras aferentes nociceptivas mielinizadas e não mielinizadas, principalmente a fibra C, a qual pode ser suprimida por drogas analgésicas opioides como a morfina (HUNSKAAR; BERGE; HOLE, 1985; AMARAL e col., 2007; GONÇALVES e col., 2008). Resultados experimentais demonstram que a substância P e a bradicinina participam da primeira fase (VANEGAS; SCHAIBLE, 2004); - a segunda fase ocorre entre 15 a 30 minutos após a injeção da formalina, em que mediadores inflamatórios formados nos tecidos periféricos, como as prostaglandinas, serotonina, histamina e bradicinina, induzem mudanças funcionais nos neurônios do corno dorsal que, ao longo do tempo, promove a facilitação da transmissão em nível espinhal. Essa evidência sugere que o processo de inflamação periférica está envolvido na segunda fase (HUNSKAAR; HOLE, 1985; FRANÇA e col., 2001; OLIVEIRA; SOUSA; ALMEIDA, 2008). O A3BP nas doses testadas reduziu de maneira significativa o tempo de lambida em relação ao grupo controle nas fases neurogênica e inflamatória do teste de formalina. A morfina, analgésico opioide, e a Indometacina, fármaco anti-inflamatório de natureza não esteroidal, reduziram de maneira significativa as duas fases. 69 5 CONCLUSÃO O presente estudo avançou substancialmente em relação às propriedades antiinflamatórias e analgésicas do A3BP por meio da avaliação da atividade antinociceptiva, assim como da atividade anti-inflamatória in vitro e in vivo, onde o A3BP não demonstrou qualquer efeito em ensaios de citotoxicidade e genotoxicidade com macrófagos peritoneais de camundongos e em cultura secundária de células da linhagem J774 e de células MRC-5, bem como não mostrou qualquer atividade hemolítica das amostras estudadas com células eritrocitárias. Os efeitos do A3BP também não demonstraram curva dose-resposta nos resultados de migração celular e de avaliação dos níveis de NO, assim como demostraram grande população de neutrófilos nas amostras estudadas. Na avaliação da atividade antinociceptiva, o A3BP reduziu o número de contorções abdominais em camundongos de maneira tão eficaz quanto AINEs padrões, ao reduzir ainda o tempo de lambida na fase inflamatória do teste de formalina, não sendo eficaz na fase neurogênica. Vale ressaltar ainda, os resultados do A3BP com a baixa dosagem testada em comparação com as outras drogas derivadas do ácido 2aril-propiônico já amplamente difundidas. Contudo, os resultados aqui demonstrados são baseados em dados experimentais que precisam ser mais bem aprofundados para a aplicação terapêutica, havendo assim a necessidade de novos experimentos na avaliação do ágar como agente flogístico e da possível reação da síntese do ácido 3-benzoil-propiônico, a fim de promover maior especificidade a esta droga. 70 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABDEL-ZAHER, A.O.; AFIFY, A.H.; KAMEL, S.M.; FARGHALY, H.M.; EL-OSELY, G.M.; ELAWAAD, E.A. 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Seu trabalho de tese versará sobre: PROCESSOS INFLAMATÓRIOS, NOVAS PERSPECTIVAS: ESTUDO E ADAPTAÇÃO DE MODELO EXPERIMENTAL E ESTUDO DE DROGAS ANTIINFLAMATÓRIAS Atenciosamente, Belém, 27 de dezembro de 2011. 84 ANEXOS 85 ANEXO A 86 ANEXO B
