bactérias diazotróficas do gênero burkholderia
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1 BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS DO GÊNERO BURKHOLDERIA : ISOLAMENTO, DIVERSIDADE E CARACTERIZAÇÃO EM PLANTAS DE ARROZ NO CERRADO DE GOIÁS Marília Emanueli Siqueira de Oliveira 1,4 ; Simone Silva Rezende3,4; Claudia Cristina Garcia Martin Didonet2,4. 1 Bolsista PIBIC/CNPq Pesquisadora – Orientadora 3 Bolsista PBIC/UEG 4 Curso de Farmácia, Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas, UEG 2 1.Resumo O arroz é uma das culturas mais importantes no Brasil tanto como alimento quanto de geração de renda, e no cerrado, corresponde à cerca de 30% da produção nacional. A possibilidade de utilização no cultivo de arroz da Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN), mediada por bactérias diazotróficas, pode fornecer o nitrogênio necessário para o seu cultivo sem diminuir a produtividade. Assim, neste trabalho foram isoladas bactérias fixadoras da rizosfera de plantas de arroz (genótipo BRA02601), preferencialmente do gênero Burkholderia. As bactérias isoladas de raiz esterilizadas de arroz foram caracterizadas morfológica e bioquimicamente com teste de crescimento em 6 fontes de carbono capacidade de fixação de nitrogênio, redução de nitrato e crescimento em antibiótico; teste de catalase e urease; e coloração de Gram. Foram isoladas 75 bactérias e 20 selecionadas para as caracterizações. Os resultados foram utilizados para elaboração de dendrograma. Dos 20 isolados testados 19 foram considerados Burkholderia e 18 isolados fixadores de nitrogênio. Os microorganismos isolados constituíram a coleção de cultura de microrganismos diazotróficos de raiz de arroz para serem utilizados em ensaios de bioinoculação para esta cultura. A coleção poderá ser utilizada em outros estudos auxiliando na determinação da biodiversidade dos microrganismos do cerrado. Palavras-chave: Arroz. Diazotróficos. Burkholderia sp. 2.INTRODUÇÃO Os microrganismos representam bases importantes em processo biológicos nas cadeias alimentares e nos ciclos bioquímicos. Embora sejam organismos bastante complexos em termos de diversidades químicas e moleculares, o interesse em estudar bactérias que usam o nitrogênio como substrato tem sido relevante, visto que estes podem servir como inoculantes e proporcionar produções agrícolas rentáveis e ecologicamente corretas. Entre os vários 2 microrganismos fixadores de nitrogênio em plantas, o gênero Burkholderia está presente e constituem alto potencial agrícola e biotecnológico (PERIN et al., 2006). O arroz (Oryza sativa L.) é o principal cereal utilizado na dieta humana. Sendo uma cultura adaptada sob condições de inundação, portanto sensível à seca quando cultivado em condições de sequeiro (GUIMARÃES et al., 1999). O nitrogênio representa um fator critico para o seu crescimento por isso a cultura do arroz é altamente dependente de fertilizantes, principalmente os nitrogenados, que aumentam a poluição do ambiente, contaminam os mananciais com nitrato, acidificam o solo e emitem gases como N2 O. (STOLTZFUS et al., 1997). A fixação biológica de nitrogênio (FBN) é um grande suporte para se conseguir altas produções no campo, aliada a um equilíbrio com o meio ambiente e a racionalização dos custos (GUIMARÃES et al., 1999). Desde os anos 80, o potencial para a utilização da FBN em arroz vem sendo investigado (LADHA et al., 1998). A associação ou simbiose de diazotróficos, assim como o isolamento destes, vêm sendo estudadas em diferentes variedades de arroz, em vários países do mundo. É através da fixação biológica de nitrogênio tanto no arroz como em outras plantas, que estas podem obter o nitrogênio necessário para seu metabolismo. Em função disso a utilização de microorganismos diazotróficos no cultivo do arroz pode integrar o metabolismo de nitrogênio, proporcionando um aumento da produção de grãos (LADHA et al., 1998). Além do nitrogênio, a absorção de outros nutrientes é também favorecida por estas associações, principalmente pelo aumento do sistema radicular. Como há uma grande interdependência entre solo, planta e microrganismo é de se esperar que estirpes de diazotróficos diferentes possam ocorrer em arroz nos solos de cerrado em Goiás, por isso o isolamento de microrganismos da região é essencial. O estado de Goiás vem se destacando na produção de arroz cultivado em condições de sequeiro e estudos a respeito de microrganismos diazotróficos associados ao arroz merecem destaque. Assim este projeto tem como objetivo o isolamento, caracterização e estudo da diversidade de bactérias diazotróficas, preferencialmente do gênero Burkholderia, associadas à planta de arroz, sendo que os organismos obtidos serão posteriormente testados como bioinoculantes em ensaios realizados pela Embrapa Arroz e Feijão. Este estudo ainda propicia, em longo prazo, a obtenção de bactérias que poderão ser utilizadas em estudos de bioprospecção, para utilização da biodiversidade de microrganismos do cerrado. 3.MATERIAL E MÉTODO 3 Material vegetal: As plantas foram fornecidas pela Embrapa Arroz e Feijão, Santo Antônio de Goiás, GO. A raiz de 3 plantas de arroz de sequeiro em sistema de plantio direto, genótipo BRA02601, foi utilizada como amostra. Preparo do extrato - As raízes das plantas foram cortadas e lavadas. O processo de esterilização superficial foi realizado segundo Döbereiner; Baldani; Baldani, (1995). A partir da extração foi realizada a etapa da diluição seriada e plaqueamento em meio semi-seletivo. Isolamento - O extrato das raízes esterilizadas foi diluído seriadamente de 10-2 a 10-9 sendo inoculado 100 uL da amostra que foram espalhadas com alça de Drigalski, em placas contendo o meio JMVe semi-seletivo para Burkholderia. Deste ensaio foi realizada a contagem e a coleta de microrganismos para o estudo. Caracterização morfológica - Para esta caracterização dos isolados foram considerados os critérios a partir da colônia : forma; elevação; bordas; superfície; estrutura; caracteres ópticos; coloração; crescimento; brilho; fluorescência em fonte de luz U.V. e consistência (UFBA, 2006). Foi realizado também o teste de Gram para os isolados selecionados (PELCZAR, CHAN & KRIEG 1996). Caracterização bioquímica - Os testes bioquímicos foram todos realizados em triplicatas. A capacidade de crescimento bacteriano foi avaliada em meio de cultura sólida utilizando as seguintes fontes de carbono: ácido nicotínico, frutose, glicose, maltose, manitol e sacarose com concentração final de 5 mMol.L-1 . Posteriormente foi inoculada 10uL da amostra de cada isolado e crescido à temperatura ambiente e avaliada no período de 72h. O teste de presença da enzima catalase foi realizado segundo Tortora e colaboradores (1998). A presença da enzima urease e a capacidade de crescimento intrínseco em antibiótico foram realizadas segundo Hungria & Araújo (1994). Os antibióticos utilizados foram amoxicilina, ampicilina, rifampicina e tetraciclina nas concentrações de 100µg.mL-1 , 250µg.mL-1 , 400µg.mL-1 e 500µg.mL-1 .O teste de redução do nitrato foi realizado em meio semi-sólido contendo nitrato de potássio com concentração final de 5 mMol.L-1 , e avaliado o crescimento com 72horas. Para a capacidade de fixar nitrogênio 100µL das culturas dos isolados foram adicionados a meio semi-sólido sem fonte de nitrogênio e avaliado a formação de película característica em 72 horas Análise dos dados - Para a confecção do dendrograma foi utilizado o programa NTSYSpc versão 2.02i (1986-1998 Applied Biostatistcs)com a aplicação do Coeficiente de Jaccard. 4.RESULTADOS E DISCUSSÃO Para isolamento de bactérias do gênero Burkholderia foi utilizado meio semi-seletivo JMVe sendo obtido 72 bactérias isoladas das amostras de raiz de arroz cultivado no cerrado. 4 Destas, 20 foram selecionadas para os testes bioquímicos e morfológicos para as caracterizações. De acordo com Ferreira et al. (2000) várias bactérias diazotróficas pertencentes aos gêneros Burkholderia spp. foram isoladas de plantas de arroz em meio JMVe. Para a caracterização destas bactérias vários testes foram realizados e os resultados utilizados para a análise por agrupamento fornecendo grupos com maior similaridade entre si demonstrada pelo dendrograma (Figura 1). A determinação da capacidade dos isolados de fixarem nitrogênio, foi analisada em meio semi-sólido JMVe sem nitrogênio, através da visualização da formação de película característica (Tabela 2). Dos 20 isolados em JMVe, 18 apresentaram formação de película superficial, o que indica capacidade de fixar nitrogênio (Figura 1 e Tabela 1). Apenas dois isolados que não formaram película (M3 e M24A) e estão localizados em grupos diferentes de acordo com a análise de agrupamento demonstrado no dendrograma (Figura 1). Nos testes de caracterização morfológica a maioria dos isolados do meio JMVe apresentaram colônias pequenas e circulares, amareladas, viscosas (úmidas) e com bordas inteiras. Características semelhantes são relatadas com as bactérias fixadoras: B. brasiliensis, B. tropica, B. kururiensis e B. vietnamiensis (REIS; BALDANI; BALDANI, 2002) e B. silvatlantica (PERIN et al. 2006). As características morfológicas foram avaliadas, mas como podem apresentar variação de acordo com o meio de cultivo não foram consideradas para a análise de agrupamento (HUNGRIA; ARAÚJO, 1994). Moreira e Correia (2005) afirmam que os microrganismos pertencentes ao gênero Burkhoderia são Gram- negativos, resistentes a vários antibióticos, podendo inclusive utilizar a penicilina como fonte de crescimento e têm capacidade de utilizar mais de 200 fontes de carbono em seu metabolismo. Todos os isolados obtidos em meio JMVe foram Gramnegativos e cresceram relativamente bem em todas as fontes de carbono utilizada, como previsto para o gênero (Tabela 1). Nos testes com antibiótico foi possível notar que o nível de crescimento foi maior nos antibióticos penicilínicos (ampicilina e amoxicilina), exceto para a estirpe M60. Essa estirpe se diferencia das demais, estando em um grupo isolado no dendrogama (Figura 1), o que leva a pensar que provavelmente não seja do mesmo gênero, visto que está muito distante do restante dos grupos de isolados. Segundo Reis, Baldani e Baldani (2002) quatro microrganismos fixadores do gênero Burkholderia analisados (B. brasiliensis, B. tropica, B. kururiensis e B. vietnamiensis) são urease negativos, catalase positivos e possuem capacidade de reduzir nitrato. 5 Tabela 1 Teses bioquímicos realizados para as estipes isoladas de raiz de plantas de arroz (genótipo BRA02601) em meio JMVe 1 2 3 4 4 4 4 4 4 Estirpes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M3 - Negativo Negativo ++ + ++ ++ ++ ++ M4 ++ - Negativo Negativo + + + + + + M12 ++ - Negativo Negativo + ++ ++ ++ ++ ++ M14 ++ + Negativo Negativo ++ +++ +++ +++ +++ +++ M16 +++ - Negativo Negativo ++ ++ +++ ++ ++ +++ M19 ++ + Positivo Negativo + ++ +++ ++ ++ +++ M21 ++ Positivo Negativo ++ +++ +++ ++ +++ +++ M24A Positivo Negativo + ++ +++ ++ ++ ++ M24B + Positivo Negativo ++ ++ ++ ++ ++ + M27 ++ Positivo Negativo ++ ++ +++ ++ +++ +++ M35 +++ Positivo Negativo ++ +++ +++ +++ +++ +++ M41 + - Negativo Negativo + + ++ ++ ++ ++ M46A +++ Positivo Negativo ++ + ++ ++ ++ ++ M46B ++ - Negativo Negativo ++ + ++ ++ ++ ++ M51 +++ Positivo Negativo ++ +++ +++ +++ ++ +++ M54 +++ Positivo Negativo ++ +++ +++ +++ +++ +++ M60 ++ Positivo Negativo ++ + ++ ++ ++ ++ M62 +++ Positivo Negativo ++ +++ ++ ++ +++ +++ M68A + Positivo Negativo + + + + + + M68B +++ Positivo Negativo ++ +++ +++ +++ +++ +++ 1 Fixação de Nitrogênio; 2 Redução de Nitrato; 3 Catalase; 4 Urease; 5 Coloração de Gram; 6 Ácido 1 Nicotínico; 7 Frutose; 8 Glicose; 9 Maltose; 10 Manitol; 11 Sacarose Formação de película superficial 2 3 : muito (+++), médio (++), pouco (+) e ausente (-). Formação de bolhas: Mudança de coloração: 4 rosa-choque (+++), rosa (++), rosa claro (+) e inalteração da cor (-). Avaliação do crescimento nas -1 fontes de carbono (5mmol.L ): muito (+++), médio (++), pouco (+) e ausente (-), após 72h de incubação. Coeficiente de Jaccard Figura 1: Dendrograma de similaridade obtido pelo coeficiente de Jaccard para os 20 isolados de bactérias advindas do meio JMVe. 6 Com base nestes resultados espera-se que os isolados do meio semi- seletivo JMVe sejam pertencentes ao gênero Burkholderia, visto que os resultados apresentados neste trabalho se enquadram em resultados já descritos anteriormente para este gênero. Contudo são necessários testes moleculares para a confirmação dessa hipótese. Os microrganismos isolados e caracterizados bioquimicamente neste trabalho constituem uma coleção de cultura para serem utilizados em out ras pesquisas, auxiliando na determinação do potencial da biodiversidade dos microrganismos do cerrado. 5.CONCLUSÕES Dos vinte isolados em meio semi-seletivo JMVe, dezenove foram considerados como pertencentes ao gênero Burkholderia, apenas 2 isolados do meio JMVe (M3 e M24A) não apresentaram capacidade de fixar nitrogênio. Somente a estirpe M60 parece estar mais distante pela análise de agrupamento. 6.REFERÊNCIAS BIBILIOGRÁFICAS Döbereiner, J.; Baldani, V.L.D.; Baldani,J.I. Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de plantas não-leguminosas. Brasília : EMBRAPA-SPI :Itaguaí. 1995. Ferreira, J. S. ; Sabino, D. C. C. ; Baldani, J.I. ; Baldani, V. L. D. 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Disponível em: <http//bioinformatics.ath.cx/index.php?id=74>. Acesso em: 23 de nov. 2006. Pelczar, M. J.; Chan, E. C. S.; Krieg, N. R. Microbiologia: conceitos e aplicações. v.1, 2. ed. São Paulo: Makron Books, 1996. Perin, L.; Araùjo, J. L. S.; Reis, V. M. O gênero Burkholderia: um importante componente da comunidade microbiana. Documentos , Seropédica, Embrapa Agrobiologia. n.219, p.1-32, 2006. Reddy, P. M.; Ladha, J. K. Nitrogen fixation in rice: objectives and achievements. In: Pedrosa, F. O.; Hungria, M.; Yates, G. M.; Newton, W. E. (Ed.). Nitrogen fixation: from molecules to crop productivity. Dordrecht: Kluwer, 2000. p. 641-646. Reis, V. M.; Baldani, V. L. D.; Baldani, J. I. Ecologia, isolamento e identificação de bactérias diazotróficas. In: Princípios e Técnicas Ecológicas Aplicadas à agricultura, 9., 2002. Curso Intensivo em Agrobiologia. Seropédica: Embrapa Agrobiologia, 2002, p. 1-21. Stoltzfus, J.R.; So, R.; Malarvithi, P.P.; Ladha, J.K.; Bruijn, F.J. 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