BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS DO GÊNERO

BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS DO GÊNERO Pseudomonas : ISOLAMENTO,
DIVERSIDADE E CARACTERIZAÇÃO EM PLANTAS DE ARROZ NO CERRADO
DE GOIÁS
Simone Silva Rezende1,4; Marília Emanueli Siqueira de Oliveira 3,4; Claudia Cristina
Garcia Martin Didonet2,4.
1
Bolsista PBIC/UEG
2
Pesquisadora – Orientadora
3
Bolsista PIBIC/UEG
4
Curso de Farmácia, Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas, UEG
Resumo
O arroz é uma das culturas mais importantes no Brasil tanto como alimento quanto de
geração de renda, e no cerrado, corresponde à cerca de 30% da produção nacional. A
possibilidade de utilização no cultivo de arroz da Fixação Biológica de Nitrogênio
(FBN), mediada por bactérias diazotróficas, pode fornecer o nitrogênio necessário para
o seu cultivo sem diminuir a produtividade. Assim, neste trabalho foram isoladas
bactérias fixadoras da rizosfera de plantas de arroz (genótipo BRA02601),
preferencialmente do gênero Pseudomonas. As bactérias isoladas de raiz esterilizadas
de arroz foram caracterizadas morfológica e bioquimicamente com teste de crescimento
em 6 fontes de carbono capacidade de fixação de nitrogênio, redução de nitrato e
crescimento em antibiótico; teste de catalase e urease; e coloração de Gram. Foram
isoladas 105 bactérias e 20 selecionadas para as caracterizações. Os resultados forma
utilizados para elaboração de dendrograma. Dos 20 isolados testados todos foram
considerados Pseudomonas e fixadores de nitrogênio. Os microorganismos isolados
constituíram a coleção de cultura de microrganismos diazotróficos de raiz de arroz para
serem utilizados em ensaios de bioinoculação para esta cultura. A coleção poderá ser
utilizada em estudos posteriores auxiliando na determinação da biodiversidade dos
microrganismos do cerrado.
Palavras-chave: Arroz. Diazotróficos. Pseudomonas sp.
INTRODUÇÃO
Os microrganismos representam bases importantes em processo biológicos nas
cadeias alimentares e nos ciclos bioquímicos. Embora sejam organismos bastante
complexos em termos de diversidades químicas e moleculares, o interesse em estudar
bactérias que usam o nitrogênio como substrato tem sido relevante, visto que estes
podem servir como inoculantes e proporcionar produções agrícolas rentáveis e
ecologicamente corretas. Entre os vários microrganismos fixadores de nitrogênio em
plantas, o gênero Pseudomonas está presente e constituem alto potencial agrícola e
biotecnológico (PERIN et al., 2006).
O arroz (Oryza sativa L.) é o principal cereal utilizado na dieta humana. Sendo
uma cultura adaptada sob condições de inundação, portanto sensível à seca quando
cultivado em condições de sequeiro (GUIMARÃES et al., 1999). O nitrogênio
representa um fator critico para o seu crescimento por isso a cultura do arroz é
altamente dependente de fertilizantes, principalmente os nitrogenados, que aumentam a
poluição do ambiente, contaminam os mananciais com nitrato, acidificam o solo e
emitem gases como N2 O. (STOLTZFUS et al., 1997).
A fixação biológica de nitrogênio (FBN) é um grande suporte para se conseguir
altas produções no campo, aliada a um equilíbrio com o meio ambiente e a
racionalização dos custos (GUIMARÃES et al., 1999). Desde os anos 80, o potencial
para a utilização da FBN em arroz vem sendo investigado (LADHA et al., 1998).
A associação ou simbiose de diazotróficos, assim como o isolamento destes,
vêm sendo estudadas em diferentes variedades de arroz, em vários países do mundo. É
através da fixação biológica de nitrogênio tanto no arroz como em outras plantas, que
estas podem obter o nitrogênio necessário para seu metabolismo. Em função disso a
utilização de microorganismos diazotróficos no cultivo do arroz pode integrar o
metabolismo de nitrogênio, proporcionando um aumento da produção de grãos
(LADHA et al., 1998). Além do nitrogênio, a absorção de outros nutrientes é também
favorecida por estas associações, principalmente pelo aumento do sistema radicular.
Como há uma grande interdependência entre solo, planta e microrganismo, é de
se esperar que estirpes de diazotróficos diferentes possam ocorrer em arroz nos solos de
cerrado em Goiás, por isso o isolamento de microrganismos da região é essencial. O
estado de Goiás vem se destacando na produção de arroz cultivado em condições de
sequeiro e estudos a respeito de microrganismos diazotróficos associados ao arroz
merecem destaque. Assim este projeto tem como objetivo o isolamento, caracterização e
estudo da diversidade de bactérias diazotróficas, preferencialmente do gênero
Pseudomonas, associadas à planta de arroz, sendo que os organismos obtidos serão
posteriormente testados como bioinoculantes em ensaios realizados pela Embrapa Arroz
e Feijão. Este estudo ainda propicia, em longo prazo, a obtenção de bactérias que
poderão ser utilizadas em estudos de bioprospecção, para utilização da biodiversidade
de microrganismos do cerrado.
MATERIAL E MÉTODO
Material vegetal: As plantas foram fornecidas pela Embrapa Arroz e Feijão, Santo
Antônio de Goiás, GO. A raiz de 3 plantas de arroz de sequeiro em sistema de plantio
direto, genótipo BRA02601, foi utilizada como amostra.
Preparo do extrato: As raízes das plantas foram cortadas e lavadas. O processo de
esterilização superficial foi realizado segundo Döbereiner; Baldani; Baldani, (1995). A
partir do extração foi realizada a etapa da diluição seriada e plaqueamento em meio
semi-seletivo.
Isolamento: O extrato das raízes esterilizadas foi diluído seriadamente de 10-2 a 10-9
sendo inoculado 100 uL da amostra que foram espalhadas com alça de Drigalski, em
placas contendo o meio King B semi-seletivo para Pseudomonas. Deste ensaio foi
realizada a contagem e a coleta de microorganismos para o estudo.
Caracterização morfológica: Para esta caracterização dos isolados foram considerados
os critérios a partir da colônia : forma; elevação; bordas; superfície; estrutura; caracteres
ópticos; coloração; crescimento; brilho; fluorescência em fonte de luz U.V. e
consistência (UFBA, 2006). Foi realizado também o teste de Gram para os isolados
selecionados (PELCZAR, CHAN & KRIEG 1996).
Caracterização bioquímica: Os testes bioquímicos foram todos realizados em
triplicatas. A capacidade de crescimento bacteriano foi avaliada em meio de cultura
sólida utilizando as seguintes fontes de carbono : ácido nicotínico, frutose, glicose,
maltose, manitol e sacarose com concentração final de 5 mMol.L-1 . Posteriormente foi
inoculada 10uL da amostra de cada isolado e crescido à temperatura ambiente e
avaliada no período de 72h. O teste de presença da enzima catalase foi realizado
segundo Tortora e colaboradores (1998). A presença da enzima urease e a capacidade de
crescimento intrínsedo em antibiótico foram realizadas segundo Hungria & Araújo
(1994). Os antibióticos utilizados foram amoxicilina, ampicilina, rifampicina e
tetraciclina nas concentrações de 100ug.mL-1 , 250ug.mL-1 , 400ug.mL-1 e 500ug.mL-1 .O
teste de redução do nitrato foi realizado em meio semi- sólido contendo nitrato de
potássio com concentração final de 5 mMol.L-1 , e avaliado o crescimento com 72horas.
Para a capacidade de fixar nitrogênio 100 uL das culturas dos isolados foram
adicionados a meio semi- sólido sem fonte de nitrogênio e avaliado a formação de
película característica em 72 horas
Análise dos dados : Para a confecção do dendrograma foi utilizaso o programa
NTSYSpc versão 2.02i (1986-1998 Applied Biostatistcs)com a aplicação do Coeficiente
de Jaccard
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Utilizando o meio semi-seletivo King B, para bactérias do gênero Pseudomonas
foram obtidos 105 bactéria isoladas das amostras de raiz esterilizadas de arroz. Destas,
20 foram selecionadas para os testes bioquímicos e morfológicos para as
caracterizações. De acordo com Guimarães e colaboradores (1999) várias bactérias
diazotróficas pertencentes aos gêneros Pseudomonas spp. foram isoladas de plantas de
arroz. A capacidade dos microrganismos isolados de fixarem nitrogênio, foi analisada
no meio semi-sólido NFb com as estirpes selecionadas para o trabalho, através da
formação de película (Tabela 1). Todas as estirpes testadas formaram película
superficial, sendo consideradas fixadoras de nitrogênio. Essa característica foi relatada
por Desnoues e colaboradores (2003) para Pseudomonas stutzeri encontradas em
associação com arroz. As características morfológicas foram avaliadas, mas como
podem apresentar variação de acordo com o meio de cultivo não foram consideradas
para a análise de agrupamento (HUNGRIA; ARAÚJO, 1994).
Segundo Madigan, Martinko e Parker (2000) características como células Gramnegativas e catalase sempre positiva são um dos requisitos para a identificação do
gênero Pseudomonas. Os 20 isolados no meio King B apresentaram essas duas
características. As estirpes do meio King B foram capazes de crescer variavelmente em
todas as fontes de carbono testadas (Tabela 1). Assim como descrito para o gênero
Pseudomonas, as amostras em estudo apresentaram grande versatilidade nutricional
(FONSECA et al., 2000). Uma das características importantes dos isolados do meio
King B foi a produção de pigmentos fluorescentes pelas células (Tabela 1). Esta
característica é encontrada em várias espécies de Pseudomonas como P. fluorescens
(FONSECA et al., 2000; KWON et al., 2003), entre outras.
Os resultados dos testes bioquímicos dos isolados foram utilizados para a análise
por agrupamento fornecendo grupos com maior similaridade entre si demonstrada pelo
dendrograma (Figura 1). Das provas bioquímicas realizadas, foram decisivos o teste de
urease e a capacidade intrínseca de crescimento em antibiótico para a divisão dos
isolados do meio King B em três grupos de acordo com o dendrograma (Figura 1 e
Tabela 1). Com base nestes resultados espera-se que os isolados do meio semi- seletivo
King B pertençam ao gênero Pseudomonas, visto que os resultados apresentados neste
Tabela 1: Teses bioquímicos realizados para as estipes isoladas de raiz de plantas de
arroz (genótipo BRA02601) em meio King B.
Estirpes
11
22
3
43
5
61
7
8
9
10
11
S1A
+++
+
+
Negativo
+
++
+
++
++
+
S1B
+++
+
+
Negativo
+
++
+
++
++
+
S2
+++
+
++
Negativo
+
++
+
++
++
+
S4
+++
+
+
Negativo
+
++
+
++
++
+
S6A
++
+
+++
Negativo
+
++
+
++
++
+
S6B
++
+
++
Negativo
+
++
+
++
++
+
S8A
+++
+
Negativo
+
+
+
+
+
+
S10
+++
+
+++
Negativo
+
++
+
++
++
+
S8B
+++
+
+++
Negativo
+
++
+
++
++
+
S25
+++
+
+++
Negativo
+
+
+
+
++
+
S37
+++
+
++
Negativo
+
+
+
+
+
+
S105
+++
+
++
Negativo
+
+
+
+
+
+
S29
+++
+
+++
Negativo
+
+
+
+
+
+
S20
+++
+
+++
Negativo
+
+
+
+
+
+
S41
+++
+
+++
Negativo
+
+
+
+
+
+
S63
+++
+
+++
Negativo
+
+
+
+
+
+
S26
+++
+
Negativo
+
+
+
++
+
+
S65
+++
+
+
Negativo
+
++
+
+
+
+
S32
+++
+
Negativo
+
++
+
+
+
+
S17
+++
+
Negativo
+
+
+
+
+
+
1 Fixação de Nitrogênio; 2 Redução de Nitrato; 3 Catalase; 4 Urease; 5 Coloração de Gram; 6 Ácido
Nicotínico; 7 Frutose; 8 Glicose; 9 Maltose; 10 Manitol; 11 Sacarose 1 Formação de película superficial
em meio NFb : muito (+++), médio (++), pouco (+) e ausente (-).2 Formação de bolhas: 3 Mudança de
coloração: rosa-choque (+++), rosa (++), rosa claro (+) e inalteração da cor (-).4 Avaliação do crescimento
nas fontes de carbono (5mmol.L -1 ): muito (+++), médio (++), pouco (+) e ausente (-), após 72h de
incubação.
Coeficiente de Jaccard
Figura 1: Dendrograma de similaridade obtido pelo coeficiente de Jaccard de 20
isolados de bactérias advindas do meio King B.
trabalho se enquadram em resultados já descritos anteriormente na literatura para estes
gêneros. Contudo são necessários testes moleculares para a confirmação dessa hipótese.
Os microrganismos isolados e caracterizados bioquimicamente neste trabalho
constituem uma coleção de cultura com banco de dados para outras pesquisas,
principalmente para auxiliar na determinação do potencial da biodiversidade dos
microrganismos do cerrado.
CONCLUSÕES
Foram isolados de raiz essterilizada de arroz 105 isolados obtidos do meio semiseletivo King B. Dos isolados foram selecionados 20 isolados para as caracterizações
morfológicas e bioquímicas. Todos os isolados apresentaram capacidade de fixar
nitrogênio e todos foram considerados do gênero Pseudomonas
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