1 CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS ISOLADAS DE

Anais do IX Seminário de Iniciação Científica, VI Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação
e Semana Nacional de Ciência e Tecnologia
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
19 a 21 de outubro de 2011
CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS ISOLADAS DE ARROZ (Oryza sativa) DO
GÊNERO Pseudomonas POR REAÇÃO DE PCR DA REGIÃO BOX.
Lívia Fabiana Braga (UEG)
Claudia Cristina Garcia Martin Didonet (UEG)
[email protected]
INTRODUÇÃO
O arroz (Oryza sativa L.) é um cereal de importância fundamental no cenário agrícola,
uma cultura anual pertencente à família Poaceae. No Brasil sua produção anual corresponde a
3% da produção mundial, e produção média anual de 3,4 ton/ha, ocupando atualmente o 9°
lugar no ranking de produtor mundial (FERREIRA, 2008).
Em função da elevação dos índices populacionais a crescente demanda por alimentos e
a utilização agrícola das lavouras intensificou-se, com a finalidade de manutenção ou aumento
da produtividade, especialmente da cultura do arroz (SILVA, et. al., 2004). Cultura esta que
vem se tornando dependente de altas doses fertilizantes químicos que representam uma
significativa parcela nos custos de produção (FERREIRA, 2008; SILVA, et. al., 2004).
Uma alternativa para o aumento da produtividade da cultura de arroz é a fixação
biológica de nitrogênio (FBN) processo em que microrganismos procariotos são capazes de
assimilar o N2 atmosférico e convertê-lo a forma assimilável (NH3).
O crescente interesse pelo estudo da fixação biológica na agricultura visa minimizar o
uso de fertilizantes nitrogenados na produção dos cultivares. A utilização destes fertilizantes
minerais está ligada a grandes desvantagens, sendo as principais delas o alto custo dos adubos
e problemas ambientais, como a contaminação do lençol freático por excesso na aplicação de
N na forma de nitrato (GUIMARÃES; BALDANI; BALDANI, 2003; FERREIRA, 2008).
O nitrogênio é um dos nutrientes essenciais para a produção das culturas de arroz.
Embora, presente em abundância na atmosfera (78%), na forma de N2, este elemento não está
prontamente disponível para as plantas, uma vez que para a sua incorporação é necessária a
FBN (FERREIRA, 2008; SABINO, 2003). Um grupo seleto de seres vivos, que inclui
algumas espécies de microrganismos procarióticos utiliza seu complexo enzimático
denominado nitrogenase, para transformar o N2 em amônia, tornando assimilável à planta
desempenhando um papel relevante no processo agrícola (GUIMARÃES; BALDANI;
BALDANI, 2003; STROSCHEIN, 2007).
As bactérias diazotróficas associam-se às plantas podendo promover diversos
mecanismos tais como, indução da expressão de genes responsáveis pelo crescimento dos
pelos radiculares, mudanças nos níveis de fitohormônios, mudanças na absorção de nutrientes,
excreção de substâncias pelas bactérias dentre elas as auxinas, as citocininas e as giberelinas
que podem atuar no desenvolvimento da cultura, aumentando a produtividade ou até mesmo o
vigor e a resistência aos estresses bióticos e abióticos. (IKEDA, 2010), sendo estas bactérias
consideradas promotoras de crescimento vegetal (SABINO, 2003).
Diversas bactérias têm sido isoladas de plantas como o arroz. Os gêneros presentes
variam em função do nicho aeróbio (raiz da planta e superfície da água) ou anaeróbio (água,
superfície e dentro do solo) (FERREIRA, 2008). De interesse especial para este trabalho
abordaremos o gênero Pseudomonas.
O gênero Pseudomonas apresenta grande versatilidade nutricional, habilidade de
crescer em uma ampla variedade de ambientes e com grande potencial de colonização de
raízes (FONSECA et al., 2000).
Este gênero é encontrado em solos, folhagens, águas e sedimentos. Embora algumas
das espécies de Pseudomonas spp sejam bem conhecidas como fitopatógenos, entre elas P.
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solanacearum e P syringae responsáveis por ferimentos das raízes, perda da turgência das
células vegetais levando à murcha das plantas e em casos irreversíveis a morte do vegetal
(PEIXOTO, 1997) muitos membros deste grupo têm sido considerados promissores como
promotoras de crescimento em plantas, pela produção de reguladores de crescimento vegetal,
como exemplo os fithormônios e/ou outros metabólitos secundários (KUSS, 2006).
O conhecimento e a caracterização genética destas bactérias promotoras de
crescimento vegetal fornecem subsídios para o enriquecimento das informações de sua
interação com diferentes genótipos de arroz, implicando em estratégias que beneficiaram
tanto o manejo quanto a produção da cultura (STRALIOTTO & TEIXEIRA, 2000).
OBJETIVOS
Utilizar a caracterização genética pela PCR para amplificar regiões repetitivas (primer
BOX) de 20 bactérias isoladas de arroz (Oryza sativa) do gênero Pseudomonas.
METODOLOGIA
Vinte bactérias provavelmente isoladas do gênero Pseudomonas foram cultivadas no
meio de cultura solido e líquido KING B (g L-1: Peptona 20; K2HPO4 1,5; MgSO4 . 7H2O
1,5; Glicerol 10) (DÖBEREINER; ANDRADE; BALDANI, 1999).
O DNA dos isolados foi extraído como descrito por Ausebel e colaboradores (1999)
com modificações.
O DNA das bactérias foi amplificado pela técnica de PCR com o oligonucleotídeo
(“primer”) BOX A1R (5’-CTACGGCAAGGCGACG-3’), sintetizado pela InvitrogenTM
(Life Technologies), que amplifica regiões conservadas e repetitivas do DNA.
A reação de amplificação foi conduzida com os seguintes volumes: água milli-Q
estéril, 13,4 µL; dNTPs, 0,4 µL (estoque com 10 mM de cada base); tampão 10X, 2 µL;
MgCl2, 1,2 µL (50 mM); oligonucleotídeo, 0,8 µL (50 pmol µL -1); DNA, 1 µL (50 ng. µL-1);
Taq DNA polimerase, 0,2 mL (5 U µL-1), em um volume final de 20 µL.
A amplificação foi realizada usando os seguintes ciclos: 1 ciclo de desnaturação inicial
a 95°C por 6 min; 30 ciclos de desnaturação (40 seg a 90°C), anelamento (1 min a 52°C) e
extensão (5 min a 65°C); 1 ciclo de extensão final a 72°C por 15 min, com o uso do
termociclador PTC-100TM.
Depois da amplificação, foi preparado um gel de agarose de 20 x 25 cm a 0,8%, e em
suas canaletas foram adicionadas 3 µL das amostras amplificadas da região BOX diluídas em
5 µL de tampão FSUDS (azul de bromofenol 0.8%, ficol 10%, xileno cianol 0.4%, SDS 1%,
EDTA, 1,8mmol L-1, pH 8,0). Nos géis foi utilizado um padrão de peso molecular de 1 Kb
(Plus DNA LadderTM Invitrogen - Life technologies) como referência.
Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese a 90 V em gel de
agarose a 0,8% (20 X 25 cm), em tampão TBE 1 X que, após 40 minutos, foi corado com
brometo de etídio e visualizado em um transluminador com lâmpada UV fotografados em
câmera digital (Kodak digital scienceTM).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Das amostras amplificadas, as 20 apresentaram bom perfil de amplificação por BOXPCR. No perfil de bandeamento dos fragmentos foi possível observar no máximo 8 bandas e
no mínimo 6, com diferentes tamanhos e com 5 diferentes perfis entre as amostras.
Em seus estudos Silva (2010), relatou a presença de 4 fragmentos de intensidades
diferentes em 14 de seus isolados considerados como bactérias do gênero Azospirillum. Por
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este dado podemos inferir que as amostras são diferentes entre si e que há heterogeneidade
para esta região repetitiva nas amostras analisadas.
Segundo Ikeda (2010), a técnica de BOX-PCR é eficiente na detecção da diversidade
genética de rizóbios isolados de plantas de soja. A partir do perfil de bandas foi gerado uma
matriz de dados para observar a similaridade entre os isolados e também foi observado grande
heterogeneidade entre os isolados.
Os fragmentos observados para as bactérias estudadas apresentaram tamanhos entre
4,5 kilopares (kb) de bases e 0,6 kb. Os isolados S8A, S8B, S17, S25, S63, S97 e S105
apresentam um padrão igual de bandas entre si. Ambos apresentaram 8 bandas bem definidas
e com tamanhos aproximados de 4,5 kb, 2,3 kb, 2,0 kb, 1,7 kb, 1,3 kb, 1,1kb, 0,8 kb, 0,6 kb
respectivamente. Das bactérias estudadas somente os isolados S2 e S22 não apresentaram três
dos fragmentos, os de valores 4,5 kb, 1,7 kb e 0,8 kb.
Com um perfil diferente os isolados S6A, S105 e S97 se distinguem pela ausência da
primeira banda (4,5 kb). Já nos isolados S4, S5, S29, S39, S32, S35, S37 e S41 foi observado
a ausência da banda de 1,7 kb. O isolado S6, contudo foi o que apresentou a característica
mais peculiar, comparado aos demais, ele se distinguem pela ausência de bandas de 4,5 kb, de
2,5 kb e a de 1,7 kb, que estão presentes na maioria dos isolados.
O BOX-A 1R se mostra bastante eficiente na discriminação dos isolados por
amplificar de diferentes perfis de banda. Quando comparados os bandeamentos eles se
apresentam bem distintos, permitindo a diferenciação entre espécies de um mesmo gênero
(LEMOS, 2009). Em nosso estudo também foi possível observar diferentes perfis para os
isolados indicando que os microrganismos possam pertencer pelo menos a gêneros diferentes,
mas esta hipótese só poderá ser comprovada depois da análise por seqüenciamento do gene
16S rDNA, que esta em andamento.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O objetivo deste trabalho foi alcançado através da análise da PCR da região BOX
sendo possível observar alguma similaridade entre os isolados, com a formação de cinco
grupos, indicando que estes podem ser do gênero Pseudomonas ou de outros gêneros de
bactérias diazotróficas próximas taxonomicamente.
Neste estudo a utilização da PCR com o primer BOX para as regiões repetitivas do
genoma, se mostrou como uma ferramenta útil para o estabelecimento, pelo menos
preliminar, da diversidade das bactérias testadas. E ainda poderá ser utilizado para separação
de grupos que poderão ser testados posteriormente em ensaios de seleção de bactérias para
serem utilizadas na formulação de inoculantes.
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