COLORAÇÃO DE GRAM (Hans Christian Joachim Gram) Todas as

COLORAÇÃO DE GRAM (Hans Christian Joachim Gram)
Todas as estruturas celulares são coradas pelo corante cristal violeta. Com a adição do mordente
(Lugol), ocorre a formação do complexo iodo-pararosanilina, que fixa o corante primário nas
estruturas coradas. O álcool-acetona extrai os lipídeos, aumentando a porosidade/permeabilidade da
parede celular das bactérias Gram-negativas. O complexo cristal violeta-iodo (CVI) pode ser retirado
e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular das bactérias gram-positivas, em
virtude de sua composição, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool-acetona, a
porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CVI não pode ser extraído.
Preparo do esfregaço:
1- Pegar uma lâmina limpa no recipiente, secar e flambar rapidamente na chama do bico de Bunsen;
2- Identificar o lado da lâmina onde será feito o esfregaço;
3- Flambar a alça bacteriológica e deixá-la esfriar, colocar na cultura teste e esfregar o material da
alça bacteriológica para se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme;
4- Deixar secar nas proximidades da chama;
5- Fixar o esfregaço passando a lâmina rapidamente na chama do bico de Bunsen.
Método de Coloração de Gram:
1- Cobrir toda a lâmina com solução cristal violeta (corante roxo), aguardar um minuto;
2- Lavar rapidamente em água destilada;
3- Cobrir a lâmina com solução de Iugol (mordente) por um minuto;
4- Lavar em água destilada;
5- Inclinar a lâmina e gotejar álcool-acetona (cerca de 15 segundos) e lavar a lâmina rapidamente
em água corrente;
6- Cobrir com fucsina de gram e aguardar 30 segundos;
7- Lavar a lâmina em água destilada, deixar secar e observar ao microscópio com a objetiva de
imersão (100X).
Em culturas envelhecidas as células Gram-positivas podem se tomam Gram-negativas.
Soluções em ordem
de aplicação
Reação do aspecto das bactérias
Gram-positivas
Reação do aspecto das
bactérias Gram-negativas
Cristal violeta
Coradas em violeta.
Solução de Iugol
Formação do complexo CV-I no
Formação do complexo CV-I no interior da
interior da célula, que permanece
célula, que permanece violeta.
violeta.
Álcool-acetona
Desidratação da parede celular, diminuição
da porosidade e da permeabilidade; o
complexo CV-I não pode sair da célula,
que permanece violeta.
Fucsina ou safranina A célula não é afetada, permanece violeta.
Coradas em violeta.
Extração dos lipídeos da parede
celular, aumento da porosidade;
o complexo CV-I é removido da
célula.
A célula adquire o corante,
tornando-se vermelha.
COLORAÇÃO DE ZIEHL NIELSEN (Franz Ziehl e Friedrich Neelsen)
Há bactérias que são resistentes à coloração, mas que uma vez coradas vão resistir fortemente à
descoloração, mesmo por ácidos fortes diluídos e álcool absoluto. Estas são bactérias ácido-álcool
resistentes (gêneros Mycobacterium e Nocardia). Esta característica é devida ao elevado teor de
lípidos estruturais (ex. ácido micólico) na parede celular destas bactérias, que provoca uma grande
hidrofobicidade, dificultando a ação dos mordentes e diferenciadores de corantes aquosos.
Preparo do esfregaço:
1- Pegar uma lâmina limpa no recipiente, secar e flambar rapidamente na chama do bico de Bunsen;
2- Identificar o lado da lâmina onde será feito o esfregaço;
3- Flambar a alça bacteriológica deixá-la esfriar, colocar na cultura teste e esfregar o material com
movimentos de rotação da alça bacteriológica, para se obter um esfregaço de forma oval, bem
fino e uniforme;
4- Deixar secar nas proximidades da chama;
5- Fixar o esfregaço passando a lâmina (lado oposto ao esfregaço) 5 vezes na chama do bico de
Bunsen (rapidamente).
Método de Coloração de Ziehl Nielsen:
1- Cobrir toda a lâmina com com fucsina fenicada;
2- Aquecer em chama até emitir vapores. A partir disto, iniciar a contagem de cinco minutos;
3- Lavar a lâmina em água suavemente;
4- Colocar álcool-ácido clorídrico até que não se desprenda mais corante;
5- Lavar a lâmina com água;
6- Cobrir o esfregaço com azul-de-metileno por trinta segundos;
7- Lavar a lâmina com água;
8- Deixar secar e observar ao microscópio com a objetiva de imersão (100X).
Soluções em ordem
BAAR
BNAAR
de aplicação
Bactérias álcool ácido resistentes Bactérias não-álcool ácido resistentes
Fucsina de Ziehl
Bactérias coradas em vermelho.
A fucsina se fixa nos lipídeos
Álcool-ácido clorídrico complexos e não abandona a
célula, que permanece vermelha.
Azul-de-metileno
Bactérias coradas em vermelho.
A fucsina não se fixa nos componentes
da parede celular e abandona a célula,
que permanece sem corante em seu
interior
A célula não é afetada e permanece A célula adquire o corante, tornando-se
vermelha.
azul