Gene Therapy
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Diferenciação Celular e Terapia Gênica Martin Bonamino Divisão de Medicina Experimental – CPQ - INCA 1953 a estrutura do DNA foi descrita e com isso foi descrito logo em seguida o mecanismo da duplicação do DNA, explicando como ele era transmitido de uma geração para outra. Replicação semi-conservativa 1966 – E.L. Tatum, no simpósio na Columbia University College of Physicians and Surgeons in New York City intitulada: Reflections on Research and the Future of Medicine: “Finalmente nós podemos antecipar que os vírus serão usados efetivamente para o benefício humano, em estudos com célula somática, germinativas e possivelmente para terapia gênica. Nós podemos até ser otimistas sobre a possibilidade de uma terapia baseada no isolamento ou design, síntese e introdução de um novo gene em uma célula com um gene defeituoso em um órgão em particular.” 1968 – New England Journal of Medicine recusa a publicação de um artigo no qual French Anderson (pai da terapia gênica) teoriza a possibilidade de atacar doenças hereditárias introduzindo no organismo o gene correto ou substituindo aquele defeituoso. “Com objetivo de inserir um gene correto em uma célula contendo uma mutação, será primeiro necessário isolar o gene em questão de um cromossomo normal. Então esse gene tem que ser duplicado para se ter várias cópias. E finalmente, será necessário incorporar a cópia correta no genoma da célula defeituosa”; explicação de Dr. Anderson. Enquanto as discussões das possibilidades de se resolver os problemas genéticos sejam somente especulações, um dos métodos mais promissores seria o desenvolvimento de vírus não patogênicos capazes de transferir o material genético para a célula defeituosa. Esses vírus seriam usados para infectar células em cultura contendo o gene normal. Teoricamente, os vírus iriam incorporar a seqüência de DNA desejada. Então os vírus seriam re-isolados, multiplicados em cultura em massa, purificado e guardados para administração em pacientes que sofressem da doença genética em questão....Isso seria usado em benefício da humanidade.” F.Anderson, 1968 Histórico da Terapia Gênica Experimental: 1970 – Stanfield Rogers tratou 2 crianças com arginemia (falta de arginase: altos níveis de arginina no sangue) – baseado na observação que animais infectados com papiloma-vírus tinham níveis reduzidos de arginina no sangue. Premissas da terapia gênica: papiloma vírus – sem sucesso. Conferência: “Ethical and Scientific Issues Posed by Human Uses of Molecular Genetics" on May 15-16, 1975, in New York City Artigo: Essas crianças eram epiléticas, tinham espasmos regulares, eram grosseiramente retardadas, e progressivamente se tornavam piores. Por essas razões, parece válido assumir o risco (que nós não acreditávamos existir, de qualquer forma) da administração dos vírus nessas crianças com o objetivo de substituir o gene da enzima defeituosa. 1977 – M. Wingler e R. Axel – 1º experimento bem sucedido de transferência in vitro do gene da timidina cinase em célula de mamíferos (Cell, Vol 11, 223-232, May 1977). 1980 – Martin Cline (primeiro trangênico) – terapia gênica experimental em humanos não aprovada EUA, para pacientes com ß- talassemia: células de medula óssea geneticamente modificadas com gene da cadeia ß da hemoglobina e reinfundida nas pacientes. QUESÕES ÉTICAS Genes Dreams and Realities - (MacFarlane Burnet, 1971) O estímulo para escrever esse livro veio da sensação de que muito material sensacionalista têm sido escrito sobre o futuro da medicina pelas descobertas da biologia molecular. A cada passo, pode se dizer que com o conhecimento restrito que se tem, a terapia gênica é possível em princípio, porém os problema práticos exigiriam um exercito de brilhantes cientistas para supera-los. Na minha opinião não existe nenhuma motivação que leve ao financiamento do governo para pesquisas nesse campo. Final da década de 80 - 1º protocolo aprovado pelo NIH para teste de terapia gênica em humano: objetivo de demonstrar transferência gênica eficiente. Transferência de genes do sistema imune para um paciente em estágio avançado de neoplasia maligna. 1990 – Primeira doença aprovada para terapia gênica em humanos. Terapia somática (LINFÓCITOS): deficiência em adenosina deaminase: imunodeficiência combinada – objetivo clínico-científico. 1992 – primeira terapia gênica direcionada à um órgão interno – hipercolesterolemia familiar; 1992 - primeira terapia gênica utilizando vetores não virais diretamente em tumores. 1996 – fundação da primeira sociedade de terapia gênica (American Society of Gene Therapy) 1º Janeiro 1999 – 1º Journal: Human Gene Therapy 1999 – Primeira morte devido a terapia gênica: Jesse Gelsinger (18 anos) deficiência na ornitina transcarbamilase. 2000 – Primeira cura completa pela terapia gênica somática (stem cells): tratamento da imunodeficiência combinada severa X-linked (Bubble boy syndrome); 3 desenvolveram leucemia e 1 morreu (2003). 2003 – Primeiro produto para terapia gênica aprovado para venda em qualquer lugar do mundo, licenciado na China: vetor de adenovírus contendo gene p53. 2004 – Mais de 3000 pacientes vêm sendo tratados por terapia gênica pelo mundo e 619 novos protocolos de clinical trail foram submetidos ao NIH/FDA. 2005 – Primeiro clinical trial para retinose pigmentar aprovado nos EUA. 2006 – Primeiro clinical trial para distrofia muscular. Procedimentos técnicos necessários à terapia gênica em humanos (FDA): • isolamento do gene e suas seqüências reguladoras • determinar quais são as células afetadas • dispor de um mecanismo eficiente (vetores) para inserir o gene nas células especificadas. • dispor de tempo para análise. • que todos os procedimentos não apresentem efeitos colaterais indesejáveis. Os riscos da terapia gênica: • Resposta imune a proteína produzida pelo gene inserido causando inflamação. • Mutação insercional. • O gene saudável introduzido pode promover a síntese de muita proteína, antes defeituosa, levando a outros problemas. • Outros genes podem ser acidentalmente entregue as células. • Os vetores pode atingir outras células não afetadas pelo defeito genético, e então provocar algum problema. • o vetor viral pode se tornar infectivo/ contagioso. Engenharia genética •Transferência (em pacientes com mutação não funcional ou deleção de um gene ) •Correção (reverter mutação específica em um gene alvo) •Amplificação (aumentar a expressão do gene alvo) •Indução de morte (introdução de gene “killer”) •Silenciamento (inibição da expressão de um gene) Formas de aplicação do vetor na Terapia Gênica Ex vivo: # autólogo/ # seleciona somente célula com novo gene/ # - resp. imune In vivo: # mais direto # atinge diversas células # promotores específicos # direcionamento vetor Vetores para Transferência Gênica Sistemas de entrega Virais: Retroviruses Herpes simplex virus Adenovírus Adenovírus associados Não virais: Métodos físicos Métodos químicos Vetores não virais • Mais recentes na terapia gênica • Não imunogênicos • Uso repetido • Sem mutação insercional • Transdução in vivo limitada Principais barreiras: 1. Entrada na célula 2. Degradação citoplasmática 3. Transporte até o núcleo 4. Entrada no núcleo Mecanismo de entrega dos vetores não virais Métodos físicos: Injeção intracelular ou microinjeção Injeção intramuscular Pequena proporção de células Vacinação para várias doenças infecciosas: gripe (1993), malária, tuberculose, hepatite B, HIV, ebola etc. Produção de trangênicos Expressão de 3 meses Gene Guns 1980 DNA Alta pressão de hélio Intradérmica Vacinação Expressão 1 mês Mais dispendiosa Eletroporação (1982 mamíferos): célula não incorporam DNA naturalmente Não é usado em humanos Mecanismo de entrega dos vetores não virais Métodos químicos • Complexar e condensar o DNA • Fosfato de cálcio Complexação e condensação do DNA Polímeros ou lipídeos catiônicos ou a mistura de polímeros com lipídeos endocitados Vetores por excelência; Principais barreiras dos vetores não virais: Sistemas biomoleculares específicos de transferência, 1. Entrada na célula gênica; recombinação e expressão 2. Degradação citoplasmática Vêm evoluindo milhõesaté deoanos na natureza em 3. há Transporte núcleo associação com bactérias, plantas e animais; 4. Entrada no núcleo Vetores Doenças hereditárias Doença Gene relacionado Tecido alvo Vetor Enfisema pulmonar a-1-antitripsina Trato respiratório Lipossomas Fibrose cística CFTR Trato respiratório (SCID) Adenosina desaminase Linfócitos Células progenitoras hematopoiéticas Adenovírus Vírus Adenoassociado Lipossomas Retrovírus Doenças adquiridas Doença Gene relacionado Tecido alvo Vetor AIDS Ribozimas RNAm Anticorpos Linfócitos Retrovírus Genes supressores de tumores HTK-ganciclovir Pulmões, Fígado Cérebro Dopamina (tirosina hidroxilase) Tecido nervoso Câncer Parkinson Retrovírus, Adenovírus Retrovírus Vírus da herpes Geração de Vetores Retrovirais para Terapia Gênica Novos vetores retrovirais? MLV Integra em células em proliferação x Lentivírus Não necessita proliferação Amplamente testados em trials clínicos Pouco testados em trials clínicos Mutagênese insercional Mutagênese insercional? Vetores lentivirais derivados do HIV-1 HIV-1 VPR RRE VPU U3RU5 LTR NEF NEF GAG Y VIF ENV POL TAT REV RRE PROM GA RU5 Y SD TRANSGENE RU5 SA Vetor de transferência U3RU5 LTR Transfecção para geração de vetores virais Envelope (VSV, RD114) Rev Células 293T Transferência (EF1a-PPT-GFP / EF1a-PPT-CD20 ) Empacotador Vetor Viral Procedimentos Caros – Estrutura complexa Produção dos vetores Validação dos produtos Verificação da inserção do gene Gene funcional Número de cópias/célula RCR SCID SEVERE COMBINED IMMUNODEFICIENCY • Severe Combine Immunodeficiency Disease (SCID) is a disorder characterized by a marked deficiency of both B-lymphocyte and Tlymphocyte function. • Patients get all kinds of infections • Lots of very different genetic defects • Half of cases are X-linked • In humans with XSCID T cell are defective but B cells are normal. • One form of the autosomal recessive disease is due to a deficiency of Adenosine Deaminase. • Bone marrow transplantation is very effective but the chances of a successful transplant depend in part on the degree of infection and/or failure to thrive present at the time of transplantation. SCID can result from defects in the IL-2 receptor subfamily: (A) defective expression of the common chain, or (B) defective receptor signaling due to a missing tyrosine kinase T- B+ phenotype 40-50% of SCID cases Rare T- B- SCID • Adenosine Deaminase Deficiency (ADA) – ADA is an enzyme in the purine salvage pathway • pathway is important for T& B-cell development & differentiation • T- B- phenotype – Accounts for about 20% of all SCID cases – Autosomal recessive – Treatment • Bone marrow transplant • Continuous enzyme supplement • Gene Therapy Purine nucleoside phosphorylase deficiency and recombinase deficiencies (RAG-1 and -2) also cause SCID of the T-B- phenotype X-linked agammaglobulinemia (XLA) Hyper-IgM Syndrome • Patients make normal (or even increased) amounts of IgM • • • • T cell But can’t make IgG, IgA, or IgE! defective CD-40L expression X-linked in most cases Patients also have a defect in cellmediated immunity • Patients have recurrent bacterial infections and infections with intracellular pathogens (Pneumocystis jiroveci) B cell Immunodeficiency Syndromes Immunodeficiency Syndromes Immunodeficiency Syndromes SCID • SCID:“Imunodeficiê ncia combinada severa” • “bubble boy disease” • Doença genética recessiva • Mutação no gene para a adenosina deaminase (ADA) • Morte de precursores hematopoiéticos: falência do sistema imunológico Imunodeficiências: Vetores retrovirais Transdução estável do transgene Results from First Human Gene Therapy Clinical Trial Two years after receiving their last infusions of genetically altered cells to boost their weakened immune systems, the first patients ever to undergo gene therapy are still healthy and benefiting from the treatment. According to a historic research paper published today in Science, the two girls still have white blood cells bearing copies of the replacement ADA gene. Patient 1, whose health improved significantly following gene therapy, has maintained a normal white blood cell count as well as measurable levels of the ADA enzyme, which was almost nonexistent prior to the treatment. Both girls also have developed stronger immune systems, showing improved immune reactions in a battery of tests conducted over the course of the four-year study. Sustained Correction of X-Linked Severe Combined Immunodeficiency by ex Vivo Gene Therapy Hacein-Bey-Abina, Salima; Le Deist, Francoise; Carlier, Frederique; Bouneaud, Cecile; Hue, Christophe; De Villartay, Jean-Pierre; Thrasher, Adrian J.; Wulffraat, Nicolas; Sorensen, Ricardo; Dupuis-Girod, Sophie; Fischer, Alain; Cavazzana-Calvo, Marina. CD34+ bone marrow cells from five boys with X-linked severe combined immunodeficiency were transduced ex vivo with the use of a defective retroviral vector. Integration and expression of the (gamma)c transgene and development of lymphocyte subgroups and their functions were sequentially analyzed over a period of up to 2.5 years after gene transfer. Resultados do protocolo de Terapia Gênica para X-SCID Alain Fischer, Necker Hospital, Paris 3,5 anos após a Terapia Gênica 14 das 15 crianças com X-SCID tratadas: • Viviam normalmente em casa sem necessidade do ambiente estéril (“bolha”) ; • Possuiam contagens normais de células T nos compartimentos CD4 e CD8; • Responderam a várias imunizações infantis, incluindo difteria, tétano e pólio produzindo células T e anticorpos específicos contra os patógenos. • A produção de anticorpos apresentava níveis que permitiam evitar as infusões periódicas de imunoglobulinas. Mutagênese insercional causada por vetores retrovirais MLV Ativação cis Ativação cis Interferência com elementos de controle da expressão gênica Alteração do produto gênico LMO2 Causa das leucemia •Translocações envolvendo LMO2: leucemia T •c: vantagem seletiva aos clones corrigidos •Ambiente linfopênico: Expansão exaustiva dos clones transduzidos? Indução de expansão clonal? •LMO2: hotspot para integração dos MLV, especialmente pela expressão na linhagem T Cada patologia e protocolo de terapia gênica tem sua particularidade Risco: - Mutagênese insercional Prevenção: - Refinamento dos protocolos de transdução (número de cópias próvirus/célula), menos estímulo e tempo de cultura - Menor número de células transduzidas Risco: - Terapia ineficaz por baixo número de progenitores? RISCO / BENEFíCiO: TERAPIA GÊNICA x TMO APARENTADO Phagocyte Dysfuncions Leukocyte Adhesion Deficiencies -leukocyte interaction with vascular endothelium is disrupted Diminished intracellular killing of organisms, resulting from defective respiratory burst Diminished intracellular killing of organisms, resulting from defective lysosomes Defects in phagocytic cells Prevents adhesion and migration Respiratory burst defect, chronic TH1 stimulation Respiratory burst defect Respiratory burst defect Vesicle fusion defect Atividade antimicrobiana •Expansão clonal de células Corrigidas com inserções próximas a genes promotores de proliferação •Contagem celular normal: células Modificadas sujeitas à regulação fisiológica •O percentual de células com o transgene nos compartimentos T e B manteve-se baixo Terapia gênica Imunodeficiências: Correção funcional de genes alcançada Desafios: Aumentar o número de patologias tratadas Melhorar os protocolos terapêuticos para minimizar os riscos • novos vetores • melhor regulação gênica • melhores transduções • sistema de segurança (gene suicida?) Terapia Gênica: Riscos dos protocolos in vivo Jesse Gelsinger Tratamento com vetor adenoviral: - Falência múltipla de órgãos - Toxicidade hepática devido à carga de vetores virais administrada - Tropismo do vetor viral pelo fígado - Possível recombinação do vetor utilizado • Distúrbio metabólico de origem genética – deficiência da ornitina descarboxilase – não metabolização da amônia • 1/40.000 - fatal após 72hs de vida • JG – forma parcial do distúrbio, controlado por medicamentos • Convidado a participar do “clinical trial phase I” - 6.000.000.000 adenovírus/kg – artéria hepática. Falecimento 4 dias após injeção. • University of Pennsylvania and Genova (Dr.James Wilson) • 691 eventos adversos pré-clínicos não publicados Adenovírus – resposta imune Washingtonpost: Teen Dies Undergoing Gene Therapy By Rick Weiss and Deborah Nelson Washington Post Staff Writers Wednesday, September 29, 1999; Page A1 Jesse Gelsinger Gene therapy for ß-thal Gene transfer of a regulated ß-globin gene in HSCs would reduce the imbalance between aand ß-globin chains in erythroid cells Transplantation of autologous, genetically corrected HSCs would represent an alternative therapy for thalassemic patients lacking a suitable bone marrow donor Gene therapy for ß-thal Beta Thalassemias • Result from Point Mutations on genes • Severity depends on where the hit(s) lie b0-no b-globin synthesis; b+ reduced synthesis • Disease results in an overproduction of aglobin chains, which precipitate in the cells and cause splenic sequestration of RBCs • Erythropoiesis increases, sometimes becomes extramedullary TERAPIA GENICA for DELLA ß-TALASSEMIA Gene therapy ß-thalassemia 21_11.jpg ß-globin vector Purification of CD34+ cells Patient Transduction Infusion of genetically-corrected cells The success of gene therapy is based on: efficient gene transfer into target cells adequate level of transgene expression persistence of gene expression regulation of gene expression tolerance to transgene product safety ß-globin locus LCR Lentiviral vectors (1996) 5’LTR HIV-1 DNA U VIF GAG PRO Y ENV R POL TAT REV Proviral DNA Genomic RNA U3 RRE R U5 PPT PBS Y SA SD CAP R U5 RRE SA tat ORFs Frame 3 U3 R U5 R gag env vif SD nef pol pro rev SA GA 5’LTR U3 R U5 vpu vpr Frame 1 Frame 2 U3 (A)n PPT PBS RRE 3’LTR RRE R U5 PROMOTER TRANSGENE 3’LTR NEF Lentiviral vectors in GT: the French trial Terapia Celular/Terapia Gênica Science, 2007 Terapia Celular/Terapia Gênica Uso de células autólogas – Não há rejeição imunológica Indução das iPS com os mesmos 4 genes, mas c-myc desligado depois para prevenir tumores. Science, 2007 Reversão do fenótipo Possibilidades Infinitas • Qualquer doença com uma única mutação genética pode ser tratada • Regeneração tecidual • Testes de toxicidade in vitro • Testes de iPS para terapia estão em andamento Zinc Finger Nucleases – Inserção sítio dirigida Imunoterapia – O papel dos linfócitos T Reconhecer o tumor….. … poupar tecidos saudáveis Transplante de precursores hematopoiéticos Enxerto: Precursores hematopoiéticos + Linfócitos (T) Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro (DECH) x Enxerto Contra Leucemia (ECL) Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro Os linfócitos T estão intimamente ligados ao efeito antitumoral e à Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro Eliminar os linfócitos T do enxerto evita a DECH, mas impede o efeito ECL Enxerto contra Leucemia (ECL) Appelbaum, 2001 Enxerto contra Leucemia (ECL) Appelbaum, 2001 Enxerto contra Leucemia (ECL) Appelbaum, 2001 Enxerto contra Leucemia (ECL) Appelbaum, 2001 Gene suicida para o tratamento da DECH aguda BMT Recipient Cell culture Activation of T cells Select transgene Positive T cells For Infusion Gene transfer Collect donor PBMC Drug treatment for transgene-positive T cell elimination GVHD Sistema de gene suicida HSV-TC HSV TC HSV TC Cinases Celulares Bonini et al, Science 1997 Limitações Proteína imunogênica Timidina Cinase Seleção de mutantes não funcionais da proteína TC Ganciclovir - uso no pós transplante Terapia Gênica para tumores com defeitos em p53 Terapia gênica e Câncer Explorando o sistema imunológico Imunoterapia Transferência adotiva de células T Transferência adotiva de células T Transferência adotiva de células T Evasão Tumoral Reconhecimento de Tumores Antígenos Tumorais Tumor Infiltrating Lymphocytes 129 Terapia Gênica na Imunoterapia? Anticorpos Monoclonais Recurrent colorectal cancer labeled with a monoclonal antibody conjugated to a radioisotope. Tumor as red spots located in the pelvic region, while blood vessels are outlined by circulating antibody (green). Redirecionamento de linfócitos para a eliminação de tumores Receptor quimérico de antígeno (CAR) • Reconhecimento independente de MHC • Alta afinidade pelo antígeno •Dispensa seleção de clones reativos do paciente Ativação da Célula T A estimulação de células T requer múltiplos sinais CD19 Biagi et al, 2005 Kershaw et al, 2005 Resposta anti-CD20 NIH3T3 CD20 CD3z NK92 Brentjens et al, 2007 Blood, Julho 2010 D+143 Neuroblastoma em pacientes pediátricos CAR anti GD2 Pule et al, Nature Medicine 2008
