E-Pôster

“OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO DE EXPRESSÃO DOS
RECOMBINANTES CORRESPONDENTES AO DOMÍNIO
III DA PROTEÍNA E DO VÍRUS DENGUE EM
ESCHERICHIA COLI”
Tatiane R Oliveira1, Sergio Rodriguez-Málaga2, Maria Izabel F Guedes1
1. Laboratório de Bioquímica Humana – Universidade Estadual do Ceará – Fortaleza – Ceará,
e-mail: [email protected].
2. Instituto de Ciências Biológicas – Universidade Federal do Pará
Fomento: CAPES, CNPq, Banco do Nordeste
INTRODUÇÃO
Domínio III da proteína E do vírus dengue.
Vírus Dengue
Estruturais
1
Não Estruturais
595 aa
Proteína E
DI
DII
DI
I
DII
DIII
DIII
100 aa
Imunogenicidade do domínio III da
proteína E é dependente da união
(*)
das cisteínas Cys302 e Cys333
(destacadas em verde)
OBJETIVO
O presente trabalho visa o estabelecimento das condições de expressão dos recombinantes correspondente ao
domínio III da proteína E dos quatro sorotipos do vírus e de um antígeno quimérico
tetravalente em sistema procarioto.
METODOLOGIA
1. Estratégias de clonagem individual e quimérica do domínio III
EDIII-1
EDIII-1
EDIII-2
EDIII-2
EDIII-3
EDIII-4
Quimera EDIII
EDIII-3
EDIII-4
2. Expressão das proteínas recombinantes
Lise bacteriana
Centrifugação
BL-21
(IPTG diferentes concentrações)
pET-EDIII
Sobrenadante
(Solúvel)
SDS-PAGE/WB
Precipitado
(Insolúvel)
3 horas
(200 r.p.m.)
Sobrenadante
(Solúvel)
Lise bacteriana
Centrifugação
S.I
(NaCl diferentes concentrações)
SDS-PAGE/WB
Precipitado
(Insolúvel)
RESULTADOS
A
EDIII-1
1 2 3
EDIII-2
B
4 5 6 7
8
1
2
3
4 5 6
7
8
6
7
*
*
C
EDIII-4
EDIII-3
1
2
3 4
D
5 6 7 8 9
1
2
*
3
4
5
**
P
M
E
1
2
3
4
5
6
I II III
S
I
II
III
C
7
45 kDa
Quimera EDIII-1, 2-3
Quimera DIII-1, 2-3
**
Figura 1. Análise em SDS-PAGE 15% da expressão das diferentes proteínas
His6-EDIII do vírus dengue. As proteínas EDIII-1, 2 e 3 foram expressas na forma
solúvel a 37°C e 30°C (*) e as proteínas EDIII-4 e quimera foram expressas na
forma insolúvel a 37°C (**).
Figura 2 – Análise da expressão das proteínas recombinantes
por “Immunoblotting”, sob diferentes condições de indução. S:
sobrenadante (frações solúveis), P: precipitado bacteriano (fração
insolúvel), M: marcador de peso molecular, C: controle de bactérias
não induzidas.
CONCLUSÃO
Modificações nas condições de temperatura e concentrações de indutores influência
na produção das proteínas,
Obtivemos três recombinantes dos cinco estudados (EDIII-1, 2 e 3) sob forma
solúvel a partir do sobrenadante dos extratos bacterianos, sendo as demais obtidas a
partir de corpos de inclusão,
Detectamos um padrão de reatividade do anticorpo anti-His6 com as proteínas His6EDIII-1, 2, 3 e 4 (individuais) de aproximadamente 14kDa e reconhecimento de uma
proteína de aproximadamente 45 kDa correspondente ao antígeno quimérico.
PERSPECTIVAS
Utilização destes recombinantes na investigação da resposta imune naturalmente
adquirida de indivíduos procedentes de diferentes áreas endêmicas do Estado do
Ceará.