Manual do Kit DSP Vírus QIAamp
Propaganda
1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 1 Novembro 2007 Manual do Kit DSP Vírus QIAamp® Σ 50 Versão 1 IVD O Kit DSP vírus QIAamp® é um sistema genérico que utiliza a tecnologia QIAamp para isolar e purificar os ácidos nucleicos virais de amostras de plasma humano ou soro com a finalidade de diagnóstico in vitro. Para utilização em diagnóstico in vitro exclusivamente. REF 60704 H B 1050717PT 11/2007 QIAGEN GmbH, D-40724 Hilden, Tel: +49-2103-29-0 R1 MAT 1050717PT Sample & Assay Technologies 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 2 Marcas comerciais: QIAGEN®, QIAamp®, QIAvac, MinEluteTM (Grupo QIAGEN); AMPLICOR HBV MONITOR®, AMPLICOR HCV MONITOR®, AMPLICOR HIV-1 MONITOR®, COBAS®, TaqMan® (Roche Group); artusTM, RealArtTM (artus GmbH); Eppendorf® (Eppendendorf-Netheler-Hinz GmbH). Nomes registados, marcas comerciais, etc. utilizados neste documento, quando não mencionados como tal, não são considerados como não protegidos por lei. O processo PCR está coberto pela Patente U.S. 4,683,195 e 4,683,202 e as equivalentes patentes estrangeiras, propriedade da Hoffmann- La Roche AG. QIAGEN 2004 ©, todos os direitos reservados. 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 3 Conteúdo Conteúdo do kit 4 Símbolos 5 Conservação 6 Controlo de qualidade 6 Finalidade da utilização 6 Limitações da utilização do produto 7 Dados de segurança 7 Introdução 9 Princípio e procedimento 10 Equipamentos e reagentes não fornecidos 14 Notas importantes 15 Pontos importantes antes de iniciar o protocolo 15 Preparação do RNA 16 Conservação das amostras 16 Preparação dos reagentes e tampões 16 Eluição dos ácidos nucleicos virais 19 Rendimento e qualidade dos ácidos nucleicos virais 19 Montagem do sistema de vácuo QIAvac 24 Plus 19 Protocolo Isolamento e purificação dos ácidos nucleicos virais do plasma e soro humano Distribuidores QIAGEN Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 22 25 3 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 4 Conteúdo do kit Kit DSP vírus QIAamp® Catálogo n°. 60704 Número de preparações 50 50 QIAamp MinElute Colunas MinElute QIAamp™ com tubos de lavagem (WT) (2 ml) COL EXT Extensões para Colunas (3 ml) COL EXT 50 ET Tubos de Eluição (1,5 ml) ELU TUBE 50 VC Conectores de Vácuo VAC CON 50 LT Tubos de Lise (2 ml) LYS TUBE 50 WT Tubos de Lavagem (2 ml) WASH TUBE 50 LYS BUF 33 ml AL Tampão de Lise* AW1 Tampão de Lavagem 1* (concentrado) WASH BUF 1 CON 19 ml AW2 Tampão de Lavagem 2† (concentrado) WASH BUF 2 CON 13 ml AVE Tampão de Eluição† (tampa roxa) ELU BUF PS Solvente de Protease QPROT SOLV CAR RNA † Transportador RNA transportador (tampa vermelha) QP Protease‡ QIAGEN® CD Manual QPROT H B H B 4 x 2 ml 4,4 ml 310 µg 1 recip. 1 1 * Contém Cloridrato de Guanidina. Não compatível com desinfectantes que contenham lixívia. Para maior informação consultar a página 7. † Contém azida sódica como conservante. ‡ Volume de ressuspensão 4,4 ml. 4 Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 5 Símbolos Σ Kit contendo reagentes para a preparação de 50 amostras 50 Consultar a informação dada no manual i Para ser utilizado até IVD Dispositivo para diagnóstico in vitro REF Número de Catálogo LOT Número do Lote MAT Número do Material Componentes COMP Volume VOL Temperaturas Limites Fabricante legal No momento da recepção i Nota importante Mudar de luvas depois de cada passo do protocolo contendo este símbolo 8°C 2°C ? EtOH ADD Abrir no momento da entrega; conservar as colunas para centrifugação do MinElute QIAamp a 2–8°C Escrever a data actual depois de ter sido adicionado etanol ao recipiente Adicionar CONT Contém LYOPH Liofilizado RCNS Reconstituído com EtOH Etanol GuHCI Cloridrato de Guanidina SUBT ➡ Subtilisina Levar a Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 5 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 6 Conservação As colunas do MinElute QIAamp devem ser conservadas a 2–8°C assim que forem recebidas. Todos os tampões podem ser conservados à temperatura ambiente (15–25°C). O carrier DNa liofilizado pode ser conservado à temperatura ambiente (15–25°C) até ao final do prazo de validade. O RNA transportador só pode ser dissolvido em Tampão de Eluição (AVE). O RNA transportador dissolvido deve ser imediatamente adicionado ao Tampão de Lise (AL), como descrito na página 14. Esta solução deve ser preparada no momento e é estável a 2–8°C, até 48 horas. A porção do RNA transportador dissolvida no Tampão de Eluição (AVE) não utilizado, deve ser congelado em alíquotas a –20°C. A protease liofilizada QIAGEN (QP) pode ser conservada à temperatura ambiente (15–25°C) até ao final do prazo de validade, sem decréscimo do desempenho. A protease QIAGEN reconstituida (QP) é estável até um ano quando conservada entre 2–8°C, mas apenas até ao final do prazo de validade. O Wash Buffer 1 (AW1) reconstituido e o Wash Buffer 2 (AW2) reconstituído são estáveis até um ano quando conservados à temperatura ambiente (15–25°C), mas apenas até ao final do prazo de validade. Controlo de qualidade De acordo com o Sistema Geral de Certificação de Qualidade Total da QIAGEN, cada lote do Kit DSP vírus QIAamp é testado periodicamente frente às especificações prédeterminadas para assegurar a qualidade do produto de modo consistente. Finalidade de utilização O Kit DSP vírus QIAamp é um sistema genérico que utiliza a tecnologia QIAamp para realizar o isolamento e purificação dos ácidos nucleicos de amostras de plasma ou soro com a finalidade de diagnóstico in vitro. Qualquer resultado de diagnóstico gerado utilizando o procedimento de preparação da amostra juntamente com qualquer ensaio para diagnóstico subsequente, deve ser interpretado considerando também outros aspectos clínicos e de laboratório relacionados. O produto foi criado para ser utilizado por profissionais como técnicos e médicos treinados nas técnicas de biologia molecular. Foi desenhado para poder ser utilizado em qualquer aplicação subsequente com amplificação enzimática ou qualquer outra modificação enzimática do DNA ou RNA seguida por sinais de detecção ou amplificação. Os ácidos nucleicos isolados e purificados podem ser utilizados tanto em ensaios de diagnóstico qualitativo NAT (p.e rastreio do sangue) como qualitativo (p.e monitorização de carga viral) 6 Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 7 Para evitar qualquer irregularidade nos resultados do diagnóstico, o produto foi desenhado de modo a poder ser utilizado conjuntamente com controlos internos, controlos negativos e positivos dos processos de preparação, amplificação e detecção das amostras de acordo com os ensaios subsequentes utilizados. O produto foi desenhado para uso com o sistema de vácuo QIAvac 24 Plus ou com um sistema de vácuo equivalente. Limitações de utilização do produto O kit não pode ser utilizado com amostras de sangue tecidos, medula óssea, ou meios de cultura celular. Também não é é utilizado para o isolamento e purificação dos ácidos nucleicos de bactérias, fungos, ou parasitas. A sua utilização para o isolamento e purificação de ácidos nucleicos de células livres de fluídos corporais como urina e líquido cefaloraquidiano (LCR), não foi ainda estudada. Dados de segurança Sempre que trabalhar com produtos químicos, deve usar uma bata de laboratório, luvas descartáveis e óculos de protecção. Para obter mais informações, é favor consultar o folheto informativo relativo aos dados de segurança do material (MSDSs). O mesmo está disponível online no formato PDF, na www.qiagen.com/ts/msds.asp . Neste endereço pode encontrar, analisar e imprimir o MSDS para cada constituinte e/ou Kit QIAGEN. PRECAUÇÃO: Não adicionar lixívia ou soluções ácidas directamente sobre os resíduos resultantes da preparação da amostra. O Tampão de Lise (AL) e o Tampão de Lavagem 1 (AW1) contêm cloridrato de guanidina e podem formar compostos altamente reactivos quando misturados com lixívia. No caso de derrame de algum líquido contendo os referidos tampões, limpar com detergentes próprios para utilização em laboratório e água. Se o líquido derramado contiver agentes potencialmente infecciosos, limpar a área afectada, primeiramente com o detergente para utilização em laboratórios e água e depois com 1% (v/v) de solução de hipoclorito de sódio. Se os recipientes do tampão apresentarem algum dano ou vazamento, utilizar luvas e óculos protectores ao descartar estes recipientes para evitar acidentes pessoais. A QIAGEN não realizou testes para materiais infecciosos residuais no líquido residual dos procedimentos realizados com o Kit DSP vírus QIAamp. A possibilidade de contaminação deste líquido com materiais infecciosos residuais embora remota não deve ser excluída completamente. Portanto, o líquido residual deve ser considerado como infeccioso e manipulado e descartado conforme previsto nos regulamentos de segurança locais. Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 7 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 8 As seguintes frases relacionadas com segurança e risco, são aplicadas aos componentes dos Kit DSP vírus QIAamp: Tampão de Lise (AL) e Tampão de Lavagem 1 (AW1) Contém Cloridrato de guanidina: nocivo, irritante. Frases de segurança e risco:* R2236/38, S13-26-36-46 Protease QIAGEN (QP) Contém subtilisina (do Bacillus subtilis): sensibilizante, irritante. Frases de segurança e risco:* R 37/38-41-42,S22-24-26-36/37/39-46 Informação durante 24 horas para casos de emergência Podem ser obtidas informações médicas para casos de emergência em inglês, francês e alemão durante 24 horas por dia no: Centro Mainz de informação sobre venenos, Alemanha Telf: + 49-6131-19240 * R22: Nocivo se ingerido; R36/38: irritante para os olhos e pele; R37/38: irritante para o sistema respiratório e pele; R41: risco de afectar gravemente os olhos; R42: pode causar sensibilização quando inalado; S13: manter separado dos alimentos, bebidas e alimentos para animais; S22: não inalar o pó; S24: evitar o contacto com a pele; S26: no caso de contacto com os olhos, lavar imediatamente com água abundante e consultar um médico; S36: utilizar roupa protectora adequada; S36/37/39: utilizar roupa protectora adequada, luvas e máscara de protecção para o rosto e olhos; S46: no caso de ingestão, consultar o médico imediatamente e mostrar a embalagem e /ou etiqueta. 8 Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 9 Introdução O Kit DSP vírus QIAamp utiliza tecnologia muito bem consolidada para o Isolamento e purificação de DNA e RNA viral. O procedimento do Kit DSP vírus QIAamp une as propriedades da ligação selectiva de uma membrana de base de sílica com a utilização de volumes mínimos de eluição de 20 µl ou 60 µl. O intervalo linear do procedimento QIAamp DSP Virus foi determinado para o HIV RNA e o HBV DNA em vários testes de diagnóstico subsequentes (Tabela 1, Figuras 1 e 2). Tabela 1. Ensaios de diagnóstico subsequentes onde o intervalo linear do procedimento do Kit DSP vírus QIAamp foi testado Teste Kit RT-PCR do HIV RNA em tempo real Teste TaqMan e Teste COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR PCR do HBV DNA em tempo real Teste TaqMan e Teste COBAS AMPLICOR HBV MONITOR B 8 6 4 y = 1.0042x + 0.0832 R2 = 0.9974 2 0 1 2 3 5 4 6 Resultado do log IU/ml 7 8 Resultado do log IU/ml A Resultado do log IU/ml O intervalo linear do procedimento QIAamp DSP Vírus com utilização dos testes Taqman 6 5 4 3 2 1 0 y = 0.9725x + 0.0982 R2 = 0.9984 1 2 3 4 5 Resultado do log IU/ml 6 Figura 1 O intervalo linear do procedimento QIAamp DSP Vírus a um volume de eluição de 60 µl foi determinado utilizando os testes TaqMan para o A HIV RNA e B HBV DNA. Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 9 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 10 B 6 5 4 3 2 1 y = 1.0098x + 0.1234 R2 = 0.9982 2 3 4 Resultado do log IU/ml 5 Resultado do log IU/ml A Resultado do log IU/ml Intervalo linear do procedimento QIAamp DSP Virus utilizando os Testes COBAS AMPLICOR MONITOR 4 3 2 y = 0.8839x + 0.1718 R2 = 0.984 1 0 1 2 3 4 Resultado do log IU/ml Figura 2 O intervalo linear do procedimento QIAamp DSP Vírus a um volume de eluição de 60 µl foi determinado utilizando os testes COBAS AMPLICOR MONITOR para o A HIV RNA e B HBV DNA. O procedimento é adequado para utilização com plasma ou soro; com EDTA ou citrato. As amostras devem ser frescas, liofilizadas ou congeladas, desde que não tenham sido congeladas e descongeladas mais do que uma vez. O procedimento pode ser utilizado para o Isolamento de RNA e DNA viral de vários tipos de vírus de RNA e DNA. O procedimento foi desenhado de modo a evitar a contaminação cruzada entre as amostras e permitir a manipulação de amostras potencialmente infecciosas com segurança. Este procedimento é muito útil no caso do processamento de múltiplas amostras ao mesmo tempo. Os ácidos nucleicos virais são eluídos num Tampão de Eluição (AVE) e estão prontos para serem utilizados em reacções de amplificação ou conservados a –20°C. Princípio e procedimento O procedimento do Kit DSP vírus QIAamp compreende 4 passos: ■ Lise das partículas virais na amostra ■ Ligação dos ácidos nucleicos virais do Lisado à membrana da coluna do MinElute QIAamp ■ Lavagem da membrana ■ Eluição dos acidos nucleicos virais da membrana Este procedimento é realizado utilizando as colunas do MinElute QIAamp num sistema de vácuo. 10 Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 5 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 11 Volume da amostra O limite de detecção (DL) e o limite de quantificação (QL), conforme as directrizes ICH- 2QA e QB, foram determinados para o procedimento do Kit DSP vírus QIAamp (com um volume inicial de 500 µl e um volume de eluição de 20 µl e 60 µl) utilizando vários ensaios de diagnóstico subsequente (Tabelas 2 e 3). Tabela 2. Detecção do Limite do procedimento QIAamp DSP Virus Teste Volume de eluição cut off a 95% artus™ RealArt™ HBV DNA 20 µl 2.31 IU/ml (n=240) artus RealArt HCV RNA 20 µl 24.31 IU/ml (n=192) AMPLICOR manual HIV RNA 60 µl 90.92 IU/ml (n=209) TaqMan HBV DNA 60 µl 4.73 IU/ml (n=192) Tabela 3. Quantificação do Limite do procedimento QIAamp DSP Virus Teste TaqMan HBV DNA TaqMan HIV RNA QL CV 5.7 IU/ml < 70% (n=88) 52 IU/ml < 60% (n=88) 100 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HBV DNA 30 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HCV RNA 700 IU/ml < 60% (n=66) COBAS AMPLICOR HIV RNA Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 11 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 12 Lise das partículas dos vírus As amostras são lisadas em condições desnaturantes em temperaturas elevadas. A lise é realizada na presença da protease QIAGEN (QP) e do Tampão de Lise (AL), os quais asseguram a inactivação das RNases. Ligação dos ácidos nucleicos à membrana da coluna do MinElute QIAamp Para optimizar a ligação do DNA e RNA viral às membranas da coluna do MinElute QIAamp, os ácidos nucleicos virais são adsorvidos numa membrana de sílica gel e o lisado passa pela coluna por aplicação de vácuo. Remoção dos contaminantes residuais Enquanto os ácidos nucleicos virais permanecem ligados à membrana da coluna do MinElute QIAamp, os contaminantes são arrastados eficientemente por lavagem utilizando o Tampão de Lavagem 1 (AW1), o Tampão de Lavagem 2 (AW2) e por último etanol. Eluição dos ácidos nucleicos puros Os ácidos nucleicos puros são eluídos da membrana da coluna do MinElute QIAamp utilizando o Tampão de Eluição (AVE). As colunas do MinElute QIAamp permitem a eluição de volumes de 20 µl a 60 µl. Dependendo dos ensaio subsequente utilizado, o eluído de ácidos nucleicos pode ser de até 50% do volume da reacção sem apresentar nenhum efeito inibidor. 12 Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 13 Procedimento do QIAamp DSP Virus Amostra Ler cuidadosamente o protocolo (página 19) antes de começar Dentro do LT, adicionar 75 µl de QP, 500 µl da amostra e 500 µl de AL Lise Agitar com um Vortex por 15 segundos Incubar por 15 minutos (±1 min) a 56°C (±1°C) Adicionar 600 µl de etanol Agitar com um Vortex por 15 segundos Incubar 5 minutos (±1 min.) à temperatura ambiente (15–25°C) Ligação Transferir o lisado para a Coluna do MinElute QIAamp conectada à EXT Vacúo Lavagem (AW1) Remover EXT antes de aplicar o vacúo Adicionar 600 µl de AW1 reconstituído Retirar a EXT Vacúo Lavagem (AW2) Adicionar 600 µl de AW2 reconstituído Lavagem (etanol) Adicionar 750 µl de etanol Centrifugação a seco Colocar a Coluna do MinElute QIAamp no WT (tampão de lavagem) Vacúo Vacúo Centrifugar 1 min. a 14,000 rpm Elução Colocar a Coluna do MinElute QIAamp no WT (tampão de lavagem) Incubar por 3 min. A 56°C Colocar a Coluna do MinElute QIAamp em ET Adicionar 20 µl ou 60 µl do AVE Incubar por 3 min. a temperatura ambiente (15–25°C) Ácidos nucleicos virais puros Centrifugar 1 min. a 14,000 rpm Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 13 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 14 Equipamentos e reagentes não fornecidos Sempre que trabalhar com produtos químicos, usar equipamento de laboratório, luvas descartáveis e óculos de protecção. Para obter mais informações, é favor consultar o folheto informativo sobre os dados de segurança do material (MSDSs), disponibilizado pelo distribuidor do produto. ■ Etanol (96–100%) ■ Pipetas* e pontas de pipetas (para evitar a contaminação cruzada, recomenda-se o uso de pontas de pipetas com barreiras para aerossóis) ■ Luvas descartáveis ■ Bloco de aquecimento* para lise da amostra a 56°C (recomenda-se o Sistema Termoagitador Eppendorf® com bloco térmico para micro tubos de teste de 2 ml†) ■ Microcentrífuga* ■ Cilindro de medida (50 ml) ■ Vortex ■ O sistema de vácuo QIAvac 24 Plus‡ (QIAvac 24 Plus, cat. N° 19413, QIAvac Connecting System, cat. N° 19419, Vacuum Pump, cat. N° 84020) ou qualquer sistema de vácuo equivalente para uso em laboratório * Para assegurar que as amostras sejam processadas adequadamente no procedimento do QIAamp DSP Vírus, recomenda-se que os aparelhos (p.e pipetas e blocos de aquecimento) sejam calibrados de acordo com as recomendações do fabricante. † Esta não é uma lista completa de fornecedores e não inclui vários vendedores importantes de material biológico ‡ Disponível em meados de 2004; por favor consulte www.qiagen.com/products/accessories 14 Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 15 Notas importantes Pontos importantes antes de iniciar o protocolo ■ Após a recepção do Kit, confirme se todos os constituintes estão em perfeito estado. Se os pacotes de blisters ou os recipientes de tampão apresentarem algum dano, contactar o Serviço Técnico QIAGEN ou o seu distribuidor local. No caso de vazamento de líquido, consultar a “Informação sobre Segurança” (página 7) . ■ Não utilizar constituintes do Kit danificados, pois a sua utilização pode conduzir a um mau funcionamento do Kit. ■ Utilizar sempre equipamento livre de RNase. ■ Conservar o etanol (96–100%) sobre gelo durante o procedimento. ■ Mudar sempre as pontas das pipetas ao transferir líquidos diferentes. Para evitar a contaminação cruzada, recomenda-se a utilização de pontas de pipetas com barreira por aerossóis. ■ Realizar todos os passos correspondentes à centrifugação, a temperatura ambiente (15–25°C) ■ Utilizar sempre luvas descartáveis e verificar que as mesmas não estejam contaminadas com material proveniente da amostra. ■ Descartar as luvas quando contaminadas, pelo menos em todos os passos marcados com o símbolo de luvas. ■ Evitar a contaminação cruzada abrindo só um tubo de cada vez. ■ Não utilizar constituintes de outros kits com o kit que a ser utilizado em determinado momento, excepto quando tiverem números de lotes iguais. ■ Evitar a contaminação microbiana dos reagentes do Kit. ■ Para minimizar o risco de infecção com materiais potencialmente infecciosos, recomenda-se trabalhar com ambiente de fluxo laminar até as amostras serem lisadas. ■ Este kit deve ser utilizado unicamente por pessoal treinado nas práticas de diagnóstico in vitro. ■ O procedimento fornece as instruções para o processamento de uma única amostra de plasma ou soro, mas até 24 amostras poderão ser processadas ao mesmo tempo com o sistema de vácuo QIAvac 24 Plus. Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 15 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 16 Preparacão do RNA Ao preparar o RNA viral, realizar todos os passos do manual de procedimentos com rapidez. O Tampão de Eluição contém azida sódica*, um agente antimicrobiano que evita o crescimento dos organismos produtores de RNases. No entanto, como este Tampão não contém nenhum produto químico que degrade as RNases, não inibirá activamente as RNases introduzidas por manipulação inadequada. Deve-se ter extremo cuidado para evitar a contaminação com RNases ao manipular o Tampão de Eluição (AVE) Conservação das amostras Após a colheita e centrifugação, o plasma e o soro devem ser conservados a 2–8°C, até 6 horas. Para a conservação por longos períodos de tempo, congelar em alíquotas a –20°C ou –80°C. As amostras de plasma ou soro congeladas não devem ser descongeladas mais do que uma vez. Ciclos repetidos de congelamento e descongelamento conduzem à desnaturação e precipitação das proteínas, produzindo títulos virais menores e consequentemente num rendímento de ácidos nucleicos reduzido. Adicionalmente os crioprecipitados formados durante o congelamento e descongelamento entopem as membranas das colunas do MinElute QIAamp. Se os crioprecipitados forem visíveis, deve-se realizar o pellet por centrifugação a aproximadamente 6800 x g por 3 min. O sobrenadante sem crioprecipitados deve ser aspirado e processado imediatamente sem destruir o pellet. Preparação dos reagentes e tampões Preparação da Protease QIAGEN Adicionar 4,4 ml do Solvente da Protease (PS) ao recipiente do liofilizado QIAGEN (QP) e agitar muito bem. Para evitar a formação de espuma agitar invertendo o tubo várias vezes. Certificar-se de que a Protease QIAGEN está completamente dissolvida. i Não adicionar Protease QIAGEN (QP) ao Tampão de Lise (AL) directamente. Adição do RNA transportador e do Controlo interno ao Tampão de Lise O RNA transportador é utilizado com duas finalidades. Em primeiro lugar, para melhorar as ligações dos ácidos nucleicos à membrana da coluna do MinElute QIAamp, especialmente quando existem poucas moléculas na amostra. Em segundo lugar, porque a adição de grandes quantidades de RNA transportador reduz a possibilidade de degradação do RNA viral nos casos raros onde as RNases não são desnaturadas pelos sais caotrópicos nem pelos detergentes do Tampão de Lise (AL). Se o transportador não for adicionado ao Tampão de Lise (AL), a quantidade de RNA e DNA recuperado poderá ser menor. * Quando trabalhar com produtos químicos, utilizar sempre vestuário adequado para laboratório, luvas descartáveis e óculos protectores. 16 Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 17 O RNA transportador RNA pode também ser incluído em alguns reagentes de controlo interno de ensaios subsequentes comerciais. Neste caso, consultar as instruções de utilização do fabricante do ensaio subsequente. A utilização de um controlo interno é muito recomendada nos casos em que é utilizado o Kit DSP Vírus MinElute QIAamp conjuntamente com sistemas de diagnóstico por amplificação. Os controlos internos do RNA ou DNA e o RNA transportador reconstituído devem ser adicionados ao Tampão de Lise (AL) e ser muito bem agitados e misturados, invertendo os tubos 10 vezes. Não agitar com vortex, para evitar a formação de espuma. Consultar as instruções do fabricante para determinar a concentração óptima de controlo interno. Ao utilizar uma concentração diferente da sugerida, poderão ser obtidos resultados incorrectos. Ao ser calculada a quantidade correcta de controlo interno deve-se levar em consideração o volume inicial da amostra e o volume de eluição. Lembrar que o volume inicial da amostra utilizado com o Kit DSP Vírus MinElute QIAamp é de 500 µl. Para preparar a solução de RNA transportador, adicione 310 µl de Tampão de Eulição (AVE) ao tubo que contém 310 µg de RNA transportador para obter uma solução de 1 µg/µl. Dissolver o RNA transportador completamente dividir em alíquotas de tamanhos convenientes e conservar a –20°C. Não congelar- descongelar o RNA transportador mais do que duas vezes. Nota: O RNA transportador não deve ser dissolvido no Tampão de Lise (AL). Deverá primeiramente ser dissolvido no Tampão de Eluição (AVE) e depois adicionado ao Tampão de Lise (AL). Verificar se o RNA transportador está completamente dissolvido no volume correcto de Tampão de Eluição (AVE), antes de misturar o mesmo com o Tampão de Lise (AL). i Utilizar sempre o controlo interno correcto para o ensaio downstream. Consultar as instruções do fabricante para maiores informações. Calcular o volume da mistura do Tampão de Lise (AL)/ RNA transportador necessária por lote de amostras, seleccionando o número de amostras a serem processadas simultaneamente na tabela 4 (página 18). Os volumes são calculados através dos seguintes cálculos: n x 0,55 ml = y ml y ml x 11,2 µl/ml = z µl Onde: n = número de amostras processadas simultaneamente y = Volume do Tampão de Lise (AL) calculado z = Volume de RNA transportador/ Tampão de Eluição (AVE) adicionado ao Tampão de Lise (AL) Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 17 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 18 Tabela 4. Volume de Tampão de Lise (AL) e de RNA transportador/ Tampão de Eluição (AVE) requeridos para o procedimento do QIAamp DSP Vírus N° Amostras Vol. AL (ml) Vol. RNA Transportador/ AVE (µl) N° Amostras Vol. AL (ml) Vol. RNA Transportador/ AVE (µl) 1 0,55 6,2 13 7,15 80,0 2 1,10 12,3 14 7,70 86,0 3 1,65 18,5 15 8,25 92,4 4 2,20 24,6 16 8,80 98,6 5 2,75 30,8 17 9,35 104,7 6 3,30 37,0 18 9,90 110,9 7 3,85 43,1 19 10,45 117,0 8 4,40 49,3 20 11,00 123,2 9 4,95 55,0 21 11,55 129,4 10 5,50 61,6 22 12,10 135,5 11 6,05 67,8 23 12,65 141,7 12 6,60 73,9 24 13,20 147,8 Preparação do Tampão de Lavagem 1 Com um cilindro de medida, adicionar 25 ml de etanol (96–100%) ao recipiente que contém 19 ml do Tampão de Lavagem 1 (AW1) concentrado. Conservar o Tampão de Lavagem 1 (AW1) reconstituído à temperatura ambiente (15–25°C). i Misturar sempre o Tampão de Lavagem 1 (AW1) reconstituído, invertendo o recipiente várias vezes antes de iniciar o procedimento. Preparação do Tampão de Lavagem 2 Com um cilindro de medida, adicionar 30 ml de etanol (96–100%) ao recipiente que contém 13 ml do Tampão de Lavagem 2 (AW2) concentrado. Conservar o Tampão de Lavagem 2 (AW2) reconstituído à temperatura ambiente (15–25°C). i Misturar sempre o Tampão de Lavagem 2 (AW2) reconstituído, invertendo o recipiente várias vezes antes de iniciar o procedimento. Preparação do Tampão de Eluição São fornecidos com o kit quatro tubos de Tampão de Eluição (AE). Deve-se ter cuidado para não contaminar o tampão com RNases. No caso de realizar 4 procedimentos de purificação ou menos utilizando só um kit, descartar o tubo do Tampão de Eluição (AVE) ao final de cada processo. 18 Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 19 Eluição dos ácidos nucleicos virais Para aplicações downstream que requeiram volumes iniciais pequenos (p.ex. algum ensaio de PCR e RT-PCR), a sensibilidade do ensaio pode ser aumentada utilizando os ácidos nucleicos virais eluídos em 20 µl do Tampão de Eluição (AVE) O volume do eluído de ácidos nucleicos da coluna do MinElute QIAamp pode ser até 5 µl menor do que o volume do Tampão de Eluição aplicado à coluna. Por exemplo a eluição de ácidos nucleicos com um volume de Tampão de Eluição de 60 µl (AVE) permite obter um eluído de 55 µl aproximadamente enquanto que com um volume de 20 µl resultará um eluído de 15 µl aproximadamente. O volume do eluído obtido depende da natureza da amostra. Se este volume é muito pequeno para o ensaio downstream, aumente o volume pela adição de Tampão de Eluição (AVE). Ácidos nucleicos virais eluídos são recolhidos em Tubos de Eluição (ET). Se armazenar os ácidos núcleico virais até 24 horas. recomendamos a conservação entre 2–8°C. Rendimento e qualidade dos ácidos nucleicos virais O rendimento e a qualidade dos ácidos nucleicos virais é adequada para todos os tipos de procedimentos de detecção subsequente de diagnósticos moleculares. Os ensaios de diagnóstico devem ser realizados de acordo com as instruções do fabricante. Montagem do sistema de vácuo QIAvac 24 Plus Verifique que a extensão da coluna, o Conector do Vácuo (VC) e a Válvula do Vácuo estejam correctamente montados. 4 3 2 1 Figura 3 Montagem dos componentes do Kit DSP Vírus QIAamp para procedimentos com Vácuo 1: Válvula do Vácuo (fornecido com o sistema de vácuo) 2: Conector de Vácuo (VC) 3: Coluna do MinElute QIAamp 4: Extensão da coluna (EXT) Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 19 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 20 Ao utilizar o sistema de vácuo QIAvac 24 Plus, recomenda-se rotular os Tubos de Lise (LT), Tubos de Eluição (ET) e as colunas do MinElute QIAamp conforme o esquema da figura 4 para evitar a mistura das amostras. Esta figura pode ser copiada e rotulada com o nome das amostras. 20 01 02 03 04 05 06 13 14 15 16 17 18 Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 21 Nome: Operador: ID ensaio: 07 08 09 10 11 12 19 20 21 22 23 24 Figura 4 Esquema para identificar os Tubos de Lise (LT), Tubos de Eluição (ET) e as colunas do MinElute QIAamp na utilização de um sistema de vácuo QIAvac 24 Plus. Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 21 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 22 Protocolo Protocolo: isolamento e purificação de ácidos nucleicos virais do plasma e soro Para o isolamento e purificação de ácidos nucleicos virais de uma amostra de 500 µl de Plasma e de Soro tratadas com EDTA ou Citrato. Passos a realizar antes de começar ■ Equilibrar as amostras à temperatura ambiente (15–25°C) e certificar-se de que estão muito bem misturadas. ■ Adicionar RNA transportador reconstituído com Tampão de Eluição (AVE) ou controlo interno ao Tampão de Lise (AL), de acordo com as instruções da página 16. ■ Confirmar que o Tampão de Lavagem 1 (AW1), Tampão de Lavagem 2 (AW2) e a Protease (QP) tenham sido preparadas de acordo com as instruções referidas nas “Notas importantes”, na página 15. ■ Equilibrar o Tampão de Eluição (AE) à temperatura ambiente (15–25°C), para uso no passo 18. Se possível, utilizar Tampão de Eluição Fresco (AVE) para cada procedimento (são fornecidos 4 tubos). ■ Colocar um bloco de aquecimento a 56°C, este será utilizado no passo 4 e 17. ■ Evitar a contaminação cruzada inserindo um Vácuo-Conector (VC) em cada adaptador luer do sistema de vácuo. ■ Confirmar que os recipientes para resíduos do sistema de vácuo estejam limpos e que as ligações estejam conectadas correctamente. ■ Para obter mais detalhes sobre o funcionamento do sistema de vácuo, especialmente sobre sua manutenção, consultar o manual fornecido conjuntamente. Procedimento 1. Pipetar 75 µl da Protease QIAGEN (QP) num Tubo de Lise (LT) i Verificar o prazo de validade da protease reconstituída antes de utilizá-la 2. Adicionar 500 µl do plasma ou soro ao Tubo de Lise (LT) 3. Adicionar 500 µl do Tampão de Lise (AL) ao Tubo de Lise (LT), fechar a tampa e agitar no vortex por 15 seg. Para garantir um processo de lise eficiente, é fundamental que a amostra e o tampão de Lise (AL) sejam misturados até que seja obtida uma solução homogénea. i Como o Tampão de Lise tem uma alta viscosidade (AL), certificar-se de adicionar o volume correcto de Tampão de Lise (AL) realizando a pipetagem cuidadosamente ou utilizando uma pipeta apropriada como a pipeta multiset Eppendorf ou equivalente. i Não adicionar Protease QIAGEN (QP) directamente ao Tampão de Lise (AL). 22 Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 23 4. Incubar a 56°C (±1°C), por 10 min. (±1 min.) 5. Centrifugar o Tubo de Lise (LT) por ≥5 seg. à velocidade máxima para retirar as gotas de dentro da tampa. Mudar de luvas e abrir o Tubo de Lise (LT) cuidadosamente. 7. Adicionar 600 µl de etanol (96–100%) ao Tubo de Lise (LT), fechar a tampa e agitar no vortex por ≥15 seg. Incubar por 5 min. (±1 min.) à temperatura ambiente (15–25°C). 8. Centrifugar o Tubo de Lise por ≥5 seg. à velocidade máxima para retirar as gotas de dentro da tampa. 9. Inserir a coluna do MinElute QIAamp no Vácuo-Conector (VC) (consultar figura 3, página 19). Inserir uma extensão da coluna (EXT) na coluna do MinElute QIAamp aberta. i Manter o Tubo de Lavagem (WT) para depois utilizá-lo no processo de secagem por centrifugação, no passo 16. 10. Mudar as luvas e abrir só um tubo de cada vez. 11. Aplicar cuidadosamente todo o Lisado resultante do passo 6 à extensão da coluna (EXT) do MinElute QIAamp, sem molhar as bordas. Evitar tocar a membrana da coluna do MinElute QIAamp com a ponteira da pipeta. 12. Conectar a bomba de vácuo. Quando o lisado tiver passado através da coluna do MinElute QIAamp abrir a válvula do sistema de vácuo e libertar o vácuo. Ao processar várias colunas do MinElute QIAamp ao mesmo tempo, recomenda-se fechar a válvula do vácuo de cada coluna depois que o lisado tiver passado através da membrana para reduzir a duração deste passo do vácuo. i Se o lisado não tiver passado completamente através da membrana após 15 min., descartar a coluna do MinElute QIAamp e repetir o procedimento com uma amostra nova. i A válvula do sistema deve ser utilizada para permitir a redução da pressão do vácuo. 13. Aplicar 600 µl de Tampão de Lavagem 1 (AW1) à coluna do MinElute QIAamp. Retirar e descartar cuidadosamente o extensão da coluna (EXT) e fechar a válvula do sistema de vácuo. Quando o Tampão de Lavagem 1 (AW1) tiver passado através da coluna do MinElute QIAamp, abrir a válvula e libertar o vácuo. Para evitar contaminação cruzada, assegure-se que os Extensores de Coluna (EXT) removidos não passam passam por cima das colunas QIAamp MinElute, que estão próximas. Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 23 Protocolo 6. Protocolo 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 24 14. Aplicar 750 µl de Tampão de Lavagem 2 (AW2) à coluna do MinElute QIAamp sem molhar as bordas. Evitar tocar a membrana da coluna do MinElute QIAamp com a ponta da pipeta. Deixar a tampa da coluna aberta e fechar a válvula do sistema de vácuo. Quando o Tampão de Lavagem 2 (AW2) tiver passado através da coluna do MinElute QIAamp, abrir a válvula e libertar o vácuo. Deixar a tampa da coluna aberta e fechar a válvula do sistema de vácuo. 15. Aplicar 750 µl de etanol (96–100%) à coluna do MinElute QIAamp sem molhar as bordas. Evitar tocar a membrana da coluna do MinElute QIAamp com a ponta da pipeta. Quando o etanol tiver passado através da coluna do MinElute QIAamp, abrir a válvula e libertar o vácuo. Deixar a tampa da coluna aberta e fechar a válvula do sistema de vácuo. i Utilizar pontas de pipetas com barreiras para aerossóis para aplicar o etanol à coluna do MinElute QIAamp. 16. Fechar a tampa da coluna do MinElute QIAamp, retirar este do sistema vácuo e descartar o Vácuo-Conector (VC). Colocar a coluna do MinElute QIAamp num Tubo de lavagem (WT) reservado do passo 9 e centrifugar à velocidade máxima (aproximadamente 20,000 x g, ou 14,000 rpm) por 1 min. para secar a membrana completamente. Descartar o Tubo de Lavagem que contém o filtrado. i A omissão da centrifugação de secagem pode ocasionar inibição do ensaio subsequente. 17. Colocar a coluna do MinElute QIAamp num Tubo de Lavagem novo (WT) e incubar com a tampa aberta a 56°C por 3 min. para evaporar o líquido remanescente. 18. Colocar a coluna do MinElute QIAamp num Tubo de Eluição (ET) e descartar o Tubo de Lavagem (WT). Abrir cuidadosamente a tampa da coluna do MinElute QIAamp e aplicar de 20 a 60 µl de Tampão de Eluição (AE) (dependendo do ensaio downstream) no centro da membrana. Fechar a tampa e incubar à temperatura ambiente (15–25°C) por ≥3 min. Centrifugar à velocidade máxima (aproximadamente 20,000 x g, ou 14,000 rpm) por 1 min. para eluir os ácidos nucleicos. i Realizar o procedimento de manutenção para sistema de vácuo depois de realizar este protocolo (para obter mais detalhes consultar o manual fornecido com o sistema de vácuo). 24 Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 25 Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 25 1050717_PT 26 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 26 Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 27 Manual do Kit DSP Vírus QIAamp 11/2007 27 1050717_PT 16.04.2008 10:33 Uhr Seite 28 www.qiagen.com Australia ■ Orders 03-9840-9800 ■ Fax 03-9840-9888 ■ Technical 1-800-243-066 Austria ■ Orders 0800/28-10-10 ■ Fax 0800/28-10-19 ■ Technical 0800/28-10-11 Belgium ■ Orders 0800-79612 ■ Fax 0800-79611 ■ Technical 0800-79556 Canada ■ Orders 800-572-9613 ■ Fax 800-713-5951 ■ Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) China ■ Orders 021-51345678 ■ Fax 021-51342500 ■ Technical 021-51345678 Denmark ■ Orders 80-885945 ■ Fax 80-885944 ■ Technical 80-885942 Finland ■ Orders 0800-914416 ■ Fax 0800-914415 ■ Technical 0800-914413 France ■ Orders 01-60-920-926 ■ Fax 01-60-920-925 ■ Technical 01-60-920-930 ■ Offers 01-60-920-928 Germany ■ Orders 02103-29-12000 ■ Fax 02103-29-22000 ■ Technical 02103-29-12400 Hong Kong ■ Orders 800 933 965 ■ Fax 800 930 439 ■ Technical 800 930 425 Ireland ■ Orders 1800-555-049 ■ Fax 1800-555-048 ■ Technical 1800-555-061 Italy ■ Orders 02-33430411 ■ Fax 02-33430426 ■ Technical 800-787980 Japan ■ Telephone 03-5547-0811 ■ Fax 03-5547-0818 ■ Technical 03-5547-0811 Korea (South) ■ Orders 1544 7145 ■ Fax 1544 7146 ■ Technical 1544 7145 Luxembourg ■ Orders 8002-2076 ■ Fax 8002-2073 ■ Technical 8002-2067 The Netherlands ■ Orders 0800-0229592 ■ Fax 0800-0229593 ■ Technical 0800-0229602 Norway ■ Orders 800-18859 ■ Fax 800-18817 ■ Technical 800-18712 Singapore ■ Orders 65-67775366 ■ Fax 65-67785177 ■ Technical 65-67775366 Sweden ■ Orders 020-790282 ■ Fax 020-790582 ■ Technical 020-798328 Switzerland ■ Orders 055-254-22-11 ■ Fax 055-254-22-13 ■ Technical 055-254-22-12 UK ■ Orders 01293-422-911 ■ Fax 01293-422-922 ■ Technical 01293-422-999 USA ■ Orders 800-426-8157 ■ Fax 800-718-2056 ■ Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) 1050717PT 11/2007 Sample & Assay Technologies
