AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TÓXICA E ANTIMICROBIANA

1
UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
CURSO DE FARMÁCIA
GEAN PIZZOLOTTO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TÓXICA E ANTIMICROBIANA IN
VITRO DOS EXTRATOS METANÓLICOS DE Calendula officinalis L.
(ASTERACEAE) VISITADAS E PROTEGIDAS DE INSETOS
CRICIÚMA, JUNHO DE 2010
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GEAN PIZZOLOTTO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TÓXICA E ANTIMICROBIANA IN
VITRO DOS EXTRATOS METANÓLICOS DE Calendula officinalis L.
(ASTERACEAE) VISITADAS E PROTEGIDAS DE INSETOS
Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado
para a obtenção do grau de Farmacêutico no
Curso de Farmácia da Universidade do
Extremo Sul Catarinense, UNESC.
Orientador: Prof. Dr. Claus Tröger Pich
CRICIÚMA, JUNHO DE 2010
3
GEAN PIZZOLOTTO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TÓXICA E ANTIMICROBIANA IN
VITRO DOS EXTRATOS METANÓLICOS DE Calendula officinalis L.
(ASTERACEAE) VISITADAS E PROTEGIDAS DE INSETOS
Trabalho de Conclusão de Curso aprovado pela
Banca Examinadora para obtenção do Grau de
Farmacêutico, no Curso de Farmácia da
Universidade do Extremo Sul Catarinense,
UNESC, com Linha de Pesquisa em
Ecotoxicologia de plantas medicinais.
Criciúma, junho de 2010
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________
Prof. Dr. Claus Tröger Pich - UNESC
___________________________________________________
Prof. Dra. Vanilde Citadini Zanette - UNESC
_______________________________________________________
Prof. MSc. Eduardo João Agnes - UNESC
4
A minha mãe e padrasto, Graça e Luiz, a meu
irmão Maicon e minha vó Valcir aos colegas
dos Grupos GPIG e GPETNO e a todos que
indiretamente contribuíram para a realização
deste trabalho.
5
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Claus Tröger Pich pela orientação deste trabalho e pela
paciência que teve comigo na orientação do TCC.
Aos meus amigos que fazem e fizeram parte do Grupo de Pesquisa em
Imunologia e Genética e Etnofarmacologia. Especialmente a Nanda Zanette, pela
ajuda incessante e apoio na realização deste trabalho. Na qual estou devendo não
sei quantos dogões.
As técnicas (os) do laboratório de Bioquímica e botânica e aos vigias do
bloco “S”, pela ajuda, amizade e paciência.
A Universidade do Extremo Sul Catarinense pelo espaço oferecido para
realização deste trabalho.
A minha mãe e meu padrasto, Maria das Graças Pizzolotto Bassani e Luiz
Valmir Bassani pelo apoio e pagamento das repetitivas mensalidades. Ao resto da
minha família Pizzolotto pelos pousos nos finais de semanas, amizade e
compreensão.
E a Deus por mais esta conquista e pela oportunidade de conviver com
todas estas pessoas acima mencionadas.
6
RESUMO
As plantas medicinais sempre desempenharam um papel importante na saúde
mundial, possuindo grande relevância no tratamento de várias doenças, mesmo
após os avanços da medicina moderna. Calendula officinalis L. que pertencente à
família Asteraceae, é uma espécie economicamente importante devido aos seus
potenciais efeitos farmacêuticos. Plantas possuem composição química que pode
ser modificada de acordo com suas condições fisiológicas e alteradas em resposta a
ataques de insetos herbívoros ou visitantes florais alterando as atividades tóxicas
e/ou protetoras das mesmas. Este trabalho teve como objetivo avaliar
comparativamente a atividade tóxica e antimicrobiana dos extratos metanólicos de
flores de Calendula officinalis (Asteraceae), visitadas (V) e não visitadas (NV) por
insetos polinizadores e fitófagos através de toxicidade aguda em Artemia salina,
Daphnia magna, interação com DNA plasmidial e teste antimicrobiano frente às
bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Para a realização dos testes de
Artemia salina (n=10) e Daphnia magna (n=10) foram expostas em diversas
concentrações (0,62 a 20 mg/mL), para posterior cálculo da CL50/CE50,
respectivamente, através do método Trimmed Spearman-Karber. No teste de
clivagem de DNA plasmidial as doses testadas (9,7 a 621 µg/mL) ficaram incubadas
por 16 horas a 37 °C, as incubações foram submetidas à eletroforese em gel de
agarose e fotografadas, observando-se a transformação da forma supertorcida do
DNA plasmidial em circular aberta (quebras simples de DNA) e linear (quebras
duplas de DNA), cujas proporções foram calculadas com o programa ImageJ 1.41o
de análise de intensidade e tamanho de bandas. A atividade antimicrobiana in vitro
foi avaliada pela metodologia de difusão em agar pelo método do poço, nas doses
de 0,31 a 20mg/mL, na qual permaneceram incubadas por 24h a 37 °C. Os
resultados obtidos permitem demonstrar que os extratos V e NV em Artemia salina
apresentaram CL50 4mg/mL e CL50 5,74mg/mL, e em D. magna CE50 1,24mg/mL e
CE50 1,64 mg/mL, respectivamente. Referente ao teste de DNA plasmidial, os
extratos V e NV, em todas as concentrações apresentaram quebras no DNA do tipo
circular aberta e houve presença de quebra linear na V e NV a partir da dose
9,7µg/mL e 78,12 µg/mL, respectivamente. No teste antimicrobiano não houve
inibição do crescimento bacteriano nas concentrações testadas frente às bactérias
selecionadas. A partir dos resultados pôde-se concluir que o extrato metanólico de
Calendula officinalis visitada apresentou maior toxicidade e atividade nucleásica
comparado ao extrato não visitado, de insetos polinizadores e fitófagos.
Palavras-chave: Calendula officinalis. Artemia salina. Daphnia magna.
sensibilidade antimicrobiano.
teste de
7
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Esquema geral de partição e separação provável dos principais
metabólitos secundários em plantas. Fonte: YUNES; CALIXTO, 2001..................... 20
Figura 2: Ilustração do microcrustáceo de água salgada, Artemia salina. Fonte:
Kribensis.................................................................................................................... 22
Figura 3: Ilustração do microcrustáceo de água doce, Daphnia magna. Fonte:
Stringhini; Salomon, s.d. ........................................................................................... 23
Figura 4: Esquema de Corte da Molécula de DNA Plasmidial. Fonte: modificado de
Berg; Tymoczko e Stryer, 2004. ................................................................................ 25
Figura 5: Fotografia de um gel de agarose demonstrando a separação das formas do
DNA plasmidial Fonte: PICH, 2009. .......................................................................... 25
Figura 6: Esquema simplificado da preparação e execução do Teste de toxicidade
aguda com Artemia salina. Fonte: Adaptado de Bortolotto, 2009. ............................ 29
Figura 7: Índice de Letalidade (%) obtido através do Teste de toxicidade utilizando
Artemia salina em concentrações (mg/mL) seriadas dos extratos metanólicos da
Calendula officinalis visitada e não visitada de insetos, e controle negativo com
solução de sal marinho sintético (concentração de 0mg/mL). Índice de letalidade
está expresso como média (%) das quatro replicatas. .............................................. 33
Figura 8: Índice de Mobilidade (%) obtido através do Teste de toxicidade utilizando
Daphnia magna em concentrações (mg/mL) seriadas dos extratos metanólicos da
Calendula officinalis visitada e não visitada por insetos, e controle negativo com
solução padrão para Daphnia magna. Índice de Mobilidade está expresso como
média (%) das duas replicatas. ................................................................................. 34
Figura 9: Análise da atividade nucleásica de DNA observada pela proporção de DNA
plasmidial clivado pelo extrato metanólico da Calendula officinalis visitadas de
insetos em diferentes concentrações (9,76 a 2500 µg/mL). A – Gráfico em barra; B –
Gráfico em linha. ....................................................................................................... 35
Figura 10: Análise da atividade nucleásica de DNA observada pela proporção de
DNA plasmidial clivado pelo extrato metanólico da Calendula officinalis não visitadas
de insetos em diferentes concentrações (9,76 a 2500 µg/mL). A – Gráfico em barra;
B – Gráfico em linha. ................................................................................................. 36
Figura 11: Resultado do método do poço dos extratos metanólicos da Calendula
officinalis. visitada (a) e não visitada (b) de insetos na concentração de 40 mg/mL
frente à Escherichia coli. ........................................................................................... 37
8
Figura 12: Resultado do método do poço dos extratos metanólicos da Calendula
officinalis. visitada (a) e não visitada (b) de insetos na concentração de 40 mg/mL
frente Staphylococcus aureus. .................................................................................. 37
9
SUMÁRIO
1
Introdução......................................................................................................... 10
2
Objetivos ........................................................................................................... 12
2.1 Geral: ........................................................................................................... 12
2.2 Específicos: .................................................................................................. 12
3
Fundamentação Teórica .................................................................................. 13
3.1 Plantas medicinais ....................................................................................... 13
3.1.1 Calendula officinalis ............................................................................... 14
3.1.1.1 Propriedades terapêuticas atribuídas à Calendula officinalis .......... 17
3.2 Processo de extração................................................................................... 18
3.3 Toxicidade .................................................................................................. 201
3.3.1 Artemia salina ...................................................................................... 222
3.3.2 Daphnia magna ................................................................................... 233
3.4 Potencial antimicrobiano ............................................................................ 234
3.5 Clivagem em DNA plasmidial ..................................................................... 255
4
Metodologia ...................................................................................................... 26
4.1 Tipo de pesquisa ........................................................................................ 277
4.2 Obtenção das amostras ............................................................................. 277
4.3 Preparação dos extratos metanólicos ........................................................ 277
4.4 Teste de toxicidade aguda em Artemia salina............................................ 288
4.5 Teste de toxicidade aguda em Daphnia magna ........................................... 29
4.6 Teste de Clivagem de DNA Plasmidial......................................................... 30
4.7 Teste da atividade antimicrobiana .............................................................. 311
4.7.1 Microorganismos utilizados ................................................................. 311
4.7.2 Meio de cultura e materiais .................................................................. 311
4.7.3 Difusão em Ágar Método do Poço ....................................................... 311
5
Resultados ...................................................................................................... 333
5.1 Teste de toxicidade com Artemia salina ..................................................... 333
5.2 Teste de toxicidade com Daphnia magna .................................................. 344
5.3 Teste de Clivagem de DNA Plasmidial....................................................... 344
5.4 Teste da atividade antimicrobiana .............................................................. 366
6
Discussão ....................................................................................................... 388
7
Conclusão ....................................................................................................... 411
Referências ............................................................................................................ 422
APÊNDICES ............................................................................................................. 48
10
1
INTRODUÇÃO
A ultilização de plantas medicinais está vinculada com a arte de curar,
sendo uma forma de tratamento com raízes muito antigas, desde os primórdios da
medicina, fundamentada com informações através de sucessivas gerações
(SIMÕES et al., 1998).
As plantas medicinais sempre desempenharam um papel importante na
saúde mundial e mesmo com os avanços da medicina moderna essas plantas
continuam tendo grande importância no tratamento de diversas doenças. Segundo a
OMS,
devido
à
pobreza
e
a
dificuldade
de
acesso
a
medicamentos,
aproximadamente 65 a 80% da população mundial, que vive em países em
desenvolvimento, depende de plantas medicinais para a atenção primária a saúde
(CALIXTO, 2000).
Apesar do conhecimento acumulado e dos estudos de plantas medicinais
na área da farmacologia e toxicologia ainda é muito pequeno para comprovar sua
segurança. Estima-se que das 250 a 500 mil espécies de plantas existentes no
planeta, apenas 15% foi estudada e somente para algum uso especifico
(CECHINEL-FILHO; YUNES, 1998).
No processo de cultivo das espécies medicinais alguns fatores podem
afetar de forma significativa a qualidade e a quantidade de princípios ativos
produzidos pelas plantas, pelo fato de que rotas metabólicas podem ser ativadas ou
inativadas, levando à produção de diversos produtos do metabolismo secundário em
cada situação (SILVA et al.,1995). Segundo Gotlieb (1981), graças à atividade
metabólica secundária, os vegetais são capazes de produzir substâncias
antibióticas,
utilizadas
como
mecanismo
de
defesa
contra
predação
por
microrganismos, insetos e herbívoros. Assim mudanças na composição química de
plantas podem ser induzidas em resposta a ataques por insetos herbívoros ou por
insetos visitantes florais (VALLADARES et al., 2002). Nas plantas aromáticas tais
mudanças podem afetar compostos fenólicos (como os taninos), compostos
terpenóides (óleos essenciais), alcalóides, glicosídeos cianogênicos e glicosinolatos
contendo enxofre (GULLAN; CRANSTON, 2007). Algumas destas substâncias são
tóxicas e outras podem ter pequeno ou nenhum efeito sobre os consumidores
(STRAUSS; ZANGERL, 2002).
11
Considerando que há falta de informação na literatura sobre a segurança
de plantas medicinais associadas à proteção e visitação nas mesmas por insetos,
que podem estar induzindo mudanças na composição química de plantas, este
estudo teve como finalidade avaliar a atividade tóxica e antimicrobiana in vitro do
extrato metanólico de flores de Calendula officinalis L. protegidas e visitadas de
insetos polinizadores e fitófagos.
12
2
2.1
OBJETIVOS
Geral:
- Avaliar a atividade tóxica e antimicrobiana in vitro dos extratos metanólicos de
flores de Calendula officinalis L. visitadas e protegidas de insetos polinizadores e
fitófagos.
2.2
Específicos:
- Investigar o potencial tóxico dos extratos metanólicos de Calendula officinalis
visitadas e protegidas de insetos polinizadores e fitófagos através do teste de
toxicidade aguda em Artemia salina;
- Pesquisar o potencial tóxico dos extratos metanólicos de Calendula officinalis
visitadas e protegidas através do teste de mobilidade sobre Daphnia magna;
- Determinar a atividade de clivagem do DNAs plasmidiais pBSKII dos extratos
metanólicos de Calendula officinalis protegidas e visitadas de insetos polinizadores
e fitófagos;
- Analisar a atividade antimicrobiana dos extratos metanólicos de Calendula
officinalis visitadas e protegidas de insetos polinizadores e fitófagos.
13
3
3.1
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
Plantas medicinais
Historicamente as plantas medicinais têm sido usadas, ao longo de eras
de evolução, como alimento e remédio para todas as espécies de animais, das mais
primitivas às mais especializadas. À medida que a evolução ensaiava e esculpia a
inteligência nos animais e com a chegada dos primeiros hominídeos há 2 milhões de
anos, o instinto foi cedendo lugar à razão, e a busca à flora, embora empírica,
passou a contar com um forte aliado: o espírito investigador. No Brasil, a utilização
destas plantas teve início com a cultura da população indígena das diversas tribos
que aqui habitaram (SIMÕES et al., 1998).
As plantas medicinais sempre desempenharam um papel importante na
saúde mundial e mesmo com os avanços da medicina moderna essas plantas
continuam tendo grande importância no tratamento de diversas doenças. Segundo
a OMS, devido à pobreza e a dificuldade de acesso a medicamentos,
aproximadamente 65 a 80% da população mundial que vive em países em
desenvolvimento depende de plantas medicinais para a atenção primária a saúde
(CALIXTO, 2000). No Brasil, que abrange 30% das florestas tropicais do planeta,
calcula-se que existam de 55 a 80 mil espécies de plantas, sendo que menos de
2% já foram estudas cientificamente (CASTRO; FERREIRA, 2001).
É preciso levar em consideração que muitas vezes essas plantas
medicinais da flora nativa são consumidas com pouco ou nenhuma comprovação de
suas propriedades farmacológicas, o que se torna um problema sério de saúde, pois
os efeitos adversos a fitomedicamentos ocorrem comumente (VEIGA JUNIOR;
PINTO; MACIEL, 2005).
Segundo a definição OMS a planta medicinal é todo ou qualquer vegetal
que possui, em um ou mais órgãos, substâncias que podem ser utilizadas com fins
terapêuticos ou que sejam precursores de fármacos semi-sintéticos. Já o fitoterápico
é todo o medicamento tecnicamente obtido e elaborado, empregando-se matériasprimas vegetais com finalidade profilática, curativa ou para fins de diagnóstico, com
benefício para o usuário. É caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos
14
do seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade
(KALLUF, 2008).
Assim nos dias de hoje, o estudo com plantas está muito difundido
principalmente nas universidades de farmácia, no qual cada dia apresentam-se
trabalhos científicos sobre as plantas e a sua ação terapêutica, bem como a sua
melhor forma de apresentação e utilização.
3.1.1 Calendula officinalis
Calendula officinalis pertencente à família Asteraceae, ordem Asterales e
clado Evasterídeas II (APG, 2009), é uma espécie economicamente importante
devido ao seu potencial farmacêutico, cosmético e ornamental (GARCIA et al.,
1996).
A Calendula officinalis é originária do mediterrâneo e foi cultivada na
Europa a partir do século XII, de onde logo se estendeu para o resto do mundo.
Pode-se dizer que a sua derivação botânica vem do latim, Kalendulae, que é
designado como o primeiro dia do calendário romano (LUZ; FERRADA; GOVÍN,
2001).
Trata-se de uma planta herbácea anual, de 30-60 cm de altura, apresenta
capítulos florais largos com cerca de 4,0 cm de diâmetro, terminais e solitárias, a
coloração das pétalas varia do amarelo ao laranja. As pétalas das flores centrais são
tubulosas e as periféricas liguladas (CORREA et al., 1984). No Brasil, a planta é
conhecida popularmente como Calêndula, Calêndula-hortense, Maravilha-dosjardins ou malmequer (CORRÊA, 1978).
O seu uso para terapias populares vem de longa data, no qual mais de 35
propriedades foram atribuídas à decocção e tinturas das flores, por exemplo, como
colerética, anti-inflamatória, bactericida, analgésica, antitumoral, antiúlcera, diurética,
cicatrizante (DUKE, 1991). No Brasil o uso da Calêndula está regulamentado pela
RE nº 89 de 16 de março de 2004 da ANVISA como anti-inflamatório e cicatrizante
de uso tópico em doses diárias de 8,8 a 17,6 mg de flavonóides (BRASIL, 2004).
Nos dados farmacológicos do extrato das flores foram relatadas ações
bactericida, fungistáticas, virucida e tricomicida (testes em vitro, principalmente);
15
essas ações parecem estar relacionadas com a presença dos flavonóides e das
saponinas. Em modelos com animais, foi relatada ação cicatrizante, com um
aumento da atividade fagocitária. Tal atividade é atribuída por alguns autores aos
carotenóides, e por outros, às saponinas e flavonóides (ISSAC, 1992).
A Farmacopéia Brasileira IV edição (1988), utiliza como marcador para a
droga vegetal, os flavonóides totais (
destacam-se
os
flavonóis
0,4%), dentre os compostos Isolados,
3-O-glicosídeos
isoharmnetina
3-glucosídeo,
isoharmnetina 3-rutinosídeo, quercetina 3-glucosídeo (isoquercetina), isoharmnetina
3
rutinoharmnosídeo,
isoharmnetina
3
glucoharmnosídeo
e
quercetina
3-
triglucosídeo. Todos esses flavonóides apresentam a quercetina ou a isoharmnetina
como porção aglicona (VIDAL-OLLIVIER et al., 1989; YOSHIKAWA et al., 2001).
Na fitoquímica realizada com as flores da planta, que é a parte mais
utilizada e também a mais estudada, foram encontrados grande espectro de
compostos químicos, sobretudo das classes dos flavonóides, terpenos e
carotenódes (VALDÉZ; GARCIA, 1999). Assim, os flavonóides podem ser
considerados
os
metabólitos
secundários
mais
importantes
na
atividade
farmacológica das flores de calêndula, no qual também são marcadores para aferir a
qualidade da matéria prima (BILIA et al., 2002)
Quando se fala na fitoquímica de uma planta não se deve deixar de lado a
existência
de
dois
grupos
de
metabólicos
bastante
importantes
ao
seu
desenvolvimento, no qual se caracteriza em metabólitos primários e os metabólitos
secundários, sendo os primários considerados essenciais à vida das espécies
vegetais e comuns aos seres vivos. Nessa categoria incluem-se as macromoléculas:
carboidratos, lipídios, proteínas e ácidos nucléicos, que fazem parte dos
constituintes celulares (SANTOS, 2002).
Já os metabólitos secundários são considerados especiais, pois são
produzidos, transformados e acumulados pelas plantas sem estar diretamente
relacionados à manutenção da vida dos organismos produtores. A produção desses
compostos ocorre em todas as espécies vegetais garantindo dessa forma
metabolismo diferenciado e único para a sua sobrevivência e perpetuação no
ecossistema (SANTOS, 2002). Os três principais grupos de compostos secundários
são os terpenos, os fenóis e os alcalóides (KALLUF, 2008).
Os terpenóides são considerados os maiores grupos dos compostos
secundários. Eles são encontrados livres nos tecidos vegetais sem se combinarem e
16
outros ocorrem na natureza na forma de glicosídeos, ésteres e ácidos orgânicos.
São compostos essenciais ao funcionamento da fotossíntese e fazem transporte de
açúcares pelas membranas celulares (KALLUF, 2008).
A classe dos fenóis são denominadas como substâncias que têm pelo
menos um grupo hidroxila ligado ao anel aromático. Esses grupos são de grande
importância nos metabólitos secundários das plantas no qual exerce função de
regulação estrutural, crescimento e proteção. Eles têm uma grande variedade
química como: ácido gálico, ácido cinâmico, cumarina, flavonóides, lignina e
antocianidina (KALLUF, 2008).
Os alcalóides formam um grupo heterogêneo de substâncias orgânicas
com nitrogênio ligado ao anel heterocíclico. Eles têm importante função na regulação
do crescimento e defesa do vegetal. Os constituintes e as propriedades químicas
próprias dos alcalóides se aliam a uma toxicidade elevada e, muitas vezes, a uma
potente atividade farmacológica, nas quais as principais ações terapêuticas são:
anestésica, analgésica, psicoestimulante e neuro-depressora (KALLUF, 2008).
A concentração dessas substâncias determina a ação terapêutica, tóxica
ou efeito placebo da planta, sendo que elas podem estar espalhadas por toda a
planta ou ainda concentrada em algum órgão (SILVA JUNIOR, 2003).
Os terpenóides fazem parte da constituição dos óleos voláteis e são
encontrados em plantas aromáticas, no qual os monoterpenos constituem 90%.
Essa é uma substância que exerce diferentes funções ecológicas, como inibidores
da germinação, na proteção contra predadores, na atração de polinizadores, entre
outras (HARBONE, 1993).
Valladares et al. (2002) apontam que mudanças na composição química
de plantas podem ser induzidas em resposta a ataques por insetos herbívoros ou a
visitantes florais. Segundo estes autores, as mudanças químicas induzidas em
plantas medicinais por insetos podem ser comuns e suas implicações econômicas
merecem a investigação. Uma vez que a composição química das plantas varia com
suas condições fisiológicas, e que essas condições dependem da interação com
insetos predadores ou visitantes florais, entre elas a Calendula officinalis, podem
apresentar resultados diferentes entre plantas com e sem a visitação desses
animais.
Assim esses fatores em conjunto podem afetar de forma significativa a
qualidade e a quantidade de compostos ativos produzidos pelas plantas, pelo fato de
17
que rotas metabólicas podem ser ativadas ou inativadas, levando à produção de
diversos produtos do metabolismo secundário em cada situação (SILVA et al.,
1995).
3.1.1.1 Propriedades terapêuticas atribuídas à Calendula officinalis L.
No uso de Calendula officinalis para terapias populares mais de 35
propriedades foram atribuídas à decocção e tinturas das flores, por exemplo,
colerética, anti-inflamatória, bactericida, analgésica, antitumoral, antiúlcera, diurética,
cicatrizante
(Duke,
1991).
Segundo
os
pesquisadores,
estas
atividades
farmacológicas atribuídas à Calendula officinalis estão relacionadas com a presença
de flavonóides e saponinas (ISSAC, 1992).
Estudos
demonstraram
com
diferentes
o
extrato
atividades
hidroalcoólico
de
anti-inflamatórias,
Calendula
sendo
a
officinalis
capacidade
antioxidante desta espécie um possível mecanismo de ação para tais propriedades.
Cordova et al. (2002) investigaram o extrato butanólico de Calendula officinalis
contra a peroxidação lipídica de microssomas de fígado de rato e ação scavenger de
radicais livres. Os resultados obtidos sugerem que a fração butanólica possui ação
scavenger e atividade antioxidante significativas.
Outros estudos clínicos demonstraram que a tintura e o gel de Calendula
officinalis 10 e 2%, respectivamente, são úteis para o tratamento de queimaduras do
sol e do fogo, além de lesões rebeldes, como úlcera varicosa de evolução crônica.
Nesses casos, a droga vegetal acelerou a cicatrização e reduziu a dor (JORGE
NETO et al., 1996).
Em experimentos realizados por Volpato (2005), para verificar a atividade
antibacteriana das flores de Calenula officinalis, utilizou-se sub-frações hexânica,
diclorometano, acetato de etila, metanólica e etanólica 85% das flores de Caledula
officinalis, pela metodologia da cavidade em placa, com o intuito de avaliar o perfil
de
sensibilidade
frente
a
microrganismos
patogênicos,
gram
positivo
(Staphylococcus aureus, Bacillus cereus) e negativo (Enterobacter aerogenes,
Klebiciela pneumoniae e Pseudomonas aeroginosa). Com os resultados foi possível
verificar atividade antibacteriana, na qual os extratos foram na maioria ativos para as
18
cepas gram positivas, sendo que apenas o extrato metanólico apresentou atividade
para gram negativos (Klebiciela pneumoniae). As sub-frações metanólica e etanólica
apresentaram atividade inibitória para Bacillus cereus (gram positivo). Dentre as
frações ensaiadas, as frações hexânica e diclorometano apresentaram melhor
desempenho na atividade antibacteriana para gram positivos (Bacillus cereus e
Staphylicoccus aureus). Assim o estudo revelou que atividade antibacteriana se
concentra principalmente nas frações menos polares da planta, nas frações
hexânica e diclorometano, no qual ambas frações são ricas em esteróides e
triterpenos.
Outro teste antimicrobiano realizado por Parente (2008), para determinar
a concentração inibitória mínima (CIM), foram utilizadas cepas padrões American
Type Culture Collection (ATCC), través de culturas de Staphylococcus aureus
(ATCC 6532), Staphylococcus aureus (ATCC 13048), Micrococcus roseus (ATCC
1740), Micrococcus luteus (ATCC 9341), Bacillus cereus (ATCC 14576), Bacillus
stearothermophylus
Enterobacter
(ATCC
aerogenes
1262),
(ATCC
Enterobacter
13048),
cloacae
Escherichia
coli
(HMA/FTA
(ATCC
502),
25922),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) e Serratia marcescens (ATCC 14756), no
qual utilizaram a metodologia de diluição em placa. Os resultados indicaram que o
extrato etanólico e as frações diclorometano e hexâno de calêndula apresentaram
atividade antibacteriana, principalmente sobre bactérias gram positivas.
Dados de toxicidade aguda apontam que a DL50 para o extrato aquoso de
Calendula officinalis por via intravenosa em camundongos é de 375mg/kg
(MANOLOV et al., 1964). Boyadzhiev e Vissh (1964) demonstraram um valor de
DL50 respectivamente por vias subcutânea e intravenosa de 45mg/camundongo e
526mg/100g de rato a partir do extrato hidroalcoólico das flores de calêndula.
Estudos de toxicidade crônica com extratos de calêndula (150mg/kg) por via oral em
ratos e hamster respectivamente por 22 e 18 meses não demonstraram sinais de
toxicidade (AVRAMOVA et al., 1988).
3.2
Processo de extração
19
O processo extração tem com objetivo a retirada dos princípios ativos das
plantas, no qual se utiliza de solventes, tais como álcool, a água, os vinagres, os
óleos, o propilenoglicol ou a glicerina. Nesse processo o que vai decidir a escolha
do solvente é a composição química da planta e a solubilidade dos princípios
ativos. Nos processos extrativos temos como principais métodos, a maceração,
infusão, decocção, digestão, percolação e a destilação (KALLUF, 2008).
No processo de extração, deve-se levar em consideração uma série de
fatores que interferem nesta operação, tais como característica do material vegetal,
o seu grau de divisão, o meio extrator (solvente) e a metodologia utilizada. O grau
de divisão do material irá influenciar diretamente na eficiência da extração, no qual
a rigidez do tecido vai dificultar a penetração do solvente extrativo e assim interferir
na processo de extração (SIMÕES et al., 2003).
Na escolha do solvente adequado além da eficiência do processo
extrativo, deve-se levar em conta a sua toxicidade e o risco que seu manuseio
representam, a estabilidade das substâncias extraídas, a disponibilidade e o custo
do solvente. Os fatores relacionados aos métodos de extração dizem respeito à
agitação, a temperatura e ao tempo necessário para executá-los (SIMÕES et al.,
2003).
Das inúmeras metodologias utilizadas para a preparação de extratos
vegetais, visando o isolamento de seus constituintes químicos, um dos métodos
que são considerados mais adequados para a análise química-farmacológica é a
preparação de um extrato hidroalcoólico (etanol/água 50/50, v/v). Quando se
considera que o extrato em estudo apresenta efeitos biológicos de interesse, devese proceder a um método sistemático de investigação. O solvente mais adequando
neste caso para obtenção do extrato bruto é o metanol, pois possibilita a extração
de um maior número de compostos (YUNES; CALIXTO, 2001). Praticamente todos
os constituintes de interesse para a análise fitoquímica apresentam alguma
solubilidade em misturas etanólicas ou metanólicas a 80%, de tal modo que estas
costumam se empregadas com freqüência (SIMÕES et al., 2003).
Após este extrato pode ser submetido a um processo de partição líquidolíquido, com solventes de polaridades crescentes, como hexâno, diclorometano,
acetato de etila e butanol, conforme a figura 1, visando uma separação das
substâncias através de suas polaridades (YUNES; CALIXTO, 2001). No entanto,
devido aos protocolos internacionais que condenaram o uso de solventes clorados,
20
proibindo sua produção, estes solventes já não devem ser mais utilizados para a
preparação de extratos, sendo portando, mais indicado, uma única extração
utilizando metanólico ou etanólico (MACIEL et al., 2002).
Figura 1: Esquema geral de partição e separação provável dos principais metabólitos
secundários em plantas. Fonte: YUNES; CALIXTO, 2001.
3.3
Toxicidade
21
São definidas como tóxicas aquelas plantas que possuem algum tipo de
efeito lesivo ou substância nociva, causando distúrbios ao organismo do homem ou
de animais, pelo contato ou ingestão (ANDRADE FILHO; CAMPOLINA; DIAS, 2001).
A flora brasileira apresenta um número grande e variado de espécies
potencialmente lesivas para o ser humano. A planta medicinal utilizada em
medicamento é um xenobiótico, isto é, um produto estranho ao organismo humano,
nele introduzido com finalidades terapêuticas. Como toda substância estranha, os
produtos de sua biotransformação são potencialmente tóxicos e assim devem ser
encarados até que se prove o contrário (SCHVARTSMAN, 1991; SIMÕES et al.,
2003).
As toxicidades provocadas por xenobióticos podem ser classificadas em
agudas e crônicas, conforme o número e a persistência de contato do sistema
biológico com o agente. A intoxicação aguda é decorrente de um único contato ou
múltiplos contatos com o agente tóxico, num período de tempo aproximadamente
24h. No qual experimentalmente a avaliação da toxicidade aguda é feita geralmente
utilizando pelo menos 3 espécies animais, sendo uma não roedora. O parâmetro
mais utilizado para expressar o grau de toxicidade aguda de substâncias químicas é
a dose letal de 50% (DL50) que correspondem à dose que provavelmente mata 50%
dos organismos de um lote utilizado para o experimento. Além da dose letal, pode se
determinar ainda à dose efetiva ou eficaz 50% (DE50) que é a dose que promove
efeito desejado em 50%, nos organismos submetidos à experiência. Um outro
parâmetro utilizado é o estado de imobilidade no qual é um parâmetro que antecede
o estado de letalidade (OGA; ZANINI, 2003).
A intoxicação crônica resulta de contatos repetidos com o agente tóxico,
num período de tempo prolongado, de meses ou anos. Muitos compostos não
chegam a causar danos após alguns contatos, porém, em contatos prolongados,
podem promover efeitos lentos e graves, como são os casos de mutagenicidade e
carcinogenicidade (OGA; ZANINI, 2003).
Assim nos estudos de plantas e de novas substâncias, um balanço entre
a atividade biológica versus a toxicidade é um parâmetro fundamental para verificar
sua aplicabilidade (CALIXTO, 2000).
Temos assim os bioindicadores, no qual é um termo utilizado para
descrever uma espécie de animal ou vegetal que consegue responder a uma
variedade de alterações no ambiente em que vive de formas peculiares dando
22
diversas respostas: fisiológicas, bioquímicas, genéticas, comportamentais entre
outras (SHUGART, 1994).
3.3.1 Artemia salina
A utilização de Artemia salina como organismo bioindicador em teste de
toxicidade aguda é um bioensaio que serve tanto como indicador de toxicidade como
de bioatividade de diversas substâncias químicas, inclusive extratos de plantas
(LOPES et al., 2002). Apresenta vantagens como: rapidez, praticidade (PARRA et
al., 2001), simplicidade, baixo custo, requer pouca quantidade de amostra (SILVA et
al., 2000), além de apresentar boa relação com testes in vivo, sugerindo que é um
método útil (PARRA et al., 2001) e de confiança (SILVA et al., 2000). Artemia salina
é um microcrustáceo de água salgada, encontrado em muitos ambientes marinhos
do planeta onde é utilizado como alimento vivo para peixes, sendo seus cistos
encontrados facilmente em lojas de aquaristas (NUNES et al., 2006).
O ciclo de vida da Artemia salina se inicia pela eclosão de cistos
dormentes, os quais são embriões encapsulados metabolicamente inativos. Esses
cistos podem permanecer no estado dormente por muitos anos, desde que mantidos
em lugar sem umidade. Quando esses cistos entram em contato com água salgada,
eles se tornam hidratados e reassumem o seu desenvolvimento (GOMES, 1986).
Figura 2: Ilustração do microcrustáceo de água salgada, Artemia salina. Fonte: Kribensis
(2010).
23
3.3.2 Daphnia magna
Outro modelo de bioindicador utilizado é a Daphnia magna STRAUS,
1820 é um microcrustáceo planctônico de água doce, com tamanho médio de 5 a 6
mm, que é vulgarmente conhecido como pulga d’água. É amplamente indicado por
apresentar características significativas como abundância em meio aquático e
sensibilidade a substâncias tóxicas. Seu manejo e cultivo, frente a condições
favoráveis em laboratório, são fácil uma vez que apresenta um ciclo de vida curto e
um padrão reprodutivo assexuado. Sendo assim, seu genótipo padrão garantindo
uma uniformidade no resultado do ensaio (KNIE; LOPES, 2004).
Figura 3: Ilustração do microcrustáceo de água doce, Daphnia magna. Fonte: Stringhini;
Salomon (s.d).
3.4
Potencial antimicrobiano
Com base em testes in vitro, os agentes antimicrobianos são classificados
em bactericidas ou bacteriostáticos. Os antimicrobianos com atividade bactericida
matam as bactérias, provocando dano irreversível e irreparável nas estruturas e
funções vitais das células; e os com atividade bacteriostática, inibem o crescimento
e reprodução das células, paralisando o seu metabolismo celular, porém, esta ação
pode ser reversível quando a sua ação é neutralizada (TORTORA; FUNKE; CASE,
2005).
Assim os antimicrobianos têm a propriedade de inibir o crescimento de
bactérias ou causa sua morte. A procura destas propriedades em plantas vem
24
crescendo cada vez mais como resultado da resistência dos microrganismos aos
antibióticos comumente usados na terapêutica, sendo uma possibilidade de origem
de novos potentes antibióticos no qual bactérias patogênicas com algum tipo de
resistência se tornem sensíveis (ROJAS et al., 2006).
A resistência bacteriana tornou-se uma ameaça aos tratamentos de
doenças infecciosas, na medida em que já foram encontrados casos de
patógenos comuns resistentes a quase todos os antibacterianos disponíveis no
mercado, ocasionando um aumento na taxa de morbidade, mortalidade e dos
custos nos serviços de saúde (VIKSVEEN, 2003). Outro agravante que deve ser
considerado é que, recentemente, a resistência não encontra apenas nas
dependências de hospitais, ocorrendo também na comunidade de um modo
geral, devido à utilização desordenada dos antibióticos (VIKSVEEN, 2003).
Uma pesquisa feita por Sader et al. (2001), em 12 hospitais brasileiros
localizados em 4 estados distintos, mostra que os patógenos mais freqüentemente
isolados nestes hospitais foram os Staphylococcus aureus (22,8%), seguidos pela
Escherichia coli (13,8%) e a Pseudomonas aeruginosa (13,3%).
Staphylococcus
aureus
é
a
bactéria
mais
importante
entre
os
estafilococos, apesar desse microrganismo gram-positivo fazer parte da microbiota
humana normal ele pode ocasionar infecções oportunistas importantes dentre elas
estão as infecções cutâneas, crônicas e até infecções sistêmicas como endocardite,
osteomielite, pioartrite, abscesso metastático em particular na pele, pulmões, fígado,
rins e cérebro, além de ser a causa mais freqüente de meningite associada a
derivações ventriculoperitoneais (KONEMAN et al., 2001).
A espécie Escherichia coli já foi isolada em todos os tecidos e sistemas
humanos tornado-se assim o microorganismo mais comumente isolados em
laboratórios clínicos. Os principais sítios são: trato urinário onde é responsável por
cerca de 90% dos casos infecciosos, feridas, pneumonias, meningites em neonatos
além de ser a bactéria gram-negativa mais comumente envolvida em septicemia por
choque devido as suas endotoxinas (KONEMAN et al., 2001).
Praticamente todas as bactérias, com exceção dos micoplasmas,
possuem, uma membrana celular circundante, uma parede celular rígida, que
determina a forma do organismo, sendo também determinante para a classificação
25
da bactéria como gram-positiva
gram
ou gram-negativa (HARVEY;; CHAMPE; FISHER,
2008).
3.5
Clivagem em DNA plasmidial
Os plasmídeos são moléculas de DNA circular, de fita dupla,
extracromossômico
romossômico e com capacidade de replicação autônoma que ocorrem
naturalmente em bactérias e em alguns organismos eucarióticos unicelulares, como
leveduras (PASSAGLIA; ZAHA, 2003).
Além de sua forma normal superenovelada (F I) o DNA plasmidial pode
possuir a forma circular aberta (F II) e a forma linear (F III). Quebras na dupla hélice
fazem com que a forma superenovelada transforme-se
transforme se em forma circular aberta
através de quebras simples e forma linear através de quebra dupla de cadeia (Figura
4). Todas as três possuem velocidades de migração eletroforética diferenciadas,
apresentando-se
se como bandas distintas em géis de eletroforese,
eletroforese, como demonstrado
na figura 5 (SREDDHARA; COWAN, 2001).
Figura 4:: Esquema de Corte da Molécula
Mol
de DNA Plasmidial. Fonte: Berg ; Tymoczko e Stryer
(2004), modificado.
Figura 5:: Fotografia de um gel de agarose demonstrando a separação das formas
forma do DNA
plasmidial Fonte: PICH ( 2009).
2009
26
27
4
4.1
METOLOGIA
Tipo de pesquisa
A pesquisa foi experimental e, segundo seus fins, aplicada (BARROS;
LEHFELD, 2000). Para isso, utilizou-se amostragem com análise estatística e
abordagem quantitativa (OLIVEIRA, 2002). Além de levantamento bibliográfico
(MARTINS, 2004).
4.2
Obtenção das amostras
O material botânico, capítulos de Calendula officinalis, foi coletado no
município de Grão-Pará (SC) com identificação da planta pela Professora Dra.
Vanilde Citadini Zanette e com posterior registro e armazenamento de um exemplar
no Herbário Pe. Dr. Raulino Reitz, da Universidade do Extremo Sul Catarinense –
UNESC, sob o número CRI 8347. Foram coletados 3kg de capítulos de plantas
expostas à visitação de insetos e 3 kg de plantas protegidas contra os insetos. Para
a proteção das plantas, foi preparado um canteiro e as plantas foram protegidas de
visitas de insetos por meio de uma cobertura de tela verde clara e inspecionadas,
diariamente, pelo proprietário da área, para evitar eventuais invasões por insetos.
4.3
Preparação dos extratos metanólicos
As flores foram secas em estufa a 30 a 40°C e então moídas, após foram
colocadas em suspensão com solvente metanol PA com quantidade suficiente de
solvente para cobrir o material, então foram deixados em repouso por sete dias em
local seco e protegido da luz. O solvente foi reposto quando houve necessidade
durante esse período. Após este período, com auxílio de funil e gaze, o extrato
fluido foi filtrado e concentrado em Rota-vapor (Fisaton 802D), em uma temperatura
28
de 40ºC e 117 RPMs. Os extratos metanólicos (plantas protegidas e plantas
visitadas) foram armazenados em frascos hermeticamente fechados, num local
fresco e ao abrigo da luz.
4.4
Teste de toxicidade aguda em Artemia salina
O teste de toxicidade foi realizado conforme a figura 6, através de ensaios
com Artemia salina pelo método de Meyer e colaboradores (1982), com algumas
modificações. Cistos de Artemia salina foram incubados durante 24 horas em
solução de sal marinho sintético (30g/L), com iluminação e aeração constantes.
Após a eclosão, 10 microcrustáceos foram incubados em placas “multiwell” durante
24 horas a 25ºC, na ausência de luz, em 2mL de amostra do extrato metanólico de
Calendula officinalis visitadas e não visitadas de insetos diluídos em solução de sal
marinho sintético. As concentrações testadas foram as seguintes: 0,62; 1,25; 2,5; 5;
10; 20 mg/mL. É importante salientar que para cada concentração testada foram
realizadas quatro replicatas com 10 indivíduos em cada uma. O controle negativo
(concentração 0mg/L) seguiu o mesmo procedimento, porém foram incubados
apenas em solução de sal marinho sintético. Ao término das 24h de incubação,
foram analisadas as mortes dos indivíduos. Após a contagem dos indivíduos mortos,
foi calculado a CL50, na qual determina a concentração letal média (50%) do
composto ou extrato em estudo sobre indivíduos de Artemia salina expostos, ou
seja, a concentração que leva a morte da metade dos indivíduos (LEWAN et al.,
1992 apud PARRA et al., 2001).
A CL50 é calculada através do método matemático Trimmed SpearmanKarber (HAMILTON et al., 1977), usando o software Probitos® e para a construção
dos gráficos utilizou-se o software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Inc.San Diego,
CA, USA).
29
Figura 6: Esquema simplificado da preparação e execução do Teste de toxicidade aguda com
Artemia salina. Fonte: Bortolotto (2009), adaptado.
4.5
Teste de toxicidade aguda em Daphnia magna
Para realização deste ensaio foram utilizados os extratos metanólicos de
flores de Calendula officinalis, protegidas e visitadas de insetos nas doses de 0,62;
1,25; 2,5; 5, 10 e 20 mg/mL no qual foi avaliado a toxicidade aguda das amostras.
Para a realização dos ensaios de toxicidade aguda foram utilizados os organismos
teste Daphnia magna, nos quais são cultivados no Laboratório de ecotoxicologia no
IPAT. As amostras foram feitas em duplicata bem como o controle negativo, no qual
cada recipiente recebeu 20 mL de uma solução ISO para diluição das amostras para
posterior teste com Daphnia magna. Após inseriu-se 10 daphnias jovens (entre 2 e
26 horas de vida) em cada recipiente.
Então as amostras foram deixadas em
exposição por um período de 48 horas, sem alimentação e luminosidade e
temperatura de 20±2 0C.
Ao final dos testes registrou-se o número de organismos imóveis em cada
recipiente. Os indivíduos foram considerados imóveis quando não apresentavam
movimento após 10 segundos de observação mesmo com pequena agitação dos
recipientes. Com os dados de imobilidade dos organismos calculou-se a
Concentração Efetiva Mediana (CE50), que representa a concentração nominal da
30
amostra, no início do ensaio, que causa efeito agudo a 50% dos organismos durante
o tempo de exposição (Knie; Lopes, 2004).
A CE50 foi calculada através do método matemático Trimmed SpearmanKarber (HAMILTON et al., 1977), usando o software Probitos® e para a construção
dos gráficos utilizou-se o software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Inc.San Diego,
CA, USA).
4.6
Teste de Clivagem de DNA Plasmidial
Células de Escherichia coli DH5
foram transformadas com o plasmídio
pBSK-II para sua amplificação (AUSUBEL et at., 1995). O DNA plasmidial foi
purificado utilizando o sistema HiSpeed Plasmid Maxi Kit (Qiagen) seguindo as
recomendações descritas pelo fabricante. Foram incubados durante 16hs a 37°C,
microtubos contendo: 5µL de DNA plasmidial (600ng) + 5µL tampão PIPES pH 7,5
(25µM de concentração final) + 20µL de cada concentração do extrato metanólico
Calendula officinalis visitadas e não visitadas de insetos (9,7; 19,5; 39; 78; 156, 312,
625, 1.250 e 2.500 µg/mL.) + água nanopura estéril suficiente para completar volume
de 40µL. O controle negativo foi procedido com água nanopura + tampão PIPES, e
para controle positivo foi utilizado 3µL de DNA plasmidial digerido pela enzima de
restrição EcoRV.
Após as incubações, adicionou-se a cada amostra, 5µL tampão de
eletroforese 6x (EDTA 0,25M, glicerol 50% e azul de bromofenol 0,01%) para a
interrupção das reações. 20µL de cada amostra foram aplicados em gel de agarose
(0,8%), contendo 5 L de brometo de etídio para coloração, e após submeteu-se a
eletroforese horizontal com tampão TBE 0,5x pH 7,4 (Tris 44,5mM, ácido bórico
44,5mM, EDTA 1mM) por aproximadamente 50 minutos a 50V.
Após corrida eletroforética as bandas com as formas superenovelada, circular
e linear do DNA plasmidial foram visualizadas e fotodocumentadas com o auxílio de
um transluminador ( = 302nm), e quantificadas por meio do software ImageJ 1.41º,
tabulados em planilha de Microsoft Office Excel 2007 e para a confecção dos
gráficos foi utilizado o software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Inc.San Diego, CA,
USA (PICH, 2009).
31
4.7
Teste da atividade antimicrobiana
4.7.1 Microorganismos utilizados
A atividade antimicrobiana (AA) foi investigada frente a microrganismos
gram positivos Staphylococcus aureus e gram negativos Escherichia coli. As
linhagens de bactérias utilizadas para o teste estão registradas no American Type
Culture Colletion (ATCC).
4.7.2 Meio de cultura e materiais
Para a realização dos testes foi utilizado o meio de cultura, agar (PCA). O
meio de cultura foi preparado, segundo as especificações do fabricante, com as
quantidades do meio de cultura por litro, sendo pesado, acrescido de água destilada,
dissolvido e aquecido até a obtenção de uma solução homogênea e translúcida. Os
materiais necessários para realização do teste foram empacotados com papel pardo,
após os meios de cultura e os materiais foram esterilizados em autoclave durante 20
minutos a temperatura de 121°C e pressão de 1,2 atm. Após este processo, os
mesmos foram autoclavados, os materiais foram colocados em estufa com
temperatura de 60°C durante 24 horas para a secagem da umidade resultante do
processo de esterilização e os meios de cultura foram armazenados em refrigerador
a uma temperatura de aproximadamente 4°C (NCCLS, 2003).
4.7.3 Difusão em Ágar Método do Poço
A atividade antimicrobiana dos extratos metanólicos de flores de Calendula
officinalis, protegidas e visitadas de insetos foram determinadas utilizando o método
do poço. Em capela de fluxo laminar, uma colônia proveniente de placas de meio
32
PCA inoculadas no dia anterior e incubadas a 37°C foi distribuída uniformemente
sobre o ágar PCA com uma alça de níquel previamente flambada. A distribuição foi
realizada girando a placa em 45º e estriando até o final da mesma por três vezes.
Depois de semear as bactérias, foi realizada a perfuração dos poços com o auxílio
de um tubo de metal de 0,9 mm de diâmetro previamente flambado. Em cada placa
foram perfurados dois poços, adicionando 100µL dos extratos nas concentrações de
0,31; 0,62; 1,25; 2,5; 5; 10; 20; 40mg/mL. As placas foram identificadas e incubadas
em estufa bacteriológica à temperatura de 35 ± 2°C, durante o período de 24 horas.
Após a incubação, a leitura dos resultados foi obtida com a medição do halo de
inibição, com auxílio de uma régua milimetrada (FIORI et al., 2009).
33
5
5.1
RESULTADOS
Teste de toxicidade com Artemia salina
Os resultados obtidos (média das quatro replicatas), referentes ao teste de
toxicidade com Artemia salina, do extrato metanólico da Calendula officinalis
visitadas e não visitadas por insetos, são representados na figura 7.
A CL50 do extrato não visitada foi estimada em 5,74 mg/mL e a visitada foi
de 4 mg/mL. Sabendo que quanto menor a CL50 mais tóxico é o extrato, pode-se
aferir que o extrato visitado apresentou maior toxicidade do que o extrato não
visitado.
Figura 7: Índice de Letalidade (%) obtido através do Teste de toxicidade utilizando Artemia
salina em concentrações (mg/mL) seriadas dos extratos metanólicos de Calendula officinalis
visitada e não visitada de insetos, e controle negativo com solução de sal marinho sintético
(concentração de 0mg/mL). Índice de letalidade está expresso como média (%) das quatro
replicatas.
34
5.2
Teste de toxicidade com Daphnia magna
Os resultados obtidos (média da duplicata), referentes ao teste de
toxicidade com Daphnia magna, do extrato metanólico da Calendula officinalis
visitadas e não visitadas por insetos, são representados na figura 8.
A CE50 do extrato não visitada foi estimada em 1,64 mg/mL e a visitada foi
de 1,24 mg/mL. Sabendo que quanto menor a CE50 mais tóxico é o extrato, pode-se
aferir que o extrato visitado apresentou maior toxicidade do que o extrato não
visitado.
Figura 8: Índice de imobilidade (%) obtido através do Teste de toxicidade utilizando Daphnia
magna em concentrações (mg/mL) seriadas do extratos metanólicos de Calendula officinalis
visitada e não visitada de insetos, e controle negativo com solução padrão para Daphnia
magna. Índice de Mobilidade está expresso como média (%) das duas replicatas.
5.3
Teste de Clivagem de DNA Plasmidial
Na análise da atividade nucleásica com extrato metanólico de Calendula
officinalis visitada por insetos pode-se observar que na concentração de 19,53
µg/mL começou apresentar as três formas (FI, FII e FIII) mantendo semelhantes os
35
valores até a dose 78,12 µg/mL. Na concentração de 156,25 µg/mL obteve-se uma
diminuição brusca da forma supertorcida (FI) e um pico da forma circula aberta (FII).
Este fato se repete na concentração 312,5 µg/mL a 1250 µg/mL que possui valores
parecidos, voltando a ter uma queda na FI e um aumento da FII na dose 2500 µg/mL
(Figura 9).
A
B
Figura 9: Análise da atividade nucleásica de DNA observada pela proporção de DNA plasmidial
clivado pelo extrato metanólico de Calendula officinalis visitadas de insetos em diferentes
concentrações (9,76 a 2500 µg/mL). A – Gráfico em barra; B – Gráfico em linha.
Para o extrato não visitado por insetos até a concentração 78,12 µg/mL
não apresentou quebras duplas no DNA plasmidial (FIII). Esta dose (78,12 µg/mL)
foi a que maior conteve quebra circular aberta (FII), no qual foi diminuindo a
porcentagem de FII e aumentando a forma supertorcida (FI) até a concentração 625
µg/mL. Do mesmo modo observa-se que nas concentrações seguintes há um
aumento da forma FII e conseqüentemente uma diminuição da FI (Figura 10).
36
A
B
Figura 10: Análise da atividade nucleásica de DNA observada pela proporção de DNA
plasmidial clivado pelo extrato metanólico de Calendula officinalis não visitadas de insetos em
diferentes concentrações (9,76 a 2500 µg/mL). A – Gráfico em barra; B – Gráfico em linha.
5.4
Teste da atividade antimicrobiana
Os resultados obtidos pelo método do poço dos extratos metanólicos de
Calendula officinalis visitada e não visitada por insetos, frente às bactérias testadas,
encontram-se no apêndice. Pelos resultados observou-se que não houve zona de
inibição em nenhuma das doses testadas frente Staphylocccus aureus e Escherichia
coli.
As figuras 11 e 12 estão indicando que na maior concentração que é de
40 mg/mL não apresentou zona de inibição. No apêndice encontram-se as fotos das
demais concentrações visitadas e não visitadas (0,31; 0,62; 1,25; 2,5; 5; 10 ; 20 e 40
mg/mL) que também não apresentaram zona de inibição.
37
a
b
Figura 11: Resultado do método do poço dos extratos metanólicos de Calendula officinalis
visitada (a) e não visitada (b) de insetos na concentração de 40 mg/mL frente à Escherichia
coli.
a
b
Figura 12: Resultado do método do poço dos extratos metanólicos de Calendula officinalis
visitada (a) e não visitada (b) de insetos na concentração de 40 mg/mL frente Staphylococcus
aureus.
38
6
DISCUSSÃO
No teste de toxicidade aguda com Artemia salina foi demonstrado que o
extrato metanólico de Calendula officinalis visitado e não visitado foi capaz de
provocar toxicidade em concentrações elevadas em indivíduos de Artemia salina
expostos, pois promoveu letalidade de 100% nas concentrações testadas e a CL50
foi de 4 mg/ml para as visitadas e 5,74 para as não visitadas. Assim, observando
que o extrato visitado apresentou uma CL50 menor que o não visitado, nos indica
comparativamente que o extrato visitado foi mais tóxico que o não visitado, mas de
acordo com de Meyer e colaboradores (1982) estes valores demonstram que os dois
extratos não apresentaram toxicidade conforme sua classificação que preconiza que
valores de CL50 maiores que 1mg/ml não apresentam resultados positivos.
Na bibliografia não foram localizados nenhum outro estudo de toxicidade
utilizando Artemia salina com Calendula officinalis. No entanto, comparando este
resultado com os obtidos em teste com Artemia salina com extratos de espécies de
Asteraceae, observou-se que os resultados de toxicidade aguda são similares aos
encontrados nos extratos etanólicos de Mikania cordifolia L. (Willd) e Vernonia
brasiliana L. (Druce) que apresentaram CL50 maior que 1mg/ml (ROJAS-DE-ARIAS
et al., 1995).
Outros testes para avaliar a toxicidade aguda da Calendula officinalis
foram realizados por Manolov et al., (1964) no qual apontaram que a DL50 para o
extrato aquoso de Calendula officinalis por via intravenosa em camundongos de 375
mg/kg. Boyadzhiev e Vissh (1964) demonstraram um valor de DL50 respectivamente
por via subcutânea e intravenosa de 45mg/camundongo e 526mg/100g de rato a
partir do extrato hidroalcoólico das flores de calêndula. Estudos de toxicidade
crônica com o extrato hidroalcoólico de calêndula de 150mg/kg por via oral em ratos
e hamster respectivamente por 22 e 18 meses não demonstraram sinais de
toxicidade (AVRAMOVA et al., 1988).
No teste de toxicidade aguda com Daphnia magna não foram encontrados
trabalhos relacionando o microcrustáceo com extratos de plantas. Mas de acordo
com a legislação ambiental de Santa Catarina que estabelece limites máximos de
toxicidade aguda para efluentes, no qual valores de diluição menores que 12,5%
para CE50 são potencialmente tóxicos (FATMA, 2002). Os extratos de Calendula
39
officinalis visitado e não visitado foram considerados potencialmente tóxicos nas
doses 1,24 mg/mL para visitado e 1,64 mg/mL para não visitada. Pois os extratos
apresentaram um valor de diluição para CE50 de 6,2% para visitado e 8,2% para não
visitado.
Na clivagem de DNA plasmidial os extratos metanólicos de Calendula
officinalis apresentaram as formas de quebra circular aberta em todas as
concentrações dos extratos visitados e não visitados, e a quebra linear foram
observadas no extrato visitado em todas as doses, exceto na concentração 312,5
µg/mL, e a partir da dose de 78,12 µg/mL do extrato não visitado. Com esses dados
pode-se concluir que o extrato de plantas visitadas por insetos polinizadores e
fitofágos apresentou maior intensidade de quebras no DNA plasmidial.
A atividade nucleásica pode ser compreendida por dois mecanismos,
oxidativo e hidrolítico. Inicialmente, a interação do composto no local que ocorre a
quebra é igual para ambos os mecanismos, as moléculas atenuam as ligações de
hidrogênio entre as bases, unindo-se a uma das fitas ou deslizando entre as bases
(BISCHOFF; HOFFMANN, 2002 apud PARAGINSKI, 2007).
No teste de clivagem também se observou que a interação do composto
com o DNA plasmidial não apresentou relação direta entre concentração e forma de
quebra. Assim, formulamos duas hipóteses, uma no qual poderia estar ocorrendo
uma precipitação do extrato nas doses utilizadas no experimento e outra que pode
estar relacionada há alguma substância inibitória que se encontra no extrato e que
em algumas concentrações há a presença suficiente desta para inibir a quebra.
Na literatura foram encontrados resultados com relação direta entre
concentração e forma de quebra como os de Macêdo e colaboradores (2008), Silva
et al. (2008) e Crescêncio (2009) com extrato de Bauhinia monandra, Cassia
angustifolia e Ilex paraguariensis, respectivamente.
Em vista que no DNA plasmidial apresentou grande quantidade de
quebras não se pode esquecer que este teste não apresenta nenhuma barreira
física (membranas) que possa estar impedindo o ataque na molécula de DNA.
No teste antimicrobiano pela metodologia de difusão em agar pelo método
do poço os extratos metanólicos de Calendula officinalis visitado e não visitado não
foram bactericida nem bacteriostático frente à Staphylococcus.aureus e Escherichia
coli em nenhuma das concentrações testadas. A partir desses resultados podemos
verificar que a ação antimicrobiana frente à extração metanólico do extrato de
40
Calendula officinalis visitada e não visitada não apresentou atividade antimicrobiana.
Mas de acordo com teste antimicrobianos realizado por Volpato (2005), com
subfrações hexânica, diclorometano, acetato de etila, metanólica e etanólica das
flores de Calendula officinalis ensaiadas pela metodologia da cavidade em placa,
frente às bactérias Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853,
Staphylococcus
aureus
ATCC
25923,
Staphylococcus
epidermidis
ATCC12228 e Bacillus cereus, indicaram que as frações hexano e diclorometano
apresentaram maior atividade antibacteriana, principalmente em gram positivas.
Assim essa atividade pode ser explicada pelo fato que solventes mais apolares
podem estar extraindo os compostos mais apolares do extrato, no qual esses podem
ser os principais constituintes fitoquímicos atuando de forma antibacteriana.
No
mesmo estudo eles observaram que a cromatografia de ambas frações eram ricas
em esteróides e triterpenos.
Teste antimicrobiano realizado por Parente (2008), utilizando cepas
padrão American Type Culture Collection (ATCC), través de culturas de
Staphylococcus aureus (ATCC 6532), Staphylococcus aureus (ATCC 13048),
Micrococcus roseus (ATCC 1740), Micrococcus luteus (ATCC 9341), Bacillus cereus
(ATCC 14576), Bacillus stearothermophylus (ATCC 1262), Enterobacter cloacae
(HMA/FTA 502), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), Escherichia coli (ATCC
25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) e Serratia marcescens (ATCC
14756) utilizarando à metodologia de diluição em placa. Indicaram que o extrato
etanólico e as frações diclorometano e hexâno de calêndula apresentaram atividade
antibacteriana, principalmente sobre bactérias gram positivas.
Assim a atividade antibacteriana de extratos parece depender, não apenas
da presença de substâncias antimicrobianas no vegetal, mas também das condições
de extração do mesmo (MACHADO et al.,1988).
41
7
CONCLUSÃO
Os resultados de toxicidade aguda utilizando-se o modelo de Artemia
salina e Daphnia magna indicaram que o extrato de Calendula officinalis visitado
apresentou maior toxicidade comparado com não visitado de insetos polinizadores e
fitófagos, apesar dos dados para ambos não poderem ser considerados tóxicos
frente aos modelos utilizados.
A aplicação do teste de clivagem de DNA plasmidial também demostrou
que o extrato visitado apresentou maior quantidade de quebras do tipo circular
aberta e linear do que o extrato não visitado. Ressalta-se que o DNA plasmidial não
apresenta membranas que possam bloquear sua interação com a molécula de DNA.
No teste de atividade antimicrobiano os extratos metanólicos não
apresentaram inibição microbiana em nenhuma das doses testadas frente às
bactérias gram positiva Staphylococcus aureus e gram negativa Escherichia coli.
A partir de todos os resultados obtidos e de acordo o que foi observado
na literatura, a visitação por insetos polinizadores e fitófagos parecem estar
induzindo mudança na composição química de Calendula officinalis. Assim estes
fatores em conjunto podem estar afetando a qualidade e a quantidade de compostos
ativos produzidos pelas plantas, pelo fato de que rotas metabólicas podem estar
sendo ativadas ou inativadas, levando à produção de diversos produtos do
metabolismo secundário.
42
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48
APÊNDICES
49
APÊNDICE A - Resultado do método do poço do extrato metanólico de Calendula officinalis
Visitada de insetos nas concentrações de 40(a), 20(b), 10(c), 5(d), 2,5(e), 1,25(f), 0,62(g) e
0,31(h) mg/mL frente à Escherichia coli.
50
a
a
b
b
cc
d
d
e
e
ff
g
g
h
h
APÊNDICE B - Resultado do método do poço do extrato metanólico de Calendula officinalis
não Visitada de insetos nas concentrações de 40(a), 20(b), 10(c), 5(d), 2,5(e), 1,25(f), 0,62(g) e
0,31(h) mg/mL frente à Escherichia coli.
51
a
b
c
d
e
f
g
h
APÊNDICE C - Resultado do método do poço do extrato metanólico de Calendula officinalis
Visitada de insetos nas concentrações de 40(a), 20(b), 10(c), 5(d), 2,5(e), 1,25(f), 0,62(g) e
0,31(h) mg/mL frente à Staphylococcus aureus.
52
a
b
c
d
e
f
g
h
APÊNDICE D - Resultado do método do poço do extrato metanólico de Calendula officinalis
não Visitada de insetos nas concentrações de 40(a), 20(b), 10(c), 5(d), 2,5(e), 1,25(f), 0,62(g) e
0,31(h) mg/mL frente à Staphylococcus aureus.