Docking - LaCrEMM
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Introdução a Bioquímica: Biomoléculas vai onde? Aula 7 o que vai fazer? Docking & Aplicações Ignez Caracelli Julio Zukerman Schpector BioMat – DF – UNESP/Bauru LaCrEMM – DQ – UFSCar Bauru, 24 de setembro de 2007 de onde veio? O que sabemos? Sabemos que…. “Tomou Doril, a dor sumiu.” “É Gripe? Benegripe.” “Melhoral pra você ficar legal.” A aspirina 10 de agosto de 1897 químico da Bayer: Felix Hoffmann A aspirina Hipócrates, médico grego e pai da Medicina científica, escreveu que o pó ácido da casca do Salgueiro ou Chorão (que contém salicilatos mas é potencialmente tóxico) aliviava dores e diminuia a febre. A aspirina Este remédio também é mencionado em textos das civilizações antigas do Médio Oriente, Suméria, Egipto e Assíria. A aspirina A aspirina Os nativos americanos usavam-no também, para dores de cabeça, febre, reumatismo e tremores. O reverendo Edmund Stone, de Chipping Norton no condado de Oxford, Reino Unido, redescobriu em 1763 as propriedades antipiréticas da casca do Salgueiro e as descreveu de forma científica. A aspirina O princípio activo da casca, a salicina ou ácido salicílico (do nome latino do Salgueiro Salix alba ) foi isolado na sua forma cristalina em 1828 pelo farmacêutico francês Henri Leroux, e Raffaele Piria, químico italiano. A aspirina 50 partes de ácido salicílico + 75 partes de anidrido acético t = 2 horas T = 500oC A aspirina A aspirina onde foi parar? A aspirina Cristalografia – difração de raio X solução processamento de dados Estrutura: solução e refinamento difração fonte de RX melhora do feixe RX A aspirina detecção A aspirina Ácido 2-etanoatobenzóico (conforme IUPAC) liga onde? Sinô Sinônimos: nimos: Ácido acetilsalicílico (AAS) Ácido O-acetilsalicílico Acetilsalicilato Enzima = proteína enzima ↔ substrato acelerador de reações COX ↔ substrato COX ↔ inibidor → aspirina enzima ciclooxigenase COX COX COX COX COX Como ocorre a inibição? COX Como ocorre a inibição? • para saber isso temos que ter: • para saber isso temos que ter: • estrutura tridimensional (3D) do complexo formado entre enzima-inibidor ou • estrutura tridimensional (3D) do inibidor (aspirina) + • estrutura 3D da enzima • estrutura tridimensional (3D) do complexo formado entre enzima-inibidor os is t od nt a mé ime r pe ex Fármacos Como ocorre a inibição? • para saber isso temos que ter: Fontes • estrutura tridimensional (3D) do inibidor (aspirina) + • estrutura 3D da enzima os t od mé ico sil in naturais sintéticas Alvos química física Perfil da Indústria Farmacêutica cristalografia Tipos de Alvos bioquímica computação hardware receptores 45% desconhecidos 7% fisiologia outras... farmácia enzimas 28% hormônios e fatores 11% canais de íons 5% receptores nucleares 2% ácidos nucléicos 2% biofísica computação software matemática biologia Perfil da Indústria Farmacêutica fármaco no mercado: 10-12 anos Descoberta de um fármaco iní início: estudos pré-clínicos • busca de alvo biológico e/ou pesquisadores imaginação; objetivos síntese de novos compostos testes in vitro testes in vivo formulação , estabilidade, fabricação análise FDA • busca de molécula com atividade biológica estudos clínicos Descoberta de um fármaco • descoberta do compostocomposto-líder: líder identificação de um composto com atividade biológica especifica. Descoberta de um fármaco • sorte • otimização: otimização propriedades do líder são testadas em ensaios biológicos; novas moléculas são projetadas e sintetizadas para obter as propriedades desejadas. penicilina descoberta de composto-lider otimização do composto-líder Descoberta de um fármaco Descoberta de um fármaco modificação química screening corantes fármaco atividade biológica Prontosil derivou de um corante com atividades anti-bacterianas. Descoberta de um fármaco desenho racional de fármacos (rational drug design) • primeira etapa: com projeto de compostos com requerimentos específicos. • segunda etapa: moléculas planejadas sintetizadas • primeira etapa: com projeto de compostos com requerimentos específicos. • pergunta: de onde vem os requerimentos específicos? compostos químicos modelagem molecular Descoberta de um fármaco desenho racional de fármacos (rational drug design) cristalografia estrutura 3D testes biológicos Pharmacophore-based Drug Design • ligantes e atividade: são examinados os ligantes ativos e inativos. • grupos químicos no ligante: gera hipótese sobre os grupos químicos, se são necessários ou não para a função biológica. • ligantes e grupos químicos: gera novos ligantes que tem os mesmos grupos químicos 3D – mimetiza os grupos ativos. referência estrutura 3D do composto pharmacophore-based drug design •alvo como um todo •alvo enzima específica •ensaios in vitro •ensaios in vivo Descoberta de um fármaco novo desenho estrutura 3D do alvo receptor-based drug design Descoberta de um fármaco Receptor-based Drug Design • estrutura 3D do alvo: utiliza estrutura 3D, história bioquímica da macromolécula, verifica se está ou não complexada, pode verificar proteínas/seqüências homologas. • grupos químicos : busca por grupos químicos especificos que podem fazer parte de uma interação atrativa entre a proteinaalvo e o fármaco. • ligantes e grupos químicos: projeta um fármaco-candidato de acordo com sua complementaridade de interações com o alvo. receptor ligante projetado Descoberta de um fármaco Estruturas tridimensionais Rational Drug Design • anos 1970: não se utilizavam a estrutura 3D dos alvos → farmacóforo. • anos 1990: aumento substancial da estrutura tridimensional dos alvos 3D → proteínas. métodos experimentais métodos teóricos • anos 2000: metodologias andam paralelas. Estruturas Tridimensionais métodos experimentais: cristal Estruturas Tridimensionais métodos teóricos informações obtidas em • literatura especializada • bancos de dados Estruturas tridimensionais moléculas pequenas moléculas grandes Docking: “O que é docking?” “Como se forma o complexo entre uma proteína e um ligante?” ligante?” “Qual a importância de estudar um complexo proteínaproteína-ligante?” ligante?” “O que é docking?” docking “O que é docking?” docking Docking é o processo de encontrar o melhor ajuste de encaixe entre duas moléculas. (ancoragem, atracagem) Docking é o processo de encontrar o melhor ajuste de encaixe entre duas moléculas tridimensionais. tridimensionais R ec ep to r = + Lig an te Co mp le x o Idéia central Docking: “Qual a importância de estudar um complexo proteínaproteína-ligante?” receptor a ação de um fármaco está determinada univocamente pela sua complementaridade bioquímica e tridimensional em seu sítio receptor especifico ligante ligante: moléculas pequenas, fragmentos de proteínas, ... é uma atividade de pesquisa que permite a redução do número de potenciais alvos relacionados ao estudo de uma enfermidade particular receptor: proteínas, enzimas, DNA, ... Docking: “Como se forma o complexo entre uma proteína e um ligante?” ligante?” “Como se forma o complexo entre duas estruturas tridimensionais?” tridimensionais?” permite a redução do custo e tempo de desenvolvimento de um novo fármaco Laboratório Experimento no laboratório: o que é necessário para realizar o experimento? equipamentos reagentes controle de temperatura..... Docking Docking Experimento in silico: silico Parte 1: o que é necessário para realizar o experimento? definição do método computacional equipamentos métodos computacionais reagentes definição do receptor, ligantes, ... Docking: busca de conformação Dinâmica Molecular Monte Carlo Algoritmos genéticos função score Campo de Forças PMF (Potential of Mean Force) Métodos empíricos Principais Programas de Docking Gold Genetic Optimisation for Ligand Docking Algoritmos genéticos flexibilidade total do ligante e parcial do receptor Principais Programas de Docking Principais Programas de Docking FlexX AutoDock Métodos baseados em fragmentos flexibilidade total do ligante Automated Docking of flexible ligands to receptors Monte Carlo simulated annealing flexibilidade total do ligante e receptor rígido Principais Programas de Docking Dock3.5 Dock3.5 Mecânica Molecular corpos rígidos ligante rígido e receptor rígido Dock4.0 Dock4.0 Mecânica Molecular ligante flexível e receptor rígido Dock3.5: Kuntz, I.D et al. “A geometric approach to macromolecule-ligand interactions” J. Mol. Biol. 161: 269269-288, 1982. •busca de cavidades, reentrâncias e de protuberâncias • ajuste da protuberância de uma molécula na reentrância da outra Docking Parte 2: fundamental (a) definição das moléculas de interesse (b) preparação das moléculas para o experimento in silico. preparação da macromolécula preparação da macromolécula preparação do ligante estudo de formação do complexo coordenadas http://www.rcsb.org/pdb modelagem molecular SIMULAÇÃO COMPUTACIONAL - docking análise dos resultados em tela gráfica Protein Data Bank (PDB) Lisozima: Informações http://pdb.rcsb.org/pdb/ lisozima data de consulta: 29 de setembro de 2007 48395 estruturas depositadas raios X ∼ 85% NMR ∼ 15% Lisozima: Informações lisozima total de estruturas PDB: 1037 método experimental: raio X: X 1021 NMR: NMR 9 pdb: 1037 estruturas metodo experimental: ??? fonte: ??? mutante: ??? resolução:??? ligante ou não (complexo) Métodos Experimentais: Informações raio X NMR microscopia eletrônica difração de elétrons difração de nêutrons Métodos Experimentais: Microscopia Eletrônica Métodos Experimentais: Microscopia Eletrônica c Busca no PDB: resolução Resultado experimental: Mapa de densidade eletrônica o que você vê + o que você pensa = o que você obtém Resultado experimental = o que você vê preparação da macromolécula coordenadas escolha do sítio http://www.rcsb.org/pdb modelagem molecular adição de H polares preparação da macromolécula coordenadas modelagem molecular o sitio está preparado para receber o ligante? conhecimento prévio: p.ex, dados bioquímicos escolha do sítio o sítio está preparado para receber o ligante? o sítio está preparado para receber o ligante? Proteína: glutationa redutase http://www.rcsb.org/pdb humana: 1gre e 1xan (seqüências de aminoácidos iguais) 1xan 1gre preparação do ligante sítio descrição geométrica do sítio descrição eletrostática do sítio cristalografia desenho da molécula cristalografia modificação sítio preparado para o docking otimização da estrutura ligante com cargas parciais preparação da macromolécula preparação do ligante lig rec rec rec q A jj B jj j E = ∑ Aii ∑ 12 − Bii ∑ 6 + 332, 0 qi ∑ rij i =1 j =1 rij j =1 j =1 Drij van der Waals de atração estudo de formação do complexo SIMULAÇÃO COMPUTACIONAL - docking eletrostático van der Waals de repulsão D: função dielétrica 332,0 fator de conversão a kcal/mol Docking docking rígido energias (van der Waals, eletrostática, total) ligante sítio pontuação por contato interações distâncias análise gráfica orientações Chagas Aplicação: biomoléculas Chagas e Leishmania: enzimas-alvo Glutationa redutase (GR) humanos e mamíferos em geral Tripanotiona redutase (TR) tripanossomatídeos TR: TR enzima tripanotiona redutase de T. cruzi GR: GR enzima glutationa redutase humana Chagas e Leishmania: enzimas-alvo TR e GR Glutationa redutase (GR) Tripanotiona redutase (TR) enzimas homodiméricas 500 aa / monômero flavoproteínas: grupo prostético → FAD coenzima: NADPH Chagas e Leishmania: enzimas-alvo TR e GR Ciclo da Reação Catalítica da GR a GSH ES-SE Glutationa redutase (GR) E-S-S-G f H+ substrato GSSG GSH NADPH GSSG + NADPH + H+GR → 2 GSH + NADP+ b E-S-S-G • GS- EH2 + NADP+ e Tripanotiona redutase (TR) substrato TS2 NADP+ TS2 + NADPH + H+ TR → T(SH)2 + NADP+ c EH2 • G-S-S-G EH2 GSSG Chagas Chagas nifurtimox® Projeto: sítio ativo Nitrocompostos Nitrofuranos NO2 GI01 GI03 RD06 HC05 O O X N N N butil 2hexil R 2--metoxietil feniletil 4-( R ))-1-(5(5-nitrofurfuriliden) nitrofurfuriliden)semicarbazida Nitrotiofenos Nitrotiofenos NO2 SG03 SG01 SR06 SH05 O S X N N nitrofurano N 4-( R ))-1-(5(5-nitrotieniliden) nitrotieniliden)semicarbazida butil R 2hexil 2--metoxietil feniletil cristalografia e docking atividade in vitro planejamento síntese atividade de compostos nas enzimas atividade in vivo d Projeto: sítio ativo Projeto: sítio ativo mecanismo de inibição enzimática AS docking ligantes competitivo TR ligantes ligantes Estruturas Tridimensionais conformação dobrada 1conformação conformação planejada dobrada planejamento HC05 HC05 Cristalografia HC05 HC05 síntese cristalografia 1conformação conformação não-planejada estendida moléculas pequenas conformação estendida conformação intermediária Estudo das conformações Busca de conformações de mínima energia dinâmica molecular otimização de geometria por MM+ e AM1 seleção de conformações = estendida (HC05) cristalográfica = outra intermediária = intermediária (SH05) cristalográfica = dobrada (HC05) cristalográfica GR docking semi-rígido SH05 Nitrocompostos tendência geral TR GR Repetição de orientações? orientações GR IS ; AS IS ; AS TR His75A His75B energia favorável padrões de ligação bem definidos (VG) alta % de repetição (VG) AS energia favorável padrões de ligação bem definidos (VG) alta % de repetição (VG) IS Phe78B Phe78A Asn71A Asn71B Trp70A (2) Trp70B sem diferenças de energia sem padrões de ligação claros (visualização gráfica VG) NS Nitrocompostos tendência geral IS > AS IS > AS TR GR AS ENF-TR = -18,896 kcal/mol ENF-GR = -25,478 kcal/mol Projeto: sítio de interface GR TR mecanismo de inibição enzimática Sítio de ligação energia favorável padrões de ligação bem definidos alta % de repetição não-competitivo Computer assisted design of potentially active antianti-trypanosomal compounds JOURNAL OF MOLECULAR STRUCTURESTRUCTURE-THEOCHEM 584: 9595-105 APR 26 2002 Projeto: sítio da interface TR ligantes ligantes docking ligantes GR m co e pl xo cr r pa se ão aç l ia fic i t ar Algoritmo de Docking do is o fic rá g lo ta re c co on m str pl uç ex ã o o SI Redocking validação Projeto: sítio interface Redocking His82 Nitrocompostos HC05 - amarelo SG05 - vermelho GI01 - azul SG01 - rosa GI03 - vinho SG03 - violeta RD06 - laranja SR06 - verde His75 Phe78 Tyr407 Trp70 Leu438 Nitrocompostos tendência geral TR GR IS ENF-TR = -30,976 kcal/mol ENF-GR = -36,750 kcal/mol IS > AS IS > AS Projeto: sítio da interface GR TR energia favorável Sítio Sítio de + provável ligação padrões de ligação bem definidos alta % de repetição Conformational analyses and docking studies of a series of 5-nitrofuran- and 5-nitrothiophen-semicarbazone derivatives in three possible binding sites of trypanothione and glutathione reductases Vega-Teijido, Caracelli, Zukerman-Schpector JOURNAL OF MOLECULAR GRAPHICS & MODELLING 24 (5): 349-355 MAR 2006 Conclusões: Conclusões: do ponto de vista da análise gráfica da estrutura tridimensional : • a preferência pelo sítio SI da GR, é devida ao canal formado pelo canal formado pelas Phe78 do ponto de vista do docking: docking: • • acomodam-se preferencialmente no sítio da interface, tanto em GR como em TR, com probabilidade maior em GR; • • podem também se ligar ao sítio ativo de ambas enzimas; • observam-se interações favoráveis nos sítios SA e SI. • • os sítios SA e SI podem comunicar-se. • • • os complexos obtidos nos estudos de docking mostraram uma dependência da conformação do ligante; • do ponto de vista do mecanismo de reação: • os nitrocompostos podem ligar-se nos sítios SA e SI. • compatível com mecanismo enzimático não-competitivo, misto. • • resultados são compatíveis com dados de cinética de inibição para outros nitrofuranos. • coordenadas do receptor coordenadas do receptor coordenadas do ligante coordenadas do ligante sítio de ligação sítio de ligação docking rec rec rec q A jj B jj E = ∑ Aii ∑ 12 − Bii ∑ 6 + 332, 0 qi ∑ j r r i =1 j =1 j =1 j =1 Drij ij ij conhecimento do problema, lig energias visualização gráfica decisões do pesquisador docking rec rec rec q A jj B jj E = ∑ Aii ∑ 12 − Bii ∑ 6 + 332, 0 qi ∑ j r r i =1 j =1 j =1 j =1 Drij ij ij lig (4)bioquímica da das proteínas envolvidas energias visualização gráfica de um plano de ação análise: distâncias, orientações, interações complexo enzima-ligante análise: distâncias, orientações, interações família de ligantes Inibidores de Cisteíno-Proteases • Compostos de telúrio estão sendo estudados na sua interação com catepsinas, no intuito de entender o mecanismo de inibição de processos invasivos envolvidos com o câncer de próstata. complexo enzima-ligante (4) + de 75% do tempo variam com o algoritmo utilizado Cl 1 Cl 2 Cl 2 Cl 3 Cl 1 Cl 1 Cl 2 Drug Delivery - nanotecnologia novos métodos de preparação de sistemas liberadores de fármacos Drug Delivery - nanotecnologia inaladores microesferas implantes patches Drug Delivery - nanotecnologia polímero polímero fármaco tempo t = 0 tempo t = t Obrigada pela atenção!
