Trabalho

XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
AVALIAÇÃO DO USO DE Bacillus spp. NO COMBATE A Vibrio spp.
DURANTE A LARVICULTURA DO CAMARÃO MARINHO
Litopenaeus vannamei.
Karin Barbosa da Silva1, Roberta Maria Cavalcante Nery2, Silvio Ricardo Maurano Peixoto3.
Introdução
O cultivo do camarão envolve práticas de manutenção da água, do substrato e diminuição do estresse dos animais.
Um dos principais problemas no cultivo é o aparecimento de enfermidades por patógenos oportunistas (Silva, 2007).
Agentes microbianos podem estar envolvidos nessas doenças. Com o aumento da comunidade bacteriana, ocorre
desequilíbrio nas populações causando riscos à saúde animal, principalmente em pós-larvas, cujo gênero Vibrio é um
dos causadores de perdas na produção aquícola, e é encontrado naturalmente em sistemas estuarinos e marinhos
(Aguirre-guzmáan, 2001).
A prática do uso de antimicrobianos pode influenciar na evolução de bactérias resistentes a antibióticos, sendo assim
há interesse da indústria em monitorar e banir o uso dos mesmos. Um recurso alternativo é utilizar micro-organismos
com efeitos probióticos nas fazendas de cultivo. Um dos principais grupos de bactérias testados no cultivo de camarões
têm sido dos gêneros Vibrio e Bacillus (Gomez-gil et al, 2000)
Entre as importantes características das bactérias probióticas, destacam-se a capacidade de sobrevivência ao trato
gastrointestinal; não provocar toxicidade e nem ser patogênico ao homem e nem aos animais; apresentar estabilidade
durante o período de estocagem, permanecer viável por longos períodos em condições normais de armazenamento e
ter capacidade de competir contra bactérias intestinais não desejáveis, demonstrando efeitos positivos ao hospedeiro
(Ferreira et al, 2012).
No presente trabalho, foi avaliada a utilização de probióticos na etapa de berçário do L. vannamei para melhoria do
desempenho zootécnico, controle de Vibrio spp., estimulação do sistema imunológico e melhoria da qualidade de
água. Bem como, a resposta à resistência ao desafio experimental por Vibrio spp. em larvas de camarões Litopenaeus
vannamei.
Material e métodos
Foram adquiridas cepas de Vibrio harveyi e Vibrio alginolyticus provenientes a partir da coleção do Laboratório de
Camarões Marinhos da Universidade Federal de Santa Catarina, Brasil. As bactérias foram armazenadas em criotubos
(-80 °C). Para sua ativação foram cultivadas em Agar Tiossulfato Citrato Bile Sacarose - HIMEDIA® (TCBS) durante
24 horas em estufa a 30 °C.
Para o inóculo de Vibrio, as bactérias foram plaqueadas em Tripic Soy Agar enriquecido de 2,0% de NaCl (TSASAL) com quatro poços abertos (d = 3 mm), foram semeadas numa concentração de 10 8 UFC/mL de V. harveyi e V.
alginolyticus e incubadas a 30 °C (Fig.1).
As estirpes do bacilo foram obtidas a partir de um probiótico comercial (INVE Sanolife ® MIC), contendo esporos
de B. subtilis, B. licheniformis e B. pumilus. Antes da aplicação do probiótico comercial na água, o mesmo foi
cultivado em tubos Falcon contendo caldo Tripic Soy Broth (TSB) durante 48 horas (30 °C). A seguir, foram
centrifugados, decantado e suspenso em caldo TSB, logo após, homogeneizados e 20 µL foram acrescentados aos três
poços nas placas de TSA-SAL, que continham o inóculo do Vibrio, num total de três réplicas. No quarto poço, foi
acrescentado 20 µL de TSB estéril para possível atividade inibitória do meio. As placas foram incubadas à temperatura
de 30 º C durante 24h.
O experimento foi realizado com a fase larval zoea do camarão L. vannamei. Os animais foram adquiridos de uma
larvicultura comercial localizada em Pernambuco. Os camarões inicialmente foram tratados diariamente com o
probiótico comercial (MIC-INVE®) numa concentração de 10 5 UFC/mL. Na fase zoea 1, as larvas foram então
transferidas para as parcelas experimentais com densidade de 100 animais/L e infectadas com as bactérias V. harveyi e
V. alginolyticus numa concentração de 107 UFC/mL cada.
Os seguintes tratamentos foram realizados com quatro réplicas cada: V. harveyi (T1); V. alginolyticus (T2), V.
harveyi + probiótico comercial (T3), V. alginolyticus + probiótico comercial (T4) e tratamento controle sem inóculo de
probiótico e Vibrio (T5). Diariamente, foram incorporadas as concentrações de bactérias probióticas às parcelas
experimentais do T3 e T4 até o final do experimento. O V. harveyi e o V. alginolyticus foram inoculados diretamente
na água de cultivo apenas no início de cada experimento.
Durante o experimento, a concentração de cada tratamento foi confirmada através de plaqueamento em meio Agar
TCBS. Após o período de incubação (24 h a 30 °C) foram contadas as placas que apresentaram entre 30 e 300 UFC
(DOWNES e ITO, 2001).
Primeiro Autor é Primeiro Autor é aluna bolsista PIBIC-EM do curso Bacharelado em Ciência Biológicas da Universidade Federal Rural de
Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, cep: 52171-900, E-mail: [email protected].
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Segundo Autor é Mestranda em Recursos Pesqueiros e Aquicultura/UFRPE do Departamento de Engenharia de Pesca, Universidade Federal Rural de
Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, cep: 52171-900. E-mail: [email protected]
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Terceiro Autor é Professor Adjunto do Departamento de Engenharia de Pesca, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de
Medeiros, s/n, Dois Irmãos, cep: 52171-900.
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XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
A quantificação de Vibrio nas larvas foi realizada através de uma amostra de 50 animais antes da infecção e ao final
de cada experimento. As amostras dos animais foram lavadas, pesadas, maceradas, serialmente diluídas e semeadas
em meio Agar TCBS.
Resultados e Discussão
No teste in vitro, as bactérias probióticas apresentaram halo inibitório contra V. harveyi e V. alginolyticus de 12 e
11 mm, respectivamente (Fig. 2) Na avaliação in vivo, observou-se um incremento na sobrevivência dos camarões
tratados com bactérias probióticas, com diferenças significativas para os camarões infectados com V. harveyi, onde a
sobrevivência passou de 12,80% nos animais apenas infectados (T1) para 81,07% nos animais infectados tratados com
probióticos (T3) (tabela 1).
As espécies utilizadas neste experimento estão entre as que mais causam mortalidade nos cultivos do L. vannamei.
De acordo com Lightner (1996) espécies como V. vulnificus, V. campbellii, V. splendidus, V. damsela, V.
parahaemolyticus, V. harveyi e V. alginolyticus têm sido descritas como as principais espécies patogênicas para
camarões peneídeos. Certificando relação com o tratamento com apenas o inóculo de V. harveyi (T1) obteve uma
sobrevivência significativamente inferior (12,80±6,61%), quando comparado com o V. alginolyticus (T2) (62,67 ±
9,91%) e controle (T5) (66,00 ± 1,74%), os quais não diferiram entre si (Tabela 1).
Aguirre-Guzmán et al (2001) mostraram que não houve diferença significativa na taxa de sobrevivência de larvas
do L. vannamei infectadas com o V. alginolyticus numa concentração de 107 UFC/mL, em comparação com o grupo
controle. Lavilla-Pitogo et al (1990) ao submeterem larvas de P. monodon a uma linhagem de V. harveyi obtiveram
100% de mortalidade. No entanto, esses mesmos autores observaram altas taxas de mortalidade nos estágios larvais
infectados com o V. harveyi na mesma concentração, corroborando com os nossos resultados.
Na fase inicial do experimento, não foi detectada a presença de Vibrio spp. nas larvas zoea. Ao final do experimento
não foi detectada a presença de Vibrio spp. na água de cultivo e nas larvas adicionada nos experimentos. Observou-se
ainda uma tendência de menor quantidade de Vibrio na água dos tratamentos com uso de probiótico. Entretanto,
apesar de uma menor concentração de Vibrio spp. nas larvas tratadas com probiótico, principalmente com o uso de V.
harveyi (T3), não houve diferenças significativas entre os tratamentos.
Algumas linhagens V. alginolyticus foram identificadas como patógenas (Lightner, 1996), enquanto outras
linhagens foram testadas como bactérias probióticas, resultando em sobrevivências semelhantes ou superiores às do
tratamento controle (Balcazar et al., 2007). No presente estudo, o tratamento com infecção por V. alginolyticus obteve
uma sobrevivência semelhante ao tratamento controle, no entanto, o efeito probiótico desta bactéria não foi
identificado nesta pesquisa.
Os resultados indicaram efeitos letais potencializados na fase larvais zoea de L. vannamei cultivadas na presença do
V. harveyi numa concentração de 107 UFC/mL quando comparadas à infecção por V. alginolyticus nesta mesma
concentração.
Agradecimentos
Ao CNPq pelo auxílio financeiro ao projeto e pela concessão da bolsa.
Referências
Aguirre-Guzmáan, G.; Ruiz, H.M. & Ascencio, F. A review of extracellular virulence product of Vibrio species
important in diseases of cultivated shrimp. Aquaculture Research, 35, 1395-1404, 2004.
Aguirre-Guzmán, G., Vázquez-juárez, R., Ascencio F. Differences in the Susceptibility of American White Shrimp
Larval Substages (Litopenaeus vannamei) to Four Vibrio Species. Journal of Invertebrate Pathology 78, 215–219,
2001.
Balcazar , J.L.; Rojas-Luna, T.; Cunningham, P. D. Effect of the addition of four potential probiotic strains on the
survival of pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) following immersion challenge with Vibrio
parahaemolyticus. Journal of Invertebrate Pathology, 96, 147–150, 2007.
Ferreira, A.H.C.; Araripe, M. N. B. A.; Monteiro, C. A. B.; Lopes, J. B.&Araripe, H. G. A. Uso de probióticos na
aquicultura. Revista Eletrônica Nutritime – ISSN 1983-9006 - Revisão Artigo 176, V. 9, N. 05, p. 1965 – 1980 Setembro/ Outubro, 2012.
Gomez-gil, B., Roque, A., Turnbull, J.F. The use and selection of probiotic bacteria for use in the culture of larval
aquatic organisms. Aquaculture 191, 259–270, 2000.
Lavilla-Pitogo, C.R.; Leano, E.M.; Paner, M.G. Mortalities of pond-cultured juvenile shrimp, Penaeusmonodon,
associated with dominance of luminescent Vibrios in the rearing environment. Aquaculture, 164, 337–349, 1998.
Lightner, D. V. Disease of culture penaeid shrimp. In “Handbook of Mariculture: Crustacean Aquaculture” (J. P.
McVey, Ed.), 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1996.
Silva, R.P.P. Fatores interferentes na frequência da vibriose em camarão marinho cultivado (Litopenaeus vannamei,
Boone 1931) no litoral sul de Pernambuco, 2007.
XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
Tabelas e figuras