Palestra Rui Curi

REAVALIANDO A FUNÇ
FUNÇÃO DOS
ÁCIDOS GRAXOS
Rui Curi
Departamento de Fisiologia e Biofísica
ICB-USP
ÁCIDOS GRAXOS SATURADOS
Ác. Palmítico (16:0)
O
CH2
CH3
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
C
CH2
CH2
CH2
OH
Carboxila
(Polar)
Radical
(Apolar)
Curta
ACETATO
PROPIONATO
BUTIRATO
C2
C3
C4
Média
LÁURICO
MIRÍSTICO
C12
C14
Longa
PALMÍTICO
ESTEÁRICO
ARAQUÍDICO
C16
C18
C20
> Número de Carbonos,
> Ponto de Fusão
Ácidos Graxos Poliinsaturados
Ácido Linoleico
18:2 ω 6
2
13
ω
3
β
α
1
C
6 carbonos
1
Esteárico
18:0
COOH
CH3
H
Oleico
cis 18:1
H
C
CH 3
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
cis
C
CH
CH
2
2
CH
CH
2
2
CH
2
O
2
CH
C
CH
2
Elaídico
trans 18:1
CH3
O
trans
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
H
CH2
CH2
OH
C
C
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
C
H
O
H
CH2
ÁCIDOS GRAXOS QUANTO AO
TAMANHO DA CADEIA
Curta
ACETATO
PROPIONATO
BUTIRATO
C2
C3
C4
Média
LÁURICO
MIRÍSTICO
C12
C14
Longa
PALMÍTICO
ESTEÁRICO
ARAQUÍDICO
C16
C18
C20
> Número de Carbonos,
> Ponto de Fusão
2
3
LIPOPROTEÍNAS
4
Ácidos Graxos Essenciais
•
São assim chamados porque são ESSENCIAIS para a saúde humana e são os
únicos não sintetizados pelo organismo.
São eles os poliinsaturados Ácido Linoleico (18:2 w6) e Ácido Alfa- linolênico
(18:3 w3).
•
Precisam ser obtidos por fonte externa, principalmente dos óleos vegetais e de
peixes.
•
O organismo humano converte os ácidos graxos essenciais, com importantes
funções nas células do cérebro, terminações nervosas e órgãos sensoriais.
•
Através de um ação enzimática, nosso organismo utiliza os derivados destes
ácidos graxos essenciais na síntese das prostaglandinas
Ácidos Graxos Essenciais
•
Deficiência no suprimento de ácidos graxos essenciais (ou no seu metabolismo) acarretam
vários sintomas :
Eczemas de pele
Queda de cabelo
Problemas de visão
Distúrbios de comportamento
Artrites e reumatismo
Cicatrização de feridas
Degeneração de fígado e rins
Excessiva perda de água pela pele
Susceptibilidade a infecções
Problemas circulatórios e cardíacos
Fraqueza
Fonte : Dr. Udo Erasmus
Livro “Fats that Heal Fats that Kill”
Kill”
Diabetes
Alive Books 13ª
13ª ediç
edição
5
ÁCIDOS GRAXOS
ESSENCIAIS
Quando aplicados topicamente
proporcionam
• Regeneração epitelial
• Manutenção da hidratação
• Nutrição da pele
6
EXERCÍCIO AERÓBIO/JEJUM
SNC
DESEMPENHO
120 g/24 horas
GLICOSE
FÍGADO
↑ glicogenólise
↑ gliconeogênese
↑ proteólise
aa
(ATP)
↑ Lipólise
CONTEÚDO DE
GLICOGÊNIO
AGL
MÚSCULO
ESQUELÉTICO
ADIPÓCITO
Unger & Orci, 1981; Stumvoll et al., 1995
CICLO ÁCIDO GRAXO - GLICOSE
CICLO DE RANDLE
Acil-CoA
Acil-CoA
Lactato
PDH
Acetil-CoA
OAA
CS
ACS
CoA
Citrato
piruvato
FDP
-
↑ATP
↑ citrato
FFQ
F6P
AG
Mitocôndria
glicose
↑ G6P
HQ
-
↑ AG
Glicogênio
GLUT-4
glicose
RANDLE et al., 1963
7
ALGUMAS FUNÇÕES DOS
ÁCIDOS GRAXOS
•
•
•
•
•
Constituintes de membranas
Produção de mediadores químicos
Substratos energéticos
Reduzem o consumo de glicose
Regulação da expressão de genes
FOSFOLIPÍ
FOSFOLIPÍDIOS DE MEMBRANA PLASMÁ
PLASMÁTICA
PROSTAGLANDINAS
8
Peripheral/ Central Prostaglandins and COX-2
Peripheral
Central
Pathophysiologic conditions
IL
Trauma/Inflammation
(eg. Hypoxia, ischemia) or
inflammatory stimuli
PLA, IL-1β
Release of arachdonic acid
PGE
IL-1β
Induction of COX-2
Induction of COX-2
Prostaglandins in spinal cord
Prostaglandins in periphery
Central sensitization
Sensitivity of peripheral
nociceptors
Abnormal pain sensitivity
(primary hyperalgesia)
Pain
Buba H et al. J Neurosc. 2001; 21: 1750-6
Ek M et al. Nature; 2000; 410: 430-1
Samad T A et al. Nature. 2001; 410: 471-5
Samad T A et al. Trends Mol Med. 2002; 5: 390-6
∆6 - dessaturase
Elongase
Família ω6
Família ω3
Família ω9
Linoleico
18:2 ω 6
Linolênico
18:3 ω 3
Oleico
18:1 ω 9
Araquidônico
20:4 ω 6
Eicosapentaenóico
EPA
22: 5 ω 3
-2H
+ 2 CH2
∆5 - dessaturase
Elongase
∆4 - dessaturase
Docosa-hexaenóico
DHA
22: 6 ω 3
DIABETES
Pacientes diabéticos: incidência 3 a 4 vezes
maior de tuberculose (Banyai, 1931)
Diabéticos estão mais predispostos a certas
infecções (tais como otite externa malígna,
mucormicose rinocerebral)
9
EFEITO DO DIABETES NA MORTE
DO LINFÓCITO ?
Morte celular
Necrose:
• Processos patológicos
• Entumecimento celular
• Liberação de mediadores
lisossomais
• Perda da integridade de
membrana
Morte celular
Apoptose
• Morte celular programada
• Redução de volume celular
• Organelas permanecem
íntegras
• Condensação da cromatina
• Fragmentação nuclear
Kerr & Currie (1972)
10
Apoptose
x
→ A induç
indução leva 1-3 h
Necrose
→ Trauma severo,
severo, induz
resposta inflamató
inflamatória
→ ↑ do tamanho mitocondrial
→ ↓ do tamanho celular
→ Condensaç
Condensação da cromatina
→ Perda de Membrana
(formaç
formação de “blebbing”
blebbing”)
→ Floculaç
Floculação nuclear
→ Perda da integridade
da membrana plasmá
plasmática
→ Fragmentaç
Fragmentação nuclear
Citometria de fluxo
Fluxo
Amostra
Amostra
Side Angle
Side
Light Scatter
Light
Filtros
Ópticos
Laser
Red-Orange
OrangRed
fluorescence
Flourescen
FL2
(FL2
Sistema
de Luzes
Forward Angle
Light Scatter
Green
Green
fluorescence
Flourescen
FL1
(FL1
Lixo
Red
Red
fluorescence
Flourescen
FL3
(FL3
Sistema
Fluídico
Sistema Óptico e
Eletrônico
Fluorescência
Tampão
Side Angle
Light Scatter
Detectores
Forward Angle
Foward
Light Scatter
Light
Fluorescência
Sistemas de Controle
e Arquivo de Dados
Citometria de fluxo
Iodeto de Propídeo (PI)
Composto fluorescente que se liga ao DNA – intercala-se
inespecificamente entre as bases.
Normalmente não atravessa a membrana celular – pouco
lipossolúvel. Portanto, se atravessar indica perda de viabilidade.
viabilidade
Espectro de excitação a 488
nm e de emissão a 580 nm –
FL2.
11
Avaliação da Fragmentação de DNA
• Células
incubadas
em
tampão Citrato: Triton +
Iodeto de Propídeo por 24
horas a 4°C.
• Células são lisadas, expondo
seus núcleos.
INDUÇÃO DE DIABETES E OBTENÇÃO DE LINFÓCITOS
+ +
Administração de aloxana
(40mg/kg) i.v.
Jejum de 16 h
+ +
Após 7 dias
retirada do
linfonodo
mesentérico
Machos com
200-250g
Imediatamente e após
cultura por 12, 24 e 48
horas
Linfócitos livres
Effect of alloxan-induced diabetes on DNA fragmentation of
rat lymphocytes
DNA fragmenta tion (%)
Untreated
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
**
control
*
diabetic
*
*
**
0
12
24* 48
0
*
12
24 48 hours of culture
*P<0.05 for comparison with the control group.
12
Fragmentação do DNA
MW
Control
Diabetic
Pacientes do Hospital Universitário
Diabéticos com glicemia acima de 200 mg/dL
11 homens e 3 mulheres
Idade de 13 a 82 anos
Controles – 9 homens e 5 mulheres
Idade de 21 a 43 anos
Obtenção de linfócitos humanos
1:1
1:2
25 mL
PBS
6 mL
PBS
sangue
diluído
25 mL
sangue
3 mL
mononucleares
centrifuga 30 min
1200 rpm 25oC
histopaque
histopaque
neutrófilos
eritrófilos
30 min
centrifuga 10 min
1200 rpm 4oC
pellet
em suspensão Aderidas
Linfócitos monócitos
13
Fragmentação de DNA em Linfócitos Humanos
cells with fragmented DNA (%)
20
*
18
control
16
diabetic
14
12
10
8
*
6
4
2
0
Freshly obtained1
48 h in culture
*P<0.05 comparado com o controle
Avaliação molecular de uma
paciente diabética descompensada
não diagnosticada
Anti-apoptotic
Pro-apoptotic
14
b cl-x S
2. 5
2
2
arbitrary un it
arbitrary unit
b c l-2
2.5
1.5
1
0.5
1. 5
1
0. 5
0
0
c o n tr o l
co n t r o l
DM
DM
G A PD H
p 53
c -m yc
2. 5
arbitrary un it
arbitrary un it
2. 5
2
1. 5
1
0. 5
2
1. 5
1
0. 5
0
0
c on tr ol
co n tr o l
DM
DM
G A PD H
Possível Papel da
Glicose ?
Análise em LY humanos e de
ratos, células Raji, Jurkat
Lymphocytes with Fragmented DNA (%)
Correlação entre a proporção de linfócitos com DNA
fragmentado e a concentração de glicose no sangue
2
R = 0.1661
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Blood Glucose Levels (mg/dl)
15
Efeito do tratamento com insulina (2 U por rato - 3 dias)
sobre a fragmentação do DNA de linfócitos de ratos
cells with fragme nted D NA (% )
100
*
90
80
70
60
50
40
30
20
*
10
0
0 h 0h control
48 h48h diabetic
0 h 0h diabetic
48 h 48h diabetic
0 h 0h diabetic
48 h48h
control
control
diabetic
insulin treated diabetic
*P<0.05 para comparação com o controle.
Possível Papel dos
Corpos Cetônicos?
DIABÉTICO: ↓↓ INSULINA
CETOGÊNESE
FÍGADO
↑ LIPÓLISE
AGL
CORPOS
CETÔNICOS
ADIPÓCITO
Sem efeito
Na morte de
linfócitos
Unger & Orci, 1981; Stumvoll et al., 1995
16
DIABÉTICO: ↓↓ INSULINA
↑ LIPÓLISE
AGL
ADIPÓCITO
Unger & Orci, 1981; Stumvoll et al., 1995
mEq/L de ácidos graxos livres
Concentração plasmática de ácidos graxos livres
0.6
*
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
controle
diabético
Linfócitos de ratos jejuados por 16, 24 e 48 horas
controle
Fragmentação de DNA em linfócitos de ratos em jejum
% de células com DNA fragmentado
jejum
a
60
a
a
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Tempo (h) de jejum
17
Possível Papel dos
Ácidos Graxos ?
Toxicidade dos Ácidos Graxos
Em Linhagens Linfocíticas
• Cultivo de células Jurkat (linfócito T) e
Raji (linfócito B) por 24 horas na
presença de diferentes ácidos graxos.
• As concentrações de AG variaram de
50 µM a 1 mM.
Concentração Máxima Tolerada de Ácidos Graxos
Ácido Graxo
Jurkat
Raji
Propiônico C3:0
> 1mM
> 1mM
Butírico C4:0
800µM
700µM
Capróico C6:0
> 1mM
> 1mM
Caprílico C8:0
> 1mM
> 1mM
Cáprico C10:0
Mais abundantes
no plasma
Mais tóxicos
400µM
400µM
Láurico C12:0
200µM
200µM
Mirístico C14:0
150µM
150µM
Palmítico C16:0
50µM
100µM
Palmitoleico C16:1
100µM
100µM
Esteárico C18:0
Menos tóxicos
50µM
50µM
Oléico C18:1
250µM
250µM
Elaídico C18:1
300µM
400µM
Vacênico C18:1
200µM
150µM
Linoleico C18:2
100µM
100µM
Linolênico C18:3
50µM
50µM
Araquidônico C20:4
50µM
25µM
Eicosapentaenóico C20:5
50µM
25µM
Docosahexaenóico C22:6
50µM
25µM
18
ÁCIDOS GRAXOS DO PLASMA DE RATOS DIABÉ
DIABÉTICOS (HPLC)
Proporção d e
ácidos grax os
no plasma d e
ratos
CO NT RO LE
CO N TRO LE
D IA 6
0.76±0.25
a
Láurico
1.74±0.39
Linolênico
1.28±0.34
DHE
1.79±0.22
M irístico
5.16±0.36
5.14±0.85
AA
3.21±0.41
11.74±1.65
1.85±0.54
3.65±1.13
a
a
DIA 6
0.0017m M
0.00076m M
0.0012 m M
0.00185m M
0.0017m M
0.0036mM
0.0051m M
0.0051mM
0.003m M
0.011m M
Palm itoléico
1.08±0.2
1.87±0.65
0.001m M
0.0018mM
Linoléico
9.55±0.9
12.3±3.9
a
0.009m M
0.012m M
Palm ítico
31.13±0.94
Oléico
4.61±0.38
Esteá rico
Eicosa
30.69±1.43
16.32±1.96
a
0.03m M
0.03m M
0.0046m M
0.016m M
40.7±1.5
40.65±7.1
0.04m M
0.04m M
0.45±0.02
0.45±0.08
0.0004m M
0.0004mM
RATO DIABÉTICO POR ALOXANA:
Ácido oleico apresentou aumento de
cerca de 4 vezes
TOXICIDADE DO ÁCIDO OLEICO?
EFEITOS DO ÁCIDO OLEICO EM
CÉLULAS JURKAT CULTIVADAS
POR 12, 24 E 48 HORAS
19
% de células viavéis
Viabilidade Celular
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
*
*
*
24 h
48 h
72 h
*
*
0
25
*
50
*
*
*
*
100
200
Concentração de oléico (µM)
% de DNA fragmentado
Fragmentaç
Fragmentação de DNA
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
*
*
*
24 h
48 h
72 h
*
*
0
25
50
100
200
Concentração de oléico (µM)
CELULAS
Apoptoticas
Viaveis
Folheto Externo
Folheto Interno
Fosfatidilserina
AnexinaV
20
% de células com
externalização de fosfatidilserina
Externalização de Fosfatidilserina
16
14
12
10
*
controle
8
6
4
2
0
AO 100 µM
0
6 12 18 24
Tempo (horas)
ÁCIDOS GRAXOS DO PLASMA DE RATOS DIABÉ
DIABÉTICOS (HPLC)
Proporção d e
ácidos grax os
no plasma d e
ratos
CO NT RO LE
CO N TRO LE
D IA 6
0.76±0.25
a
Láurico
1.74±0.39
Linolênico
1.28±0.34
DHE
1.79±0.22
M irístico
5.16±0.36
5.14±0.85
AA
3.21±0.41
11.74±1.65
Palm itoléico
1.85±0.54
3.65±1.13
1.08±0.2
9.55±0.9
Palm ítico
31.13±0.94
Oléico
Esteá rico
Eicosa
0.00185m M
0.0017m M
0.0036mM
0.0051m M
0.0051mM
0.003m M
0.011m M
0.001m M
0.0018mM
a
0.009m M
0.012m M
30.69±1.43
16.32±1.96
4.61±0.38
a
0.00076m M
0.0012 m M
1.87±0.65
12.3±3.9
Linoléico
a
DIA 6
0.0017m M
a
0.03m M
0.03m M
0.0046m M
0.016m M
40.7±1.5
40.65±7.1
0.04m M
0.04m M
0.45±0.02
0.45±0.08
0.0004m M
0.0004mM
Solução: 0,10mM -----100%
x -----1,74%=0,0017mM
Fragmentação de DNA em LY humanos com diferentes [ ] ácidos graxos
100
*
80
*
*
*
*
*
60
40
20
0
normal
etanol
0.1
0.2
0.3
controle
0.4
0.1
0.2
0.3
0.4
mM
diabético
21
Marcação com Rodamina 123 em LY humanos após 40h
*
40
35
despolarizada
% de células com membrana
45
30
25
*
*
0.3
0.4
*
20
15
10
5
0
normal
etanol
0.2
0.3
0.4
0.2
controle
mM
diabético
ESTADO
DIABÉTICO
ÁCIDOS
GRAXOS?
mitocôndria
APOPTOSE DE
LINFÓCITOS
PPAR - Um Receptor Nuclear para Ácidos Graxos
PPAR
Receptor Nuclear/Fator de Transcrição
Receptor ativado por proliferadores de peroxissoma
(do inglês “Peroxisome Proliferator Activated Receptor”)
Clonado em 1990 por Isseman & Green - fígado de rato
Membro da subfamília de receptores que incluem
receptores do hormônio tireoidiano (TR), receptor do
ácido retinóico (RAR) e receptor da vitamina D3 (VDR)
22
Como PPAR exerce sua função de fator de transcrição ?
9-cis RA
PPAR α
metabolismo de ácidos graxos
PPAR RXR
Transcrição gênica
PPER
PPAR γ
diferenciação de adipócitos
formação de células espumosas
Ativador
PPAR δ
implantação e decidualização do embrião
câncer de cólon
metabolismo de ácidos graxos
Ligante
Análise da atividade de ligação dos PPARs ao DNA em
células Jurkat tratadas sob ação de ácidos graxos
1) controle
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
(2) 50 µM ácido propriônico
(3) 50 µM ácido láurico
(4) 50 µM ácido oléico
(5) 25 µM ácido esteárico
PPAR:RXR
(6) 5 µM ácido linoléico
(7) 5 µM ácido γ linolênico
(8) 5 µM ácido araquidônico
(9) 12,5 µM EPA
(10) competidor 50 X.
Indução de condensação de cromatina por ativadores
do PPARγ em células Jurkat
controle
controle
DMSO
DMSO
Ciglitizona
15d PGJ2
As setas indicam células apoptóticas e o aumento utilizado foi de 200X
23
IDENTIFICAÇ
IDENTIFICAÇÃO DE GENES
REGULADOS PELO ÁCIDO
OLEICO
EM CÉ
CÉLULAS JURKAT E RAJI
POR
“MACROARRAY”
MACROARRAY”
Linhagem de
células
Célula tratada
Célula controle
Tratamento da cultura de
células com ácido oleico (50 µM)
por 24 horas
Tratamento com etanol
(controle)
Extração do RNA total, síntese de
cDNA e marcação da sonda com
33P
Hibridização
Análise da membrana por densitometria (Array-Pro Analyzer)
Confirmação por PCR
Genes Regulados pelo Ácido Oleico
nas Células RAJI
♦Citocinas e receptores relacionados - 1
♦Vias de transdução de sinais - 6
♦ Fatores de transcrição e genes relacionados - 7
♦ Ciclo celular - 2
♦ Defesa e reparo - 6
♦ Síntese de DNA - 2
♦ Apoptose – 5 (CASP 3, BAX, bcl-xL, Bcl2, BIK)
24
ESTADO
DIABÉTICO
ÁCIDOS
GRAXOS?
ÁCIDOS
GRAXOS?
PPAR
mitocôndria
APOPTOSE DE
LINFÓCITOS
EFEITO DOS ÁCIDOS GRAXOS NA
SINALIZAÇ
SINALIZAÇÃO INTRACELULAR EM
LEUCÓ
LEUCÓCITOS
IL-2
Ras
Ras
GTP
IL-2
JAK 3
P
GDP
Sos Grb2
P
JAK 1
P
P
P
Gab2
P
P
PI-3K
ERK 1/2
JAK 3
JAK 1
P
P
Shc
P
AKT
P
P
P
P
P
STAT5 a/b
serina
+ ciclina D1
+ E2F
transcrição
fo
sf
or
Ativação do NF-κ
κB Inibição de proteínas
pró-apoptóticas:Bad,
caspase 9,GSK-3
ila
çã
o
Elk-1, Fos, AP-1, NF-AT, cMyc
fatores de transcrição
Proliferação celular
25
IL-2
IL-2
α
JAK 3
JAK 3
JAK 1
P
γ
β
P
IL-2R
Gab2
IL-2
P
JAK 1
P
P
P
P
JAK 3
JAK 1
P
P
Shc
P
P
P
P
Grb2
Sos
Ras-GDP
Ras-GTP
P
P
STAT5 a/b
PI-3K
AKT
+ cyclin D1
+ E2F
NF-κ
κB activation
Inhibition of: Bad,
caspase 9,GSK-3
ERK
ph
os
ph
or
yla
tio
n
transcription
Elk-1, Fos, AP-1, NF-AT, cMyc
Transcription factors
Cell proliferation
26