AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO - CCET

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE PLANTAS DO
CERRADO BYRSONOMIA VERBACIFOLIA
STHEPHANE JULLY SILVA
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO SUBMETIDO À COORDENAÇÃO
DO CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL DA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE
GOIÁS COMO PARTE DOS REQUISITOS PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO
DE BACHAREL EM QUÍMICA INDUSTRIAL.
ANÁPOLIS, GO – BRASIL
JULHO, 2011
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE PLANTAS DO
CERRADO BYRSONOMIA VERBACIFOLIA
STHEPHANE JULLY SILVA
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO SUBMETIDO À COORDENAÇÃO
DO CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL DA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE
GOIÁS COMO PARTE DOS REQUISITOS PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO
DE BACHAREL EM QUÍMICA INDUSTRIAL.
Aprovado em: 05/07/2011
_________________________________________
Profª. Dra. Samantha Salomão Caramori
(ORIENTADORA)
_________________________________________
Profª. M.Sc. Luiza Luanna Amorim Purcena
(MEMBRO)
_________________________________________
Profª. Karla de Aleluia Batista
(MEMBRO)
ANÁPOLIS, GO – BRASIL
JULHO 2011
ii
SILVA, STHEPHANE JULLY
Avaliação do Potencial Biotecnológico de
Plantas do Cerrado. [Anápolis, GO] 2011.
Xii, 3z6 p. 29,7 cm (UnUCET/UEG,
Bacharel, Química Industrial, 2011)
Trabalho de Conclusão de Curso Universidade
Estadual
de
Goiás,
UnUCET
1. Byrsonomia verbascifolia
2. Cerrado
3. Enzimas
4. Potencial biotecnológico
l. UnUCET/UEG
II. Título (série)
iii
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho in memorium
à minha avó Ana Correia da Silva,
por ter feito de tudo para me ensinar
que o que aprendemos não é em
vão, que o conhecimento é a única
coisa que não se poder tirar de
uma pessoa. À ela por ter sempre
acreditado em mim, por ter por mim
um imenso orgulho e por ter me
dado ás mão nos primeiros passos
desta longa jornada .
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por ter me concedido a vida.
À minha avó Ana Correia, pela dedicação e aprendizado que me
proporcionou durante os 16 anos que lhe foram permitidos passarem comigo.
Ao meu pai Osmiro de Sousa, pelo exemplo de homem e pai, lutador
incansável e obstinado, que não deixou que as inúmeras dificuldades da vida
lhe fossem impecilhos.
Aos meus irmãos, companheiros queridos, principalmente a Kelly Well´s,
que juntamente comigo presenciou vários momentos difíceis em nossas vidas.
À minha querida irmã Lilian, que sempre me apoiou e esteve do meu
lado nos momentos mais difíceis.
À Alinne, outro anjo em minha vida. Nunca vou me esquecer das
palavras de ânimo e conforto que me dizia quando as coisas pareciam pesar
sobre mim.
À minha mãe Edinilce Alves Ferreira e às minhas tias: Maurisia
Rodrigues, Eliane e Maísa Pires.
À Rosilayne, minha melhor amiga, que me suportou nesses anos de
faculdade e ainda me suportará por muitos ainda. Sem você esses anos não
teriam dito a menor graça.
Aos amigos e companheiros que fiz nesta Universidade e sempre levarei
comigo: Lays Dias, Ludmila de Oliveira, Rosana Araújo, Tais, Wesley Batista,
Richard Cruz e Ana Carolina Oliveira.
Às três paixões de minha vida: João Pedro, Guilherme e Mariana, graças
a Deus vocês existem, são meus pedacinhos do céu.
Ao Plínio Cantuária, Neocionedes e Reinner Alves, amigos prestativos e
outros que conquistei nesta jornada: Valdirene Regina, Vânia Lúcia, Sebastião,
Rosilda.
v
À Profª. Drª. Kátia F. Fernandes, por disponibilizar o Laboratório Química
de Proteínas no ICB2 – UFG para a realização dos experimentos deste
trabalho.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnológico
(CNPq) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG), pelo
financiamento dos reagentes utilizados neste trabalho, pelo projeto NÚCLEO
DE EXCELÊNCIA EM GENÉTICA E CONSERVAÇÃO DE ESPÉCIES DO
CERRADO – GECER (Programa de Apoio a Núcleos de Excelência PRONEX/FAPEG/CNPq – Chamada Pública 007/2009).
De maneira especial, quero agradecer à Prof a. Dra. Samantha Salomão
Caramori, que contribui imensamente para que este trabalho se realizasse.
vi
Resumo do Trabalho de Conclusão de Curso apresentado a UnUCET/ UEG
como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Bacharel
em Química Industrial
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOTECNOLOGICO DE PLANTAS
DO CERRADO
Sthephane Jully Silva
Julho/2011
Orientador: Prof a. Dra. Samantha Salomão Caramori
Curso: Química Industrial
O Cerrado é considerado o segundo bioma do Brasil, possuíndo uma gama
florística com imenso potencial. Essa riqueza é pouco estudada e explorada
comercialmente. O murici é uma planta bastante conhecida no Norte e
Nordeste por apresentar propriedades nutricionais e medicinais. O objetivo
deste trabalho foi explorar o potencial bioquímico do murici planta do gênero
Byrsonomia da família Malpiguiaceae para possíveis fins biotecnológicos. As
partes da planta analisadas para determinação de umidade residual e cinzas,
proteínas solúveis totais e atividade enzimática foram os frutos, as folhas e o
caule. O fruto do murici apresentou alto teor de umidade (0,4272% ±0,04873%)
e lipídios (51,939%±0,860%). No caule foi observado um alto teor de proteína
solúvel total entre (13-14 mg g-1 farinha). A folha demonstrou uma atividade
enzimática inespecífica para peroxidases de 25 a 50% a mais em relação ás
amostras de fruto e caule, e proteases inespecífica entre (1400 e 1600 U g-1
farinha) e específica (150 U mg-1 proteína), comprovando valores significativos.
Para enzima polifenoloxidase tanto para a atividade inespecífica e específica e
peroxidase específica o fruto se sobressaiu, apresentando valores entre 100 a
120 U mg-1de proteína e entre 310 e 390 U de farinha respectivamente,
enquanto que para a atividade de peroxidase específica atingiu o valor máximo
de 50 U mg-1de proteína. Por apresentar valores significativos de proteínas, o
murici se apresentou com grande predisposição para aproveitamento
biotecnológico.
Palavras-chave:
Byrsonomia
polifenoloxidases, peroxidases.
verbascifolia,
Cerrado,
proteases,
vii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .......................................................................................... x
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................ 3
2.1 O Bioma Cerrado ......................................................................................... 3
2.2 Murici ............................................................................................................ 4
2.3 Proteínas ...................................................................................................... 5
2.4 Enzimas........................................................................................................ 6
2.4.1 Proteases ............................................................................................ 7
2.4.2. Polifenoloxidase e Peroxidases ........................................................ 8
3 OBJETIVOS .................................................................................................. 10
3.1 Geral........................................................................................................... 10
3.2 Específicos ................................................................................................. 10
4 Materiais e Métodos ...................................................................................... 11
4.1 Solventes, Soluções e Reagentes.............................................................. 11
4.2 Equipamentos e vidrarias ........................................................................... 11
4.3 Métodos...................................................................................................... 11
4.3.1 Coleta do material vegetal ................................................................ 11
4.3.2 Preparo das farinhas......................................................................... 12
4.3.3 Umidade e Cinzas............................................................................. 12
4.3.4 Extração de lipídios........................................................................... 12
4.3.5 Caracterização de Proteínas ............................................................ 13
viii
4.3.5.1 Preparo do extrato ...................................................................... 13
4.3.5.2 Proteínas solúveis totais ............................................................. 14
4.3.5.3 Atividade de Peroxidase ............................................................. 14
4.3.5.4 Atividade de Polifenoloxidase ..................................................... 14
4.3.5.5 Atividade de Protease (inespecífica) .......................................... 15
4.3.5.6 Atividade de Peroxidase, Polifenoloxidase e Protease (específica)
............................................................................................................... 15
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................. 16
5.1 Análise do teor de umidade e cinzas .......................................................... 16
5.2 Análises do extrato bruto ............................................................................ 17
6 CONCLUSÕES ............................................................................................. 22
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 23
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Murici – destaque para o fruto da planta, em diferentes estágios de
maturação, que vão desde a coloração esverdeada até a amarela. .................. 5
Figura 2. Extração de lipídios (soxlhet) (Arquivo pessoal, 2011)...................... 13
Figura 3. Teor de proteína solúvel presente nos fragmentos de Byrsonima
verbacifolia. As barras expressam as repetições das leituras (g) para cada
grama de farinha da planta. Dados obtidos por regressão linear (y = 0,0076x +
0,3998) utilizando soroalbumina bovina como padrão; R2 = 0,995. ................. 17
Figura 4. Atividade de peroxidase presente em caule, folhas e frutos de
Byrsonima verbacifolia contra os substratos pirogalol e H2O2. A: atividade
inespecífica (U g-1 farinha); B: atividade específica: (U mg-1 proteína). ............ 18
Figura 5. Atividade de polifenoloxidase presente em caule, folhas e frutos de
Byrsonima verbacifolia contra o substrato catecol. A: atividade inespecífica (U
g-1 farinha); B: atividade específica: (U mg-1 proteína)...................................... 19
Figura 6. Atividade proteolítica presente em caule, folhas e frutos de Byrsonima
verbacifolia contra o substrato caseína. A: atividade inespecífica (U g-1 farinha);
B: atividade específica: (U mg-1 proteína). ........................................................ 20
x
1 INTRODUÇÃO
O Cerrado é uma unidade ecológica típica da zona tropical, definido por
uma vegetação de fisionomia e flora próprias. Ao lado da Amazônia, o domínio
do Cerrado constitui outro grande conjunto de terras a ser prontamente
ocupado e integrado no contexto sócio-econômico do Brasil (PINTO,1994).
A flora do Cerrado possui inúmeras espécies frutíferas com grande
potencial de uso agrícola que são utilizadas pela população local. Essa
diversidade de flora é em parte explicada pelos diferentes tipos de paisagens
encontrados, que vão desde formações campestres, com predominância de
gramíneas, até aquelas arbóreo-arbustivas, como as matas mesofíticas e as
matas de galeria (EITEN, 1994).
Nesse bioma estão inseridos espécies frutíferas de importância
extrativista, e uma delas é o murici (Byrsonima verbascifolia), da família
Malpiguiaceae, bastante conhecida no Cerrado norte mineiro. Sua casca é rica
em taninos e bastante utilizada como antiinflamatório e cicatrizante devido sua
adstringência. Além da importância medicinal o fruto do murici é bastante
usado na alimentação do sertanejo e contribui também como fonte de renda de
inúmeras famílias (GUSMÃO, VIEIRA e JÚNIOR, 2006).
Os frutos do murici são em geral consumidos in natura ou na forma de
sucos, licores, sorvetes, geléias e doces diversos. Os frutos apresentam
sabores incomuns. A caracterização física e química destes frutos não é
determinante para considerá-los de alto valor nutricional, já que a
biodisponibilidade dos nutrientes é fundamental na determinação do valor
nutritivo do alimento. Estudos acerca das características de frutos do cerrado
são precários na literatura, sendo preciso mais pesquisas que auxiliem a
composição em macronutrientes, vitaminas e minerais, a biodisponibilidade
destes nutrientes e a utilização dos frutos no processamento de alimentos com
elevado valor agregado (SILVA et al., 2008).
Os frutos das espécies nativas do cerrado além de oferecer um elevado
valor nutricional, podem possuir possível potencial biotecnológico, ainda pouco
explorado comercialmente. Peroxidases e Polifenoloxidases são distribuídas
amplamente nos vegetais (MENEZES e CARAMORI, 2007). Essas enzimas
1
são responsáveis pelo escurecimento em frutas, vegetais e em seus produtos
processados, por isso o controle das atividades destas enzimas é de grande
importância durante a transformação dessas matérias-primas (FREITAS et al.,
2008).
As proteases exercem um papel importante em processos fisiológicos de
interesse, por representarem uma ferramenta significativa na análise de
sequência de proteínas, na identificação e no isolamento de domínios das
enzimas multifuncionais mais complexas. Importantes também no campo
comercial, além do fisiológico, as proteases representam 60% do total de
enzimas produzidas pela indústria mundial, nas áreas de alimentação e de
detergentes (TREMACOLDI, 2009).
O presente trabalho visa apresentar as características enzimáticas de
plantas do cerrado, em especial o murici e suas aplicações no que diz respeito
ao potencial biotecnológico.
2
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O Bioma Cerrado
O Brasil é um dos maiores detentores da biodiversidade mundial. Na
agricultura, aproximadamente 200 espécies de plantas são responsáveis pelo
alimento consumido mundialmente, e isto poderia ser bem maior se fossem
investidos recursos em pesquisa e em formas de obtenção de técnicas para a
utilização da flora do cerrado (BIZERRIL, 2004).
A flora do Cerrado possui inúmeras espécies frutíferas com grande
potencial de uso agrícola que são utilizadas pela população local. Essa
diversidade de flora é em parte explicada pelos diferentes tipos de paisagens
encontrados, que vão desde formações campestres, com predominância de
gramíneas, até aquelas arbóreo-arbustivas, como as matas mesofíticas e as
matas de galeria (EITEN, 1994). A grande diversidade florística posiciona a
flora do bioma Cerrado como a mais rica entre as savanas do mundo, com
mais de 6.429 espécies já catalogadas (VOIGT, 2009).
Os frutos, em geral, são consumidos in natura ou na forma de sucos,
licores, sorvetes, geléias e doces diversos. No entanto, poucos dados estão
disponíveis na literatura especializada com relação à composição química
destes frutos e sua aplicação tecnológica, o que ressalta a necessidade de
pesquisas científicas sobre o assunto (Silva, 2008).
A partir da década de 1940, com a Segunda Guerra Mundial e a falta de
recursos, a mangaba foi veemente explorada para a produção de látex. O
babaçu e a macaúba foram muito estudados como fonte de petróleo em
conseqüência da crise da década de 1970 e mostraram grandes possibilidades
para o uso em motores de combustão, em permutação ao óleo diesel. Com o
avanço das práticas agrícolas a partir dos anos 1970, as áreas de Cerrado
nativo deram lugar a outras comodities com maior aceitação no mercado
mundial, como a soja, o algodão, o arroz. Além disto, com o preço das terras
mais atrativo em relação a outras áreas agrícolas no país, como nos estados
de São Paulo e Minas Gerais, grande parte das propriedades rurais em Goiás
passaram a se dedicar à bovinocultura ( A V I D O S e F E R R E I R A , 2 0 0 3 ) .
3
Atualmente, cerca de 40% da área de Cerrado nativo já foi convertida
para uso humano (SANO et al., 2009). Em função da rapidez com que vem
ocorrendo os desmatamentos, alguns autores classificam o Cerrado como
hotspot. O conceito de hotspot configura um bioma que abriga espécies
endêmicas, ou seja, espécies restritas a um determinado local. Este conceito
também se baseia, no grau de ameaça que a região está exposta (MYERS,
2007). Estes dois fatores são fundamentais visto que estão interligados, já que
a perda da área caracterizada pela ameaça extingue as espécies ali abrigadas,
causando a extinção das mesmas, lembrando que tais espécies não estão
distribuídas em outros espaços geográficos (KLINK e MACHADO, 2005).
Segundo Abramovay (2000), é possível extrair de forma sustentável os
recursos e o verdadeiro banco de germoplasmas hoje existentes nos cerrados.
Silva (2003) afirma que as fruteiras nativas do Cerrado são independentes de
sistema de manejo apoiados em revolvimento intensivo do solo; proporcionam
proteção ao solo contra impactos de gotas de chuva e contra formas
aceleradas de erosão hídrica e eólica; permitem a convivência com outras
culturas em detrimento com um melhor aproveitamento da terra; podem ser
exploradas sem forte mudança da biodiversidade.
2.2 Murici
O murici é uma planta nativa do Cerrado e está inserido na família das
Malpighiaceae, que é a mesma família da acerola e posssui várias espécies.
Entre as mais conhecidas se destaca a Byrsonima verbacifolia e a Byrsonima
coccolobifolia. Entre essas, fazem parte da família Malpighiaceae: a Byrsonima
lancilolia, Byrsonima sericea, Byrsonima spicata, e a Byrsonima stipulacea
(LORENZI,1998).
Essa
diversidade
de
espécies
existe
devido
às
particularidades de cor e local de ocorrência (LAREDO, 2011).
O murici é uma árvore bastante adaptada ao fogo e ao solo pobre,
porém rico em alumínio, sendo uma das primeiras a florescer ao término das
queimadas. As folhas são recobertas por pêlos e ficam agrupadas no ápice dos
ramos, podendo assim proteger as gemas apicais do fogo. Ao contrário de
4
outras espécies, não foi visto na planta a ocorrência de vassoura-de-bruxa, que
prejudica as flores, impedindo assim a formação dos frutos (LAREDO, 2011).
O fruto do murici, quando maduro, apresenta uma coloração amarelo
forte, uma casca fina e tem diâmetro de aproximadamente 1,5 a 2 cm e um
forte odor semelhante a queijo rançoso, agridoce e consistência oleosa
(GUIMARÃES e SILVA, 2007). É utilizado principalmente in natura, na forma de
doce, sorvetes, licores e muito apreciado como geléias (LAREDO, 2011).
Existem poucas técnicas agronômicas adequadas para o cultivo e
reprodução desta árvore e estudos sobre o seu potencial na alimentação
humana, bem como de seus valores nutricionais (GUIMARÃES e SILVA, 2007).
Figura 1. Murici – destaque para o fruto da planta, em diferentes estágios de
maturação, que vão desde a coloração esverdeada até a amarela.
2.3 Proteínas
5
Segundo Nelson e Cox (2011), as proteínas são partes essências da
célula, constituindo cerca de 50% de seu peso seco tendo uma importância
estrutural e funcional grandiosa.
As proteínas são moléculas bem específicas especializadas em diversas
funções do organismo dos seres vivos. Inúmeras propriedades de suma
importância permitem que as proteínas façam parte de uma ampla faixa de
funções, como é o caso da catálise enzimática (BERG, TYMOCZKO, STRYER,
2008).
A dosagem do teor de proteínas totais numa amostra pode fornecer
informações a respeito de seu valor nutricional. A razão entre a atividade de
determinada enzima e a concentração de proteínas solúveis num extrato,
denominada atividade específica, revela o potencial dessa amostra como fonte
enzimática a ser estudada (CARAMORI et al., 2004).
2.4 Enzimas
As enzimas são proteínas (com exceção de alguns RNAs que são
catalisadores durante seu próprio processamento) catalisadoras com elevada
especificidade por seus substratos, além de operarem em faixas amplas de pH,
mas em condições brandas de temperatura e pressão (NASCIMENTO e
SOLDI, 2004; NELSON e COX, 2011).
O estudo das enzimas teve inicio no século XIX, com as
investigações da conversão do amido em açúcares e a degradação da carne
por secreções do estômago. Os primeiros trabalhos começaram com Louis
Pasteur que dizia que os fermentados denominados enzimas eram os
responsáveis pela obtenção do açúcar em álcool. Essa hipótese logo foi
derrubada por Eduard Buchner em 1897 ao se descobrir que os extratos de
levedo podiam fermentar o açúcar até álcool, independente de estarem
presentes na estrutura das células vivas (BERGER, TYMOZCKO e STRYER,
2008; NELSON e COX, 2011).
A indústria alimentícia utiliza enzimas no processamento de
derivados de leite, por fermentação ou coagulação; cerveja, a partir de cevada
e lúpulo fermentados; vinhos, pela modificação microbiológica do açúcar das
6
frutas em álcool; frutose, pela transformação do amido de milho; ácido cítrico, a
partir do açúcar de cana; pão, com a expansão da massa pelo gás carbônico
liberado pelo fermento microbiológico (MANFREDI, 2003).
As enzimas acrescentadas aos alimentos podem otimizar a
disponibilidade de nutrientes, minimizar os gastos com alimentação e diminuir
os resíduos de produção no ambiente (COSTA, 2003). A indústria química
serve-se de processos enzimáticos na elaboração de aminoácidos para
suplementação alimentar de pacientes portadores de deficiência digestiva e em
ração animal. Essas enzimas, denominadas proteases pelo seu mecanismo de
ação e tipo de substrato, são inseridas na formulação de sabões e detergentes
para retirada de manchas nos tecidos (MANFREDI, 2003).
Os biocatalisadores se apresentam como uma alternativa aos
processos químicos clássicos, sendo citados como exemplo as enzimas
hidroliticas (proteases, amilases, celulases) e oxidorredutases (peroxidases,
polifenoloxidases), muito utilizadas rotineiramente na química orgânica
(VECCHIA, NASCIMENTO e SOLDI, 2004).
2.4.1 Proteases
As proteases são enzimas largamente utilizadas em diversos setores
da economia mundial. Elas são aplicadas no processamento das indústrias de
alimentos, bebidas, na formulação de detergentes, no beneficiamento de couro
e pele. No mercado de biocatalisadores as proteases são responsáveis por
40% de toda a produção mundial (NEVES, PORTO e TEIXEIRA, 2006).
De todas as fontes exploradas atualmente os microorganismos são
mais utilizados, já que tem uma ampla diversidade bioquímica, facilidade de
manipulação genética e necessitam de um menor espaço (CHAUD, VAZ e
FELIPE, 2007). Neves, Porto e Teixeira (2006) destacam a participação das
proteases de origem microbiana especialmente na indústria de alimentos, visto
que a maioria das espécies exploradas não apresentam riscos patogênicos.
A primeira verificação da atividade proteolítica em plantas data de
1799, porém o uso do látex e folhas da papaya como vermífugo e amaciante de
7
carnes já se fazia há mais tempo. Um grande número de proteases já foi
isolada de frutos e látex de várias plantas, mas apenas recentemente tem sido
estudado seu papel em processos celulares do metabolismo vegetal, incluindo
a papaína, bromelina, ficina e quimopapaína. A germinação de sementes, em
que a atividade proteolítica está relacionada ao crescimento e desenvolvimento
de plântulas, bem como à renovação de proteínas e à senescência chama
bastante atenção e vem sendo muito investigada. Também em folhas, flores e
frutos de várias espécies vegetais há atividade de proteases de diferentes
classes (TREMALCOLDI, 2009).
2.4.2. Polifenoloxidase e Peroxidases
A polifenoloxidase é encontrada nas membranas celulares e possui
uma maior ocorrência em tecidos infectados. Isto ocorre porque a ativação
destas enzimas ocorre apenas no momento de sua liberação para o meio
extracelular. É de um valor inestimável para as plantas, no que diz respeito aos
mecanismos de defesa ou na senescência (CAMPOS, FERREIRA e VORAZI,
2004; PIMENTA, CHAGAS e COSTA, 1997).
As polifenoloxidases reagem sobre uma gama diversa de substratos.
Dentre estes encontram-se: p-cresol, tirosina e ácido p-cumárico como
substratos monofenólicos, enquanto catecol, diidroxifenilalanina e ácido
clorogênico são substratos difenólicos (ALMEIDA et al., 2009)
A peroxidase é uma enzima essencial das plantas e está implicada
em inúmeras reações, ligações de polissacarídeos, oxidação do ácido indol-3acético, ligações de monômeros, lignificação, cicatrização de ferimentos,
oxidação de fenóis, defesa de patógenos, regulação da elongação de células e
outras (CAMPOS, FERREIRA e VORAZI, 2004). A ação da peroxidase e a
resistência de plantas ás doenças de forma positiva tem sido objeto de estudos
em muitos trabalhos, sendo que o aumento da atividade da peroxidase em fase
de desenvolvimento da doença tem se correlacionado com a expressão de
resistência
em
diferentes
interações
patógeno-hospedeiro
(SOARES,
MARINGONI e LIMA, 2004).
8
Polifenoloxidases e as peroxidases atuam rapidamente degradando
de
forma
oxidativa
os
compostos
fenólicos
próximo
ao
local
da
desintegralização celular provocada por patógenos. Uma das características
deste fenômeno e consequentemente o mais estudado é a ocorrência de
substâncias escuras originadas da polimerização oxidativa das quinonas.
Apenas o primeiro estágio da infecção concede a formação de quinonas
iniciadas de o-difenois pelo processo enzimático. Essas quinonas quando em
quantidade estabelecida acabam por inibir a produção de polifenoloxidase. No
entanto, sequências de reações químicas ainda são desconhecidas (CAMPOS,
FERREIRA e VORAZI, 2004; PIMENTA, CHAGAS e COSTA, 1997).
A peroxidase atua sobre as substâncias que produzem cores vivas
na oxidação, e pode também promover diversas reações de biodegradação e
com isso apresenta um alto grau de versatilidade. A peroxidase diferentemente
de outras enzimas é termoestável, sendo recuperada após tratamento térmico.
Sendo assim a atividade da peroxidase em muitas indústrias de alimentos é
usada como índice de branqueamento (LUIZ, HIRATA e CLEMENTE, 2007). Já
o desenvolvimento da cor causada pela ação da polifenoloxidase é desejável
no processamento de chás, café, cacau, maçãs, sidra, ameixas, passas pretas,
figos pretos e zapote (NABECHIMA, 2010).
9
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Dosar a atividade de enzimas e outras proteínas no murici (Byrsonima
verbacifolia) para aproveitamento biotecnológico.
3.2 Específicos
- Coletar amostras de murici (caule, folhas e frutos);
- Estudar o perfil protéico nas diferentes amostras;
- Dosar e comparar a atividade de peroxidases, polifenoloxidases e
proteases com as diferentes partes da planta e com outros trabalhos da
literatura científica.
10
4 Materiais e Métodos
4.1 Solventes, Soluções e Reagentes
Foram obtidos os seguintes reagentes: Caseína, TCA ≥ 99% e Pirogalol
da Sigma-aldrich (Saint Louis, EUA), Azul de Comassie G250, ácido fosfórico,
etanol 99% (v/v), fosfato monobásico e dibásico de sódio J. T. Baker (Austin,
EUA), H2O2 PA – ACS (Diadema, São Paulo).
4.2 Equipamentos e vidrarias
Os equipamentos usados na realização dos experimentos foram: estufa
(315 SE, FANEM, São Paulo, Brasil), mufla (QUIS, Robertshaw, Divisão
Pyrotec, São Paulo, Brasil), manta aquecedora (52, ALCACÉR, Ribeirão Preto,
Brasil), espectrofotômetro (BEL 2000, Piracicaba, Brasil), balança semianalítica (KERN 410, SER AC ADAPTER, Balingen, Alemanha), agitador
magnético (Fisatom 752, Brasil), centrífuga (FANEN Excelsa, Guarulhos,
Brasil), banho-maria (DE LEO 1195, Ind. Brasileira, Porto Alegre – RS, Brasil) e
moinho de martelos (SP-33, SP LABOR, Presidente Prudente, Brasil).
4.3 Métodos
Foram realizados testes em triplicata para cada fragmento da planta:
caule, folha e fruto, com exceção à extração de lipídios, que foi feita em
duplicata.
4.3.1 Coleta do material vegetal
O material vegetal foi colhido na região de Senador Canedo, Goiás,
Brasil, latitude de -16° 42' 29'' e longitude de - 49° 05' 35''. Foram feitas três
coletas a 1° no dia 29 de janeiro, a 2° no dia 8 de março e a última no dia 10 de
junho de 2011 no período vespertino, sendo cada coleta composta por número
11
indefinido de folha, caule e fruto. Os fragmentos da planta (caule, folha e fruto)
foram armazenados separadamente em sacos plásticos.
O material vegetal foi enxágue com água e submetido à secagem a
temperatura ambiente por sete dias. Logo após secagem as partes do vegetal
foram separadas, sendo as folhas retiradas manualmente do pedúnculo, o
caule dividido em porções menores e os frutos permaneceram intactos.
4.3.2 Preparo das farinhas
Para o preparo da farinha os fragmentos vegetais foram triturados no
moinho de martelo, sendo obtido a farinha que logo em seguida foi
armazenada a temperatura ambiente em frascos plásticos devidamente
vedados.
4.3.3 Umidade residual e Cinzas
Para quantificar o teor de umidade residual nas amostras, pesou-se
os cadinhos e adicionou-se 1,0 g da respectiva farinha em cada um deles. As
amostras foram inseridas na estufa por 24 h á aproximadamente 110 ºC. Após
este período os cadinhos foram retirados e transferidos para um dessecador e,
após o resfriamento, os mesmos foram pesados. O teor de umidade residual foi
determinado pela diferença entre as massas das amostras antes e após o
tratamento e foram expressos em porcentagem. Para a determinação de
cinzas, utilizou-se as amostras sem umidade, inserindo-as na mufla por 2 h á
aproximadamente 610 ºC. Após esse tempo, foi esperado que as amostras se
resfriassem para posterior pesagem. O teor de cinzas foi determinado pela
massa das amostras restante nos cadinhos, expressa em porcentagem.
4.3.4 Extração de lipídios
Para a extração de lipídios foi utilizado o seguinte conjunto (Figura 4)
sendo todas as amostras de caule, fruto e folhas pesados até a determinação
de 1 g, armazenados em papel filtro em formato cartucho devidamente tarado,
12
os cartuchos foram inseridos no Soxhlet, a manta aquecedora foi ligada, sendo
a extração realizada dentro de um período de três horas.
Após o termino da extração os cartuchos foram retirados seguindo
rapidamente para um dessecador onde ficaram armazenados por três dias para
a retirada de umidade, após esse tempo todos os cartuchos foram pesados.
Para a verificação quantitativa de lipídios foi feita a diferença de pesagem do
cartucho com amostra antes e depois da extração.
Figura 2. Extração de lipídios (soxlhet) (Arquivo pessoal, 2011).
4.3.5 Caracterização de Proteínas
4.3.5.1 Preparo do extrato
Foram colocados 20,0 mL da solução tampão (fosfato de sódio 0,1
mol/L, pH 7,0) a 1,0 g de cada amostra de caule e folhas, e no caso dos frutos
adotou-se a proporção de 1,0 g de amostra para 10,0 mL de tampão, em
béqueres separados, deixando agitar por 1 h em um agitador magnético. As
amostras foram então submetidas a centrifugação a 5000 rpm por 20 min onde
13
houve a separação do precipitado, sendo este descartado e o sobrenadante
utilizado para as análises.
4.3.5.2 Proteínas solúveis totais
Para a determinação do total de proteínas solúveis nas amostras
utilizou-se o método de Bradford (1976). Para o cálculo da concentração de
proteínas solúveis foi realizado com base em uma curva padrão com
soroalbumina bovina (Merck, Alemanha) e utilizada uma regressão linear, com
R2 = 0,995 equação y= 0,0076x + 0,3998.
Adicionou-se 5,0 mL do reagente de Bradford a 100 µL de cada
extrato em tubos de ensaio. Ao branco, foram adicionados 5,0 mL do reagente
a 100 µL da solução tampão. Os mesmos foram incubados a temperatura
ambiente por 10 min e a leitura foi feita em espectrofotômetro a 595 nm.
4.3.5.3 Atividade de Peroxidase
A detecção da atividade de peroxidase foi feita de acordo com a
metodologia descrita por Halpin et al. (1989), utilizando pirogalol e peróxido de
hidrogênio como substratos. A formação do produto foi monitorada por
espectrofotômetro a 420 nm. Uma unidade de enzima foi caracterizada como a
quantidade de enzima presente nas amostras capaz de produzir um aumento
de 0,1 na absorbância por minuto de reação, de acordo com as condições de
ensaio adotadas da literatura.
4.3.5.4 Atividade de Polifenoloxidase
A medida da atividade de polifenoloxidase foi realizada seguindo a
metodologia de Halpin e Lee (1987) utilizando o catecol como substrato. A
obtenção do produto foi monitorada por medida espectrofotométrica a 380 nm.
14
4.3.5.5 Atividade de Protease (inespecífica)
A medida da atividade de protease foi realizada de acordo com a
metodologia descrita por Arnon (1970) utilizando a caseína como substrato e o
TCA (ácido tricloroacético) como solução paralisadora. A formação do produto
foi monitorada por espectrofotômetro a 280 nm, após a centrifugação dos tubos
de ensaio a 5000 rpm por 5 min, com a leitura do sobrenadante.
4.3.5.6 Atividade de Peroxidase, Polifenoloxidase e Protease (específica)
Para o cálculo da atividade específica de peroxidase, polifenoloxidase e
protease foi feita a razão entre a atividade da enzima por mg de proteína das
respectivas amostras.
15
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 Análise do teor de umidade , cinzas e lipídeos
Para se determinar o teor de umidade residual e cinzas foram pesados
1,0 g das frações das respectivas partes de Byrsonima verbacifolia, folhas,
frutos e porções do caule. Na Tabela 1 estão apresentados os valores
encontrados, expressos em porcentagem.
Como pode ser observado, há uma concentração de lipídeos entre (30-50%)
em todas as porções analisadas desta planta. A maior concentração de
lipídeos totais foi encontrada nas amostras dos frutos (51,939%), e confirma o
que pode ser observado a olho nu: a consistência oleaginosa. Estes dados são
comparáveis com plantas da mesma família, em Silva et al no fruto do murici
da espécie (Byrsonima verbascifolia Rich) o valor de lipídios encontrados em g
100g-1 foi de 2,19 + 0,09 e também se assemelham aos dados de algumas
plantas de Cerrado, como em Caramori e Menezes (2007), onde se estudou a
composição bioquímica da semente e polpa de Campomanesia sp., e a
imobilização de peroxidase extraída destes frutos em suportes a base de
polianilina (semente-10,06 %; polpa-21,6%).
Tabela 1. Teores de umidade, cinzas e lipídeos das amostras de caule, folha e
fruto de murici, expressos em porcentagem.
Material
Umidade res. (%)
Cinzas (%)
Lipídios (%)
Caule
0,3584±0,01103
5,73±1,4219
31,600±1,470
Folha
0,3114±0,03571
4,38±0,3793
30,195±0,675
Fruto
0,4272±0,04873
3,107±0,212
51,939±0,860
16
5.2 Análises do extrato bruto
As análises realizadas para a determinação do teor de proteína solúvel
demonstraram que a maior fonte foi encontrada nas amostras do caule (Fig. 3).
Essas comparações são importantes quando se discute a inserção de novas
fontes protéicas para a alimentação, sejam elas destinadas à alimentação
humana ou à nutrição animal em geral.
Considerando os dados da Figura 3, mesmo para as amostras dos frutos
ainda há uma quantidade considerável de proteína solúvel (2-3,4 mg g-1
farinha). Dados de autores que trabalharam a composição centesimal em frutos
dessa planta revelam variações consideráveis no que tange o teor de proteína
solúvel.
Em Silva et al. (2008) para cada mg 0,1 mg-1 de frutos do murici (em
base úmida) analisados foram encontrados 0,000072 mg e em Guimarães e
Silva (2008) a composição centesimal dos frutos de Murici-Passa (MP) e in
natura (M) (mg 0,1 mg–1) apresentou uma média de aproximadamente 0,00017
mg. Embora a análise demonstrada na Figura 3 tenha sido obtida de um
experimento diferente, ela fornece dados mais consistentes para a comparação
que se pretende fazer neste trabalho, ou seja, a comparação das atividades
enzimáticas com o teor de proteína solúvel (atividade específica).
Figura 3. Teor de proteína solúvel presente nos fragmentos de Byrsonima
verbacifolia. As barras expressam as repetições das leituras (g) para cada
grama de farinha da planta. Dados obtidos por regressão linear (y = 0,0076x +
0,3998) utilizando soroalbumina bovina como padrão; R2 = 0,995.
17
A dosagem de atividade enzimática (peroxidases, proteases e
polifenoloxidases) está apresentada nas Figuras 4 e 5. Na Figura 4 é possível
observar que todas as amostras testadas foram capazes de reagir com os
substratos específicos para peroxidases. Entretanto, a farinha obtida da folha
da planta apresentou entre 25 a 50% atividade de peroxidase a mais em
relação às amostras de frutos e caule, respectivamente (Figura 4A). Já no
trabalho de (DETONI, 2005), para verificação de peroxidase em uvas da
espécie Niagara rosada armazenadas à diferentes temperaturas, utilizando-se
o
método
de
Clemente(1998)
foi
encontrada
uma
média
de
115
(unid.min.100mL).
A
B
Figura 4. Atividade de peroxidase presente em caule, folhas e frutos de
Byrsonima verbacifolia contra os substratos pirogalol e H2O2. A: atividade
inespecífica (U g-1 farinha); B: atividade específica: (U mg-1 proteína).
18
Considerando a atividade de peroxidase em relação ao teor de proteínas
nas amostras (Figura 4B), vê-se claramente que os frutos são os mais
interessantes para estudos do perfil protéico para fins de isolamento e
purificação, uma vez que a atividade de peroxidase nessas amostras é
predominante em relação ao caule e folhas.
A
B
Figura 5. Atividade de polifenoloxidase presente em caule, folhas e frutos de
Byrsonima verbacifolia contra o substrato catecol. A: atividade inespecífica (U
g-1 farinha); B: atividade específica: (U mg-1 proteína).
19
Na Figura 5A observa-se uma maior atividade de polifenoloxidase por U g-1 de
farinha no fruto do murici com um valor entre 310 e 390 U g-1 de farinha.
Também em atividade específica o fruto se sobressaiu apresentando de 100 a
120 U mg-1de proteína.
Em (DETONI et al., 2007) a uva Niagara rosada, seguindo o método
proposto por (JANOVITZ-KLAPP, RICHARD & NICOLAS), apresentou uma
atividade enzimática de polifenoloxidase de 17,26 (unid.min.100mL) após 21
dias armazenada à uma temperatura de 1°C. Esses res ultados são importantes
no que tange a comparação da atividade de polifenoloxidase entre o murici e
diversas espécies frutíferas.
A
B
Figura 6. Atividade proteolítica presente em caule, folhas e frutos de
Byrsonima verbacifolia contra o substrato caseína. A: atividade inespecífica (U
g-1 farinha); B: atividade específica: (U mg-1 proteína).
20
Nas Figuras 6A e 6B percebe-se maior atividade proteolitica inespecífica
e especifica nas folhas do vegetal, sendo observado um valor entre 1400 e
1600 U g-1 farinha para atividade inespecífica e para atividade específica maior
que 150 U mg-1 proteína. Em Caramori, Souza e Fernandes (2008), foi
observado no fruto do Inga da espécie I. cylindrica maior atividade proteolítica
específica nas sementes (179,20 U mg-1). Porém, nas amostras de polpa de
Inga alba, a atividade proteolítica específica observada foi maior do que os
dados deste trabalho (466,84 U mg-1 de proteína).
21
6 CONCLUSÕES
Através dos dados coletados pode se concluir que:
•
O fruto apresentou um alto teor de umidade e lipídios, como já era
esperado. Tendo em vista tal fato a concentração oleaginosa do fruto
pode ser bastante aproveitada para fins diversos.
•
O murici apresenta valores protéicos bastante satisfatórios, sendo,
portanto, uma espécie com enorme potencial para ser utilizado na
indústria alimentícia, como complemento alimentar, na indústria
farmacêutica e de cosméticos.
•
Em relação á atividade enzimática específica e inespecífica para
peroxidase e polifenoloxidase o murici demonstrou altos valores o que
comprova sua predisposição para fins biotecnológicos.
22
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