meningoencefalite herpética em bezerros

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
ALLAN JÜRGEN ISERNHAGEN
MENINGOENCEFALITE HERPÉTICA EM BEZERROS:
EVOLUÇÃO CLÍNICA E DIAGNÓSTICO.
LONDRINA – PARANÁ
2005
2
ALLAN JÜRGEN ISERNHAGEN
MENINGOENCEFALITE HERPÉTICA EM BEZERROS:
EVOLUÇÃO CLÍNICA E DIAGNÓSTICO.
Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação
em
Ciência
Animal
(Área
de
concentração: Sanidade Animal) da Universidade
Estadual de Londrina para a obtenção de título de
Mestre em Ciência Animal.
Orientador: Prof. Dr. Júlio Augusto Naylor Lisbôa
Co-orientador: Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri
LONDRINA – PARANÁ
2005
3
O presente trabalho foi realizado no setor de Grandes Animais do Hospital
Veterinário, no Laboratório de Virologia Animal, no Laboratório de Patologia Clínica e no
Laboratório de Anatomia Patológica, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Estadual de
Londrina como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal pelo Programa
de Pós-graduação em Ciência Animal, sob orientação do Prof. Dr. Júlio Augusto Naylor
Lisbôa.
Os recursos financeiros para o desenvolvimento do projeto foram obtidos
junto às agências e órgãos de fomento à pesquisa abaixo relacionados:
1. CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
2. CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
3. Fundação ARAUCÁRIA: Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento
Científico e Tecnológico do Paraná
4. PROPPG: Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade Estadual de
Londrina
4
Candidato:
ALLAN JÜRGEN ISERNHAGEN
Título da dissertação:
MENINGOENCEFALITE HERPÉTICA EM BEZERROS: EVOLUÇÃO CLÍNICA E
DIAGNÓSTICO.
Comissão examinadora:
Prof. Dr. Júlio Augusto Naylor Lisbôa
Prof. Dr. Rogério Martins Amorim
Profa. Dra. Alice Fernandes Alfieri
Londrina, 24 de junho de 2005.
5
À minha família, pelo amor e carinho em
todos os momentos da minha vida
6
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por tudo que tem me dado durante toda a minha vida.
Aos meus pais Walter e Maria Teresinha por todo carinho, amor e apoio em todos os
momentos de minha vida.
À minha irmã Allana por estar sempre ao meu lado.
A toda minha família que sempre me apoiou pra continuar seguindo em frente.
Ao professor e orientador Julio Augusto Naylor Lisbôa, pela amizade e enorme
colaboração na minha formação.
Ao professor e co-orientador Amauri Alcindo Alfieri pelas orientações e auxílio na
realização deste trabalho.
Aos professores do Programa de Mestrado em Ciência Animal.
Aos professores da graduação e a todos aqueles que passaram pela minha vida.
Aos professores Dr. Amauri Alcindo Alfieri, Dra Alice Fernandes Alfieri e Dra Ana
Paula Frederico Rodrigues Loureiro Bracarense, membros da banca de qualificação, pelas
colaborações neste trabalho.
Aos estagiários e amigos Mariana Cosenza, Márcio, Vitor, Romerson e Mariana.
Aos Residentes de Grandes Animais pela amizade e ajuda na realização deste trabalho.
A professora Mara Regina Stipp Balarin, a professora Ana Paula Frederico Rodrigues
Loureiro Bracarense, a Kerlei Cristina Médici e a residente Karina Keller Marques da Costa
Flaiban pelo auxílio na realização do trabalho.
Aos colegas de mestrado.
A todos os meus amigos.
7
Aos colegas do Laboratório de Virologia Animal Gustavo, Michele, Glei, Betinha,
Marlise e Sheila.
Aos funcionários do Hospital Veterinário da UEL.
E a todos que de alguma forma contribuíram e fizeram parte deste trabalho e da minha
vida, muito obrigado.
8
RESUMO
ISERNHAGEN, A.J. Meningoencefalite herpética em bezerros: evolução clínica e
diagnóstico. Dissertação (Programa de Pós-graduação em Ciência Animal) – Centro de
Ciências Agrárias – Universidade Estadual de Londrina – 2005.
A encefalite causada pelo BoHV-5 acomete bovinos de todas as faixas etárias, principalmente
os jovens, e determina baixa morbidade e alta letalidade. No Brasil, surtos da doença têm sido
relatados de forma crescente. Alguns aspectos sobre essa enfermidade ainda merecem maior
esclarecimento. O objetivo deste trabalho foi avaliar a evolução clínica e aspectos do
diagnóstico da meningoencefalite herpética em bezerros infectados experimentalmente com o
BoHV-5. Sete bezerros machos, sadios, da raça Holandesa com até 60 dias de idade foram
infectados por instilação de 0,5mL de inóculo (107,42 TCID50) em cada cavidade nasal. A
estirpe viral utilizada foi a AA PAR. Durante o período experimental pós-infecção (p.i.)
realizaram-se exames físicos duas vezes ao dia e hemogramas a cada 48 horas. Amostras de
líquor foram colhidas e analisadas a cada 48 horas a partir do início dos sinais de
encefalopatia. Nove subdivisões do encéfalo (córtex anterior, córtex dorso-lateral, córtex
ventro-lateral, córtex posterior, diencéfalo, mesencéfalo, ponte, medula oblonga e cerebelo) e
os gânglios do nervo trigêmeo foram colhidos após a morte e submetidos ao exame
histopatológico. A presença do vírus foi investigada, por meio da reação em cadeia pela
polimerase (PCR) e do isolamento em cultivo celular, nas diferentes porções do encéfalo, no
líquor e nos gânglios do nervo trigêmeo. Quatro bezerros manifestaram sinais de
encefalopatia a partir dos dias 9 (n=2) e 11 p.i. (n=2) e evoluíram para a morte em 12 horas
(n=1), 3 dias (n=2) ou 10 dias (n=1). Os demais bezerros (n=3) não manifestaram qualquer
evidência de encefalopatia e foram submetidos à eutanásia 30 dias p.i.. Os principais sintomas
observados foram: depressão, disfagia, amaurose, manias (atos compulsivos), ataxia,
sialorréia, mioclonias na face e convulsões. As freqüências respiratória e cardíaca não
variaram significativamente ao longo do tempo, e a temperatura corporal exibiu uma
tendência a se elevar entre 9 e 12 dias p.i. As alterações no leucograma foram discretas e
inespecíficas coincidindo com o início do quadro. A elevação de células mononucleares no
líquor foi a alteração mais importante de auxílio ao diagnóstico ainda em vida, apresentandose tanto nos bezerros sintomáticos quanto nos assintomáticos. O genoma viral foi identificado
em várias localizações do encéfalo e nos gânglios dos nervos trigêmeos, assim como, no
líquor de dois bezerros que manifestaram encefalopatia. O exame histopatológico confirmou,
por fim, que todos os bezerros estudados exibiram processo inflamatório encefálico,
indicando que a encefalite causada pelo BoHV-5 pode, eventualmente, ser branda e
assintomática.
Palavras-chave: Bezerro; BoHV-5; encefalite; sinais clínicos; evolução; diagnóstico
9
ABSTRACT
ISERNHAGEN, A.J. Herpetic meningoencephalitis in calves: clinical feature and diagnosis.
Dissertação (Programa de Pós-graduação em Ciência Animal) – Centro de Ciências Agrárias
– Universidade Estadual de Londrina – 2005.
The encephalitis caused by BoHV-5 affects cattle of all ages, mainly young, and is
characterized by low morbidity rate and high case fatality rate. Outbreaks of this disease have
increasingly been reported in Brazil. Some aspects of this disease are still unclear. In this
study, cases of herpetic meningoencephalitis were experimentally induced in calves to
investigate clinical pictures and diagnosis. Seven healthy male Holstein calves, up to 60 days
old, were infected with 0,5mL of virus suspension (107,42 TCID50) in each nasal cavity. The
AA PAR viral strain was used in this experiment. During the experimental postinfection (p.i.)
period, physical examinations were conducted twice a day and routine complet blood counts
were performed every 48 hours. Cerebrospinal fluid (CSF) analysis was performed in samples
collected every 48 hours from the onset of neurological signs on. Nine encephalic portions
(anterior cortex, dorsolateral cortex, ventrolateral cortex, posterior cortex, diencephalon,
mesencephalon, pons, medulla oblongata and cerebellum) and the trigeminal ganglia were
obtained at necropsy and submitted to histopathology. Virus detection was investigated in
each encephalic portion, trigeminal ganglia and CSF by means of polimerase chain reaction
(PCR) and virus isolation in cells culture. Four calves developed signs of neurologic disease
beginning at days 9 (n=2) and 11 p.i. (n=2) and died in 12 hours (n=1), 3 days (n=2) and 10
days (n=1). The other three calves remained asymptomatics and were euthanized 30 days p.i..
Depression, dysphagia, amaurosis, mania (compulsive behavior), ataxia, sialorrhea, facial
myoclonia and convulsion were the main signs. No significant changes occurred in the heart
and respiratory rates; but the rectal temperature tended to increase between days 9 and 12
p.i..The changes in leukogram were slight and unspecific coinciding with the onset of clinical
signs. Increases in CSF mononuclear cell counts occurred in all symptomatic and
asymptomatic calves, as the most important diagnostic aid before death. The BoHV-5 genome
was detected in several areas of the encephalon and in the trigeminal ganglia; as well as in the
CSF of two calves showing neurological signs. Histologically, all calves developed
encephalic inflammatory process which confirms that the encephalitis caused by BoHV-5
may, sometimes, be mild and asymptomatic.
Key words: Calf; BoHV-5; encephalitis; clinical signs; diagnosis
10
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 Variação da temperatura retal aferida diariamente à tarde em bezerros que
desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3)
após a infecção experimental com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um
bezerro sintomático........................................................................................................ 48
Gráfico 2 Variação do número total de leucócitos presentes no sangue de bezerros
que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos
(n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas
um bezerro...................................................................................................................... 52
Gráfico 3 Variação do número de segmentados presentes no sangue de bezerros que
desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3)
após a infecção experimental com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um
bezerro............................................................................................................................ 52
Gráfico 4 Variação da concentração do fibrinogênio plasmático em bezerros que
desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3)
após a infecção experimental com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um
bezerro............................................................................................................................ 53
Gráfico 5 Variação dos leucócitos mononucleares presentes no líquor de bezerros
que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos
(n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas
um bezerro...................................................................................................................... 56
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Cortes histológicos de sistema nervoso central de bezerros acometidos por
meningoencefalite causada pelo BoHV-5, corados por HE. A. Área de malácia no
córtex frontal (10x). B. Acentuado infiltrado inflamatório perivascular de células
mononucleares (seta) (20x). C. Gliose focal (seta) (20x). D. Acentuado infiltrado
inflamatório mononuclear em leptomeninges (seta) (20x)............................................ 60
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Aspectos clínicos individuais da evolução da meningoencefalite herpética
induzida experimentalmente em bezerros. Londrina/Paraná, 2005............................... 44
Tabela 2 Valores das funções vitais (x ± s) aferidas diariamente à tarde em bezerros
que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos
(n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5...................................................... 47
Tabela 3 Valores do eritrograma (x ± s) observados ao longo do tempo em bezerros
que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos
(n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5...................................................... 50
Tabela 4 Valores do leucograma e do fibrinogênio plasmático (x ± s) observados ao
longo do tempo em bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou
permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5.... 51
Tabela 5 Valores liquóricos (x ± s) observados ao longo do tempo em bezerros que
desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3)
após a infecção experimental com o BoHV-5................................................................ 55
Tabela 6 Resultados da presença de DNA viral detectado pela PCR e do isolamento
viral em porções do sistema nervoso e em amostras de líquor dos bezerros
sintomáticos e assintomáticos inoculados com BoHV-5............................................... 61
Tabela 7 Alterações histológicas das porções do sistema nervoso dos bezerros que
desenvolveram quadro de encefalopatia (n=4) e dos que permaneceram
assintomáticos (n=3) após inoculação experimental com BoHV-5............................... 62
12
SUMÁRIO
1 REVISÃO DE LITERATURA
ENCEFALITE PELO BoHV-5 – REVISÃO DE LITERATURA
Introdução...........................................................................................................
Etiologia..............................................................................................................
Epidemiologia.....................................................................................................
Patogenia.............................................................................................................
Sinais clínicos.....................................................................................................
Achados patológicos...........................................................................................
Diagnóstico.........................................................................................................
Diagnóstico diferencial.......................................................................................
Profilaxia.............................................................................................................
Referências .........................................................................................................
14
14
17
18
20
20
21
23
24
25
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral................................................................................................. 31
2.2 Objetivos específicos..................................................................................... 31
3 ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO
INFECÇÃO EXPERIMENTAL PELO BoHV-5 EM BEZERROS:
EVOLUÇÃO CLÍNICA E DIAGNÓSTICO
Resumo................................................................................................................
Abstract...............................................................................................................
Introdução...........................................................................................................
Material e métodos..............................................................................................
Resultados e discussão........................................................................................
Referências..........................................................................................................
33
34
35
38
43
63
4 CONCLUSÕES............................................................................................ 68
5 APÊNDICE
Apêndice A – Lista de tabelas............................................................................. 70
13
1 REVISÃO DE LITERATURA
14
ENCEFALITE PELO BoHV-5 - REVISÃO DE LITERATURA
INTRODUÇÃO
A meningoencefalite herpética bovina é uma infecção viral do Sistema
Nervoso Central (SNC) causada pelo herpesvírus bovino 5 (BoHV-5), que acomete bovinos
de todas as faixas etárias, principalmente os jovens (D’ARCE et al., 2002; SALVADOR et al.,
1998; SOUZA et al., 2002). A infecção é caracterizada por uma meningoencefalite não
purulenta, associada a lesões necróticas do córtex cerebral e inflamatórias nas substâncias
branca e cinzenta, sendo geralmente fatal (CARRILO et al., 1983; RIET-CORREA et al.,
1989).
ETIOLOGIA
O
BoHV-5 é um membro
da família Herpesviridae, subfamília
Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. É um vírus DNA de fita dupla, com
aproximadamente 137 Kilobases (Kb) constituído por uma região única longa (UL) e uma
região única curta (US), nucleocapsídeo icosaédrico com 162 capsômeros e envelope
glicoprotéico (FAUQUET et al., 2004). Os membros dessa subfamília são reconhecidos pela
sua grande variedade de hospedeiros, rápido crescimento em culturas e habilidade em causar
lise nas células. Porém, a principal propriedade biológica dessa subfamília é a capacidade de
estabelecer latência em neurônios dos gânglios sensoriais após a infecção aguda
(ASHBAUGH et al., 1997; CHOWDHURY et al., 2002; SILVA et al., 1998).
A reativação do vírus está geralmente associada a fatores de estresse como
transporte,
parto,
desmama
ou
confinamento
e
pelo
tratamento
sistêmico
com
15
corticosteróides. Ocorre com ou sem sinais clínicos e pode haver liberação de partículas virais
infecciosas nas secreções nasais (BELKNAP et al., 1994; COLODEL et al., 2002; HALFEN;
VIDOR, 2001; MEYER et al., 2001).
O BoHV-1 também pertence à subfamília Alphaherpesvirinae e é
responsável por várias enfermidades como a rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR),
vulvovaginite/balanopostite infecciosa (IPV), conjuntivite e abortamentos, estando raramente
associado a quadros de encefalite (PEREZ et al., 2002; ROELS et al., 2000; SOUZA et al.,
2002).
Durante o período de latência não é possível o isolamento do vírus e
antígenos virais não são demonstrados na célula infectada. Entretanto, técnicas moleculares
como a reação em cadeia pela polimerase (PCR) e hibridização in situ são capazes de detectar
o DNA viral e identificar os sítios de latência, como o gânglio trigeminal para o BoHV-5 e
linfonodos e mucosa nasal para o BoHV-1. Em contraste com a infecção ativa, onde a
replicação viral é comumente seguida de lise celular, a infecção latente geralmente não
determina a lise da célula infectada e ocorre em células de vida longa, com baixa taxa de
replicação e altamente diferenciadas, como os neurônios e células linfóides (ASHBAUGH et
al., 1997; CARON et al., 2002; ENGELS; ACKERMANN, 1996).
A replicação viral ocorre no núcleo celular. São descritas pelo menos dez
glicoproteínas do envelope viral, as quais são importantes para desencadear resposta imune do
hospedeiro. A entrada do herpesvírus na célula também é mediada por várias dessas
glicoproteínas, que fazem a ligação, a fusão e a penetração do vírus na célula hospedeira e
têm importante função na difusão do vírus célula a célula (SCHWYZER; ACKERMANN,
1996; WILD et al., 1998). As três principais glicoproteínas são gB, gC e gD
(CHOWDHURY, 1995).
16
Os primeiros isolamentos de herpesvírus a partir de animais com sinais de
encefalopatia, por carência de métodos adequados para a caracterização viral, foram
atribuídos ao BoHV-1, agente etiológico dos quadros de IBR e IPV, devido ao grau de
homologia entre estas estirpes (D’OFFAY et al., 1993; FRENCH, 1962; RIET-CORREA et
al., 1989). Posteriormente, foi denominado BoHV tipo 1, subtipo 3 (BoHV-1.3) e, finalmente,
pelas suas características moleculares, epidemiológicas e antigênicas distintas, foi
reclassificado como BoHV-5 (COLODEL et al., 2002; TEIXEIRA et al., 1998).
Embora tanto o BoHV-1 como o BoHV-5 sejam vírus neurotrópicos, eles
diferem em sua capacidade de causar encefalite (ASHBAUGH et al.,1997; CHOWDHURY et
al., 2002). O BoHV-1 pode ocasionalmente ser neuroinvasivo, mas raramente causa
encefalite, enquanto o BoHV-5 tem forte neurotropismo, freqüentemente levando a
encefalites fatais (PEREZ et al., 2002).
A infecção pelo BoHV-1 geralmente determina alta morbidade e baixa
mortalidade. Já a infecção pelo BoHV-5 costuma se apresentar com baixa morbidade e alta
letalidade (D’ARCE et al., 2002; ROEHE et al., 1997; SOUZA et al., 2002).
Com relação à composição genômica, o DNA do BoHV-5 apresenta
similaridade de 85% com o do BoHV-1. Sugere-se que as diferenças na seqüência de
nucleotídeos entre esses dois vírus estejam distribuídas por todo o genoma (CHOWDHURY
et al., 2002). Análises com anticorpos monoclonais (MAbs) têm demonstrado diferenças
antigênicas entre as principais glicoproteínas (gB, gC e gD) do BoHV-5 e BoHV-1
(CHOWDHURY et al., 1997; COLLINS et al., 1993).
17
EPIDEMIOLOGIA
Devido à grande similaridade genômica, ocorre uma forte reação sorológica
cruzada entre os diferentes BoHV, o que dificulta os levantamentos epidemiológicos
geográficos da ocorrência do BoHV-5 (COLODEL et al., 2002; HALFEN et al., 2000). Desta
forma é desconhecida a prevalência do BoHV-5 no mundo (ROEHE et al., 1997). Inquéritos
sorológicos indicam que o BoHV-1 está disseminado nos rebanhos de todo o país, embora
uma parte dos bovinos soropositivos para o BoHV-1 possa estar infectada pelo BoHV-5, já
que não existem meios de diferenciar os anticorpos produzidos contra os dois vírus
(HALFEN; VIDOR, 2001).
Surtos de meningoencefalite herpética têm sido relatados em vários países
como Austrália (FRENCH, 1962; GARDINER et al., 1964; HILL et al., 1984), Estados
Unidos (BARENFUS et al., 1963), Canadá (GOUGH; JAMES, 1975), Argentina (CARRILO
et al., 1983) e Escócia (WATT et al., 1981).
No Brasil, encefalites causadas por BoHV-5 têm sido confirmadas de forma
crescente nos rebanhos, com casos descritos nos Estados do Rio Grande do Sul (RIETCORREA et al., 1989; WEIBLEIN et al., 1989), Rio de Janeiro, Minas Gerais (GOMES et al.,
2002; SOUZA et al., 2002), Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, São Paulo (COLODEL et al.,
2002; SALVADOR et al., 1998) e Paraná (CLAUS, 2002). Embora não existam relatos da
infecção em outros Estados, sugere-se que o BoHV-5 seja enzoótico em todo o país (ROEHE
et al., 1997). No Rio Grande do Sul, casos de encefalites por BoHV-5 foram a segunda maior
causa de encefalites com etiologia definida, sendo a primeira, a raiva (SANCHES et al.,
2000).
Os surtos não apresentam caráter sazonal, sendo acometidos bovinos de
diferentes raças e independente do sexo, afetando principalmente animais jovens, porém
18
surtos acometendo animais com mais de 60 meses já foram relatados (ELIAS; SCHILD;
RIET-CORREA., 2004; SALVADOR et al., 1998).
PATOGENIA
Alguns trabalhos de infecção experimental em coelhos, ovinos e bezerros
têm sido realizados na busca do melhor entendimento da patogenia da infecção pelo BoHV-5
(BAGUST; CLARK, 1972; BELTRÃO et al., 2000; MEYER et al., 1996; PEREZ et al.,
2002; SILVA et al., 1999; VOGEL et al., 2003).
As principais portas de entrada do vírus são as superfícies mucosas do trato
respiratório. A transmissão é geralmente associada ao contato íntimo com essas superfícies,
mas o vírus também pode ser propagado por meio de aerossóis (HALFEN; VIDOR, 2001).
Beltrão et al. (2000), utilizando coelhos como modelos experimentais,
mostraram que a inoculação pela via intranasal foi mais eficiente na indução da doença
nervosa do que pela via conjuntival. Coelhos sacrificados 24 horas pós-inoculação (p.i.)
intranasal demonstraram replicação viral somente na cavidade nasal. Em coelhos sacrificados
posteriormente, detectou-se a replicação viral no bulbo olfatório (48h p.i.) e no córtex
olfatório (48 a 72h p.i.). Com 72h p.i. o vírus foi detectado também no gânglio do trigêmeo e
na ponte, além do córtex cerebral. No quarto dia após a inoculação, a infecção já se
encontrava distribuída por várias áreas do SNC. Estes estudos sugerem o sistema olfatório
como a principal via de acesso do BoHV-5 ao encéfalo após a inoculação intranasal.
Chowdhury et al. (1997) também utilizaram a inoculação intranasal do
BoHV-5 em coelhos, associada ao tratamento com dexametasona. Dados de isolamento e
identificação viral, histopatológicos, imunoistoquímicos e de hibridização in-situ mostraram
que o BoHV-5 foi capaz de invadir e se replicar nas estruturas olfatórias do coelho, sugerindo
que o vírus alcance o SNC, predominantemente, pelo bulbo olfatório.
19
Perez et al. (2002), para estudar a patogenia da infecção pelo BoHV-5 em
bovinos, utilizaram bezerros inoculados pela via intranasal com uma estirpe viral isolada de
um bovino com quadro de encefalite na Argentina. Os bezerros foram separados em dois
grupos: animais com infecção aguda (grupo 1) e animais com infecção latente (grupo 2). Três
meses p.i., os animais do grupo 2 receberam dexametasona por via intravenosa na dose de 0,1
mg/kg/dia, por 5 dias. A excreção do BoHV-5 em secreções nasais e oculares foi evidenciada
em 75% dos animais do grupo 1 e em 91% dos animais do grupo 2. Em ambos os grupos, o
córtex anterior foi a área mais gravemente afetada. As lesões se desenvolveram
simultaneamente no córtex anterior, bulbo, ponte e gânglio do trigêmeo, sugerindo que o
BoHV-5 alcance o cérebro por transporte axonal nos neurônios bipolares dos nervos
olfatórios para o bulbo olfatório.
Vogel et al. (2003), para estudar a distribuição do BoHV-5 no SNC,
inocularam 12 bezerros pela via intranasal com uma estirpe viral isolada de um surto de
meningoencefalite no sul do Brasil, sendo que outros dois animais permaneceram como
controle negativo. Cinqüenta e cinco dias p.i., quatro bezerros inoculados (grupo A) foram
submetidos à eutanásia para coleta de amostras do SNC. Os outros oito animais (grupo B)
foram tratados com dexametasona por 5 dias a partir do dia 60 pi e submetidos à eutanásia 55
dias após o tratamento com dexametasona. Verificou-se que todos os animais inoculados
apresentaram excreção viral por vários dias durante a infecção aguda. Após o tratamento com
dexametasona (grupo B), cinco dos oito animais apresentaram excreção viral, porém, por
menos dias do que na infecção aguda. Em ambos os grupos, o DNA viral foi detectado em
várias porções do SNC, porém a distribuição foi mais ampla nos bezerros do grupo B. Foi
demonstrado que o DNA do BoHV-5 está presente em diversas áreas do SNC de bovinos com
infecção latente, sendo que após a reativação outras áreas também apresentaram DNA viral.
20
SINAIS CLÍNICOS
Os principais sintomas observados em casos de meningoencefalite herpética
bovina são: isolamento do rebanho, depressão, secreção nasal e ocular, sialorréia, nistagmo,
opistótono, amaurose, andar em círculo, ataxia, hipermetria, tremores musculares, flacidez de
língua, bruxismo, convulsões, decúbito permanente, coma e morte. O período de evolução da
doença é apontado como variável de 1 a 15 dias, sendo mais comum entre 4 e 7 dias
(COLODEL et al., 2002; RIET-CORREA et al., 1996; SALVADOR et al., 1998; SANCHES
et al., 2000).
Os sinais clínicos podem variar de acordo com a área do SNC acometida.
Assim, em um mesmo foco, os animais acometidos não necessariamente irão apresentar os
mesmos sinais clínicos e na mesma intensidade (LISBÔA et al., 2003).
ACHADOS PATOLÓGICOS
À necropsia, com freqüência não são evidenciadas lesões significativas
(SALVADOR et al., 1998). As principais alterações macroscópicas descritas no encéfalo são
áreas de malácia corticais, achatamento das circunvoluções, protrusão cerebelar pelo forâmen
magno, congestão e hemorragia (RIET-CORREA et al., 1989; SALVADOR et al., 1998;
WEIBLEIN et al., 1989). As lesões macroscópicas no SNC aparentemente não têm relação
com o tempo de evolução da doença, uma vez que as lesões de malácia do córtex cerebral
ocorrem tanto nos bovinos com curso clínico de 2 a 3 dias como naqueles em que a evolução
da doença é superior a 7 dias (ELIAS; SCHILD; RIET-CORREA, 2004).
Microscopicamente,
as
principais
alterações
caracterizam-se
por
meningoencefalite não supurativa difusa, presença de manguitos perivasculares de células
21
mononucleares, satelitose, necrose neuronal, gliose multifocal, meningite e hemorragias.
Corpúsculos de inclusão intranucleares, geralmente eosinofílicos, podem ocorrer em
neurônios, sendo mais freqüentes nos astrócitos (ELIAS; SCHILD; RIET-CORREA, 2004;
MEYER et al., 2001; PEREZ et al., 2002; SALVADOR et al., 1998; SANCHES et al., 2000).
DIAGNÓSTICO
O diagnóstico ante-mortem é difícil de ser estabelecido, visto que não
existem sintomas patognomônicos da enfermidade, a qual pode se confundir com qualquer
outro quadro de encefalopatia. O diagnóstico post-mortem com auxílio de métodos
laboratoriais é, portanto, de importância fundamental (HALFEN; VIDOR, 2001). As taxas de
morbidade e de letalidade podem ajudar no direcionamento do diagnóstico, bem como excluir
outras enfermidades.
Testes sorológicos têm valor limitado no diagnóstico, pois não diferenciam
animais infectados pelo BoHV-5 dos infectados pelo BoHV-1, devido à intensa reação
cruzada entre os vírus (ROEHE et al., 1997; TEIXEIRA et al., 1998).
A confirmação do envolvimento do BoHV-5 pode ser realizada pelo
isolamento do vírus em cultivo celular e posterior caracterização do isolado por meio de
técnicas que empregam anticorpos monoclonais para a identificação de proteínas virais
específicas (ROEHE et al., 1997); e/ou por técnicas moleculares (CLAUS, 2002; D’OFFAY
et al., 1993).
Kunrath et al. (2004), utilizando anticorpos monoclonais (AcM) produzidos
com uma estirpe brasileira do BoHV-5, padronizaram técnicas rápidas para o diagnóstico de
infecções por herpesvírus. A detecção de antígenos virais por imunofluorescência em células
descamativas (IFCD) foi comparada com o isolamento viral em secreções nasais de bezerros,
22
apresentando uma concordância nos resultados de 89,6%. Testes com AcM também foram
utilizados para detectar antígenos do BoHV-5 em impressões frescas do cérebro de bezerros
acometidos de enfermidade neurológica e em células de cultivo utilizadas na técnica de
soroneutralização, permitindo a obtenção dos resultados em 24 horas. A técnica, denominada
de soroneutralização rápida, apresentou sensibilidade de 97,3%, especificidade de 95,5% e
precisão de 96,2% em comparação com a soroneutralização tradicional, mostrando que os
AcM podem ser úteis para uso em técnicas rápidas para o diagnóstico de infecções suspeitas
de BoHV-5.
Atualmente, técnicas de biologia molecular como a PCR para a detecção do
genoma viral são empregadas com sucesso no diagnóstico da infecção pelo BoHV-5. Além
disso, a técnica de PCR não exige a viabilidade da partícula viral e possibilita a utilização de
uma ampla variedade de amostras. Esta característica assume grande importância em
Medicina Veterinária onde, principalmente em animais de produção, os materiais biológicos
colhidos a campo para o diagnóstico muitas vezes são conservados inadequadamente e
demandam longo intervalo de tempo para o transporte até o laboratório (ASHBAUGH et al.,
1997; CLAUS, 2002). Quanto a este último aspecto a técnica de PCR seria mais vantajosa do
que o isolamento em cultivo celular, além de fornecer resultado mais rápido.
Trabalhando com a infecção experimental em bezerros, Meyer et al. (2001)
puderam demonstrar que as partículas virais não se distribuem uniformemente por todo o
encéfalo, gerando resultados de cultivo celular negativos de acordo com a área que originou o
fragmento estudado. O sucesso do diagnóstico depende, portanto, da escolha apropriada da(s)
amostra(s) a ser(em) encaminhada(s). É ausente na literatura qualquer menção a respeito da
possibilidade da utilização de amostras de líquor com fins diagnósticos e das alterações no
líquor de animais acometidos de encefalite pelo BoHV-5 sendo, entretanto, a pleiocitose
23
mononuclear e/ou aumento na concentração de proteína um achado comum em encefalites
herpéticas em outras espécies (CALLAN; VAN METRE, 2004).
DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
Como os sinais neurológicos presentes nas infecções pelo BoHV-5 podem
ser observados em diversas situações onde haja comprometimento das funções do encéfalo, o
diagnóstico diferencial é de fundamental importância (CLAUS, 2002). Os principais
diagnósticos diferenciais são a raiva, a polioencefalomalácia, algumas intoxicações por
plantas, encefalites bacterianas (HALFEN; VIDOR, 2001; SALVADOR et al., 1998) e
intoxicação por chumbo (CALLAN; VAN METRE, 2004).
Sanches et al. (2000) realizaram um estudo retrospectivo das necropsias de
bovinos no Sul do Brasil, onde em cerca de 10% dos casos estavam presentes sinais de
distúrbios neurológicos. Dos casos em que foi possível concluir o diagnóstico, cerca de 50%
foram diagnosticados como raiva (151 animais)
e aproximadamente 5%
como
meningoencefalite herpética bovina (14 animais).
Spilki et al. (2003) descreveram o isolamento de BoHV-5 de um caso
confirmado de raiva em um bezerro com sinais de encefalopatia. O diagnóstico de raiva foi
confirmado por meio de imunofluorescência direta e inoculação em camundongos. Já o
isolamento do BoHV-5 foi realizado em cultivo de células MDBK. Os autores sugerem que
este caso de infecção mista pode ter sido causado pela reativação do herpesvírus após a
infecção pelo vírus rábico, levando o animal a uma situação de estresse. Porém, não foi
possível estimar se o BoHV-5 teve um papel ativo durante o quadro.
24
PROFILAXIA
As manifestações clínicas da infecção pelo BoHV-5 podem ser controladas e
prevenidas por meio de procedimentos adequados de manejo e programas de vacinação
(HALFEN; VIDOR, 2001).
Devido às similaridades em aspectos biológicos e moleculares entre o
BoHV-5 e o BoHV-1, ocorrem significativas reações sorológicas cruzadas entre os dois vírus.
Dessa forma, a mesma tecnologia utilizada para a produção de vacinas contra o BoHV-1 é
apontada como alternativa para o controle dos surtos de meningoencefalite pelo BoHV-5
(HALFEN et al., 2000). Apesar de não impedir as infecções pelos BoHV-1 e BoHV-5, a
vacinação reduz significativamente a incidência da doença (HALFEN; VIDOR, 2001).
Vogel et al. (2002) realizaram um estudo para determinar a atividade
neutralizante antiBoHV-5 conferida por três vacinas contendo antígenos do BoHV-1. Bovinos
soronegativos foram divididos em três grupos e imunizados três vezes (5mL via intramuscular
nos dias 0, 30 e 180) com vacinas que continham antígenos do BoHV-1 (vacina A e B) ou
com uma vacina contendo antígenos do BoHV-1 e BoHV-5 (vacina C). O soro coletado no
dia 210 foi testado pela técnica de soroneutralização frente ao BoHV-1 e BoHV-5. Nos três
grupos, os títulos médios antiBoHV-1 não diferiram dos títulos antiBoHV-5. A vacina C
resultou no maior número de reagentes contra o BoHV-5 (96,9%), enquanto as vacinas A e B
resultaram, respectivamente, em 85,7% e 92,9% de animais sororreagentes. Com isto, a
inclusão de antígenos do BoHV-5 em vacinas a serem utilizadas em regiões onde as duas
espécies de vírus estão presentes parece ser desejável para ampliar o grau e espectro da
resposta imunológica.
Para a imunoprofilaxia das herpesviroses no Brasil, são disponíveis dois
tipos de vacinas: vacinas com vírus inativados, e vacinas com vírus atenuados termo-sensíveis
25
(mutante ts), de uso intramuscular. Essas vacinas são comprovadamente seguras para uso em
todas as categorias de animais, inclusive fêmeas gestantes, sendo que na primo vacinação são
necessárias duas doses com intervalos de três a quatro semanas (ALFIERI; ALFIERI;
MÉDICI, 1998).
Animais, filhos de mães vacinadas e que receberam adequadamente o
colostro, deverão ser vacinados, com duas doses, entre o quinto e sexto mês de vida. Animais
filhos de vacas negativas e não vacinadas poderão receber a primeira dose já a partir de dois a
três meses de idade. Para as revacinações, que deverão ocorrer num intervalo máximo de nove
meses a um ano, apenas uma dose de vacina é necessária (ALFIERI; ALFIERI; MÉDICI,
1998). Este esquema de vacinação é recomendado para prevenção de infecções pelo BoHV-1,
podendo ser utilizado também para profilaxia da meningoencefalite herpética bovina.
REFERÊNCIAS
ALFIERI, A.A.; ALFIERI, A.F.; MÉDICI, K.C. Conseqüências da infecção pelo herpesvírus
bovino tipo 1 sobre o sistema reprodutivo de bovinos. Semina: Ciências Agrárias,
Londrina, v.19, n.1, p.86-93, 1998.
ASHBAUGH, S.E.; THOMPSON, K.E.; BELKNAP, E.B.; SCHULTHEISS, P.C.;
CHOWDHURY, S.; COLLINS, J.K. Specific detection of shedding and latency of bovine
herpesvirus 1 and 5 using a nested polymerase chain reaction. Journal of Veterinary
Diagnostic Investigation, Lawrence, v.9, n.4, p.387-394, 1997.
BAGUST, T.J.; CLARK, L. Pathogenesis of meningo-encephalitis produced in calves by
infectious bovine rhinotracheitis herpesvirus. Journal of Comparative Pathology,
Edinburgh, v.82, p.375-383, 1972.
BARENFUS, M.; QUADRI, C.A.D.; MCINTYRE, R.W.; SCHROEDER, R.J. Isolation of
Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus from Calves with Meningoencephalitis. Journal of
American Veterinary Medical Association, Chicago, v.143, n.7, p.725-728, Oct. 1963.
BELKNAP, E.B.; COLLINS, J.K.; AYERS, V.K., SCHULTHEISS, P.C. Experimental
infection of neonatal calves with neurovirulent bovine herpesvirus type 1.3. Veterinary
Pathology, Lawrence, v.31, p.358-365, 1994.
26
BELTRÃO, N.; FLORES, E.F.; WEIBLEN, R.; SILVA, A.M.; ROEHE, P.M.; IRIGOYEN,
L.F. Infecção e enfermidade neurológica pelo herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5): coelhos
como modelo experimental. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v.20, n.4,
p.144-150, out./dez. 2000.
CALLAN, R.J.; VAN METRE, D.C. Viral diseases of the ruminant nervous system.
Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, Philadelphia, v.20, n.2, p.327362, July 2004.
CARON, L.; FLORES, E.F.; WEIBLEN, R. SCHERER, C.F.C.; IRIGOYEN, L.F.; ROEHE,
P.M.; ODEON, A.; SUR, J.-H. Latent infection by bovine herpesvírus type-5 in
experimentally infected rabbits: virus reactivation, shedding and recrudescence of
neurological disease. Veterinary Microbiology, Amsterdan, v.84, n.4, p.285-295, Feb. 2002.
CARRILO, B.J.; AMBROGI, A.; SCHUDEL, A.A.; VASQUEZ, M.; DAHME, E.;
POSPICHIL, A. Meningoencephalitis caused by IBR virus in calves in Argentina.
Zentralblatt Für Veterinärmedizin Reihe B, Berlin, v.30, p.327-332, 1983.
CHOWDHURY, S.I. Molecular basis of antigenic variation between the Glycoproteins C of
respiratory bovine herpesvirus 1 (BHV-1) and neurovirulent BHV-5. Virology, New York,
v.213, n.2, p.558-568, Nov. 1995.
CHOWDHURY, S.I.; LEE, B.J.; MOSIER, D.; SUR, J.-H.; OSORIO, F.A.; KENNEDY, G.;
WEISS, M.L. Neuropathology of Bovine Herpesvirus Type 5 (BHV-5) Meningo-encephalitis
in a Rabbit Seizure Model. Journal of Comparative Pathology, Edinburgh, v.117, p.295310, 1997.
CHOWDHURY, S.I.; ONDERCI, M.; BHATTACHARJEE, P.S.; AL-MUBARAK, A.;
WEISS, M.L.; ZHOU, Y. Bovine herpesvirus 5 (BHV-5) Us9 is essential for BHV-5
neuropathogenesis. Journal of Virology, Washington, v.76, n.8, p.3839-3851, Apr. 2002.
CLAUS, M.P. Detecção do herpesvírus bovino tipos 1 e 5 por amplificação parcial do gene
da glicoproteína C e estudo retrospectivo da meningoencefalite herpética bovina. 2002.
Dissertação (Mestrado em Sanidade Animal) - Universidade Estadual de Londrina, Londrina.
COLLINS, J.K.; AYERS, V.K.; WHETSTONE, C.A.; van DRUNNEN LITTEL-van den
HURK, S. Antigenic differences between the major glycoproteins of bovine herpesvirus type
1.1 and bovine encephalitis herpesvirus type 1.3. Journal of General Virology, London,
v.74, p.1509-1517, 1993.
COLODEL, E.M.; NAKAZATO, L.; WEIBLEN, R.; MELLO, R.M.; SILVA, R.R.P.;
SOUZA, M.A.; FILHO, J.A.O.; CARON, L. Meningoencefalite necrosante em bovinos
causada por herpesvírus bovino no estado de Mato Grosso, Brasil. Ciência Rural, Santa
Maria, v.32, n.2, p.293-298, 2002.
D’ARCE, R.C.F.; ALMEIDA, R.S.; SILVA, T.C.; FRANCO, A.C.; SPILKI, F.; ROEHE,
P.M.; ARNS, C.W. Restriction endonuclease and monoclonal antibody analysis of Brazilian
isolates of bovine herpesviruses types 1 and 5. Veterinary Microbiology, Amsterdan, v.88,
n.4, p.315-324, Sep. 2002.
27
D’OFFAY, J.M.; MOCK, R.E.; FULTON, R.W. Isolation and characterization of
encephalitic bovine herpesvirus type 1 isolates from cattle in North America. American
Journal of Veterinary Research, Chicago, v.54, n.4, p.534-539, Apr. 1993.
ELIAS, F.; SCHILD, A.L.; RIET-CORREA, F. Meningoencefalite e encefalomalacia por
Herpesvírus bovino-5: distribuição das lesões no sistema nervoso central de bovinos
naturalmente infectados. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v.24, n.3, p.123131, jul./set. 2004.
ENGELS, M.; ACKERMANN, M. Pathogenesis of ruminant herpesvirus infections.
Veterinary Microbiology, Amsterdan, v.53, n.1,2, p.3-15, Nov. 1996.
FAUQUET, C. M.; MAYO, M. A.; MANILOFF, J.; DESSELBERGER, U.; BALL, L. A.
Virus Taxonomy. The eighth report. San Diego: Academic Press, 2004, 1162 p.
FRENCH, E.L. A specific virus encephalitis in calves: isolation and characterization of the
causal agent. Australian Veterinary Journal, Sydney, v.38, p.216-221, Apr. 1962.
GARDINER, M.R.; NAIRN, M.E.; SIER, A.M. Viral meningoencephalitis of calves in
Western Australia. Australian Veterinary Journal, Sydney, v.40, p.225-228, June 1964.
GOMES, L.I.; ROCHA, M.A.; COSTA, E.A.; LOBATO, Z.I.P.; MENDES, L.C.N.;
BORGES, A.S.; LEITE, R.C.; BARBOSA-STANCIOLI, E.F. Detecção de herpesvírus
bovino 5 (BoHV-5) em bovinos do Sudeste Brasileiro. Arquivo Brasileiro de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v.54, n.2, p.217-220, 2002.
GOUGH, A.; JAMES, D. Isolation of IBR virus from a heifer with meningoencephalitis.
Canadian Veterinary Journal, Guelph, v.16, n.10, p.313-314, Oct. 1975.
HALFEN, D.C.; VIDOR, T. Infecções por herpesvírus bovino-1 e herpesvírus bovino-5. In:
RIET-CORREA,F.; SCHILD, A.L.; MÉNDEZ, M.D.C.; LEMOS, R.A.A. Doenças de
ruminantes e eqüinos. 2.ed. São Paulo : Varela, 2001. v.2, p.97-108.
HALFEN, D.C.; VIDOR, T.; BRAGA, F.M.; VAN DER LAAN, C.W. Imunogenicidade do
herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) em vacinas inativadas de diferentes formulações. Ciência
Rural, Santa Maria, v.30, n.5, p.851-856, 2000.
HILL, B.D.; HILL, M.W.M.; CHUNG, Y.S.; WHITTLE, R.J. Meningoencephalitis in calves
due to bovine herpesvirus type 1 infection. Australian Veterinary Journal, Sydney, v.61,
n.7, p.242-243, July 1984.
KUNRATH, C.F.; VOGEL, F.S.F.; OLDONI, I.; FLORES, E.F.; WEIBLEN, R.;
DEZENGRINI, R.; TORRES, F.D.; PAN, K.A. Soroneutralização e imunofluorescência
utilizando anticorpos monoclonais no diagnóstico rápido de infecções pelo herpesvírus bovino
tipos 1 e 5 (BHV-1 e BHV-5). Ciência Rural, Santa Maria, v.34, n.6, p.1877-1883, nov.-dez.
2004.
28
LISBÔA, J.A.N.; ALFIERI,A.A.; BALARIN, M.R.S.; CLAUS, M.P.; ISERNHAGEN, A.J.
Aspectos clínicos e diagnóstico da encefalite causada por HVB-5 em bezerros. In:
CONGRESSO LATINO AMERICANO DE BUIATRIA, 11., 2003, Salvador. Anais...
Salvador, 2003. p.19.
MEYER, G.; LEMAIRE, M.; LYAKU, J.; PASTORT, P.-P., THRY, E. Establishment of a
rabbit model for bovine herpesvirus type 5 neurological acute infection. Veterinary
Microbiology, Amsterdan, v.51, n.1-2, p.27-40, 1996.
MEYER, G.; LEMAIRE, M.; ROS, C.; BELAK, K.; GABRIEL, A.; CASSART, D.;
COIGNOUL, F.; BELAK, S.; THIRY, E. Comparative pathogenesis of acute and latent
infections of calves with bovine herpesvirus types 1 and 5. Archives of Virology, Vienna,
v.146, n.4, p.633-652, 2001.
PEREZ, S.E.; BRETSCHNEIDER, G.; LEUNDA, M.R.; OSORIO, F.A.; FLORES, E.F.;
ODEÓN, A.C. Primary infection, latency, and reactivation of bovine herpesvirus type 5 in
the bovine nervous system. Veterinary Pathology, Lawrence, v.39, n.4, p.437-444, 2002.
RIET-CORREA, F.; MOOJEN, V.; ROEHE, P.M.; WEIBLEN, R. Viroses confundíveis com
febre aftosa. Ciência Rural, Santa Maria, v.26, n.2, p.323-332, maio/ago. 1996.
RIET-CORREA, F.; VIDOR, T.; SCHILD, A.L.; MÉNDEZ, M.C. Meningoencefalite e
necrose do córtex cerebral em bovinos causadas por herpes vírus bovino-1. Pesquisa
Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v.9, n.1/2, p.13-16, 1989.
ROEHE, P.M.; SILVA, T.C.; NARDI, N.B.; OLIVEIRA, L.G.; ROSA, J.C.A. Diferenciação
entre os vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina (BHV-1) e herpesvírus da encefalite bovina
(BHV-5) com anticorpos monoclonais. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro,
v.17, n.1, p. 41-44, jan./mar. 1997.
ROELS, S.; CHARLIER, C.; LETELLIER, C.; MEYER, G.; SCHYNTS, F..; KERKHOFS,
P.; THIRY, E.; VANOPDENBOSCH, E. Natural case of bovine meningoencephalitis in an
adult cow. Veterinary Record, London, v.146, n.20, p.586-588, May 2000.
SALVADOR, S.C.; LEMOS, R.A.A.; RIET-CORREA, F.; ROEHE, P.M.; OSÓRIO,
A.L.A.R. Meningoencefalite em bovinos causada por herpesvírus bovino-5 no Mato Grosso
do sul e São Paulo. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v.18, n.2, p.76-83,
abr./jun. 1998.
SANCHES, A.W.D.; LANGOHR, I.M.; STIGGER, A.L.; BARROS, C.S.L. Doenças do
sistema nervoso central em bovinos no Sul do Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio
de Janeiro, v.20, n.3, p.113-118, jul./set. 2000.
SCHWYZER, M.; ACKERMANN, M. Molecular virology of ruminant herpesviruses.
Veterinary Microbiology, Amsterdan, v.53, n.1,2, p.17-29, Nov. 1996.
SILVA, A.M.; FLORES, E.F.; WEIBLEN, R.; BOTTON, S.A.; IRIGOYEN, L.F.; ROEHE,
P.M.; BRUM, M.C.S.; CANTO, M.C. Infecção aguda e latente em ovinos inoculados com o
herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5). Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v.18,
n.3/4, p.99-106, jul./dez. 1998.
29
SILVA, A.M.; WEIBLEN, R.; IRIGOYEN, L.F.; ROEHE, P.M.; SUR, H.J.; OSORIO, F.A.;
FLORES, E.F. Experimental infection of sheep with bovine herpesvírus type-5 (BHV-5):
acute and latent infection. Veterinary Microbiology, Amsterdan, v.66, p. 89-99, 1999.
SOUZA, V.F.; MELO,S.V.; ESTEVES, P.A.; SCHMIDT, C.S.; GONÇALVES, D.A.;
SCHAEFER, R.; SILVA, T.C.; ALMEIDA, R.S.; VICENTINI, F.; FRANCO, A.C.;
OLIVEIRA, E.A.; SPILKI, F.R.; WEIBLEN, R.; FLORES, E.F.; LEMOS, R.A.; ALFIERI,
A.A.; PITUCO, E.M.; ROEHE, P.M. Caracterização de herpesvírus bovinos tipos 1 (BHV-1)
e 5 (BHV-5) com anticorpos monoclonais. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de janeiro,
v.22, n.1, p.13-18, jan./mar. 2002.
SPILKI, F.R.; FRANCO, A.C.; TEIXEIRA, M.B.; ESTEVES, P.A.; SCHAEFER, R.;
SCHMIDT, E.; LEMOS, R.A.; ROEHE, P.M. Bovine herpesvírus type 5 (BHV-5) in a calf
with rabies. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v.23, n.1, p.1-4, jan./mar.
2003.
TEIXEIRA, M.F.B.; ESTEVES, P.A.; COELHO, C.S.S.; SILVA, T.C.; OLIVEIRA, L.G.;
ROEHE, P.M. Diferenças em níveis de anticorpos neutralizantes contra herpesvírus bovinos
tipos 1 (BHV-1) e 5 (BHV-5). Pesquisa Agropecuária Gaúcha, Porto Alegre, v.4, n.1, p.6165, 1998.
VOGEL, F.S.F.; CARON, L.; FLORES, E.F.; WEIBLEN, R.; WINKELMANN, E.R.;
MAYER, S.V.; BASTOS, R.G. Distribution of bovine herpesvirus type 5 in the central
nervous systems os latently, experimentally infected calves. Journal of Clinical
Microbiology, Washington, v.41, n.10, p.4512-4520, Oct. 2003.
VOGEL, F.S.F.; FLORES, E.F.; WEIBLEN, R.; KUNRATH, C.F. Atividade neutralizante
anti-herpesvírus bovino tipos 1 (BHV-1) e 5 (BHV-5) no soro de bovinos imunizados com
vacinas contra o BHV-1. Ciência Rural, Santa Maria, v.32, n.5, p.881-883, 2002.
WATT, J.A.; JOHNSTON, W.S.; MACLEOD, N.S.; BARLOW, R.M. Infectious bovine
rhinotracheitis and encephalitis. Veterinary Record, London, v.108, n.3, p.63-64, Jan. 1981.
WEIBLEN, R.; BARROS, C.S.L.; CANABARRO, T.F.; FLORES, I.E. Bovine meningoencephalitis from IBR virus. Veterinary Record, London, v.124, n.25, p.666-667, June
1989.
WILD, P.; SCHRANER, E.M.; PETER, J.; LOEPFE, E.; ENGELS, M. Novel Entry Pathway
of Bovine Herpesvirus 1 and 5. Journal of Virology, Washington, v.72, n.12, p.9561-9566,
Dec. 1998.
30
2 OBJETIVOS
31
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar aspectos da evolução clínica e do diagnóstico da meningoencefalite herpética em
bezerros experimentalmente infectados com o herpesvírus bovino 5.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterizar os sintomas e a evolução do quadro de meningoencefalite herpética em
bezerros.
Identificar as alterações hematológicas e liquóricas ao longo da evolução.
Verificar as alterações histológicas em diferentes áreas do encéfalo e no gânglio do nervo
trigêmeo.
Verificar a presença do vírus em diferentes áreas do encéfalo, no gânglio do nervo
trigêmeo e no líquor.
32
3 ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO
33
INFECÇÃO EXPERIMENTAL PELO BoHV-5 EM BEZERROS:
EVOLUÇÃO CLÍNICA E DIAGNÓSTICO
RESUMO
A encefalite causada pelo BoHV-5 acomete bovinos de todas as faixas etárias, principalmente
os jovens, e determina baixa morbidade e alta letalidade. No Brasil, surtos da doença têm sido
relatados de forma crescente. Alguns aspectos sobre essa enfermidade ainda merecem maior
esclarecimento. O objetivo deste trabalho foi avaliar a evolução clínica e aspectos do
diagnóstico da meningoencefalite herpética em bezerros infectados experimentalmente com
BoHV-5. Sete bezerros machos, sadios, da raça HPB com até 60 dias de idade foram
infectados por instilação de 0,5mL de inóculo (107,42 TCID50) em cada cavidade nasal. A
estirpe viral utilizada foi a AA PAR. Durante o período experimental pós-infecção (p.i.)
realizaram-se exames físicos duas vezes ao dia e hemogramas a cada 48 horas. Amostras de
líquor foram colhidas e analisadas a cada 48 horas a partir do início dos sinais de
encefalopatia. Nove subdivisões do encéfalo (córtex anterior, córtex dorso-lateral, córtex
ventro-lateral, córtex posterior, diencéfalo, mesencéfalo, ponte, medula oblonga e cerebelo) e
os gânglios do nervo trigêmeo foram colhidos após a morte e submetidos ao exame
histopatológico. A presença do vírus foi investigada, por meio da reação em cadeia pela
polimerase (PCR) e do isolamento em cultivo celular, nas diferentes porções do encéfalo, no
líquor e nos gânglios do nervo trigêmeo. Quatro bezerros manifestaram sinais de
encefalopatia a partir dos dias 9 (n=2) e 11 p.i. (n=2) e evoluíram para a morte em 12 horas
(n=1), 3 dias (n=2) ou 10 dias (n=1). Os demais bezerros (n=3) não manifestaram qualquer
evidência de encefalopatia e foram submetidos à eutanásia 30 dias p.i.. Os principais sintomas
observados foram: depressão, disfagia, amaurose, manias (atos compulsivos), ataxia,
sialorréia, mioclonias na face e convulsões. As freqüências respiratória e cardíaca não
variaram significativamente ao longo do tempo, e a temperatura corporal exibiu uma
tendência a se elevar entre 9 e 12 dias p.i. As alterações no leucograma foram discretas e
inespecíficas coincidindo com o início do quadro. A elevação de células mononucleares no
líquor foi a alteração mais importante de auxílio ao diagnóstico ainda em vida, apresentandose tanto nos bezerros sintomáticos quanto nos assintomáticos. O genoma viral foi identificado
em várias localizações do encéfalo e nos gânglios dos nervos trigêmeos, assim como, no
líquor de dois bezerros que manifestaram encefalopatia. O exame histopatológico confirmou,
por fim, que todos os bezerros estudados exibiram processo inflamatório encefálico,
indicando que a encefalite causada pelo BoHV-5 pode, eventualmente, ser branda e
assintomática.
Palavras-chave: Bezerro; BoHV-5; encefalite; sinais clínicos; evolução; diagnóstico
34
BoHV-5 EXPERIMENTAL INFECTION IN CALVES: CLINICAL
FEATURE AND DIAGNOSIS
ABSTRACT
The encephalitis caused by BoHV-5 affects cattle of all ages, mainly young, and is
characterized by low morbidity rate and high case fatality rate. Outbreaks of this disease have
increasingly been reported in Brazil. Some aspects of this disease are still unclear. In this
study, cases of herpetic meningoencephalitis were experimentally induced in calves to
investigate clinical pictures and diagnosis. Seven healthy male Holstein calves, up to 60 days
old, were infected with 0,5mL of virus suspension (107,42 TCID50) in each nasal cavity. The
AA PAR viral strain was used in this experiment. During the experimental postinfection (p.i.)
period, physical examinations were conducted twice a day and routine complet blood counts
were performed every 48 hours. Cerebrospinal fluid (CSF) analysis was performed in samples
collected every 48 hours from the onset of neurological signs on. Nine encephalic portions
(anterior cortex, dorsolateral cortex, ventrolateral cortex, posterior cortex, diencephalon,
mesencephalon, pons, medulla oblongata and cerebellum) and the trigeminal ganglia were
obtained at necropsy and submitted to histopathology. Virus detection was investigated in
each encephalic portion, trigeminal ganglia and CSF by means of polimerase chain reaction
(PCR) and virus isolation in cells culture. Four calves developed signs of neurologic disease
beginning at days 9 (n=2) and 11 p.i. (n=2) and died in 12 hours (n=1), 3 days (n=2) and 10
days (n=1). The other three calves remained asymptomatics and were euthanized 30 days p.i..
Depression, dysphagia, amaurosis, mania (compulsive behavior), ataxia, sialorrhea, facial
myoclonia and convulsion were the main signs. No significant changes occurred in the heart
and respiratory rates; but the rectal temperature tended to increase between days 9 and 12
p.i..The changes in leukogram were slight and unspecific coinciding with the onset of clinical
signs. Increases in CSF mononuclear cell counts occurred in all symptomatic and
asymptomatic calves, as the most important diagnostic aid before death. The BoHV-5 genome
was detected in several areas of the encephalon and in the trigeminal ganglia; as well as in the
CSF of two calves showing neurological signs. Histologically, all calves developed
encephalic inflammatory process which confirms that the encephalitis caused by BoHV-5
may, sometimes, be mild and asymptomatic.
Key words: Calf; BoHV-5; encephalitis; clinical signs; diagnosis
35
INTRODUÇÃO
O herpesvírus bovino 5 (BoHV-5) é um vírus DNA de fita dupla, com
envelope glicoprotéico, pertencente à família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae,
(FAUQUET et al., 2004). O BoHV-5 é o agente etiológico da meningoencefalite herpética
dos bovinos, que acomete principalmente animais jovens e apresenta baixa morbidade e alta
letalidade (D'ARCE et al., 2002; SALVADOR et al., 1998). O herpesvírus bovino 1 (BoHV1) também pertence a essa mesma subfamília, e é responsável por várias enfermidades como a
rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), vulvovaginite/balanopostite pustular infecciosa (IPV),
conjuntivite e abortamentos (KAHRS, 1977). A principal diferença entre o BoHV-5 e o
BoHV-1 é a habilidade de cada um causar doença neurológica. Tanto o BoHV-5 quanto o
BoHV-1 são vírus neurotrópicos, mas apenas o BoHV-5 é capaz de se replicar
significativamente no sistema nervoso central (SNC) e causar a doença neurológica
(ASHBAUGH et al., 1997; BELKNAP et al., 1994; STUDDERT, 1989).
Surtos de meningoencefalite pelo BoHV-5 têm sido relatados em vários
países do mundo como Austrália (FRENCH, 1962; GARDINER et al., 1964; HILL et al.,
1984), Estados Unidos (BARENFUS et al., 1963), Canadá (GOUGH; JAMES, 1975),
Argentina (CARRILO et al., 1983) e Escócia (WATT et al., 1981). No Brasil, encefalites
causadas pelo BoHV-5 têm sido confirmadas de forma crescente nos rebanhos, com casos
descritos no Rio Grande do Sul (RIET-CORREA et al., 1989; WEIBLEN et al., 1989), Mato
Grosso, Mato Grosso do Sul, São Paulo (COLODEL et al., 2002; SALVADOR et al., 1998),
Rio de Janeiro, Minas Gerais (GOMES et al., 2002; SOUZA et al., 2002) e Paraná (CLAUS,
2002). No Brasil, casos de meningoencefalite pelo BoHV-5 foram a segunda maior causa de
encefalites em bovinos com etiologia definida, sendo a primeira, a raiva (SANCHES et al.,
2000).
36
Devido à grande similaridade genômica, o BoHV-1 e o BoHV-5 apresentam
forte reação sorológica cruzada, e com isso os testes sorológicos têm valor limitado no
diagnóstico (ROEHE et al., 1997; TEIXEIRA et al., 1998). O isolamento viral a partir de
fragmentos do SNC pode ser utilizado para a confirmação do envolvimento do BoHV-5,
porém alguns autores relatam dificuldade para isolar o vírus de tecidos cerebrais de bezerros e
coelhos experimentalmente infectados, principalmente após a reativação viral induzida com
aplicação de dexametasona (CARON et al., 2002; PEREZ et al., 2002; VOGEL et al., 2003).
Técnicas de biologia molecular como a reação em cadeia pela polimerase (PCR) têm sido
empregadas com sucesso no diagnóstico da infecção pelo BoHV-5, apresentando a vantagem
de não exigir viabilidade viral (ASHBAUGH et al., 1997; CLAUS, 2002). Meyer et al. (2001)
demostraram que o vírus não está distribuído uniformemente por todo o encéfalo, sendo então
importante a escolha apropriada das amostras a serem encaminhadas para o diagnóstico.
Os principais sintomas observados na meningoencefalite herpética são
nistagmo, bruxismo, opistótono, amaurose, sialorréia, andar em círculos, ataxia, tremores
musculares e convulsões. O período de evolução da doença é apontado como variável de 1 a
15 dias, sendo mais comum entre 4 e 7 dias (COLODEL et al., 2002; ELIAS; SCHILD;
RIET-CORREA, 2004; SALVADOR et al., 1998; SANCHES et al., 2000). À necropsia, as
principais alterações macroscópicas relatadas são áreas de malácia, achatamento das
circunvoluções, congestão e hemorragias, porém é freqüente a ausência de lesões (RIETCORREA et al., 1989; SALVADOR et al., 1998; WEIBLEN et al., 1989). As principais
alterações microscópicas caracterizam-se por meningoencefalite não supurativa difusa,
manguitos perivasculares de células mononucleares, satelitose, necrose neuronal, gliose,
meningite, hemorragias e corpúsculos de inclusão intranucleares principalmente em astrócitos
(ELIAS; SCHILD; RIET-CORREA, 2004; MEYER et al., 2001; PEREZ et al., 2002;
SALVADOR et al., 1998; SANCHES et al., 2000).
37
Com o objetivo de estudar a patogenia da doença, alguns trabalhos têm sido
realizados por meio da indução experimental da infecção em coelhos (BELTRÃO et al., 2000;
CARON et al., 2002; MEYER et al., 1996), em cordeiros (SILVA et al., 1998) e em bezerros
(BELKNAP et al., 1994; MEYER et al., 2001; PEREZ et al., 2002; VOGEL et al., 2003).
Alguns pesquisadores sugerem o sistema olfatório como a principal via de acesso ao SNC
(BELTRÃO et al., 2000; PEREZ et al., 2002), enquanto outros sugerem que a invasão do
SNC seja via gânglio do nervo trigêmeo (BAGUST; CLARK, 1972). Entretanto, muitos
fatores relacionados a essa enfermidade ainda necessitam maiores esclarecimentos, tais como
os aspectos clínicos e os relacionados ao diagnóstico. Esse trabalho teve por objetivos
caracterizar os sintomas e a evolução do quadro de meningoencefalite herpética
experimentalmente induzida em bezerros, assim como avaliar aspectos do diagnóstico da
doença.
38
MATERIAL E MÉTODOS
Células e vírus
Todos os procedimentos de multiplicação e quantificação do BoHV-5, bem
como as tentativas de isolamento viral foram realizados em células da linhagem Madin Darby
bovine kidney (MDBK) mantidas em Meio Essencial Mínimo (MEM) (Invitrogen®, EUA)
suplementado com 8% de soro fetal bovino (Gibco, BRL®, EUA), gentamicina (55 µg/mL) e
anfotericina-B (2,5 µg/mL). A estirpe viral utilizada foi a AA PAR isolada do cérebro de um
bovino apresentando sinais de encefalite e caracterizada como BoHV-5 por meio de
imunoperoxidase com anticorpos monoclonais (SOUZA et al., 2002), sendo confirmada como
BoHV-5 pela técnica da PCR (CLAUS, 2002) . O título viral, expresso em doses infecciosas
para cultura de tecidos 50% (DICT50) foi obtido segundo Reed e Muench (1938).
Bezerros
Foram utilizados sete bezerros machos, clinicamente sadios, da raça
Holandesa, entre 20 e 58 dias de idade, procedentes de propriedades rurais de exploração
leiteira da região de Londrina/Pr. Selecionaram-se animais frutos de partos eutócicos e que
haviam mamado colostro espontaneamente e com vigor. Excluíram-se aqueles que
apresentavam anticorpos séricos contra o herpesvírus bovino.
Os bezerros foram mantidos em baias individuais durante todo o período do
experimento e eram alimentados duas vezes ao dia com um substituto de leite comercial
(Bovilac, Nutron), obedecendo-se um volume total de aproximadamente 10% do peso vivo
(PV). Recebiam água e feno de Coast-cross à vontade. Ração peletizada era mantida à
disposição cuidando-se para que a ingestão diária não ultrapassasse 10% PV.
39
Infecção experimental e acompanhamento da evolução
Os bezerros foram inoculados com o BoHV-5 pela via intranasal com
instilação de 0,5mL do inóculo em cada narina, totalizando uma dose viral de 107,42 DICT50.
Após a inoculação, exames físicos com o emprego dos métodos semiológicos clássicos
(DIRKSEN; GRÜNDER; STÖBER, 1993) foram realizados duas vezes ao dia avaliando-se as
funções vitais, a presença e o tipo de secreção nasal e/ou ocular, bem como a presença de
sinais específicos de encefalopatia.
Colheita das amostras
Amostras de sangue total foram colhidas por venopunção da jugular externa
e acondicionadas em frascos contendo anticoagulante EDTA, para posterior realização do
hemograma, ou em frascos sem anticoagulante para a posterior obtenção do soro sangüíneo
após a retração do coágulo e centrifugação. A primeira colheita antecedeu, imediatamente, o
procedimento
de
infecção
experimental.
As
demais
colheitas
foram
realizadas
seqüencialmente, ao longo de todo o período experimental, a cada 48 horas, no caso das
amostras com anticoagulante, e a cada 72 horas no caso das amostras sem anticoagulante.
As colheitas de líquor foram realizadas por meio de punção no espaço
atlanto-occipital (MAYHEW, 1989) utilizando-se o mandril metálico de um cateter
intravenoso com calibre 18G e 5,1cm de comprimento (Safty Cateter, Boin Medica).
Permitiu-se o gotejamento espontâneo de aproximadamente 6mL e aspirou-se, por fim, 0,5mL
com auxílio de uma seringa estéril com capacidade para 1mL. A primeira colheita antecedeu,
imediatamente, o procedimento de infecção experimental. A próxima colheita foi realizada no
dia em que se iniciaram os sinais de distúrbio neurológico, e repetida a cada 48 horas até a
morte. Nos bezerros que permaneceram assintomáticos as colheitas seguintes se fizeram nos
dias 21, 23, 26 e 30 pós-infecção (p.i.).
40
Após a morte natural ou a eutanásia, realizada aos 30 dias p.i. nos bezerros
assintomáticos, procedeu-se imediatamente a necropsia, onde foram registradas as alterações
macroscópicas observadas. Dez porções distintas do sistema nervoso foram colhidas
separadamente: córtex anterior (frontal), córtex posterior (occipital), córtex dorso-lateral
(parietal), córtex ventro-lateral (temporal), diencéfalo, mesencéfalo, ponte, medula oblonga,
cerebelo e gânglios dos nervos trigêmeos. Onde era possível, a colheita foi realizada
bilateralmente. As amostras foram divididas em duas porções, sendo uma fixada em formol
tamponado a 10% para a realização do exame histológico, e outra refrigerada e destinada às
técnicas de isolamento viral e da PCR.
Determinações laboratoriais
As amostras de sangue total, recém-colhidas, foram submetidas aos métodos
tradicionalmente empregados em hematologia (COLES, 1984), determinando-se as seguintes
variáveis: contagem total de hemácias, volume globular, concentração de hemoglobina e
contagem total e diferencial de leucócitos, e calculando-se os índices hematimétricos (volume
globular médio e concentração de hemoglobina globular média). O fibrinogênio plasmático
foi determinado por refratometria.
Com as amostras de líquor, recém-colhidas, avaliaram-se as características
físicas (cor, aspecto e coagulação espontânea), as contagens celulares globais e diferenciais, e
determinaram-se os valores de proteína, glicose, atividade da aspartato aminotransferase
(AST), pH e densidade (COLES, 1984).
As amostras de soro sangüíneo obtidas foram conservadas a -20ºC e
descongeladas unicamente para a realização do exame de soroneutralização, descrito por
Britsch (1978), com a finalidade de verificar a presença de anticorpos contra o herpesvírus
bovino.
41
Para a tentativa de isolamento viral processaram-se, individualmente, as
amostras de líquor frescas aspiradas com a seringa e os diferentes fragmentos do sistema
nervoso obtidos. Cada alíquota de 500µL de líquor foi inoculada diretamente em células
MDBK mantidas por uma hora a 37°C para adsorção e, em seguida, adicionou-se meio de
cultivo (MEM). Os fragmentos do sistema nervoso foram macerados (20% p/v) em MEM,
homogeneizados e centrifugados. O sobrenadante foi recolhido, tratado com antibiótico e
antifúngico e uma alíquota de 500µL inoculada em células MDBK, com adsorção por uma
hora a 370C. O inóculo era então recolhido, as células lavadas com solução salina e
adicionado meio de cultivo para sua manutenção. As células foram incubadas a 370C em
sistema roller com observação diária por no máximo sete dias para a visualização de possíveis
efeitos citopáticos (ECP). As amostras foram consideradas negativas quando não eram
observados ECP após três passagens cegas. As amostras onde eram observados ECP
compatíveis com o BoHV-5 e as consideradas negativas foram submetidas posteriormente à
técnica da PCR para confirmação do resultado.
Para a realização da técnica da PCR foram utilizadas amostras de líquor, que
permaneceram conservadas a -20ºC, e uma alíquota de 500µL do sobrenadante dos macerados
de cada fragmento do SNC. As amostras de líquor foram submetidas à técnica da PCR sem a
etapa de extração do DNA. As demais amostras foram submetidas a uma associação das
técnicas do fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (THEIL et al., 1981) e da sílica/tiocianato de
guanidina (BOOM et al., 1990) com modificações descritas por Alfieri et al. (2004) para a
extração do DNA. As amostras extraídas e as de líquor foram submetidas à técnica da PCR de
acordo com o descrito por Claus (2002), empregando-se oligonucleotídeos iniciadores
desenhados com base na seqüência do gene que codifica a glicoproteína C: B5, específico
para o BoHV-5 (5’CGG ACG AGA AGC CCT TGG 3’-NT 322-339); e Bcon, primer
consenso [5’AGT GCA CGT ACA GCG GCT CG 3’-nt 461-480 (BoHV-5)].
42
Para o exame histopatológico as amostras do SNC fixadas em formol
tamponado a 10%, submetidas à desidratação em soluções crescentes de álcoois, diafanização
em xilol, inclusão em parafina, cortadas com 5 µm de espessura e coradas pelo método de
hematoxilina-eosina (HE). As alterações encontradas no SNC foram classificadas em
discretas, moderadas e acentuadas de acordo com as características de cada lesão. A presença
de manguitos perivasculares foi considerada discreta quando apresentava até duas camadas de
células inflamatórias, moderada quando apresentava até quatro camadas, e acentuada quando
tinha cinco ou mais camadas de células.
Métodos estatísticos
O comportamento das variáveis quantitativas ao longo do tempo foi avaliado
por meio da análise de variâncias de medidas repetidas (SAMPAIO, 1998). Esse método foi
aplicado distintamente considerando-se, em separado, os resultados dos bezerros sintomáticos
e dos assintomáticos, de tal forma que não se estabeleceram comparações entre os mesmos.
Quando a estatística F resultou significativa, empregou-se o teste t de Bonferroni para
comparações entre as médias. Admitiu-se uma probabilidade de erro de 5%. Apresentaram-se
medidas de tendência central e de dispersão para a descrição dos resultados.
43
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os principais aspectos clínicos e da evolução dos quadros induzidos estão
apresentados na tabela 1. Quatro dos sete bezerros infectados manifestaram sinais de
encefalopatia, os quais se iniciaram nos dias 9 ou 11 p.i. e, em sua maioria, evoluíram para a
morte natural. Períodos de incubação semelhantes a esses foram também observados, sob
condições de infecção induzida experimentalmente, por Belknap et al. (1994), Meyer et al.
(2001) e Perez et al. (2002) em bezerros, e por Beltrão et al. (2000) e Caron et al. (2002) em
coelhos.
A duração do quadro clínico variou consideravelmente entre os animais
(tabela 1). O bezerro 7 apresentou quadro superagudo, levando cerca de 12 horas desde o
início dos sinais até a morte, após uma crise convulsiva grave. Os bezerros 6 e 11, por sua
vez, exibiram quadros agudos apresentando evolução de três dias com agravamento
progressivo. No caso do bezerro 1 o quadro teve curso estacionário e duração mais
prolongada, desenvolvendo desidratação como conseqüência da disfagia e da anorexia. Em
parte, a sua sobrevivência se prolongou por ter sido alimentado artificialmente (administração
de leite e de água por meio de sondagem esofagiana). Realizou-se a eutanásia devido a
complicações do seu estado geral no 10º dia de evolução. Observações anteriores em bezerros
experimentalmente infectados (BELKNAP et al., 1994; MEYER et al., 2001; PEREZ et al.,
2002) ou em casos naturais da doença (LISBÔA et al., 2003; SALVADOR et al., 1998)
apontaram igualmente a possibilidade de que se manifestem tais extremos de evolução, isto é,
quadros superagudos ou de duração mais prolongada.
Os primeiros sintomas consistiram em depressão moderada a acentuada,
anorexia, amaurose e disfagia. Os sinais que se seguiram foram hipotonia de língua, sialorréia,
bruxismo, ataxia, hipermetria, manias (atos compulsivos), mioclonias na face, convulsões,
44
paresia e decúbito (tabela 1), caracterizando sinais de excitação e de deficiência
(RADOSTITS; BLOOD; GAY, 1994). Os distúrbios neurológicos manifestados, assim como
a intensidade dos mesmos, variaram entre os animais e ao longo da evolução. Sinais clínicos
semelhantes também foram verificados em outros experimentos onde se induziu a infecção
experimental em bezerros (BELKNAP et al.,1994; MEYER et al., 2001; VOGEL et al.,
2003), em cordeiros (SILVA et al., 1998) e em coelhos (MEYER et al., 1996), e também em
relatos de infecções naturais pelo BoHV-5 (COLODEL et al., 2002; GOMES et al., 2002;
RIET-CORREA et al., 1989; SALVADOR et al., 1998).
Tabela 1 Aspectos clínicos individuais da evolução da meningoencefalite herpética induzida
experimentalmente em bezerros. Londrina/Paraná, 2005.
Idade (dias)
Bez 1
Bez 3
Bez 6
Bez 7
Bez 9
Bez 11
Bez 12
58
45
22
22
23
20
45
Quadro de encefalopatia
Presença de sinais
Início do quadro (dias p.i.)
Duração do quadro
Morte
+
11
10d
-
+
11
3d
+
9
12h
-
+
9
3d
-
eutanásia
eutanásia
natural
natural
eutanásia
natural
eutanásia
Depressão
Manias (atos compulsivos)
Amaurose
Disfagia
Hipotonia da língua
Bruxismo
Ataxia
Hipermetria
Sialorréia
Mioclonias na face
Convulsão tônica
Convulsão clônica
Paresia e decúbito
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
11 a 20
7; 11 a
20
+
7; 9 e 14
11 a 14
3 a 13
9
-
10 a 12
7 a 11
5 a 11
-
6e7
-
4a8
-
10 a 27
-
5 a 11
-
4; 13 e
16
16 e 17
9 a 13
-
Outras manifestações
Anorexia (dias p.i.)
Secreção nasal serosa
(dias p.i.)
Secreção ocular (dias p.i.)
Tosse esporádica (dias p.i.)
Desidratação
(p.i.) pós-infecção; (+) presente; (-) ausente.
45
Exceto o bezerro 7, todos os demais apresentaram secreção nasal serosa em
algum momento da evolução (tabela 1), o que demonstra coerência com as citações de
Belknap et al. (1994), Perez et al. (2002) e Vogel et al. (2003). Em alguns animais a secreção
se manteve por vários dias consecutivos, enquanto que em outros foi intermitente. O volume
eliminado era, de forma geral, pequeno. Muito embora alguns bezerros tenham exibido tosse
seca e esporádica, essa não coincidiu, na maioria das vezes, com a eliminação de secreção
nasal. De fato, nenhum bezerro estudado chegou a desenvolver qualquer tipo de
comprometimento das vias aéreas posteriores. Quanto à secreção ocular, somente os bezerros
11 e 12 apresentaram-na em pequeno volume, contrariando as evidências de Perez et al.
(2002).
A infecção experimental com o BoHV-5 não foi capaz de induzir quadro de
encefalopatia em todos os bezerros estudados. Ao longo do período de observação de 30 dias
p.i., três animais não exibiram qualquer manifestação de distúrbio neurológico e foram
considerados assintomáticos. Esse resultado não é surpreendente e reforça as evidências
citadas por outros pesquisadores de que a infecção com esse vírus pode se manter na forma
latente e inaparente (ASHBAUGH et al., 1997; BELKNAP et al., 1994; BELTRÃO et al.,
2000; CARON et al., 2002; MEYER et al., 2001). Dentre os estudos que infectaram
experimentalmente um número maior de bezerros, Meyer et al. (2001) verificaram menor
ocorrência da condição de animais assintomáticos (1/8 bezerros). Vogel et al. (2003), por
outro lado, não conseguiram provocar, de início, doença aparente em nenhum dos 12 bezerros
estudados; e poucos (3/8 casos) desenvolveram sinais de encefalopatia após a reativação da
infecção latente induzida pela administração de dexametasona. A permanência “silenciosa”
dos herpesvírus no organismo do hospedeiro é uma condição bem conhecida (ROCK, 1993).
A diversidade dos resultados experimentais reflete, possivelmente, as diferenças dos
potenciais de patogenicidade entre as estirpes de BoHV-5 utilizadas nos estudos.
46
As funções vitais não sofreram variações significativas ao longo da evolução
tanto nos bezerros que desenvolveram encefalopatia quanto nos assintomáticos (tabela 2).
Apenas a temperatura corporal apresentou uma tendência a assumir valores mais elevados nos
dias 8 a 12 p.i. (gráfico 1), o que reforça os achados de Perez et al. (2002). Vogel et al. (2003)
também não observaram elevação significativa da temperatura. Apenas Meyer et al. (2001)
relataram um discreto aumento da temperatura nos dias 4 a 10 p.i., o que não caracterizou,
contudo, hipertermia, pois os valores médios não ultrapassaram 39,5ºC. Nesse mesmo
trabalho, os bezerros infectados com o BoHV-1 exibiram, ao contrário, hipertermia marcante
nos primeiros dias p.i.. A análise conjunta dos resultados científicos sugere que a infecção
com o BoHV-5 não é definitivamente acompanhada por síndrome febre.
47
Tabela 2 Valores das funções vitais (x ± s) aferidas diariamente à tarde em bezerros que
desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção
experimental com o BoHV-5.
Dias
PI
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Temperatura
Retal a
(°C)
Freqüência
Cardíaca b
(bpm)
Freqüência
Respiratória b
(mpm)
sintomáticos
assintomáticos
sintomáticos
assintomáticos
sintomáticos
assintomáticos
39,9 ± 0,7
39,6 ± 0,6
39,8 ± 0,7
39,9 ± 0,5
40,0 ± 0,6
39,8 ± 0,3
39,9 ± 0,3
39,9 ± 0,7
40,1 ± 0,8
39,5 ± 0,3
39,6 ± 0,2
40,4 ± 0,6
40,4 ± 0,5
39,8 ± 0,0
39,5*
39,2*
39,3*
39,5*
38,9*
38,5*
39,5 ± 0,4
39,2 ± 0,5
39,2 ± 0,8
39,0 ± 0,6
39,1 ± 0,7
39,4 ± 0,4
39,5 ± 0,3
39,6 ± 0,4
39,7 ± 0,4
40,1 ± 0,7
40,2 ± 0,9
39,9 ± 0,9
39,7 ± 1,3
39,6 ± 0,9
39,3 ± 0,9
39,2 ± 0,8
39,5 ± 0,9
39,3 ± 0,3
39,6 ± 0,4
38,9 ± 0,8
39,4 ± 0,5
39,4 ± 0,5
39,2 ± 0,2
39,3 ± 0,8
39,2 ± 1,2
39,4 ± 0,9
39,3 ± 0,6
39,1 ± 0,4
39,2 ± 0,2
38,9 ± 0,3
38,9 ± 0,3
75,5 ± 11,7
79,0 ± 15,2
79,5 ± 15,2
78,5 ± 13,7
88,0 ± 8,4
86,0 ± 16,3
81,5 ± 13,3
84,0 ± 13,4
80,0 ± 14,1
81,3 ± 22,0
82,0 ± 16,4
80,0 ± 17,1
99,0 ± 24,0
104,0 ± 48,1
96*
140*
128*
104*
82*
122*
86,0 ± 7,2
77,3 ± 20,5
87,3 ± 7,6
70,7 ± 12,2
90,0 ± 12,5
80,0 ± 12,0
84,7 ± 16,3
87,3 ± 15,3
92,0 ± 24,3
76,0 ± 6,0
83,3 ± 12,1
86,0 ± 2,0
76,7 ± 13,3
82,0 ± 12,2
75,3 ± 3,1
73,3 ± 14,5
78,3 ± 11,9
85,3 ± 4,2
81,3 ± 13,3
82,7 ± 6,1
98,0 ± 7,2
89,3 ± 2,3
77,3 ± 6,1
79,3 ± 14,2
84,7 ± 4,6
87,3 ± 11,4
89,3 ± 9,2
86,7 ± 12,1
82,3 ± 9,1
85,3 ± 4,6
90,0 ± 0,0
31,0 ± 3,8
25,0 ± 4,8
30,0 ± 6,3
31,5 ± 7,2
30,5 ± 5,7
30,0 ± 7,1
32,5 ± 8,5
29,0 ± 12,3
32,0 ± 14,3
33,3 ± 4,2
31,3 ± 12,2
33,0 ± 16,3
24,0 ± 5,7
24,5 ± 3,5
20*
16*
18*
18*
16*
17*
32,7 ± 6,4
26,7 ± 5,0
28,7 ± 5,0
25,3 ± 6,1
30,0 ± 2,0
30,0 ± 6,0
33,0 ± 8,2
34,7 ± 2,3
36,0 ± 5,3
32,0 ± 4,0
39,3 ± 11,7
47,3 ± 18,1
37,3 ± 2,3
41,0 ± 12,5
31,3 ± 5,0
34,3 ± 9,6
36,0 ± 8,0
32,0 ± 6,9
34,7 ± 22,0
29,3 ± 5,0
43,3 ± 15,3
41,0 ± 20,1
40,0 ± 14,0
29,3 ± 8,3
33,3 ± 14,7
31,7 ± 5,7
38,7 ± 9,0
32,0 ± 4,0
35,7 ± 8,1
34,0 ± 5,3
34,0 ± 5,7
* valores obtidos em apenas um bezerro
a
0,05<p<0,10
b
p>0,05
48
ºC
40,5
40,0
39,5
* * ** *
39,0
38,5
38,0
0
2
4
6
8
10
12
sintomáticos
14
16
18
20
assintomáticos
22
24
26
28
30
dias p.i.
Gráfico 1 Variação da temperatura retal aferida diariamente à tarde em bezerros que desenvolveram
sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental
com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um bezerro sintomático.
Com relação à avaliação hematológica, como seria de se esperar nenhuma
variação significativa foi observada para as variáveis do eritrograma (tabela 3). Mesmo nos
bezerros que manifestaram distúrbio neurológico, a disfagia, presente em maior ou menor
intensidade em todos os casos, não chegou a ser acompanhada por desidratação devido à
rapidez da evolução até a morte em três dos quatro animais. Os resultados do leucograma, por
outro lado, caracterizam, nos bezerros com encefalopatia, uma tendência à elevação dos
leucócitos acompanhada por elevação significativa dos neutrófilos segmentados circulantes
(tabela 4 e gráficos 2 e 3). Tais alterações se estabeleceram a partir do 10º dia p.i. coincidindo
com o início da manifestação dos sintomas e não chegam a caracterizar uma condição de
leucocitose. Os neutrófilos atingiram valores médios próximos aos dos linfócitos circulantes,
o que pode ser interpretado como provável conseqüência de um adrenocorticismo provocado
pelo estresse da doença (COLES, 1984; JAIN, 1986). Nos bezerros assintomáticos não se
observaram tais variações no leucograma.
Quanto à concentração do fibrinogênio plasmático, todos os bezerros que
manifestaram sinais de encefalopatia exibiram hiperfibrinogenemia, muito embora não se
49
tenha comprovado diferença estatística significativa (tabela 4). Os valores médios exibidos na
tabela 4 e no gráfico 4 não refletem o comportamento de elevação dessa proteína.
Considerando-se os valores individuais, no entanto, fica evidente que, durante a evolução da
doença, concentrações tão elevadas quanto 900 a 1200mg/dL foram alcançadas. O
fibrinogênio plasmático é considerado uma proteína de fase aguda que se eleva precocemente
durante a evolução de processos inflamatórios em bovinos, podendo anteceder até mesmo as
alterações leucocitárias (JAIN, 1986). É coerente, portanto, que o mesmo comportamento
dessa variável não tenha sido observado nos bezerros assintomáticos.
50
Tabela 3 Valores do eritrograma (x ± s) observados ao longo do tempo em bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou
permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5.
Dia
p.i.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Hemácias a
(x106/mm3)
Hemoglobina a
(mg/dL)
Volume Globular a
(%)
VGM a
(fL)
CHGM a
(%)
sintomáticos
assintomáticos
sintomáticos
assintomáticos
sintomáticos
assintomáticos
sintomáticos
assintomáticos
sintomáticos
assintomáticos
7,43±1,45
7,23±1,44
7,18±1,57
7,07±1,65
6,94±1,20
7,17±1,59
6,56±1,37
5,59*
6,99*
6,99*
7,56*
5,66±1,11
5,88±1,18
5,66±1,32
5,32±1,75
5,08±1,67
5,16±1,53
5,30±1,42
5,44±1,27
5,58±1,33
5,72±1,09
6,02±1,19
6,01±1,05
5,87±0,42
5,97±0,62
6,85±1,54
6,61±1,63
11,6±2,26
11,8±2,03
11,8±1,62
11,2±2,13
10,8±1,83
11,5±2,20
10,3±0,14
12,0*
13,0*
12,4*
12,7*
8,9±1,94
9,7±1,98
9,0±2,12
8,7±2,76
8,2±2,90
8,8±2,61
8,5±2,00
8,8±1,62
8,9±1,71
9,2±0,91
9,2±1,16
9,3±1,45
9,7±0,15
9,6±0,26
9,2±1,30
9,0±0,23
35,7±6,39
34,7±6,39
34,5±7,00
34,0±7,39
33,2±5,37
34,6±7,02
32,0±5,65
28*
35*
35*
36*
26,3±4,51
27,6±5,03
27,3±5,86
25,6±8,08
24,6±8,02
25,0±7,21
25,6±6,66
26,3±5,86
27,0±6,08
27,6±4,72
28,6±5,68
28,6±5,03
28,0±2,00
28,3±2,89
29,0±1,73
28,3±2,31
48,2±1,18
48,2±1,18
48,2±1,19
48,2±1,23
48,0±1,45
48,5±1,29
48,9±1,61
50,1*
50,1*
50,1*
47,6*
46,8±3,69
47,3±2,88
48,4±1,44
48,4±1,35
48,6±1,22
48,5±1,42
48,5±1,28
48,5±1,32
48,5±1,29
48,5±1,30
47,6±0,04
47,7±0,13
47,7±0,05
47,5±0,22
43,4±7,36
43,9±6,41
32,5±1,19
34,0±1,81
34,6±2,78
33,3±4,18
32,7±5,06
33,3±3,86
32,6±5,33
42,8*
37,1*
35,4*
35,3*
33,9±1,67
35,3±4,09
32,9±3,07
33,8±2,38
32,8±2,04
35,4±1,86
33,1±1,67
33,9±3,84
33,2±4,05
33,7±3,71
32,7±4,47
32,8±3,04
34,8±1,97
34,1±3,11
31,8±2,73
32,0±2,97
* valores obtidos em apenas um bezerro
a
p>0,05
51
Tabela 4 Valores do leucograma e do fibrinogênio plasmático (x ± s) observados ao longo do tempo em bezerros que desenvolveram sinais de
encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5.
Dia
p.i.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Leucócitos b
(x103/mm3)
Linfócitos a
(x103/mm3)
Segmentados c
(x103/mm3)
Monócitos a
(x103/mm3)
Fibrinogênio a
(mg/dL)
sintomáticos
assintomáticos
sintomáticos
assintomáticos
sintomáticos
assintomáticos
sintomáticos
assintomáticos
sintomáticos
assintomáticos
9,70±0,56
6,98±1,01
8,60±2,06
8,43±1,97
9,35±3,32
12,9±7,99
12,2±3,89
12,40*
9,80*
12,65*
25,20*
8,91±1,93
7,90±3,39
8,43±1,72
9,60±0,43
7,82±2,89
6,08±0,84
7,20±1,17
6,08±1,20
6,41±1,33
7,25±1,06
7,75±4,44
6,91±0,63
8,71±0,99
9,33±1,80
6,63±0,45
6,71±1,68
6,14±1,73
4,82±1,63
5,93±1,91
6,21±1,88
6,17±1,34
5,61±1,02
6,33±2,40
8,93*
6,37*
7,34*
6,30*
7,16±1,56
6,67±2,91
5,83±1,48
7,99±0,47
6,36±1,92
4,18±0,56
5,42±1,33
4,67±0,95
5,22±1,29
5,61±1,33
5,33±0,93
4,40±0,75
5,53±1,25
4,94±0,36
4,71±1,22
5,09±1,40
3,37±1,17
2,03±1,47
2,37±0,74
2,07±1,36
2,77±2,27
5,96±5,48
5,27±5,44
3,47*
3,43*
5,31*
17,89*
1,61±0,46
1,07±0,41
2,48±0,20
1,36±0,78
1,33±0,99
1,83±0,82
1,66±0,55
1,24±0,49
1,12±0,37
1,46±0,38
2,23±0,76
2,22±1,20
3,10±2,29
3,74±1,64
1,85±0,93
2,30±1,13
0,12±0,11
0,02±0,04
0,14±0,20
0,10±0,19
0,30±,056
0,80±1,22
0,59±0,84
0*
0*
0*
0,75*
0,12±0,10
0,07±0,06
0,08±0,09
0,09±0,16
0,10±0,09
0,02±0,04
0,06±0,11
0,14±0,14
0,02±0,04
0,11±0,10
0,10±0,09
0,24±0,16
0,05±0,09
0,41±0,41
0,02±0,04
0,12±0,05
525±250
650±191
450±191
550±100
450±191
675±359
600±283
600*
1000*
1000*
1200*
333±115
333±115
433±153
433±153
600±200
600±200
600±200
466±115
733±115
633±153
666±305
433±252
500±100
433±208
466±115
500±360
* valores obtidos em apenas um bezerro
a
p>0,05
b
0,05<p<0,10 (somente para os bezerros sintomáticos)
c
p<0,05 (somente para os bezerros sintomáticos)
52
/mm 3
30000
*
25000
20000
15000
*
10000
*
*
5000
0
0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
dias p.i.
sintomáticos
assintomáticos
Gráfico 2 Variação do número total de leucócitos presentes no sangue de bezerros que desenvolveram
sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o
BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um bezerro.
/mm 3
20000
*
15000
10000
5000
*
*
*
0
0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
sintomáticos
assintomáticos
dias p.i.
Gráfico 3 Variação do número de segmentados presentes no sangue de bezerros que desenvolveram sinais
de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o
BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um bezerro.
53
mg/dL
1400
*
1200
*
1000
800
*
*
600
400
200
0
0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
sintomáticos
assintomáticos
dias p.i.
Gráfico 4 Variação da concentração do fibrinogênio plasmático em bezerros que desenvolveram sinais de
encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5.
(*) valores obtidos em apenas um bezerro.
Distintamente das alterações discretas e inespecíficas observadas no leucograma,
as alterações liquóricas foram consistentes e marcantes, particularmente no que se refere à sua
celularidade (tabela 5), comprovando, ainda em vida, a instalação do processo inflamatório
encefálico. Nos bezerros com sinais de encefalopatia o quadro foi acompanhado, desde o início
de sua evolução, por uma acentuada pleiocitose com predomínio de células mononucleares
(gráfico 5) o que é esperado e característico em processos de encefalites virais (MAYHEW,
1989). Com exceção de um caso (bezerro 9), os bezerros que permaneceram assintomáticos
exibiram as mesmas alterações celulares observadas naqueles com encefalopatia, indicando que
mesmo sem manifestarem distúrbios neurológicos esses animais também desenvolveram
encefalite. É interessante observar que houve uma redução do número de células até o término do
período de acompanhamento experimental.
A hiperproteinorraquia, que pode naturalmente acompanhar a pleiocitose, não
foi evidenciada nos bezerros estudados, com exceção do bezerro 1 ao final da evolução de seu
quadro (tabela 5). Deve-se destacar esse bezerro como distinto em função do curso prolongado de
54
sua doença. Quanto à atividade da AST no líquor verificou-se apenas uma tendência à sua
elevação e unicamente nos bezerros sintomáticos. Assim como a concentração de proteína,
destacaram-se valores particularmente altos no bezerro 1 ao final da evolução. A interpretação
conjunta dos resultados permite afirmar que dentre as variáveis liquóricas as alterações no padrão
celular possuem maior importância na caracterização da encefalite que se estabelece na doença
estudada, pois se apresenta desde o início do quadro e independe do tempo de duração do mesmo.
O líquor se apresentou incolor e límpido na maioria das colheitas realizadas,
estando, em alguns casos, levemente xantocrômico e turvo. Os valores de pH e densidade
encontravam-se dentro dos parâmetros normais, variando de 7 a 8 e de 1005 a 1010,
respectivamente (MAYHEW, 1996; SCOTT, 2004).
55
Tabela 5 Valores liquóricos (x ± s) observados ao longo do tempo em bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram
assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5.
Dia
p.i.
0
9
11
13
15
19
21
23
26
30
Células
nucleadas c
(/mm3)
Leucócitos
mononucleares c
(/mm3)
Neutrófilos a
(/mm3)
Proteínas a
(mg/dL)
AST b
(UI/L)
Glicose a
(mg/dL)
sintomáticos
assintomáticos
sintomáticos
assintomáticos
sintomáticos
assintomáticos
sintomáticos
assintomáticos
sintomáticos
assintomáticos
sintomáticos
assintomáticos
5,7±2,3
81*
242±199,3
200±13,4
187*
178*
9,3±7,0
4,0±3,4
79*
234±194,4
193±9,2
181*
167*
7,7±7,5
0,70±0,5
2*
8,3±5,5
7,0±4,2
6*
11*
1,0±1,0
17,5±13,4
12,1*
34,5±12,4
32,2±32,5
60,4*
108,7*
14,2±4,6
12,7±10,0
15,6*
20,8±14,2
76,6±88,6
132,2*
172,3*
13,9±9,2
35,4±15,6
45,5*
38,2±29,9
42,8±2,5
69,7*
80,0*
52,3±2,4
46,0±40,6
168±72,8
67,0±59,4
20,3±14,2
44,0±40,6
159±60,8
66,0±59,4
18,3±15,9
* valores obtidos em apenas um bezerro
a
p>0,05
b
0,05<p<0,10 (somente para os bezerros sintomáticos)
c
p<0,05
1,3±1,1
9,5±12,0
1,0±0,0
0,7±0,5
36,3±24,5
49,6±6,8
32,6±27,7
22,4±6,7
26,6±23,6
22,6±17,2
30,4±23,3
23,7±14,8
55,8±14,6
76,9±4,4
43,8±0,8
41,9±0,7
56
/mm 3
250
200
*
*
150
100
*
50
0
0
9
11
sintomáticos
13
15
19
21
assintomáticos
23
26
30
dias p.i.
Gráfico 5 Variação dos leucócitos mononucleares presentes no líquor de bezerros que desenvolveram
sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental
com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um bezerro.
A soroconversão foi observada em todos os bezerros estudados, entretanto
houve variação individual considerável na magnitude do título alcançado assim como no
tempo necessário para atingi-lo. Os títulos mais elevados, da ordem de 32 e 64, foram
alcançados pelos bezerros assintomáticos aos 21 dias p.i., e isso é coerente com os resultados
de Vogel et al. (2003). Perez et al. (2002), pelo contrário, detectaram títulos de anticorpos
séricos neutralizantes muito mais elevados em bezerros com infecção latente e mais
precocemente, já aos 14 dias p.i.. Porém, distintamente da condição do presente experimento,
esses autores induziram a infecção em bezerros muito mais velhos (12 meses de idade), o que
talvez possa explicar a diferença.
Na tabela 6 são apresentados os resultados da presença do DNA viral obtidos
por meio da técnica da PCR e também os resultados das tentativas de isolamento viral das
diferentes porções do sistema nervoso e do líquor. Condizendo com evidências anteriores
(LISBÔA et al., 2003), a presença do DNA viral se confirmou no líquor de dois bezerros que
desenvolveram o quadro de disfunções encefálicas, em ambos os casos em amostras colhidas
em momento final da evolução da doença. Esse resultado reforça a hipótese de que amostras
57
de líquor poderiam ser utilizadas para a confirmação, ainda em vida, do diagnóstico etiológico
dessa enfermidade.
O DNA viral foi confirmado, com maior ou menor distribuição, no sistema
nervoso de todos os animais estudados. Mesmo nos três bezerros assintomáticos o DNA se
distribuiu por 3 a 5 localizações diferentes do sistema nervoso (tabela 6). No caso dos
bezerros que manifestaram distúrbios neurológicos o DNA viral foi detectado em maior
número de localizações do sistema nervoso, ou seja com distribuição mais ampla. O cerebelo
e a medula oblonga foram os locais onde menos freqüentemente se confirmou a presença do
vírus. O telencéfalo, o diencéfalo e a ponte foram localizações freqüentes para o vírus em
todos os bezerros estudados. Esses resultados são, de forma geral, compatíveis com os de
Belknap et al. (1994) e de Meyer et al. (2001) reafirmando não haver uma localização
predileta nos casos de encefalopatia evidente. Somam-se às evidências de Vogel et al. (2003)
reforçando o conceito de que o BoHV-5 se distribui pelo encéfalo do hospedeiro mesmo na
condição de infecção latente. A presença do DNA viral nos gânglios dos nervos trigêmeos de
cinco bezerros é coerente com a afirmação de que este é um sítio comum de localização desse
vírus (ASHBAUGH et al., 1997).
As tentativas para isolar o vírus foram bem sucedidas unicamente em dois
bezerros que manifestaram encefalopatia (tabela 6), e coerentemente em porções nas quais o
DNA viral estava presente. No caso dos outros dois bezerros sintomáticos a presença do
BoHV-5 como causador dos efeitos citopáticos não foi confirmada posteriormente. O
isolamento não foi possível em nenhuma das amostras dos bezerros assintomáticos. As
dificuldades para isolamento do BoHV-5 são bem documentadas tanto em situação
experimental (CARON et al., 2002; PEREZ et al., 2002; VOGEL et al., 2003), quanto em
casos de ocorrência natural da doença (CLAUS, 2002; COLODEL et al., 2002; SALVADOR
et al. 1998). Quanto aos bezerros assintomáticos, Vogel et al. (2003) obtiveram resultados
58
similares, devendo-se atribuir a impossibilidade de isolamento ao fato de o vírus se encontrar
na sua forma latente e não apresentar, portanto, o seu potencial de infectividade.
O bezerro 6 foi o único que apresentou alterações macroscópicas encefálicas
(congestão e área de malácia no córtex anterior). Nos demais animais não se detectou lesão
alguma no sistema nervoso ou em outros sistemas orgânicos. Outros autores também
verificaram congestão e áreas de malácia em animais experimentalmente infectados
(ASHBAUGH et al., 1997; PEREZ et al., 2002) e em casos naturais da doença (COLODEL et
al., 2002; ELIAS; SCHILD; RIET-CORREA, 2004). A ausência de lesões significativas à
necropsia foi relatada por outros pesquisadores (MEYER et al., 2001; SALVADOR et al.,
1998).
Microscopicamente, todos os bezerros apresentaram algum tipo de alteração
no sistema nervoso, porém com localizações e intensidade diferentes. Em geral, as alterações
encontradas estavam distribuídas por todo o encéfalo dos bezerros, e também no gânglio do
nervo trigêmeo. Os bezerros 1, 6, 7 e 12 apresentaram acentuadas alterações em várias
porções do sistema nervoso, enquanto os bezerros 3, 9 e 11 apresentaram alterações mais
discretas (tabela 7). O bezerro 11, apesar de manifestar sinais de encefalopatia, exibiu
alterações histológicas discretas. O bezerro 12, apesar de assintomático, apresentou alterações
moderadas em várias porções do sistema nervoso. As alterações observadas confirmaram o
processo estabelecido de meningoencefalite caracterizando-se por: manguitos perivasculares
com infiltrado de células mononucleares, necrose laminar cortical, malácia, gliose e meningite
(figura 1), compatíveis com outras citações (COLODEL et al., 2002; ELIAS; SCHILD; RIETCORREA, 2004; RIET-CORREA et al., 1989; SILVA et al., 1998). Corpúsculos de inclusão
intranucleares eosinofílicos, localizados principalmente em astrócitos, são freqüentemente
evidenciados em casos naturais da doença (COLODEL et al., 2002; ELIAS; SCHILD; RIETCORREA, 2004; RIET-CORREA et al., 1989), porém não foram observados nos bezerros
59
estudados, o que condiz com outras investigações experimentais (BELKNAP et al., 1994;
PEREZ et al., 2002).
As evidências histopatológicas confirmam que mesmo os bezerros que se
mantiveram assintomáticos desenvolveram processo de inflamação no sistema nervoso, o que
explica a pleiocitose observada previamente no líquor desses animais. É possível que a
magnitude da meningoencefalite instalada, somada à localização e distribuição das lesões,
tenha sido insuficiente para determinar a manifestação da doença. Pode-se admitir que o
BoHV-5 tenha determinado infecção, distribuindo-se por localizações diversas no encéfalo, e
provocado, contudo, um processo inflamatório menos grave e não progressivo que cursou
assintomático. A forma latente da infecção deve ter se estabelecido em seguida a essa fase
inicial. Essas hipóteses encontram sustentação nos resultados publicados por Vogel et al.
(2003), os quais afirmaram que a forma de apresentação da doença deve-se às propriedades de
neuroinvasividade e de neurovirulência particulares da estirpe de BoHV-5 envolvida. Estirpes
virais, como a utilizada por esses autores, podem ser altamente neuroinvasivas e pouco
neurovirulentas e provocar, por conseqüência, um número elevado de infecções que cursarão
de forma inaparente. Se esse é um conceito correto, parece lógico suspeitar-se que os índices
de morbidade dessa doença possam ser, na realidade, mais altos do que aparentam. Os índices
de letalidade, por outro lado, podem não ser realmente tão elevados. Essas são hipóteses que
merecem uma investigação mais detalhada.
Em suma, pode-se depreender dos resultados obtidos que a infecção com o
BoHV-5 causa encefalite em bezerros, não obrigatoriamente acompanhada pela manifestação
de distúrbios neurológicos. Os sinais de encefalopatia e o tempo de evolução do quadro são
variáveis e não possuem um padrão característico. A elevação de células mononucleares no
líquor é a alteração mais importante de auxílio ao diagnóstico ainda em vida. As alterações do
leucograma são discretas e inespecíficas. Não são esperadas lesões macroscópicas e as
60
alterações histológicas com infiltrado de células mononucleares e áreas de malácia são
características, variam em gravidade e não se distribuem uniformemente pelo encéfalo. O
vírus pode se encontrar, com maior ou menor distribuição, em locais diversos do encéfalo, no
gânglio do nervo trigêmeo e, eventualmente, no líquor.
A
C
B
D
Figura 1 Cortes histológicos de sistema nervoso central de bezerros acometidos por
meningoencefalite causada pelo BoHV-5, corados por HE. A. Área de malácia no córtex frontal (10x).
B. Acentuado infiltrado inflamatório perivascular de células mononucleares (seta) (20x). C. Gliose
focal (seta) (20x). D. Acentuado infiltrado inflamatório mononuclear em leptomeninges (seta) (20x).
61
Tabela 6 Resultados da presença de DNA viral detectado pela PCR e do isolamento viral em porções do sistema nervoso e em amostras de líquor
dos bezerros sintomáticos e assintomáticos inoculados com BoHV-5.
___Bez 1__
sintomático
__Bez 3__ __Bez 6__
assintomático
sintomático
CC
DNA
Viral
CC
DNA
Viral
+
ECP*
-
-
Córtex posterior
+
ECP*
+
Córtex dorso-lateral
+
ECP*
Córtex ventro-lateral
+
Diencéfalo
__Bez 7__
Nº de bezerros com
DNA viral
positivo/nº
de
assintomático
bezerros
DNA
CC
Viral
__Bez 12_
assintomático
sintomático
CC
DNA
Viral
CC
DNA
Viral
CC
+
ECP
-
-
+
-
+
-
5/7
-
+
-
-
-
+
ECP
-
-
5/7
+
-
+
ECP*
+
-
+
-
+
-
7/7
-
+
ECP
+
ECP*
-
-
+
-
+
-
5/7
-
-
+
ECP
+
ECP
+
-
-
-
+
-
5/7
ECP*
-
-
-
-
+
-
-
-
+
-
+
-
4/7
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
-
-
6/7
Medula oblonga
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
2/7
Cerebelo
-
-
+
-
-
-
+
-
-
-
+
-
-
-
3/7
Gânglio do trigêmeo
+
-
+
-
+
-
+
-
-
-
+
-
-
-
5/7
LÍQUOR
+
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
2/7
DNA
Viral
Córtex anterior
sintomático
__Bez 9__ __Bez 11_
CC
DNA
Viral
+
-
-
+
+
-
ECP*
-
+
-
Mesencéfalo
+
Ponte
PORÇÃO DO SNC
DNA viral – testado através da técnica de PCR
CC – cultivo celular
ECP – efeito citopático
(+) positivo (-) negativo * presença de DNA viral confirmado no CC através de PCR
62
Tabela 7 Alterações histológicas das porções do sistema nervoso dos bezerros que desenvolveram quadro de encefalopatia (n=4) e dos que permaneceram
assintomáticos (n=3) após inoculação experimental com BoHV-5.
Porção do SNC
Bez 1
Bez 3
Bez 6
Bez 7
Bez 9
Bez 11
Bez 12
Sintomático
Assintomático
Sintomático
Sintomático
Assintomático
Sintomático
Assintomático
MPV (+++)
NLC (++)
Meningite (+++)
MPV (+)
NLC (+)
Meningite (+)
Gliose (+)
MPV (+)
MPV (++)
NLC (++)
Meningite (++)
Gliose (++)
Córtex anterior
MPV (++)
Meningite (++)
Malácia (+++)
NLC (+)
Meningite (+)
Gliose (+)
MPV (+++)
NLC (++)
Meningite (+++)
Gliose (++)
Malácia (+)
Córtex posterior
MPV (++)
NLC (+)
Meningite (++)
Gliose (+)
NLC (+)
Meningite (+)
MPV (++)
NLC (+)
Meningite (+)
Meningite (+)
NLC (++)
Hemorragia (+)
MPV (++)
NLC (+)
Gliose (++)
Córtex dorso-lateral
MPV (+++)
NLC (++)
Meningite (+++)
Gliose (++)
NLC (+)
MPV (++)
Meningite (+)
Gliose (+)
MPV (++)
Meningite (+)
Gliose (+)
NLC (+)
Hemorragia (+)
Meningite (++)
Córtex ventro-lateral
MPV (+++)
NLC (++)
Meningite (+++)
Malácia(+)
(-)
MPV (+)
Meningite (+)
Gliose (+)
MPV (++)
NLC (+)
Meningite (++)
Meningite (+)
Hemorragia (+)
MPV (++)
NLC (+)
Meningite (+)
Gliose (+)
Diencéfalo
MPV (+++)
Meningite (+++)
Gliose (++)
MPV (+)
MPV (+++)
Malácia (+)
MPV (+++)
Gliose (+)
Necrose (+)
Hemorragia (+)
MPV (+++)
Meningite (++)
Gliose (++)
Mesencéfalo
MPV (+++)
Necrose (++)
Meningite (+++)
Gliose (++)
Meningite (+)
MPV (+)
Gliose (+)
MPV (+++)
Necrose (+)
Gliose (+)
(-)
Meningite (+)
Hemorragia (+)
MPV (++)
Gliose (+)
Ponte
MPV (+++)
Meningite (+++)
Gliose (++)
MPV (+)
MPV (+)
Gliose (++)
MPV (++)
Hemorragia (+)
(-)
MPV (+)
Gliose (++)
Medula Oblonga
MPV (+++)
Gliose (+)
(-)
MPV (++)
Gliose (+)
MPV (+)
Meningite (++)
Gliose (+)
(-)
Hemorragia (+)
MPV (+)
Cerebelo
MPV (+++)
Meningite(+)
Gliose (+)
MPV (+)
Meningite (+)
Gliose (+)
MPV (+)
Gliose (++)
Meningite (++)
Hemorragia (+)
MPV (++)
(-)
(-)
Gânglio do trigêmeo
MPV (+)
Necrose (+)
MPV (+)
MPV (+)
(-)
(-)
Necrose (+)
Necrose (+)
MPV – Manguitos perivasculares NLC – Necrose laminar-cortical
(-) Ausência de alterações (+) Alteração discreta (++) Alteração moderada (+++) Alteração acentuada
63
REFERÊNCIAS
ALFIERI, A.F.; ALFIERI, A.A.; BARREIROS, M.A.B.; LEITE, J.P.G.; RICHTZENHAIN, L.J.
G and P genotypes of group A rotavirus strains circulating in calves in Brazil, 1996-1999.
Veterinary Microbiology, Amsterdan, v.99, n.3-4, p.167-173, Apr. 2004.
ASHBAUGH, S.E.; THOMPSON, K.E.; BELKNAP, E.B.; SCHULTHEISS, P.C.;
CHOWDHURY, S.; COLLINS, J.K. Specific detection of shedding and latency of bovine
herpesvirus 1 and 5 using a nested polymerase chain reaction. Journal of Veterinary
Diagnostic Investigation, Lawrence, v.9, n.4, p.387-394, 1997.
BAGUST, T.J.; CLARK, L. Pathogenesis of meningo-encephalitis produced in calves by
infectious bovine rhinotracheitis herpesvirus. Journal of Comparative Pathology, Edinburgh,
v.82, p.375-383, 1972.
BARENFUS, M.; QUADRI, C.A.D.; MCINTYRE, R.W.; SCHROEDER, R.J. Isolation of
Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus from Calves with Meningoencephalitis. Journal of
American Veterinary Medical Association, Chicago, v.143, n.7, p.725-728, Oct. 1963.
BELKNAP, E.B.; COLLINS, J.K.; AYERS, V.K., SCHULTHEISS, P.C. Experimental infection
of neonatal calves with neurovirulent bovine herpesvirus type 1.3. Veterinary Pathology,
Lawrence, v.31, p.358-365, 1994.
BELTRÃO, N.; FLORES, E.F.; WEIBLEN, R.; SILVA, A.M.; ROEHE, P.M.; IRIGOYEN, L.F.
Infecção e enfermidade neurológica pelo herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5): coelhos como
modelo experimental. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v.20, n.4, p.144-150,
out./dez. 2000.
BOOM, R.; SOL, C.J.A.; SALIMANS, M.M.M.; JANSEN, C.L.; WERTHEIM-van DILLEN,
P.M.E.; NOORDAA, J. van der. Rapid and simple method for purification of nucleic acids.
Journal of Clinical Microbiology, Washington, v.28, n.3, p.495-503, Mar. 1990.
BRITSCH, V. The modification of the infectious bovine rhinotracheitis virus serum
neutralization test. Acta Veterinaria Scandinavica, Kobenhavn, v.19, p. 497-505, 1978.
CARON, L.; FLORES, E.F.; WEIBLEN, R. SCHERER, C.F.C.; IRIGOYEN, L.F.; ROEHE,
P.M.; ODEON, A.; SUR, J.-H. Latent infection by bovine herpesvírus type-5 in experimentally
infected rabbits: virus reactivation, shedding and recrudescence of neurological disease.
Veterinary Microbiology, Amsterdan, v.84, n.4, p.285-295, Feb. 2002.
CARRILO, B.J.; AMBROGI, A.; SCHUDEL, A.A.; VASQUEZ, M.; DAHME, E.; POSPICHIL,
A. Meningoencephalitis caused by IBR virus in calves in Argentina. Zentralblatt Für
Veterinärmedizin Reihe B, Berlin, v.30, p.327-332, 1983.
64
CLAUS, M.P. Detecção do herpesvírus bovino tipos 1 e 5 por amplificação parcial do gene da
glicoproteína C e estudo retrospectivo da meningoencefalite herpética bovina. 2002. Dissertação
(Mestrado em Sanidade Animal) - Universidade Estadual de Londrina, Londrina.
COLES, E.H. Patologia Clínica Veterinária. 3.ed. São Paulo: Manole, 1984. 566p.
COLODEL, E.M.; NAKAZATO, L.; WEIBLEN, R.; MELLO, R.M.; SILVA, R.R.P.; SOUZA,
M.A.; FILHO, J.A.O.; CARON, L. Meningoencefalite necrosante em bovinos causada por
herpesvírus bovino no estado de Mato Grosso, Brasil. Ciência Rural, Santa Maria, v.32, n.2,
p.293-298, 2002.
D’ARCE, R.C.F.; ALMEIDA, R.S.; SILVA, T.C.; FRANCO, A.C.; SPILKI, F.; ROEHE, P.M.;
ARNS, C.W. Restriction endonuclease and monoclonal antibody analysis of Brazilian isolates of
bovine herpesviruses types 1 and 5. Veterinary Microbiology, Amsterdan, v.88, n.4, p.315-324,
Sep. 2002.
DIRKSEN, G.; GRÜNDER, H.D.; STÖBER, M. Rosenberger: Exame clínico dos bovinos.
3.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1993. 419p.
ELIAS, F.; SCHILD, A.L.; RIET-CORREA, F. Meningoencefalite e encefalomalacia por
Herpesvírus bovino-5: distribuição das lesões no sistema nervoso central de bovinos naturalmente
infectados. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v.24, n.3, p.123-131, jul./set. 2004.
FAUQUET, C. M.; MAYO, M. A.; MANILOFF, J.; DESSELBERGER, U.; BALL, L. A. Virus
Taxonomy. The eighth report. San Diego: Academic Press, 2004, 1162 p.
FRENCH, E.L. A specific virus encephalitis in calves: isolation and characterization of the
causal agent. Australian Veterinary Journal, Sydney, v.38, p.216-221, Apr. 1962.
GARDINER, M.R.; NAIRN, M.E.; SIER, A.M. Viral meningoencephalitis of calves in Western
Australia. Australian Veterinary Journal, Sydney, v.40, p.225-228, June 1964.
GOMES, L.I.; ROCHA, M.A.; COSTA, E.A.; LOBATO, Z.I.P.; MENDES, L.C.N.; BORGES,
A.S.; LEITE, R.C.; BARBOSA-STANCIOLI, E.F. Detecção de herpesvírus bovino 5 (BoHV-5)
em bovinos do Sudeste Brasileiro. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Belo Horizonte, v.54, n.2, p.217-220, 2002.
GOUGH, A.; JAMES, D. Isolation of IBR virus from a heifer with meningoencephalitis.
Canadian Veterinary Journal, Guelph, v.16, n.10, p.313-314, Oct. 1975.
HILL, B.D.; HILL, M.W.M.; CHUNG, Y.S.; WHITTLE, R.J. Meningoencephalitis in calves due
to bovine herpesvirus type 1 infection. Australian Veterinary Journal, Sydney, v.61, n.7,
p.242-243, July 1984.
JAIN, N.C. Shalm’s Veterinary Hematology. 4.ed. Philadelphia: Lea & Febiger, 1986. 1220p.
65
KAHRS, R.F. Infectious bovine rhinotracheitis: a review and update. Journal of American
Veterinary Medical Association, Chicago, v.171, n.10, p.1055-1064, Nov. 1977.
LISBÔA, J.A.N.; ALFIERI,A.A.; BALARIN, M.R.S.; CLAUS, M.P.; ISERNHAGEN, A.J.
Aspectos clínicos e diagnóstico da encefalite causada por HVB-5 em bezerros. In:
CONGRESSO LATINO AMERICANO DE BUIATRIA, 11., 2003, Salvador. Anais... Salvador,
2003. p.19.
MAYHEW, I.G. Large Animal Neurology: a handbook for veterinarians clinicians.
Philadelphia: Lea & Febiger, 1989. 380p.
MEYER, G.; LEMAIRE, M.; LYAKU, J.; PASTORT, P.-P., THRY, E. Establishment of a
rabbit model for bovine herpesvirus type 5 neurological acute infection. Veterinary
Microbiology, Amsterdan, v.51, n.1-2, p.27-40, 1996.
MEYER, G.; LEMAIRE, M.; ROS, C.; BELAK, K.; GABRIEL, A.; CASSART, D.;
COIGNOUL, F.; BELAK, S.; THIRY, E. Comparative pathogenesis of acute and latent
infections of calves with bovine herpesvirus types 1 and 5. Archives of Virology, Vienna, v.146,
n.4, p.633-652, 2001.
PEREZ, S.E.; BRETSCHNEIDER, G.; LEUNDA, M.R.; OSORIO, F.A.; FLORES, E.F.;
ODEÓN, A.C. Primary infection, latency, and reactivation of bovine herpesvirus type 5 in the
bovine nervous system. Veterinary Pathology, Lawrence, v.39, n.4, p.437-444, 2002.
RADOSTITS, O.M.; BLOOD, D.C.; GAY,C.C. Veterinary Medicine: a textbook of the
diseases of cattle, sheep, pigs, goats and horses. 8th ed. London: Baillière Tindall, 1994. 1763p.
REED, R.H.; MUENCH, H. A single method of estimating fifty percent end points. American
Journal Hygiene, v.27, p.493-497, 1938.
RIET-CORREA, F.; VIDOR, T.; SCHILD, A.L.; MÉNDEZ, M.C. Meningoencefalite e necrose
do córtex cerebral em bovinos causadas por herpes vírus bovino-1. Pesquisa Veterinária
Brasileira, Rio de Janeiro, v.9, n.1/2, p.13-16, 1989.
ROCK, D.L. The molecular bases of latent infections by alphaherpesviruses. Seminars in
Virology, v.4, p.157-165, 1993.
ROEHE, P.M.; SILVA, T.C.; NARDI, N.B.; OLIVEIRA, L.G.; ROSA, J.C.A. Diferenciação
entre os vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina (BHV-1) e herpesvírus da encefalite bovina
(BHV-5) com anticorpos monoclonais. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v.17,
n.1, p. 41-44, jan./mar. 1997.
SALVADOR, S.C.; LEMOS, R.A.A.; RIET-CORREA, F.; ROEHE, P.M.; OSÓRIO, A.L.A.R.
Meningoencefalite em bovinos causada por herpesvírus bovino-5 no Mato Grosso do sul e São
Paulo. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v.18, n.2, p.76-83, abr./jun. 1998.
66
SAMPAIO, I.B.M. Estatística aplicada à experimentação animal. Belo Horizonte: Fundação
de Ensino e Pesquisa em Medicina Veterinária e Zootecnia, 1998. 221p.
SANCHES, A.W.D.; LANGOHR, I.M.; STIGGER, A.L.; BARROS, C.S.L. Doenças do sistema
nervoso central em bovinos no Sul do Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro,
v.20, n.3, p.113-118, jul./set. 2000.
SCOTT, P.R. Diagnostic techniques and clinicopathologic findings in ruminant neurologic
disease. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, Philadelphia, v.20, n.2,
p.215-230, July 2004.
SILVA, A.M.; FLORES, E.F.; WEIBLEN, R.; BOTTON, S.A.; IRIGOYEN, L.F.; ROEHE,
P.M.; BRUM, M.C.S.; CANTO, M.C. Infecção aguda e latente em ovinos inoculados com o
herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5). Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v.18,
n.3/4, p.99-106, jul./dez. 1998.
SOUZA, V.F.; MELO,S.V.; ESTEVES, P.A.; SCHMIDT, C.S.; GONÇALVES, D.A.;
SCHAEFER, R.; SILVA, T.C.; ALMEIDA, R.S.; VICENTINI, F.; FRANCO, A.C.; OLIVEIRA,
E.A.; SPILKI, F.R.; WEIBLEN, R.; FLORES, E.F.; LEMOS, R.A.; ALFIERI, A.A.; PITUCO,
E.M.; ROEHE, P.M. Caracterização de herpesvírus bovinos tipos 1 (BHV-1) e 5 (BHV-5) com
anticorpos monoclonais. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de janeiro, v.22, n.1, p.13-18,
jan./mar. 2002.
STUDDERT, M.J. Bovine encephalitis herpesvírus. Veterinary Record, London, v.125, n.3,
p.584, Dec. 1989.
TEIXEIRA, M.F.B.; ESTEVES, P.A.; COELHO, C.S.S.; SILVA, T.C.; OLIVEIRA, L.G.;
ROEHE, P.M. Diferenças em níveis de anticorpos neutralizantes contra herpesvírus bovinos
tipos 1 (BHV-1) e 5 (BHV-5). Pesquisa Agropecuária Gaúcha, Porto Alegre, v.4, n.1, p.61-65,
1998.
THEIL, K.W.; McCLOSLEY, C.M.; SAIF, L.J.; REDMAN, D.R.; BOHL, E.H.; HANCOCK,
D.D.; KOHLER, E.M.; MOORHEAD, P.D. Rapid, simple method of preparing rotaviral doubléstranded ribonucleic acid for analysis by poliacrylamide gel eletrophoresis. Journal of Clinical
microbiology, Washington, v.14, p.273-280, 1981.
VOGEL, F.S.F.; CARON, L.; FLORES, E.F.; WEIBLEN, R.; WINKELMANN, E.R.; MAYER,
S.V.; BASTOS, R.G. Distribution of bovine herpesvirus type 5 in the central nervous systems os
latently, experimentally infected calves. Journal of Clinical Microbiology, Washington, v.41,
n.10, p.4512-4520, Oct. 2003.
WATT, J.A.; JOHNSTON, W.S.; MACLEOD, N.S.; BARLOW, R.M. Infectious bovine
rhinotracheitis and encephalitis. Veterinary Record, London, v.108, n.3, p.63-64, Jan. 1981.
WEIBLEN, R.; BARROS, C.S.L.; CANABARRO, T.F.; FLORES, I.E. Bovine meningoencephalitis from IBR virus. Veterinary Record, London, v.124, n.25, p.666-667, June 1989.
67
4 CONCLUSÕES
68
CONCLUSÕES
A infecção pelo BoHV-5 nem sempre vem acompanhada pela manifestação de sinais
de distúrbios neurológicos. Os sinais clínicos apresentados pelos bezerros e o tempo
de evolução são variáveis e não possuem um padrão característico.
A pleiocitose mononuclear é uma alteração marcante no líquor e auxilia no
diagnóstico ainda em vida. As alterações do leucograma são discretas e inespecíficas.
As alterações histológicas do sistema nervoso caracterizam-se por infiltrado
mononuclear e áreas de malácia, variam em intensidade e ocorrem principalmente no
telencéfalo e no diencéfalo.
O vírus pode se encontrar em diferentes locais do encéfalo, no gânglio do nervo
trigêmeo e, eventualmente, no líquor. A presença do genoma viral nem sempre é
acompanhada pelo isolamento bem sucedido.
69
5 APÊNDICES
70
APÊNDICE A – LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Valores individuais da temperatura retal (ºC) aferida à tarde nos bezerros
experimentalmente infectados com o BoHV-5.
Dias p.i.
Bez 1
Bez 3
Bez 6
Bez 7
Bez 9
Bez 11
Bez 12
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
39,0
39,3
39,1
39,5
39,3
39,4
39,8
39,30
39,3
39,5
39,6
40,2
40,7
39,8
39,5
39,2
39,3
39,5
38,9
38,5
-
39,1
39,5
39,5
39,4
39,5
39,6
39,7
39,7
39,3
39,3
39,2
39,2
39,3
39,3
39,1
39,2
39,2
39,4
39,7
39,1
39,3
39,4
39,2
38,8
38,8
39,0
38,9
38,9
38,9
38,6
38,6
39,9
39,2
40,0
39,8
39,8
39,8
39,6
39,6
39,6
39,8
39,8
39,9
40,0
39,8
-
40,7
40,4
40,7
40,6
40,6
40,1
40,2
39,9
40,3
-
39,8
39,5
39,7
39,3
39,6
39,6
39,7
40,0
39,7
40,4
40,8
41,0
41,2
40,7
40,3
40,0
40,5
39,6
39,9
39,6
39,9
39,9
39,4
40,2
40,6
40,5
40,0
39,6
39,3
39,0
-
39,9
39,3
39,4
39,9
40,3
40,0
40,0
40,9
41,2
39,3
39,5
41,0
-
39,5
38,7
38,3
38,4
38,3
39,0
39,2
39,2
40,1
40,6
40,7
39,6
38,6
38,9
38,6
38,4
38,9
39,0
39,2
38,1
38,9
38,9
39,0
38,9
38,2
38,8
39,0
38,8
39,3
39,2
39,0
p.i. – pós-infecção
71
Tabela 2 Valores individuais da freqüência cardíaca (batimentos por minutos) aferida à tarde dos
bezerros experimentalmente infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Bez 1
Bez 3
Bez 6
Bez 7
Bez 9
Bez 11
Bez 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
88
100
100
98
98
110
100
102
98
96
96
64
82
70
96
140
128
104
82
122
-
88
100
96
84
94
92
92
84
80
82
96
84
92
88
78
90
92
84
90
84
100
92
84
92
90
84
100
98
86
88
90
62
64
68
68
88
82
82
84
82
92
86
78
116
138
-
70
74
68
70
78
78
74
70
76
-
78
72
82
68
76
68
66
74
76
70
82
86
68
68
76
66
73
82
88
76
90
88
72
82
82
100
84
74
89
88
-
82
78
82
78
84
74
70
80
64
56
64
98
-
92
60
84
60
100
80
96
104
120
76
72
88
70
90
72
64
70
90
66
88
104
88
76
64
82
78
84
88
72
80
90
p.i. – pós-infecção
72
Tabela 3 Valores individuais da freqüência respiratória (movimentos por minuto) aferida à tarde
dos bezerros experimentalmente infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
Bez 1
Bez 3
Bez 6
Bez 7
Bez 9
Bez 11
Bez 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
36
30
36
42
38
40
44
44
40
32
42
26
20
27
20
16
18
18
16
17
-
28
26
24
20
28
30
35
32
30
28
26
28
36
29
32
24
28
28
24
30
30
27
30
32
28
27
30
32
30
30
30
32
20
34
30
30
30
34
20
22
30
18
22
28
22
-
28
22
22
28
24
26
26
18
18
-
30
22
28
24
30
24
40
36
38
36
44
50
40
40
26
43
44
40
60
34
40
32
34
20
22
30
38
28
45
40
-
28
28
28
26
30
24
26
34
48
38
34
52
-
40
32
34
32
32
36
24
36
40
32
48
64
36
54
36
36
36
28
20
24
60
64
56
36
50
38
48
36
32
32
38
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
p.i. – pós-infecção
73
Tabela 4 Valores individuais do número de hemácias sanguíneas (milhões/mm3) em bezerros
experimentalmente infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Bez 1
Bez 3
Bez 6
Bez 7
Bez 9
Bez 11
Bez 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
5,80
5,60
5,40
4,99
5,40
5,60
5,59
5,59
6,99
6,99
7,56
-
4,40
4,60
4,59
4,20
4,80
4,59
4,80
4,80
4,80
4,80
5,04
5,04
5,45
5,25
5,67
5,67
7,76
7,56
7,77
7,35
7,14
7,13
7,53
-
6,93
6,72
6,51
6,93
6,88
-
6,50
6,93
7,14
7,34
6,87
6,90
6,90
6,90
7,11
6,92
7,34
7,13
6,30
6,35
8,60
8,50
9,24
9,02
9,03
9,02
8,33
8,78
-
6,08
6,10
5,25
4,41
3,56
4,00
4,19
4,62
4,82
5,44
5,67
5,85
5,87
6,30
6,29
5,67
p.i. – pós-infecção
Tabela 5 Valores individuais do volume globular (%) em bezerros experimentalmente infectados
com BoHV-5.
Dias p.i.
Bez 1
Bez 3
Bez 6
Bez 7
Bez 9
Bez 11
Bez 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
29
28
27
25
27
28
28
28
35
35
36
-
22
23
23
21
24
23
24
24
24
24
24
24
26
25
27
27
37
36
37
35
34
34
36
-
33
32
31
33
32
-
31
33
34
35
33
33
33
33
34
33
35
34
30
30
30
31
44
43
43
43
40
42
-
26
27
25
21
17
19
20
22
23
26
27
28
28
30
30
27
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
p.i. – pós-infecção
74
Tabela 6 Valores individuais da hemoglobina plasmática (g/dL) em bezerros experimentalmente
infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Bez 1
Bez 3
Bez 6
Bez 7
Bez 9
Bez 11
Bez 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
9,5
10,2
10,4
9,8
10,7
10,4
10,2
12
13
12,4
12,7
-
7,3
8,9
8,2
7,6
8,3
8,6
8,4
9,2
9,1
9,1
9,1
8,6
9,6
9,4
7,8
9,3
11,4
11,6
12,1
10,9
9,8
10
10,4
-
10,8
10,6
10,8
9,8
9,3
-
11,1
12
11,4
11,8
11
11,6
10,5
10,3
10,5
10,2
10,5
11
9,9
9,5
9,7
8,9
14,8
14,7
14
14,3
13,4
14
-
8,5
8,3
7,4
6,6
5,2
6,4
6,5
7,1
7,1
8,4
8,2
8,4
9,7
9,9
10,3
8,9
p.i. – pós-infecção
Tabela 7 Valores individuais do volume globular médio (fl) calculado em bezerros
experimentalmente infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Bez 1
Bez 3
Bez 6
Bez 7
Bez 9
Bez 11
Bez 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
50,0
50,0
50,0
50,1
50,0
50,0
50,1
50,1
50,1
50,1
47,6
-
50,0
50,0
50,1
50,0
50,0
50,1
50,0
50,0
50,0
50,0
47,6
47,6
47,7
47,6
47,6
47,6
47,7
47,6
47,6
47,6
47,6
47,7
47,8
-
47,6
47,6
47,6
47,6
46,5
-
47,7
47,6
47,6
47,7
48,0
47,8
47,8
47,8
47,8
47,7
47,7
47,7
47,6
47,2
34,9
36,5
47,6
47,7
47,6
47,7
48,0
47,8
-
50,0
50,0
50,1
50,0
50,0
50,1
50,0
50,0
50,0
50,0
47,6
47,6
47,7
47,6
47,6
47,6
p.i. – pós-infecção
75
Tabela 8 Valores individuais da concentração de hemoglobina globular média (%) calculada em
bezerros experimentalmente infectados com o BoHV-5.
Dias p.i.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Bez 1
Bez 3
Bez 6
Bez 7
Bez 9
Bez 11
Bez 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
32,8
36,4
38,5
39,2
39,6
37,1
36,4
42,9
37,1
35,4
35,3
-
33,2
38,7
35,7
36,2
34,6
37,4
35,0
38,3
37,9
37,9
37,9
36,0
36,9
37,6
28,9
34,4
30,8
32,2
32,7
31,1
28,8
29,4
28,9
-
32,7
33,1
34,8
29,7
29,1
-
35,8
36,4
33,5
33,7
33,3
35,2
31,8
31,2
30,9
30,9
30,0
32,4
33,0
31,7
32,3
28,7
33,6
34,2
32,6
33,3
33,5
33,3
-
32,7
30,7
29,6
31,4
30,6
33,7
32,5
32,3
30,9
32,3
30,4
30,0
34,6
33,0
34,3
33,0
p.i. – pós-infecção
Tabela 9 Valores individuais dos leucócitos sanguíneos (/mm3) em bezerros experimentalmente
infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Bez 1
Bez 3
Bez 6
Bez 7
Bez 9
Bez 11
Bez 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
10.350
5.600
10.050
10.350
8.570
7.000
9.450
12.400
9.800
12.650
25.200
-
9.350
6.300
9.450
9.200
5.920
5.700
6.400
4.700
5.750
8.400
7.600
6.350
8.000
7.250
7.150
7.700
9.600
6.950
6.750
7.700
7.450
9.700
14.950
-
9.850
7.450
6.900
6.000
7.150
-
6.800
5.600
6.450
9.550
6.400
7.050
6.650
6.850
7.950
6.300
7.400
6.800
9.850
10.400
6.450
4.775
9.000
7.950
10.700
9.700
14.250
22.000
-
10.600
11.800
9.400
10.050
11.150
5.500
8.550
6.700
5.550
7.050
8.250
7.600
8.300
10.350
6.300
7.670
p.i. – pós-infecção
76
Tabela 10 Valores individuais dos leucócitos segmentados sanguíneos (/mm3) em bezerros
experimentalmente infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Bez 1
Bez 3
Bez 6
Bez 7
Bez 9
Bez 11
Bez 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
2.484
952
1.910
1.449
1.114
1.050
1.418
3.472
3.430
5.313
17.892
-
1.496
1.197
2.646
460
533
969
1.088
799
690
1.512
3.116
1.016
1.440
1.885
1.144
1.309
4.608
4.170
3.105
3.465
3.129
4.947
9.120
-
2.266
1.192
1.587
480
1.001
-
1.224
616
2.258
1.815
1.024
2.609
2.195
1.779
1.272
1.827
1.850
2.244
5.713
4.992
2.903
3.533
4.140
1.829
2.889
2.910
5.843
11.880
-
2.120
1.416
2.538
1.809
2.453
1.925
1.710
1.139
1.388
1.058
1.733
3.420
2.158
4.347
1.512
2.071
p.i. – pós-infecção
Tabela 11 Valores individuais dos linfócitos sanguíneos (/mm3) em bezerros experimentalmente
infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Bez 1
Bez 3
Bez 6
Bez 7
Bez 9
Bez 11
Bez 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
7.742
4.368
7.537
8.694
7.027
5.670
8.032
8.928
6.370
7.337
6.300
-
7.854
5.103
6.709
8.280
5.328
4.674
5.248
3.666
5.002
6.888
4.408
5.206
6.560
5.292
5.934
6.237
4.896
2.710
3.510
4.235
4.321
4.559
4.635
-
7.485
6.183
5.313
5.520
6.077
-
5.372
4.872
4.127
7.447
5.184
4.299
4.187
4.795
6.598
4.221
5.328
4.284
4.137
4.576
3.482
3.533
4.410
6.041
7.383
6.402
7.268
6.600
-
8.268
10.030
6.674
8.241
8.585
3.575
6.840
5.561
4.051
5.709
6.269
3.724
5.893
4.968
4.725
5.522
p.i. – pós-infecção
77
Tabela 12 Valores individuais dos monócitos sanguíneos (/mm3) em bezerros experimentalmente
infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Bez 1
Bez 3
Bez 6
Bez 7
Bez 9
Bez 11
Bez 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
756
-
0
0
0
0
0
0
0
141
0
0
0
64
0
0
72
77
96
0
135
0
0
194
1.195
-
99
0
0
0
72
-
136
112
65
288
192
71
201
276
80
189
148
272
0
416
0
96
270
80
428
388
1.139
2.200
-
212
118
188
0
112
0
0
0
0
141
165
380
166
828
0
177
p.i. – pós-infecção
Tabela 13 Valores individuais do fibrinogênio
experimentalmente infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
plasmático
(mg/dL)
em
bezerros
Bez. 1
Bez. 3
Bez. 6
Bez. 7
Bez. 9
Bez.11
Bez. 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
200
400
400
400
200
200
400
600
1000
1000
1200
-
400
400
600
400
800
800
600
400
800
600
600
400
400
200
400
100
800
800
600
600
600
600
800
-
600
800
600
600
400
-
400
400
400
600
600
400
800
600
800
800
1000
700
500
600
600
800
500
600
200
600
600
900
-
200
200
300
300
400
600
400
400
600
500
400
200
600
500
400
600
p.i. – pós-infecção
78
Tabela 14 Valores individuais das células nucleadas (/mm3) presentes no líquor de bezerros
experimentalmente infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
Bez. 1
Bez. 3
Bez. 6
Bez. 7
Bez. 9
Bez.11
Bez. 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
7
133
191
187
178
-
2
54
220
25
27
472
210
-
3
81
-
16
2
4
7
121
-
10
82
117
109
30
0
9
11
13
15
19
21
23
26
30
p.i. – pós-infecção
Tabela 15 Valores individuais dos leucócitos mononucleares (/mm3) presentes no líquor de
bezerros experimentalmente infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
Bez. 1
Bez. 3
Bez. 6
Bez. 7
Bez. 9
Bez.11
Bez. 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
6
130
187
181
167
-
0
52
202
24
26
458
200
-
0
79
-
15
0
0
6
113
-
8
80
116
108
29
0
9
11
13
15
19
21
23
26
30
p.i. – pós-infecção
79
Tabela 16 Valores individuais dos neutrófilos (/mm3) presentes no líquor de bezerros
experimentalmente infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
Bez. 1
Bez. 3
Bez. 6
Bez. 7
Bez. 9
Bez.11
Bez. 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
1
3
4
6
11
-
0
2
18
1
1
14
10
-
0
2
-
1
0
0
1
8
-
2
2
1
1
1
0
9
11
13
15
19
21
23
26
30
p.i. – pós-infecção
Tabela 17 Valores individuais da proteína (mg/dL) presente no líquor de bezerros
experimentalmente infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
0
9
11
13
15
19
21
23
26
30
Bez. 1
Bez. 3
Bez. 6
Bez. 7
Bez. 9
Bez.11
Bez. 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
14,3
26
55,2
60,4
108,7
-
9,5
30
44,7
13
17,3
28,8
9,2
-
6
12,1
-
14,4
15,5
20
32,2
48,8
-
18,8
63,3
54,4
52,2
30
p.i. – pós-infecção
80
Tabela 18 Valores individuais da AST (UI/L) presente no líquor de bezerros experimentalmente
infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
0
9
11
13
15
19
21
23
26
30
Bez. 1
Bez. 3
Bez. 6
Bez. 7
Bez. 9
Bez.11
Bez. 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
6,9
17,4
139,2
132,2
172,3
-
3,4
12,1
10,4
13,9
34,8
8,6
13,9
-
6,9
15,6
-
17,4
13,9
6,9
24,3
36,5
-
20,8
53,9
34,8
46,9
29,5
p.i. – pós-infecção
Tabela 19 Valores individuais da glicose (mg/dL) presente no líquor de bezerros
experimentalmente infectados com BoHV-5.
Dias p.i.
Bez. 1
Bez. 3
Bez. 6
Bez. 7
Bez. 9
Bez.11
Bez. 12
sintomático
assintomático
sintomático
sintomático
assintomático
sintomático
assintomático
46,3
69,4
44,6
69,7
80,0
-
51,5
72,5
73,8
43,2
41,4
35,4
41
-
42,4
45,5
-
55
49,6
41,5
17,5
9,7
-
50,3
45,2
80
44,3
42,7
0
9
11
13
15
19
21
23
26
30
p.i. – pós-infecção
This document was created with Win2PDF available at http://www.win2pdf.com.
The unregistered version of Win2PDF is for evaluation or non-commercial use only.
This page will not be added after purchasing Win2PDF.