FACUAL ENDOFÍTICAS

EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA
EMBRAPA RECURSOS GENÉTICOS E BIOTECNOLOGIA
Utilização de Bacillus thuringiensis endofíticos para controle de
insetos-praga do algodoeiro
ROSE GOMES MONNERAT SOLON DE PONTES
BRASÍLIA
ABRIL 2004
1
Indice
Resumo………………………………………………………………………………......
3
Abstract…………………………………………………………………………………
4
Introdução………………………………………………………………………………
5
Objetivos…………………………………………………………………………………
8
Objetivos específicos........................................................................................................
8
Metas……………………………………………………………………………………
8
Revisão de literatura……..………………………………………………………………
8
1- Microrganismos endofíticos..........................................................................................
8
2- Bacillus thuringiensis..............................................................................................…
9
Materiais e Métodos..........................................................................................................
19
Recursos físicos.................................................................................................................
22
Recursos Humanos......................................................................................................…
23
Equipe Técnica..................................................................................................................
24
Referências bibliográficas.................................................................................................
25
Formulários obrigatórios...................................................................................................
30
Formulário 1- Carta consulta...................................................................................……
30
Formulário 2- Cronograma de execução e Plano de Aplicação..............................……
32
Formulário 2.1 – Consolidado geral do orçamento............………...................................
33
Formulário 2.2 – Orçamento: equipamentos e material permanente.........………............
35
Formulário 2.3 – Orçamento: material de Consumo...............................................……
39
Formulário 2.4 – Orçamento: passagens............................................………...................
42
Formulário 2.5 – Orçamento: recursos humanos............……….......................................
46
Formulário 2.6 – Orçamento: outros serviços de terceiros.....................................……
48
Formulário 2.7 – Orçamento: manutenção de equipamentos.………...............................
49
Formulário 2.8 – Orçamento: diárias....………..................... ........................... ...............
50
Formulário 3 - Cronograma de desembolso...............................................………..........
52
Formulário 4 – Cadastro de pesquisadores........................... ...........……….....................
54
Formulário 5- Declaração de Adimplência...................………....... .................................
64
Formulário 6- Declaração de contrapartida.................………........ .................................
65
Formulário 7- Termo de compromisso inicial........................... ……...............................
66
2
RESUMO
A cultura do algodãoé uma das mais atacadas por insetos e, segundo o “IPM Working
for Development” quase 25% dos pesticidas utilizados no mundo inteiro são gastos na
cotonicultura.
Alternativas de controle de insetos, incluindo a utilização de microrganismos
entomopatogênicos como bactérias, fungos e vírus, plantas transgênicas com genes de bactérias
ou inibidores de proteinases de insetos e inimigos naturais têm sido amplamente estudados.
No entanto, devido à importância do problema, outros estudos poderão ser viabilizados como,
por exemplo, a utilização de organismos endofíticos.
Muitas bactérias do gênero Bacillus foram isoladas de tecidos de plantas, entretanto o
primeiro relato do isolamento de B. thuringiensis a partir de plantas de algodão ocorreu no
ano passado, quando em nosso laboratório foram isoladas 13 estirpes.
Estudos para inoculação e colonização de B. thuringiensis na planta podem apontar para
uma nova forma de controle de insetos, nunca antes testada com esta bactéria, reduzindo,
assim, a utilização de inseticidas e de suas conseqüências indesejáveis.
3
ABSTRACT
Cotton is one of the crops most attacked by insects and according to “IPM Working
for Development”, almost 25% of chemical products used world wide against insects are
used on cotton crop.
Insect control alternatives, including the use of entomopathogenic microrganisms
such as bacteria, fungi and virus, transgenic plants with bacterium or insect proteinases
inhibitors genes and natural enemies, have been studied. Due to the importance of the
problem, other studies could be done such as the utilization of endophytic organisms.
Many bacteria of the Bacillus genus were isolated from plant tissues, although the
first isolation reported of B. thuringiensis from cotton plants took place last year, when 13
strains were isolated in our lab.
Inoculation and colonization studies of B. thuringiensis in cotton open a new
perspective for insect control that has never been tested before.
4
INTRODUÇ
ÃO
O cultivo extensivo de grandes culturas, como soja, milho, algodão e canola, entre
outras, demanda elevado investimento em agrotóxicos devido ao complexo de pragas que as
hospedam, em especial lepidópteros e coleópteros. Os danos provocados por cada uma delas
podem variar de uma região para outra, e seu controle pode chegar a até 22% do custo da
produção (Édio Brunetta comunicação pessoal, 2004).
Dentre os insetos associados ao algodoeiro, destacam-se como pragas importantes:
1- Curuquerê - Alabama argilacea (Hueb., 1818 ) (Lepidoptera: Noctuidae)
2- Lagarta-da-maçã- Heliothis virescens (Fabr., 1781) (Lepidoptera: Noctuidae)
3- Lagarta-rosada - Pectinophora gossypiella (Saund, 1844) (Lepidoptera - Gelechiidae)
4- Lagarta-do-cartucho-do-milho
–
Spodoptera
frugiperda
(J.E.
Smith,
1797)
(Lepidoptera: Noctuidae).
5- Bicudo-do-algodeiro
–
Anthonomus
grandis
(Boheman,
1853)
(Coleoptera:
Curculionidae)
O curuquerê ataca as folhas, destruindo o limbo, as nervuras e os pecíolos. O severo
desfolhamento que pode causar reduz a produção. Provoca, ainda, a maturação forçada das maçãs
diminuindo a resistência das fibras. A lagarta da maçã destrói as maçãs e os botões florais,
favorecendo ainda, a penetração de microrganismos através dos orifícios que forma. A lagarta
rosada ataca inicialmente os botões florais, impede a abertura das pétalas, impossibilitando
conseqüentemente a formação das maçãs. Estas, no entanto, quando formadas são igualmente
atacadas e as fibras e as sementes são destruídas. A lagarta-do-cartucho-do-milho alimenta-se
das folhas do algodoeiro no seu estágio mais jovem e penetra nas maçãs e nos botões florais,
causando grande destruição e dificultando o seu controle. O bicudo-do-algodoeiro é um inseto
de difícil controle, pois seu período larval ocorre dentro das maçãs e botões florais do
algodoeiro. Essas estruturas podem ficar completamente destruídas (Nakano et al., 1992).
A principal forma de controle desses insetos tem sido feita pela utilização de produtos
químicos (França, 1993; Dias et al., 2002), cuja aplicação exige um grande investimento,
5
onerando ou mesmo inviabilizando em alguns casos a produção (Castro, 1992). Esses
agroquímicos causam danos ao meio ambiente e geram riscos de intoxicação ao homem.
A importância do controle de pragas do algodoeiro e o aumento da consciência da
população para os efeitos diretos e indiretos dos pesticidas na saúde pública e no ambiente em
geral, tem demandado novas formas de controle de pragas, que sejam mais econômicas e
menos danosas ao ecossistema.
No caso específico do controle de pragas, alternativas biológicas incluem a utilização de
bactérias, fungos, vírus e até de substancias produzidas pelo próprio inseto. Esses agentes
podem ser manipulados para o aumento da patogenicidade, ampliação do espectro de ação,
produção industrial ou a incorporação de genes inseticidas em espécies vegetais levando à obtenção
de plantas transgênicas (Perlak et al., 1990).
Dos vários agentes microbianos que possuem atividade entomopatogênica, destaca-se
o Bacillus thuringiensis (Berliner), bactéria de ampla distribuição geográfica, específica para
controlar insetos. Uma das grandes vantagens de sua utilizaçãoé sua inocuidade ao homem e
animais domésticos, além de seu efeito não poluente ao ambiente. A atividade inseticida dessa
bactéria é devida à produção de inclusões protéicas cristalinas durante a fase de esporulação. Estas
proteínas denominam-se δ-endotoxinas ou cristal parasporal (Aronson, 1986). A maioria das
cepas de B. thuringiensis pode sintetizar mais de um tipo de cristal (Lereclus et al., 1993),
que podem estar formados por distintas δ-endotoxinas, relacionadas entre si. Registros
recentes citam de mais de 120 toxinas diferentes produzidas por esta bactéria. Laboratórios
em todo o mundo procuram estirpes com novas toxinas e outras características de
patogenicidade, que possibilitem uma maior disponibilidade de princípios ativos que poderão
ser usados para o estabelecimento de estratégias de controle. A Embrapa conta com uma
coleção de 1.500 estirpes de B. thuringiensis entomopatogênicos. Dessas estirpes, algumas têm
atividade comprovada contra lepidópteros e coleópteros.
O B. thuringiensis pode ser utilizado tanto na forma nativa, como um bioinseticida,
quanto como doador de genes para o desenvolvimento de plantas transgênicas.
Recentemente no laboratório de bacteriologia do Núcleo de Controle Biológico da
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia foram iniciados estudos para verificar a
possibilidade da utilização de B. thuringiensis associado a bactérias endofíticas. Muitas bactérias
6
do gênero Bacillus foram isoladas de tecidos de plantas (Azevedo et al., 2000). Sabe-se
também, que as bactérias pertencentes a esse gênero têm a capacidade de conjugar, trocando
desta forma, material genético. Assim, pesquisas foram planejadas para encontrar Bacillus
endofíticos a partir de plantas de algodão e conjugá-los com estirpes tóxicas a lepidópteros e
coleópteros armazenados em na coleção da Embrapa. Para surpresa do grupo, nos primeiros
ensaios foram isoladas 20 estirpes de B. thuringiensis, algumas das quais contendo toxinas
ativas contra lepidópteros (Monnerat et al., 2003).
Concomitantemente a este trabalho foi realizado um grande levantamento
bibliográfico onde foi constatado este trabalho foi o primeiro relato do isolamento de B.
thuringiensis a partir de tecidos de plantas.
Na seqüência dos ensaios laboratoriais, foi verificado que B. thuringiensis, uma vez
inoculado no solo próximo às raízes da planta, espalha-se por todos os tecidos, chegando as
folhas.
Os próximos passos deste trabalho serão compreender os mecanismos que fazem com
que o B. thuringiensis viva no interior das plantas, e testar formas de inoculação da bactéria
para que se maximize sua absorção e assim tornar a planta resistente aos diferentes insetos.
Trata-se de um assunto novo, com potencial de desenvolvimento de uma nova
perspectiva para o controle de insetos, através de uma nova forma de utilização de B.
thuringiensis.
7
OBJETIVOS
Desenvolver tecnologia para utilização de Bacillus thuringiensis como inoculante para
proteger a planta do algodoeiro do ataque de insetos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1- Selecionar as estirpes de B. thuringiensis mais adequadas,
2- Verificar o tempo de permanência do Bt nos tecidos da planta,
3- Determinar a forma de inoculação,
4- Determinar a forma e freqüência da aplicação
5- Determinar o efeito sobre populações-alvo
METAS
1- Determinar a melhor forma de inoculação do B. thuringiensis para proteger a planta
do ataque de insetos em laboratório e em campo
2- Esclarecer o mecanismo da colonização da planta pelo B. thuringiensis
3- Avaliar viabilidade da tecnologia
REVISÃO DE LITERATURA
1- Microrganismos endofíticos
Microorganismos endofíticos são aqueles que habitam o interior das plantas durante
pelo menos um período do ciclo de suas vidas (Azevedo, 1998). No início da década de 1970,
microrganismos endofíticos eram considerados neutros, não causando danos ou benefícios às
plantas, mas sabe-se atualmente que esses microrganismos, em muitos casos, desempenham
8
um papel importante na proteção da plantas contra predadores e patógenos (Azevedo et al.,
2000).
Weber (1981) foi, provavelmente, o primeiro pesquisador a relatar a proteção de
plantas a insetos devido a um fungo entomopatogênico. Trabalhos posteriores sustentaram
esses dados em gramíneas e outras plantas (Funk et al., 1983; Claydon et al., 1985).
A partir de bactérias endofíticas, novas formas de controle biológico vêm sendo
desenvolvidas com o auxílio da engenharia genética. Como exemplo, deve-se mencionar a
transformação da bactéria Clavibacter xyli com o gene cry1Ac de Bacillus thuringiensis
Berliner que codifica uma proteína tóxica a alguns insetos da ordem Lepidoptera (Tester,
1992).
Muitas bactérias do gênero Bacillus foram isoladas a partir de tecidos das plantas
(Azevedo et al., 2000), entretanto nenhum autor cita o isolamento da espécie B.
thuringiensis. Um trabalho recentemente desenvolvido na Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia demonstrou que existem estirpes de B. thuringiensis colonizando tecidos de
plantas de algodão (Monnerat et al., 2003), abrindo assim, a possibilidade de uma nova
forma de controle de insetos.
2- Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria gram positiva, da família Bacillaceae que
produz no momento de sua esporulação inclusões protéicas cristalinas. Essas inclusões contêm
proteínas denominadas delta-endotoxinas que formam atualmente uma família de 110
membros, classificados em 40 grupos. Elas são produzidas sob a forma de protoxinas, as
quais são transformadas em peptídeos tóxicos no intestino do inseto, pela ação do pH alcalino
intestinal e de proteases. A toxina ativada causa a lise das células epiteliais e a morte das
larvas (Aronson et al., 1986).
Uma das vantagens da utilização de Bt é sua especificidade aos insetos sensíveis, seu
efeito não poluente ao meio ambiente, sua inocuidade aos mamíferos e vertebrados e ausência
de toxicidade às plantas (Whiteley & Schnepf, 1986; O.M.S., 1987). Produtos à base desta
bactéria para o controle de pragas agrícolas são comercializados há mais de cinqüenta anos,
sendo o seu mercado anual estimado em 100 milhões de dólares. Prevê-se que sua utilização
9
aumentará na medida em que legislações de proteção ambiental mais rigorosas forem adotadas e
produtos mais eficientes e baratos forem lançados (Dias, 1992).
A primeira menção a doenças em insetos causada por este tipo de bactéria data de 1902,
quando Ishiwata no Japão descreveu uma bactéria esporulante responsável pela mortalidade do
bicho-da-seda, Bombix mori e a chamou de Bacillus sotto. Em 1911, Berliner, na
Alemanha, redescreveu a mesma bactéria isolada a partir de lagartas da traça da farinha
Anagasta kuhniella (Lepidoptera: Pyralidae) e, em 1915, a chamou de Bacillus
thuringiensis, em homenagem à região de onde as lagartas foram coletadas (Whiteley &
Schnepf, 1986; Dias, 1992).
As possibilidades de utilização do Bt foram logo reconhecidas em controle biológico, e
em 1938 uma formulação a base desta bactéria, a Sporeína foi produzida na França (Weiser,
1986). A partir dos anos 1950, diversos países como a Rússia, a Checoslováquia, a França, a
Alemanha e Estados Unidos começaram a produzir inseticidas biológicos à base de Bt (Weiser,
1986).
Na década de 1960 foi isolada uma estirpe de Bt subsp. kurstaki, chamada HD-1
(Dulmage, 1970) que apresentou uma toxicidade de 2 a 200 vezes superior às estirpes
normalmente utilizadas nos produtos comerciais. A partir de então, a procura por outras
estirpes, possuidoras de novas toxinas foi estimulada e em 1977, sendo isolada uma estirpe
eficaz contra dípteros (Goldberg & Margalit, 1977). Alguns anos mais tarde, em 1983, uma
outra estirpe foi identificada como patogênica contra coleópteros (Krieg et al., 1983).
No mundo inteiro diversas estirpes de Bt foram isoladas e atualmente diversos
laboratórios continuam procurando por outras novas. Existem várias coleções espalhadas pelo
mundo e estima-se que existam 40.000 estirpes conhecidas. Entre estas, existem algumas
que são eficazes contra diversas ordens de insetos (lepidópteros, dípteros e coleópteros) e contra
outros grupos de invertebrados (nematóides, ácaros e protozoários) (Edwards et al., 1988;
Feiltelson et al., 1992; Crickmore et al., 1995).
Toxinas produzidas por Bacillus thuringiensis
δ-Endotoxinas
10
Este grupo de toxinas, também chamado de proteínas Cry é um dos formadores do
cristal protéico. Estas proteínas apresentam peso molecular variando de 65 a 138 kDa. Os
estudos efetuados sobre a esporulação mostraram que o cristal é formado a partir do segundo
estágio da esporulação e é liberado quando as células são lisadas. As etapas da esporulação e
biogênese do cristal seguem os seguintes passos:
Estágio 1: A célula para seu crescimento e sua parede celular se modifica;
Estágio 2: O septo de esporulaçãoé formado e a cromatina é dividida em duas partes. Começa
nesse momento a aparição de uma estrutura condensada queé o cristal;
Estágio 3: Formação do pré-esporo;
Estágio 4: Crescimento do esporo e formação do cortex;
Estágio 5: Formação do envelope esporal que envolve o esporo. O cristal, fora deste envelope,
continua seu crescimento;
Estágio 6: Maturação do esporo, o cristal atinge seu tamanho máximo;
Estágio 7: Ruptura da célula e liberação do cristal e do esporo.
A classificação das proteínas Cry baseia-se na similaridade das seqüências de aminoácidos
(Crickmore et al., 1998). Existem mais de 190 diferentes genes cry e as proteínas Cry estão
agrupadas em 40 classes.
A atualização constante dessa nova classificação encontra-se disponível no site: WWW:
http:epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html.
Dentre as estirpes de B. thuringiensis, algumas apresentam um único gene codificador
das proteínas Cry. Outras estirpes apresentam cinco genes diferentes, como é o caso da
subespécie aizawai HD-137 e subespécie israelensis IPS-82. Esta última apresentou cinco
genes codificadores da δ-endotoxina e um outro gene que codifica uma citolisina, todos
localizados em umúnico plasmídeo de 72Mda (Bourgouin et al., 1988).
As toxinas do tipo Cry1 têm 36 subgrupos representados por Cry1Aa,..., Cry1Ka
(Crickmore et al., 1998). Algumas dessas proteínas são ativas contra insetos da ordem
Lepidoptera, como por exemplo, as toxinas Cry1C e Cry1D que apresentam atividade contra
Spodoptera frugiperda e Spodoptera exigua (Bravo et al., 1998) e ainda, a toxina Cry1Cb,
isolada de B. thuringiensis subsp. galleriae, com massa molecular em torno de 130 kDa e
tóxica a S. exigua e Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae) (Kalman et al., 1993). Cita-se,
ainda a proteína Cry1E que apresenta distintas eficiências de controle em Spodoptera sp.
11
(Loguercio et al., 2001). Algumas toxinas pertencentes ao grupo Cry1 podem apresentar
atividade dupla contra lepidópteros e dípteros e contra lepidópteros e coleópteros, como é o caso
das proteínas Cry1Ca e Cry1Ba (Bradley et al., 1995), respectivamente. Vale ressaltar que as
proteínas Cry1Ab e Cry1Ca mostraram atividade contra mosquitos (Haider & Ellar, 1987;
Smith et al., 1996).
O grupo de proteínas do tipo Cry2 é formado por quatro membros: Cry2Aa, Cry2Ab,
Cry2Ac e Cry2Ad (Crickmore et al., 2002). A toxina do tipo Cry2A foi isolada da subespécie
kurstaki. A toxina do tipo Cry2B apresenta 89% de identidade com a Cry2A e é altamente
tóxica contra
Lymantria
dispar
(Lepidoptera:
Lymantriidae),
Heliothis
virescens
(Lepidoptera: Noctuidae) e T. ni e não apresentou toxicidade contra Aedes aegypti (Diptera:
Culicidae). Portanto, a toxina do tipo Cry2 é produzida por estirpes de várias subespécies de B.
thuringiensis, apresenta alta atividade larvicida para lepidópteros e baixa para dípteros
(Dankocsik et al., 1990; Wu et al., 1991). Essas toxinas apresentam peso molecular de 65
kDa e formam cristais cubóides (Hofte & Whiteley, 1989; Lereclus et al., 1989).
O grupo das proteínas Cry3 apresenta quatro integrantes: Cry3Aa, Cry3Ba, Cry3Bb e
Cry3Ca. Essas toxinas apresentam peso molecular de 73 a 75 kDa (Crickmore et al., 2002) e
produzem cristais rombóides. Krieg et al. (1983) descreveram a primeira estirpe produtora
de gene cry3. Estas proteínas são tóxicas a insetos da ordem Coleoptera, como por exemplo,
Lepitnotarsa decemlineata (Besouro da batata do Colorado) (Coleoptera: Chrysomelidae)
(Donovan et al., 1988). A toxina Cry3Ba foi isolada de B. thuringiensis subsp. tolworthi
(Sick et al., 1990), a proteína Cry3Bb é ativa contra Diabrotica undecimpunctata (Coleoptera:
Chrysomelidae), a proteína Cry3A contra o pulgão-da-batata, Macrosiphum euphorbiae
(Hemiptera: Aphididae) e a proteína Cry3Ca foi isolada de B. thuringiensis subsp. kurstaki e
apresentou toxicidade contra L. decemlineata superior à que as outras proteínas Cry3
apresentaram (Lambert et al., 1992).
A classe Cry4 apresenta duas proteínas Cry4Aa e Cry4Ba. Essas proteínas são ativas
contra dípteros. Os genes cry4A e cry4B foram isolados das estirpes de B. thuringiensis
subsp. israelensis e codificaram proteínas de 128 e 135 kDa, respectivamente, e, além disso,
formam cristais complexos de forma ovóide (Hofte e Whiteley, 1989) ou composta (esférica
ou retangular) (Lereclus et al., 1989).
12
As proteínas Cry5 são ativas contra nematóides, ácaros e formigas e, ainda, mostram
atividade contra coleópteros e lepidópteros. A proteína Cry5Aa e Cry5Ab foram isoladas de B.
thuringiensis subsp. darmstadiensis e apresentam peso molecular de 152 e 142 kDa,
respectivamente (Crickmore et al., 2002). Ambas as toxinas são ativas contra nematóides e
ácaros (Monnerat & Bravo, 2000). Já as proteínas Cry5Ac e Cry5Ba apresentam peso
molecular de 135 e 140 kDa (Crickmore et al., 2002), respectivamente e são eficazes contra
himenópteros e coleópteros (Monnerat & Bravo, 2000).
As toxinas Cry6 são ativas contra nematóides e ácaros (Monnerat & Bravo, 2000) e são
formadas por dois integrantes: Cry6Aa e Cry6Ba (Crickmore et al., 2002).
O grupo das proteínas Cry7 está representado por dois subgrupos: Cry7Aa e Cry7Ab. A
toxina Cry7Aa apresenta peso molecular de 129 kDa e atividade contra coleópteros e
lepidópteros (Lambert et al., 1992). A toxina Cry7Ab codifica uma proteína de 130 kDa e foi
isolada de B. thuringiensis subsp. dakota (Crickmore et al., 2002) e é ativa contra coleópteros
(Monnerat e Bravo, 2000).
As toxinas do grupo Cry8 são três: Cry8Aa, Cry8Ba e Cry8Ca. As proteínas Cry8Aa e
Cry8Ba foram isoladas de B. thuringiensis subsp. kumamotoensis e codificam proteínas de
131 e 134 kDa, respectivamente (Crickmore et al., 2002). A primeira apresenta atividade
dupla para coleópteros e afídeos e a segunda apenas contra coleópteros (Monnerat & Bravo,
2000). A proteína Cry8Ca foi isolada de B. thuringiensis subsp. japonensis apresentou
atividade contra um escarabeídeo, Anomala cuprea (Coleoptera: Scarabaeidae) (Hori et al.,
1994; Sato et al., 1994), portanto é eficaz contra insetos da ordem Coleoptera e apresenta
peso molecular de 130 kDa.
A classe Cry9 é formada por seis integrantes: Cry9Aa, Cry9Ba, Cry9Ca, Cry9Da,
Cry9Ea e Cry9Eb. As proteínas Cry9Aa e Cry9Ba foram isoladas de B. thuringiensis subsp.
galleriae, sendo que gene cry9Aa apresenta atividade contra Galleria mellonella
(Lepidoptera: Pyralidae) e o gene cry9Ca foi isolado de B. thuringiensis subsp. tolworthi e é
efetivo contra Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Pyralidae) e Choristoneura fumiferana
(Lepidoptera: Tortricidae) (Jansens et al., 1997), a proteína Cry9Ea foi isolada de B.
thuringiensis subsp. aizawai (Ben-Dov et al., 1999) e todas apresentam peso molecular de
130 kDa. A proteína Cry9Da foi isolada de B. thuringiensis subsp. japonensis e codifica uma
proteína de132 kDa e é ativa contra escarabeídeos da Ordem Coleoptera (Crickmore et al.,
13
2002). Algumas destas proteínas são também eficazes contra lepidópteros (Crickmore et al.,
2002).
O grupo das proteínas Cry10 é constituído por apenas um subgrupo: Cry10Aa. A toxina
do tipo Cry10Aa foi isolada de B. thuringiensis subsp. israelensis e codifica uma proteína de
78 kDa. Da mesma forma que Cry10A, a toxina do tipo Cry11Aa, também, foi isolada a
partir de B. thuringiensis subsp. israelensis e codifica uma proteína de 72 kDa (Donovan et
al., 1988). A proteína Cry11Ba foi isolada de B. thuringiensis subsp. jegathesan e apresenta
alta eficácia contra os mosquitos das espécies A. aegypti, Culex pipiens e Anopheles stephensi
(Diptera: Culicidae) (Delecluse et al., 1995) e a Cry11Bb foi isolada B. thuringiensis subsp.
medellin e é altamente tóxica às larvas de A. aegypti, Anopheles albimanus e Culex
quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) (Orduz et al., 1998). Estas proteínas apresentam peso
molecular de 81 e 84 kDa, respectivamente. Portanto, as proteínas do grupo Cry10 e Cry11
são ativas contra dípteros.
Cry12Aa é uma toxina com atividade dupla contra nematoídes e ácaros (Monnerat &
Bravo, 2000) e apresenta peso molecular de 142 kDa, enquanto Cry13 é tóxica apenas para
nematóides e apresenta uma proteína de 88kDa (Crickmore et al., 2002). A proteína Cry14Aa
foi isolada da estirpe B. thuringiensis subsp. sotto codifica uma proteína de 132 kDa
(Crickmore et al., 2002) eé ativa contra dípteros e coleópteros (Monnerat e Bravo, 2000).
A toxina do tipo Cry15 apresenta atividade específica contra lepidópteros, codifica uma
proteína de 34 kDa e foi isolada da estirpe B. thuringiensis subsp thompsoni (Brown &
Whiteley, 1992),
Ressalta-se, contudo, que nem todos os cristais são oriundos da mesma espécie de
bactéria. Por exemplo, as proteínas Cry16 e Cry17 cujos genes cry16Aa e cry17Aa foram
isolados a partir da estirpe CH18 da bactéria anaeróbica Clostridium bifermentans subsp.
malaysia e não de uma subespécie de B. thuringiensis. A proteína Cry16 apresentou atividade
contra três insetos da ordem Diptera: A. aegypti, C. pipiens e Anopheles stephensi, entretanto
a proteína Cry17 não apresentou atividade significativa contra insetos da ordem Diptera. Estas
toxinas apresentaram peso molecular de 71 e 72 kDa, respectivamente (Barloy et al, 1996,
1998).
14
As proteínas Cry18, do mesmo modo que as proteínas Cry16 e Cry17, não foram
isoladas de nenhuma estirpe de B. thuringiensis. As proteínas Cry18Aa, Cry18Ba e Cry18Ca
foram isoladas do cromossomo do patógeno obrigatório Bacillus poppiliae e apresentaram
peso molecular de 79, 76 e 78 kDa, respectivamente (Crickmore et al., 1998). O gene
cry18Aa codifica uma proteína com atividade contra o coleóptero Melolontha melolontha L
(Coleoptera: Scarabaeidae), que apresenta 40% de identidade com a proteína Cry2 de B.
thuringiensis (Zhang et al., 1997).
As proteínas Cry19 mostraram atividade contra dípteros e possuem dois integrantes:
Cry19Aa e Cry19Ba. Cry19Aa foi isolada de B. thuringiensis subsp. jegathesan, com peso
molecular de 75 kDa (Rosso & Delecluse, 1997), enquanto a Cry19Ba foi isolada de B.
thuringiensis subsp higo e apresenta peso molecular de 78 kDa e apresenta atividade para C.
pipiens, mas não para A. stephensi, além disso, possui 49% de identidade e 56% de
similaridade com Cry19Aa.
Cry20Aa foi isolada da estirpe B. thuringiensis subsp. fukuokaensis e mostrou
atividade contra os dípteros A. aegypti e C. quinquefasciatus e codifica uma proteína de 86
kDa (Lee & Gill, 1997). Cry21Aa e Cry21Ba são eficazes contra nematóides, enquanto
Cry22Aa é eficaz contra himenópteros e apresenta peso molecular de 79kDa; já as proteínas
Cry22Ab e Cry22Ba apresentam toxicidade a insetos da ordem Coleoptera (Crickmore et
al., 2002). As proteínas Cry23 e Cry24 cujos alvos ainda não foram determinados, embora se
saiba que elas são codificadas por um gene críptico.
A proteína do tipo Cry25Aa foi isolada da estirpe de B. thuringiensis subsp. jegathesan
é ativa contra dípteros e apresenta peso molecular de 76 kDa (Crickmore et al., 2002).
Cry26Aa e Cry28Aa foram isoladas de B. thuringiensis subsp. finitimus e não tiveram ainda
sua atividade determinada (Wojciechowska et al., 1999). Cry27Aa foi isolada da estirpe de
B. thuringiensis subsp. higo e apresenta peso molecular de 94 kDa (Crickmore et al., 2002).
Cry29Aa e Cry30Aa foram isoladas da estirpe B. thuringiensis subsp medellin e são
eficazes contra insetos da ordem Diptera. As proteínas do tipo Cry31, Cry32 e Cry33 não
tiveram seus alvos determinados até o momento. As proteínas Cry32Aa, Cry32Ba e Cry32Ca
foram isoladas de B. thuringiensis subsp. yunnanensis e a proteína Cry33Aa foi isolada da
estirpe B. thuringiensis subsp. dakota (Crickmore et al., 2002).
15
As proteínas do grupo Cry34 apresentam quatro integrantes: Cry34Aa, Cry34Ab,
Cry34Ac e Cry34Ba com peso molecular de 14 kDa. Já as proteínas Cry35Aa, Cry35Ab e
Cry35Ac apresentam peso molecular de 44 kDa. As toxinas do grupo Cry34 e Cry35
mostraram-se ativas contra o coleóptero Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae)
(Crickmore et al., 2002; Ellis et al., 2002).
As proteínas Cry36 e Cry38 são ativas contra insetos da ordem Coleoptera. A proteína
Cry37 ainda não teve seu alvo determinado. As proteínas Cry39 e Cry40 foram isoladas da
estirpe de B. thuringiensis subsp. aizawai e apresentaram atividade mosquitocida
(Crickmore et al., 2002).
As proteínas Cyt são constituídas pelos grupos Cyt1 e Cyt2. A classe Cyt1 possui três
integrantes: Cyt1Aa, Cyt1Ab e Cyt1Ba os quais foram isolados, respectivamente, de
estirpes de B. thuringiensis subsp. israelensis (Ward et al., 1988), B. thuringiensis subsp.
medellin (Thiery et al., 1997) e B. thuringiensis subsp. neoboensis. Todas apresentaram
peso molecular de 27 kDa (Crickmore et al., 2002). A classe Cyt2 possui cinco integrantes:
Cyt2Aa, Cyt2Ba, Cyt2Bb, Cyt2Bc e Cyt2Ca. As proteínas Cyt2Aa e Cyt2Ba foram isoladas,
respectivamente, das estirpes de B. thuringiensis subsp. kyushuensis e B. thuringiensis subsp
israelensis, ambas apresentaram peso molecular de 29 kDa. A proteína Cyt2Bb foi isolada
de B. thuringiensis subsp jegathesan e apresenta peso molecular de 30 kDa (Cheong & Gill,
1997). Todas essas proteínas são ativas contra insetos da ordem Diptera. Com relação a Cyt2Bc
pouco se sabe e, até o momento, seu alvo ainda não foi determinado. Finalmente a Cyt2Ca
apresenta atividade contra insetos da ordem Coleoptera e contra Ctenocephalides spp.
(Siphonaptera: Pulicidae) (Crickmore et al., 2002).
α-exotoxina
A α-exotoxina conhecida também como fosfolipase C, lecitinase ou fosfatidilcolina
fosfohidrolase é uma enzima que possui atividade citolítica ao atuar sobre os fosfolipídeos
que formam as membranas de diversos tipos celulares (Faust & Bulla Jr., 1982). Esta
toxina é encontrada no sobrenadante de culturas e é altamente tóxica para certos insetos através de
administração oral ou intra-hemocélica, causando degeneração e lise de hemócitos (Krieg, 1971). O
gene correspondente a esta exotoxina já foi clonado e seqüenciado (Lechner et al., 1989).
16
β-exotoxinas
A β-exotoxina ou thuringiensina é uma toxina termoestável produzida por certas estirpes
de Bt durante a fase vegetativa e secretada no meio de cultura. Ela é produzida em grande
quantidade por estirpes do sorotipo H1 e em menores quantidades por algumas estirpes dos
sorotipos H4a4b, H4a4c, H5, H9, H10, H11, H12 (Sebesta et al., 1981). A toxina do tipo Ié um
análogo do ATP e é composta de adenina, ribose, glicose e ácido fosfoalárico, com massa
molecular de 701 daltons (Farkas et al., 1969). Esta toxina atua inibindo a ação da RNA
polimerase, através da competição pelo ATP eé altamente tóxica para várias ordens de insetos,ácaros,
nematóides e também vertebrados, com efeitos teratogênicos e mutagênicos (Sebesta et al., 1981).
Assim, a partir de 1970, os produtos comerciais de Bt à base de linhagens do sorotipo H1 foram
substituídos por outrosà base de linhagens não produtoras de β-exotoxina (Sebesta et al., 1981).
A β-exotoxina do tipo II é produzida por estirpes pertencentes ao sorotipo H8a8b
(morrisoni), é um análogo do UTP e apresenta toxicidade superior à toxina do tipo I,
principalmente para coleópteros (Levinson et al., 1990). Estes autores afirmaram que os genes
responsáveis pela síntese de β-exotoxina estão localizados em plasmídeos de 75 ou 110 MDa.
Vip3A
Uma nova classe de proteínas inseticidas, Vip3A, com atividade contra larvas de
lepidópteros foi descrita por Estruch et al. (1996). Essas proteínas são produzidas e secretadas por
algumas estirpes durante a fase vegetativa e de esporulação, têm uma massa molecular predita de
88,5 kDa, não têm homologia com proteínas conhecidas e apresentam atividade contra insetos
pouco sensíveisà maioria das δ-endotoxinas, como os noctuídeos Agrotis ipsilon, S. frugiperda e
S. exigua. A clonagem e caracterização de dois genes homólogos, vip3A(a) e vip3A(b), de
diferentes estirpes foram descritas (Estruch et al., 1996). Esta foi uma descoberta importante,
pois atualmente não só se aproveitam a mistura de esporos e cristais obtidos após o cultivo de
Bt, como também poderá ser utilizado o sobrenadante das mesmas.
17
Utilização
B. thuringiensis pode ser considerado como o agente biológico de maior potencial
para o controle de insetos-praga florestais, agrícolas e vetores de doença, graças à
especificidade das δ-endotoxinas aos insetos e invertebrados-alvo, e sua inocuidade aos
vertebrados e meio ambiente, inclusive insetos benéficos e inimigos naturais (Krieg &
Langenbruch, 1981), fazendo deste agente um componente-chave em estratégias de manejo
integrado de pragas (Bravo & Quintero, 1993; Schnepf et al., 1998). Além disto, pesticidas à
base de proteínas Cry têm baixo custo de desenvolvimento e registro, em relação a um novo
inseticida químico sintético (Schnepf et al., 1998).
Bioinseticidas à base de Bt têm sido usados em todo o mundo com sucesso há quase
quatro décadas, correspondendo a cerca de 90% dos biopesticidas comercializados no mundo
(Bravo & Quintero, 1993) e a 1,5-2,0% do mercado total de inseticidas (Dias, 1992), tendo
sido responsável por um mercado de US$ 100 milhões em 1990. No início de 1998, havia
aproximadamente 200 produtos à base de Bt registrados nos Estados Unidos (Schnepf et al.,
1998), desenvolvidos por várias companhias tais como Abbott, Sandoz, Bactec, Novo Nordisk,
Mycogen. Exemplos de produtos à base de Bt podem ser vistos na tabela. Os produtos
contendo toxinas específicas para lepidópteros são, comercialmente, as mais importantes, pois
a maioria dos biopesticidas à base de Bt usados para controlar pragas agrícolas é à base da
estirpe HD-1 da subespécie kurstaki, a qual tem alta toxicidade e amplo espectro de ação
dentro da ordem Lepidoptera (Navon, 1993). A maior parte do mercado de Bt (60-70%) é
dirigida para o controle de pragas florestais (Lymantria dispar nos EUA e Choristoneura
spp. no Canadá), através de pulverizações aéreas, sendo o principal pesticida usado nessas
florestas (Navon, 1993; van Frankenhuyzen, 1993). Produtos à base de B. thuringiensis
subsp. israelensis são responsáveis por aproximadamente 20% desse mercado (Navon, 1993),
sendo estes pesticidas muito efetivos e potentes no controle de mosquitos culicídeos e
simulídeos, muitos dos quais vetores de doenças.
Pesquisas visando obter produtos mais eficientes, mais estáveis e com espectro de
atividade mais amplo estão sendo desenvolvidas usando tecnologias modernas como a do
DNA recombinante. Já existem produtos engenheirados com maior persistência em campo do
18
que os convencionais. Um dos primeiros produtos de B. thuringiensis geneticamente
engenheirados e aprovado para uso agrícola nos EUA foi o bioinseticida MVP (Mycogen,
San Diego, CA), recomendado para o controle de P. xylostella e outros lepidópteros. Neste
produto, o gene cry1Ac é expresso em altos níveis em células de Pseudomonas fluorescens, onde
os cristais permanecem encapsulados (processo denominado CellCap), o que lhe confere
maior persistência no campo (Gelernter & Schwab, 1993). Outros produtos, como o M-One
Plus (Mycogen) à base da estirpe san diego, específica para o controle de coleópteros,
desenvolvida usando o mesmo processo e recomendada para o controle do crisomelídeo L.
decemlineata em batata, jáestãoàdisposição.
Há produtos geneticamente manipulados para criar combinações de genes, através da
conjugação de estirpes distintas, com ação contra pragas diversas como coleópteros e lepidópteros,
como, por exemplo, o produto Foil (Ecogen), recomendado para o controle do complexo
de insetos da batata.
Também jáé possível a clonagem e expressão de genes de delta-endotoxinas em vírus,
algas e bactérias habitantes do solo e do sistema vascular de plantas, que servem como
sistema de transporte. Como exemplo de vírus temos o Vírus da poliedrose nuclear de
Autographa californica (AcNPV) com o gene cry1Ab ou cry1Ac de delta-endotoxina no seu
genoma. Neste sistema, as células do inseto expressam a toxina e a velocidade de ação do vírusé
acelerada. A introdução do gene cry1Ac de Btk já foi feita na bactéria endofítica Clavibacter
xyli subsp. cynodontis a qual é usada para o controle do lepidoptero Ostrinia nubilalis
(Lepidoptera: Pyralidae) em milho. Bactérias do solo, como Pseudomonas cepacia e
fluorescens transformadas com genes de Bt passam a expressar toxinas e ter ação tóxica contra
insetos na risosfera. Bradyrhizobium expressando, nos nódulos, toxina de B.t. subsp.
tenebrionis são usados contra coleópteros que atacam raízes de plantas.
MATERIAIS E MÉTODOS
1- Recuperação na planta, e dosagem de B. thuringiensis inoculado no solo
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Este experimento terá como objetivo verificar o tempo de permanência do B.
thuringiensis nos tecidos da planta de algodão. Para isso será utilizada uma estirpe de B.
thuringiensis marcada com proteína fluorescente, o que a diferenciará de outras estirpes de B.
thuringiensis.
Este trabalho será realizado em cooperação com a Universidade de Cardiff. O
pesquisador responsável irá inserir o gene green fluorescent protein (gfp) no genoma do B.
thuringiensis kurstaki (Btk) que é a estirpe padrão para matar lepidópteros. O método de
transformação será por bombardeamento.
A estirpe marcada será crescida em meio NYSM (Yousten, 1983) em incubador
rotativo (200 rpm, 30°C, 48 horas). Em seguida, serão inoculadas 60 plantas semeadas em
solo estéril e 60 plantas semeadas em solo não estéril. Será aplicado 1 ml de cultivo de Bt-gfp
no solo próximoàs raízes. Duas vezes por semana os tecidos de 3 plantas provenientes de cada
solo, serão coletados para detectar a presença da estirpe marcada. Será determinada ainda a
quantidade de Bt-gfp em cada um dos tecidos da planta. Para isso os tecidos serão pesados
antes do isolamento da bactéria. Três folhas de cada planta serão coletadas e oferecidas como
alimento para S. frugiperda e A. argilacea a fim de verificar se existe toxicidade das folhas
a esses insetos.
2- Determinação da melhor forma de inoculação do B. thuringiensis
Este trabalho será realizado em cooperação com a Embrapa Cerrados.
Diferentes formas de inoculação do B. thuringiensis serão testadas, de forma a se
recuperar as maiores quantidades de Bt-gfp na planta, tais como: adicionados à turfa,
adicionados à semente com diferentes substancias adesivas, formulados como microencapsulados, etc. A proporção de bactéria será de 40 ml de caldo de Bt-gfp para cada 100
gramas de turfa ou semente.
A forma de avaliação será realizada como a descrita no ítem anterior, verificando-se a
presença e quantidade da bactéria em cada um dos tecidos. Três folhas de cada planta serão
coletadas e oferecidas como alimento para S. frugiperda e A. argilacea a fim de verificar se
existe toxicidade das folhas a esses insetos.
20
3- Ensaios utilizando as estirpes de B. thuringiensis pertencentes ao Banco de Bactérias
Entomopatogênicas da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Uma vez determinada a forma e viabilidade da utilização de B. thuringiensis, as
melhores estirpes do banco serão testadas para controle de lepidópteros e coleópteros. No caso
dos lepidópteros serão utilizados como modelo S. frugiperda e A. argilacea. No caso de
coleópteros, será utilizado o bicudo-do-algodoeiro. As estirpes utilizadas serão aquelas que
apresentaram maior toxicidade aos insetos supra-citados em experimentos anteriormente
realizados; no caso de lepidópteros as de número S811, S845, S1905 e no caso de coleópteros
as de número S811, S601. Em ambos os ensaios serão utilizados os padrões B. thuringiensis
kurstaki (lepidópteros) e B. thuringiensis tenebrionis (coleópteros). Para cada inseto, serão
utilizadas 4 repetições com 20 plantas para cada bactéria e para o controle. Serão colocados 10
insetos por planta. O experimento será repetido pelo menos 3 vezes.
4- Testes em condições simuladas de campo
Uma vez definidos a estirpe de B. thuringiensis, a forma de aplicação e a freqüência da
aplicação, serão realizados testes de campo em condições simuladas. Este trabalho será realizado
na Embrapa Algodão, que conta com área experimental e condições propícias para a realização do
ensaio.
O dispositivo experimental será delineado em blocos ao acaso, com quatro
tratamentos e sete repetições. Cada parcela será constituída de cinco linhas de algodoeiro,
compreendendo cada uma vinte e cinco plantas. Os tratamentos serão: Cepa de Bt
selecionada para lepidópteros, cepa Bt selecionada para coleópteros, mistura das duas cepas,
produto químico.
21
RECURSOS FÍSICOS
O projeto aqui proposto é de natureza multidisciplinar e envolve a utilização de
conceitos e técnicas de diversas áreas, sendo as principais: microbiologia geral, microbiologia
de solos, Bioquímica e biologia molecular e entomologia .
O projeto será desenvolvido por quatro instituições: Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, nos laboratórios de Bacteriologia e microscopia eletrônica, que contam com
quase toda a infra-estrutura necessária para a caracterização de estirpes, realização de bioensaios,
caracterização de tecidos; a Universidade de Cardiff, que conta com estrutura e equipamentos
de biologia molecular; a Embrapa Cerrados, que conta com estrutura para desenvolver
diferentes inoculantes e a Embrapa Algodão, que conta com infra-estrutura necessária a
realização de testes de campo simulados.
Esses centros contam com quase todos os
equipamentos necessários à execução do projeto e almejam adquirir os outros equipamentos
restantes com a aprovação desta proposta. A listagem completa dos equipamentos disponíveis
e necessários estão descritos no item Equipamentos, na listagem dos formulários obrigatórios.
22
RECURSOS HUMANOS
A equipe técnica é composta por pesquisadores da Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, Embrapa Algodão, Embrapa Cerrados, Universidade de Cardiff, alunos de
pós-graduação em biologia molecular da Universidade Católica de Brasília e de agronomia da
Universidade de Brasília e estudantes de gradução dos cursos de agronomia e biologia da
Universidade de Brasília e da Universidade Católica de Brasília.
Na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia os laboratórios envolvidos são o de
bacteriologia e microscopia eletrônica, sob responsabilidade da Dra. Rose Monnerat e do Dr.
Guy Capdeville. O laboratório de Bacteriologia possui uma coleção de Bactérias
entomopatogênicas, onde estão armazenadas muitas estirpes de Bacillus thuringiensis
isoladas a partir de amostras coletadas no Brasil. Essas estirpes estão sendo testadas contra
S.a frugiperda e serão testadas contra as demais lagartas da cultura do algodão. A Embrapa
Cerrados participará dos experimentos com inoculantes. Os testes de campo serão realizados
na Embrapa Algodão e a transformação da bactéria seráefetuada pela Universidade de Cardiff.
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EQUIPE TÉCNICA
Nome
Rose Gomes
Função
Formação acadêmica
% Dedicação
Coordenador
PhD – Microbiologia/Entomologia
100
Pesquisador
PhD Bioquímica e Biologia Molecular
50
PhD Biologia Molecular
50
PhD
30
Monnerat Solon de
Pontes
Colin Berry
colaborador
Roseane Cavalcanti Pesquisador
Santos
colaborador
Ieda Mendes
Pesquisador
Colaborador
Lilian Botelho Praça Técnica de nível MSc- Agronoma
100
superior
Erica Martins
Estudante
de BSc - Biologia
100
BSc - Biologia
100
mestrado
Caroline Demo
Estudante
Mestrado
4 técnicos de nível
100
superior
24
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29
FORMULÁRIOS OBRIGATÓRIOS
FORMULÁRIO 1
FACUAL
Carta Consulta
Fundo de apoio à cultura do algodão
1. Dados Cadastrais
órgão/entidade proponente
CGC
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia - Cenargen
00348003/0038-02
endereço
Parque Estação Biológica Av. W5 Norte - Final
cidade
UF
CEP
DDD/telefone
Brasília
DF
70770900
(61) 448-4677
nome do responsável
E.A.
CPF
Rose Gomes Monnerat Solon de Pontes
512803701-06
CI/órgão exped.
cargo
função
567.027 – SSP/DF
Pesquisador III
Bióloga
endereço
CEP
SQN 209 bloco E apto. 205
70.854-050
2. Outros Partícipes
nome
CGC/CPF
E.A.
Roseane Cavalcanti dos Santos
endereço
CEP
Embrapa Algodão – Rua Oswaldo Cruz, 1143, Centenário, Campina Grande - PB
58.107-720
3. Descrição do Projeto
título do projeto
período de execução
Utilização de Bacillus thuringiensis endofíticos para controle de insetos- início
maio de 2004
praga do algodoeiro
término
abril de 2005
Identificação do objeto
Testar diferentes formas de aplicação de B. thuringiensis em algodão para que este, colonizando a planta,
combata insetos-praga da cultura
justificativa da proposição
30
O Bacillus thuringiensis vem sendo utilizado há muitos anos como bioinseticida para controle de
diversos insetos-praga. A grande limitação do seu uso, é o fato do inseto ter de ingerir esta
bactéria para morrer, pois a toxina do Bt atua a nível do intestino da larva. Com isso, insetos que
não entram em contato com a bactéria não podem ser combatidos. Este fato fez com que
pesquisadores buscassem novas estratégias para controle de insetos, como as plantas
transgênicas.
Recentes trabalhos realizados em nosso laboratório indicaram que o Bt pode ser uma bactéria
endofítica, pois isolamos diversas estirpes desta bactéria de diferentes partes do algodão. Estas
plantas vieram de um campo onde nunca foi detectada a presença de lagartas e constatamos
que Spodoptera frugiperda alimentada com folhas desse algodão tinham seu desenvolvimento
larval alterado e ao fim de 5 dias morriam. Num experimento posterior, inoculamos Bt marcado
próximo às raízes do algodão e o recuperamos no inseto que se alimentou das folhas desta
mesma planta.
Este tipo de trabalho nunca foi realizado em nenhum local do mundo, mas sabe-se que muitas
vezes as plantas podem se tornar resistentes a insetos devido a presença de fungos no seu
interior.
O objetivo do trabalho é verificar se realmente o Bt pode colonizar tecidos da planta de algodão,
tornando-a resistente a insetos e neste caso ser utilizado como inoculante ou como produto para
aplicação nas raízes.
É importante salientar que esta é uma estratégia diferente, que pode tornar a planta resistente,
sem ser via transgenia.
Como se trata de algo novo, gostaríamos de um apoio financeiro de um ano, para que tenhamos
subsídios científicos para, caso nossas hipóteses sejam confirmadas, submeter o projeto
posteriormente para a realização de testes de campo.
Valor pleiteado junto ao FUNDO: R$98.730,00
Valor da Contrapartida: R$ 411.844,00
Valor TOTAL do projeto: R$ 510.574,00
Solicitou apoio a outra Instituição? Não( x )
Sim(
) Qual?
Autorizo a análise desta CARTA CONSULTA e do eventual PROJETO TÉCNICO, segundo a sistemática
estabelecida e, em particular que seja submetido ao exame de consultores Ad Hoc escolhidos pelo
FACUAL, cujas identidades serão mantidas em sigilo.
Declaro a regularidade junto aosórgãos, da Receita Federal, Estadual e obrigações trabalhistas,
disponibilizando as competentes certidões a qualquer tempo que forem solicitadas.
Assinatura
Local e Data
31
FORMULÁRIO 2
Cronograma de Execução e
Plano de Aplicação
meta
etapa
fase
especificação
indicador físico
unidade
1- Determinar a melhor forma
de inoculação do B.
thuringiensis para proteger a
planta do ataque de insetos
1
Marcar a estirpe de B. thuringiensis com
gene da proteína fluorescente
Estirpe
marcada
1
2
Testar diferentes formas de inoculação do
B. thuringiensis
1
3
Avaliar a periodicidade da aplicação
4
Selecionar dentre as estirpes tóxicas do
banco, quais as melhores para matar S.
frugiperda, A. argilacea e A. grandis
Determinar em quais tecidos a bactéria se
localiza e se reproduz
Disponibilizaçã
o de
metodologia
Disponibilizaçã
o de
metodologia
Número de
estirpes
2- Esclarecer o mecanismo
1
de colonização da planta pelo
B. thuringiensis
2
3- Testar a eficiência da
tecnologia em condições
controladas de campo
4- Avaliação geral dos
resultados
1
1
natureza da despesa
Especificação
Equipamentos importados e nacionais
Material de consumo nacional
Material de consumo importado
Passagens aéreas
Recursos Humanos
Manutenção de equipamentos
Diárias
Serviços de terceiros
total geral
Trabalho
científico
quantidade
1
2
1
Verificar o tipo de interação entre a planta e Trabalho
a bactéria
científico
Executar testes de campo
Número de
testes
1
Compilação dos resultados, avaliação geral
1
total
407.400,00
23.130,00
12.200,00
50.444,00
2.000,00
9.000,00
6.400,00
510.574,00
Relatório
concedente
42.000,00
23.130,00
12.200,00
6.000,00
9.000,00
6.400,00
98.730,00
3
Proponente
365.400,00
44.444,00
2.000,00
411.844,00
32