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EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA EMBRAPA RECURSOS GENÉTICOS E BIOTECNOLOGIA Utilização de Bacillus thuringiensis endofíticos para controle de insetos-praga do algodoeiro ROSE GOMES MONNERAT SOLON DE PONTES BRASÍLIA ABRIL 2004 1 Indice Resumo………………………………………………………………………………...... 3 Abstract………………………………………………………………………………… 4 Introdução……………………………………………………………………………… 5 Objetivos………………………………………………………………………………… 8 Objetivos específicos........................................................................................................ 8 Metas…………………………………………………………………………………… 8 Revisão de literatura……..……………………………………………………………… 8 1- Microrganismos endofíticos.......................................................................................... 8 2- Bacillus thuringiensis..............................................................................................… 9 Materiais e Métodos.......................................................................................................... 19 Recursos físicos................................................................................................................. 22 Recursos Humanos......................................................................................................… 23 Equipe Técnica.................................................................................................................. 24 Referências bibliográficas................................................................................................. 25 Formulários obrigatórios................................................................................................... 30 Formulário 1- Carta consulta...................................................................................…… 30 Formulário 2- Cronograma de execução e Plano de Aplicação..............................…… 32 Formulário 2.1 – Consolidado geral do orçamento............………................................... 33 Formulário 2.2 – Orçamento: equipamentos e material permanente.........………............ 35 Formulário 2.3 – Orçamento: material de Consumo...............................................…… 39 Formulário 2.4 – Orçamento: passagens............................................………................... 42 Formulário 2.5 – Orçamento: recursos humanos............………....................................... 46 Formulário 2.6 – Orçamento: outros serviços de terceiros.....................................…… 48 Formulário 2.7 – Orçamento: manutenção de equipamentos.………............................... 49 Formulário 2.8 – Orçamento: diárias....………..................... ........................... ............... 50 Formulário 3 - Cronograma de desembolso...............................................……….......... 52 Formulário 4 – Cadastro de pesquisadores........................... ...........………..................... 54 Formulário 5- Declaração de Adimplência...................………....... ................................. 64 Formulário 6- Declaração de contrapartida.................………........ ................................. 65 Formulário 7- Termo de compromisso inicial........................... ……............................... 66 2 RESUMO A cultura do algodão é uma das mais atacadas por insetos e, segundo o “IPM Working for Development” quase 25% dos pesticidas utilizados no mundo inteiro são gastos na cotonicultura. Alternativas de controle de insetos, incluindo a utilização de microrganismos entomopatogênicos como bactérias, fungos e vírus, plantas transgênicas com genes de bactérias ou inibidores de proteinases de insetos e inimigos naturais têm sido amplamente estudados. No entanto, devido à importância do problema, outros estudos poderão ser viabilizados como, por exemplo, a utilização de organismos endofíticos. Muitas bactérias do gênero Bacillus foram isoladas de tecidos de plantas, entretanto o primeiro relato do isolamento de B. thuringiensis a partir de plantas de algodão ocorreu no ano passado, quando em nosso laboratório foram isoladas 13 estirpes. Estudos para inoculação e colonização de B. thuringiensis na planta podem apontar para uma nova forma de controle de insetos, nunca antes testada com esta bactéria, reduzindo, assim, a utilização de inseticidas e de suas conseqüências indesejáveis. 3 ABSTRACT Cotton is one of the crops most attacked by insects and according to “IPM Working for Development”, almost 25% of chemical products used world wide against insects are used on cotton crop. Insect control alternatives, including the use of entomopathogenic microrganisms such as bacteria, fungi and virus, transgenic plants with bacterium or insect proteinases inhibitors genes and natural enemies, have been studied. Due to the importance of the problem, other studies could be done such as the utilization of endophytic organisms. Many bacteria of the Bacillus genus were isolated from plant tissues, although the first isolation reported of B. thuringiensis from cotton plants took place last year, when 13 strains were isolated in our lab. Inoculation and colonization studies of B. thuringiensis in cotton open a new perspective for insect control that has never been tested before. 4 INTRODUÇÃO O cultivo extensivo de grandes culturas, como soja, milho, algodão e canola, entre outras, demanda elevado investimento em agrotóxicos devido ao complexo de pragas que as hospedam, em especial lepidópteros e coleópteros. Os danos provocados por cada uma delas podem variar de uma região para outra, e seu controle pode chegar a até 22% do custo da produção (Édio Brunetta comunicação pessoal, 2004). Dentre os insetos associados ao algodoeiro, destacam-se como pragas importantes: 1- Curuquerê - Alabama argilacea (Hueb., 1818 ) (Lepidoptera: Noctuidae) 2- Lagarta-da-maçã - Heliothis virescens (Fabr., 1781) (Lepidoptera: Noctuidae) 3- Lagarta-rosada - Pectinophora gossypiella (Saund, 1844) (Lepidoptera - Gelechiidae) 4- Lagarta-do-cartucho-do-milho – Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae). 5- Bicudo-do-algodeiro – Anthonomus grandis (Boheman, 1853) (Coleoptera: Curculionidae) O curuquerê ataca as folhas, destruindo o limbo, as nervuras e os pecíolos. O severo desfolhamento que pode causar reduz a produção. Provoca, ainda, a maturação forçada das maçãs diminuindo a resistência das fibras. A lagarta da maçã destrói as maçãs e os botões florais, favorecendo ainda, a penetração de microrganismos através dos orifícios que forma. A lagarta rosada ataca inicialmente os botões florais, impede a abertura das pétalas, impossibilitando conseqüentemente a formação das maçãs. Estas, no entanto, quando formadas são igualmente atacadas e as fibras e as sementes são destruídas. A lagarta-do-cartucho-do-milho alimenta-se das folhas do algodoeiro no seu estágio mais jovem e penetra nas maçãs e nos botões florais, causando grande destruição e dificultando o seu controle. O bicudo-do-algodoeiro é um inseto de difícil controle, pois seu período larval ocorre dentro das maçãs e botões florais do algodoeiro. Essas estruturas podem ficar completamente destruídas (Nakano et al., 1992). A principal forma de controle desses insetos tem sido feita pela utilização de produtos químicos (França, 1993; Dias et al., 2002), cuja aplicação exige um grande investimento, onerando ou mesmo inviabilizando em alguns casos a produção (Castro, 5 1992). Esses agroquímicos causam danos ao meio ambiente e geram riscos de intoxicação ao homem. A importância do controle de pragas do algodoeiro e o aumento da consciência da população para os efeitos diretos e indiretos dos pesticidas na saúde pública e no ambiente em geral, tem demandado novas formas de controle de pragas, que sejam mais econômicas e menos danosas ao ecossistema. No caso específico do controle de pragas, alternativas biológicas incluem a utilização de bactérias, fungos, vírus e até de substancias produzidas pelo próprio inseto. Esses agentes podem ser manipulados para o aumento da patogenicidade, ampliação do espectro de ação, produção industrial ou a incorporação de genes inseticidas em espécies vegetais levando à obtenção de plantas transgênicas (Perlak et al., 1990). Dos vários agentes microbianos que possuem atividade entomopatogênica, destacase o Bacillus thuringiensis (Berliner), bactéria de ampla distribuição geográfica, específica para controlar insetos. Uma das grandes vantagens de sua utilização é sua inocuidade ao homem e animais domésticos, além de seu efeito não poluente ao ambiente. A atividade inseticida dessa bactéria é devida à produção de inclusões protéicas cristalinas durante a fase de esporulação. Estas proteínas denominam-se -endotoxinas ou cristal parasporal (Aronson, 1986). A maioria das cepas de B. thuringiensis pode sintetizar mais de um tipo de cristal (Lereclus et al., 1993), que podem estar formados por distintas -endotoxinas, relacionadas entre si. Registros recentes citam de mais de 120 toxinas diferentes produzidas por esta bactéria. Laboratórios em todo o mundo procuram estirpes com novas toxinas e outras características de patogenicidade, que possibilitem uma maior disponibilidade de princípios ativos que poderão ser usados para o estabelecimento de estratégias de controle. A Embrapa conta com uma coleção de 1.500 estirpes de B. thuringiensis entomopatogênicos. Dessas estirpes, algumas têm atividade comprovada contra lepidópteros e coleópteros. O B. thuringiensis pode ser utilizado tanto na forma nativa, como um bioinseticida, quanto como doador de genes para o desenvolvimento de plantas transgênicas. Recentemente no laboratório de bacteriologia do Núcleo de Controle Biológico da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia foram iniciados estudos para verificar a possibilidade da utilização de B. thuringiensis associado a bactérias endofíticas. Muitas 6 bactérias do gênero Bacillus foram isoladas de tecidos de plantas (Azevedo et al., 2000). Sabe-se também, que as bactérias pertencentes a esse gênero têm a capacidade de conjugar, trocando desta forma, material genético. Assim, pesquisas foram planejadas para encontrar Bacillus endofíticos a partir de plantas de algodão e conjugá-los com estirpes tóxicas a lepidópteros e coleópteros armazenados em na coleção da Embrapa. Para surpresa do grupo, nos primeiros ensaios foram isoladas 20 estirpes de B. thuringiensis, algumas das quais contendo toxinas ativas contra lepidópteros (Monnerat et al., 2003). Concomitantemente a este trabalho foi realizado um grande levantamento bibliográfico onde foi constatado este trabalho foi o primeiro relato do isolamento de B. thuringiensis a partir de tecidos de plantas. Na seqüência dos ensaios laboratoriais, foi verificado que B. thuringiensis, uma vez inoculado no solo próximo às raízes da planta, espalha-se por todos os tecidos, chegando as folhas. Os próximos passos deste trabalho serão compreender os mecanismos que fazem com que o B. thuringiensis viva no interior das plantas, e testar formas de inoculação da bactéria para que se maximize sua absorção e assim tornar a planta resistente aos diferentes insetos. Trata-se de um assunto novo, com potencial de desenvolvimento de uma nova perspectiva para o controle de insetos, através de uma nova forma de utilização de B. thuringiensis. 7 OBJETIVOS Desenvolver tecnologia para utilização de Bacillus thuringiensis como inoculante para proteger a planta do algodoeiro do ataque de insetos. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1- Selecionar as estirpes de B. thuringiensis mais adequadas, 2- Verificar o tempo de permanência do Bt nos tecidos da planta, 3- Determinar a forma de inoculação, 4- Determinar a forma e freqüência da aplicação 5- Determinar o efeito sobre populações-alvo METAS 1- Determinar a melhor forma de inoculação do B. thuringiensis para proteger a planta do ataque de insetos em laboratório e em campo 2- Esclarecer o mecanismo da colonização da planta pelo B. thuringiensis 3- Avaliar viabilidade da tecnologia REVISÃO DE LITERATURA 1- Microrganismos endofíticos Microorganismos endofíticos são aqueles que habitam o interior das plantas durante pelo menos um período do ciclo de suas vidas (Azevedo, 1998). No início da década de 1970, microrganismos endofíticos eram considerados neutros, não causando danos ou benefícios às plantas, mas sabe-se atualmente que esses microrganismos, em muitos casos, 8 desempenham um papel importante na proteção da plantas contra predadores e patógenos (Azevedo et al., 2000). Weber (1981) foi, provavelmente, o primeiro pesquisador a relatar a proteção de plantas a insetos devido a um fungo entomopatogênico. Trabalhos posteriores sustentaram esses dados em gramíneas e outras plantas (Funk et al., 1983; Claydon et al., 1985). A partir de bactérias endofíticas, novas formas de controle biológico vêm sendo desenvolvidas com o auxílio da engenharia genética. Como exemplo, deve-se mencionar a transformação da bactéria Clavibacter xyli com o gene cry1Ac de Bacillus thuringiensis Berliner que codifica uma proteína tóxica a alguns insetos da ordem Lepidoptera (Tester, 1992). Muitas bactérias do gênero Bacillus foram isoladas a partir de tecidos das plantas (Azevedo et al., 2000), entretanto nenhum autor cita o isolamento da espécie B. thuringiensis. Um trabalho recentemente desenvolvido na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia demonstrou que existem estirpes de B. thuringiensis colonizando tecidos de plantas de algodão (Monnerat et al., 2003), abrindo assim, a possibilidade de uma nova forma de controle de insetos. 2- Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria gram positiva, da família Bacillaceae que produz no momento de sua esporulação inclusões protéicas cristalinas. Essas inclusões contêm proteínas denominadas delta-endotoxinas que formam atualmente uma família de 110 membros, classificados em 40 grupos. Elas são produzidas sob a forma de protoxinas, as quais são transformadas em peptídeos tóxicos no intestino do inseto, pela ação do pH alcalino intestinal e de proteases. A toxina ativada causa a lise das células epiteliais e a morte das larvas (Aronson et al., 1986). Uma das vantagens da utilização de Bt é sua especificidade aos insetos sensíveis, seu efeito não poluente ao meio ambiente, sua inocuidade aos mamíferos e vertebrados e ausência de toxicidade às plantas (Whiteley & Schnepf, 1986; O.M.S., 1987). Produtos à base desta bactéria para o controle de pragas agrícolas são comercializados há mais de cinqüenta anos, sendo o seu mercado anual estimado em 100 milhões de dólares. Prevê-se 9 que sua utilização aumentará na medida em que legislações de proteção ambiental mais rigorosas forem adotadas e produtos mais eficientes e baratos forem lançados (Dias, 1992). A primeira menção a doenças em insetos causada por este tipo de bactéria data de 1902, quando Ishiwata no Japão descreveu uma bactéria esporulante responsável pela mortalidade do bicho-da-seda, Bombix mori e a chamou de Bacillus sotto. Em 1911, Berliner, na Alemanha, redescreveu a mesma bactéria isolada a partir de lagartas da traça da farinha Anagasta kuhniella (Lepidoptera: Pyralidae) e, em 1915, a chamou de Bacillus thuringiensis, em homenagem à região de onde as lagartas foram coletadas (Whiteley & Schnepf, 1986; Dias, 1992). As possibilidades de utilização do Bt foram logo reconhecidas em controle biológico, e em 1938 uma formulação a base desta bactéria, a Sporeína foi produzida na França (Weiser, 1986). A partir dos anos 1950, diversos países como a Rússia, a Checoslováquia, a França, a Alemanha e Estados Unidos começaram a produzir inseticidas biológicos à base de Bt (Weiser, 1986). Na década de 1960 foi isolada uma estirpe de Bt subsp. kurstaki, chamada HD-1 (Dulmage, 1970) que apresentou uma toxicidade de 2 a 200 vezes superior às estirpes normalmente utilizadas nos produtos comerciais. A partir de então, a procura por outras estirpes, possuidoras de novas toxinas foi estimulada e em 1977, sendo isolada uma estirpe eficaz contra dípteros (Goldberg & Margalit, 1977). Alguns anos mais tarde, em 1983, uma outra estirpe foi identificada como patogênica contra coleópteros (Krieg et al., 1983). No mundo inteiro diversas estirpes de Bt foram isoladas e atualmente diversos laboratórios continuam procurando por outras novas. Existem várias coleções espalhadas pelo mundo e estima-se que existam 40.000 estirpes conhecidas. Entre estas, existem algumas que são eficazes contra diversas ordens de insetos (lepidópteros, dípteros e coleópteros) e contra outros grupos de invertebrados (nematóides, ácaros e protozoários) (Edwards et al., 1988; Feiltelson et al., 1992; Crickmore et al., 1995). Toxinas produzidas por Bacillus thuringiensis -Endotoxinas 10 Este grupo de toxinas, também chamado de proteínas Cry é um dos formadores do cristal protéico. Estas proteínas apresentam peso molecular variando de 65 a 138 kDa. Os estudos efetuados sobre a esporulação mostraram que o cristal é formado a partir do segundo estágio da esporulação e é liberado quando as células são lisadas. As etapas da esporulação e biogênese do cristal seguem os seguintes passos: Estágio 1: A célula para seu crescimento e sua parede celular se modifica; Estágio 2: O septo de esporulação é formado e a cromatina é dividida em duas partes. Começa nesse momento a aparição de uma estrutura condensada que é o cristal; Estágio 3: Formação do pré-esporo; Estágio 4: Crescimento do esporo e formação do cortex; Estágio 5: Formação do envelope esporal que envolve o esporo. O cristal, fora deste envelope, continua seu crescimento; Estágio 6: Maturação do esporo, o cristal atinge seu tamanho máximo; Estágio 7: Ruptura da célula e liberação do cristal e do esporo. A classificação das proteínas Cry baseia-se na similaridade das seqüências de aminoácidos (Crickmore et al., 1998). Existem mais de 190 diferentes genes cry e as proteínas Cry estão agrupadas em 40 classes. A atualização constante dessa nova classificação encontra-se disponível no site: WWW: http:epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html. Dentre as estirpes de B. thuringiensis, algumas apresentam um único gene codificador das proteínas Cry. Outras estirpes apresentam cinco genes diferentes, como é o caso da subespécie aizawai HD-137 e subespécie israelensis IPS-82. Esta última apresentou cinco genes codificadores da -endotoxina e um outro gene que codifica uma citolisina, todos localizados em um único plasmídeo de 72Mda (Bourgouin et al., 1988). As toxinas do tipo Cry1 têm 36 subgrupos representados por Cry1Aa,..., Cry1Ka (Crickmore et al., 1998). Algumas dessas proteínas são ativas contra insetos da ordem Lepidoptera, como por exemplo, as toxinas Cry1C e Cry1D que apresentam atividade contra Spodoptera frugiperda e Spodoptera exigua (Bravo et al., 1998) e ainda, a toxina Cry1Cb, isolada de B. thuringiensis subsp. galleriae, com massa molecular em torno de 130 kDa e tóxica a S. exigua e Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae) (Kalman et al., 1993). Cita-se, ainda a proteína Cry1E que apresenta distintas eficiências de controle em Spodoptera sp. 11 (Loguercio et al., 2001). Algumas toxinas pertencentes ao grupo Cry1 podem apresentar atividade dupla contra lepidópteros e dípteros e contra lepidópteros e coleópteros, como é o caso das proteínas Cry1Ca e Cry1Ba (Bradley et al., 1995), respectivamente. Vale ressaltar que as proteínas Cry1Ab e Cry1Ca mostraram atividade contra mosquitos (Haider & Ellar, 1987; Smith et al., 1996). O grupo de proteínas do tipo Cry2 é formado por quatro membros: Cry2Aa, Cry2Ab, Cry2Ac e Cry2Ad (Crickmore et al., 2002). A toxina do tipo Cry2A foi isolada da subespécie kurstaki. A toxina do tipo Cry2B apresenta 89% de identidade com a Cry2A e é altamente tóxica contra Lymantria dispar (Lepidoptera: Lymantriidae), Heliothis virescens (Lepidoptera: Noctuidae) e T. ni e não apresentou toxicidade contra Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Portanto, a toxina do tipo Cry2 é produzida por estirpes de várias subespécies de B. thuringiensis, apresenta alta atividade larvicida para lepidópteros e baixa para dípteros (Dankocsik et al., 1990; Wu et al., 1991). Essas toxinas apresentam peso molecular de 65 kDa e formam cristais cubóides (Hofte & Whiteley, 1989; Lereclus et al., 1989). O grupo das proteínas Cry3 apresenta quatro integrantes: Cry3Aa, Cry3Ba, Cry3Bb e Cry3Ca. Essas toxinas apresentam peso molecular de 73 a 75 kDa (Crickmore et al., 2002) e produzem cristais rombóides. Krieg et al. (1983) descreveram a primeira estirpe produtora de gene cry3. Estas proteínas são tóxicas a insetos da ordem Coleoptera, como por exemplo, Lepitnotarsa decemlineata (Besouro da batata do Colorado) (Coleoptera: Chrysomelidae) (Donovan et al., 1988). A toxina Cry3Ba foi isolada de B. thuringiensis subsp. tolworthi (Sick et al., 1990), a proteína Cry3Bb é ativa contra Diabrotica undecimpunctata (Coleoptera: Chrysomelidae), a proteína Cry3A contra o pulgão-da-batata, Macrosiphum euphorbiae (Hemiptera: Aphididae) e a proteína Cry3Ca foi isolada de B. thuringiensis subsp. kurstaki e apresentou toxicidade contra L. decemlineata superior à que as outras proteínas Cry3 apresentaram (Lambert et al., 1992). A classe Cry4 apresenta duas proteínas Cry4Aa e Cry4Ba. Essas proteínas são ativas contra dípteros. Os genes cry4A e cry4B foram isolados das estirpes de B. thuringiensis subsp. israelensis e codificaram proteínas de 128 e 135 kDa, respectivamente, e, além disso, formam cristais complexos de forma ovóide (Hofte e Whiteley, 1989) ou composta (esférica ou retangular) (Lereclus et al., 1989). 12 As proteínas Cry5 são ativas contra nematóides, ácaros e formigas e, ainda, mostram atividade contra coleópteros e lepidópteros. A proteína Cry5Aa e Cry5Ab foram isoladas de B. thuringiensis subsp. darmstadiensis e apresentam peso molecular de 152 e 142 kDa, respectivamente (Crickmore et al., 2002). Ambas as toxinas são ativas contra nematóides e ácaros (Monnerat & Bravo, 2000). Já as proteínas Cry5Ac e Cry5Ba apresentam peso molecular de 135 e 140 kDa (Crickmore et al., 2002), respectivamente e são eficazes contra himenópteros e coleópteros (Monnerat & Bravo, 2000). As toxinas Cry6 são ativas contra nematóides e ácaros (Monnerat & Bravo, 2000) e são formadas por dois integrantes: Cry6Aa e Cry6Ba (Crickmore et al., 2002). O grupo das proteínas Cry7 está representado por dois subgrupos: Cry7Aa e Cry7Ab. A toxina Cry7Aa apresenta peso molecular de 129 kDa e atividade contra coleópteros e lepidópteros (Lambert et al., 1992). A toxina Cry7Ab codifica uma proteína de 130 kDa e foi isolada de B. thuringiensis subsp. dakota (Crickmore et al., 2002) e é ativa contra coleópteros (Monnerat e Bravo, 2000). As toxinas do grupo Cry8 são três: Cry8Aa, Cry8Ba e Cry8Ca. As proteínas Cry8Aa e Cry8Ba foram isoladas de B. thuringiensis subsp. kumamotoensis e codificam proteínas de 131 e 134 kDa, respectivamente (Crickmore et al., 2002). A primeira apresenta atividade dupla para coleópteros e afídeos e a segunda apenas contra coleópteros (Monnerat & Bravo, 2000). A proteína Cry8Ca foi isolada de B. thuringiensis subsp. japonensis apresentou atividade contra um escarabeídeo, Anomala cuprea (Coleoptera: Scarabaeidae) (Hori et al., 1994; Sato et al., 1994), portanto é eficaz contra insetos da ordem Coleoptera e apresenta peso molecular de 130 kDa. A classe Cry9 é formada por seis integrantes: Cry9Aa, Cry9Ba, Cry9Ca, Cry9Da, Cry9Ea e Cry9Eb. As proteínas Cry9Aa e Cry9Ba foram isoladas de B. thuringiensis subsp. galleriae, sendo que gene cry9Aa apresenta atividade contra Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) e o gene cry9Ca foi isolado de B. thuringiensis subsp. tolworthi e é efetivo contra Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Pyralidae) e Choristoneura fumiferana (Lepidoptera: Tortricidae) (Jansens et al., 1997), a proteína Cry9Ea foi isolada de B. thuringiensis subsp. aizawai (Ben-Dov et al., 1999) e todas apresentam peso molecular de 130 kDa. A proteína Cry9Da foi isolada de B. thuringiensis subsp. japonensis e codifica uma proteína de132 kDa e é ativa contra escarabeídeos da Ordem Coleoptera (Crickmore et 13 al., 2002). Algumas destas proteínas são também eficazes contra lepidópteros (Crickmore et al., 2002). O grupo das proteínas Cry10 é constituído por apenas um subgrupo: Cry10Aa. A toxina do tipo Cry10Aa foi isolada de B. thuringiensis subsp. israelensis e codifica uma proteína de 78 kDa. Da mesma forma que Cry10A, a toxina do tipo Cry11Aa, também, foi isolada a partir de B. thuringiensis subsp. israelensis e codifica uma proteína de 72 kDa (Donovan et al., 1988). A proteína Cry11Ba foi isolada de B. thuringiensis subsp. jegathesan e apresenta alta eficácia contra os mosquitos das espécies A. aegypti, Culex pipiens e Anopheles stephensi (Diptera: Culicidae) (Delecluse et al., 1995) e a Cry11Bb foi isolada B. thuringiensis subsp. medellin e é altamente tóxica às larvas de A. aegypti, Anopheles albimanus e Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) (Orduz et al., 1998). Estas proteínas apresentam peso molecular de 81 e 84 kDa, respectivamente. Portanto, as proteínas do grupo Cry10 e Cry11 são ativas contra dípteros. Cry12Aa é uma toxina com atividade dupla contra nematoídes e ácaros (Monnerat & Bravo, 2000) e apresenta peso molecular de 142 kDa, enquanto Cry13 é tóxica apenas para nematóides e apresenta uma proteína de 88kDa (Crickmore et al., 2002). A proteína Cry14Aa foi isolada da estirpe B. thuringiensis subsp. sotto codifica uma proteína de 132 kDa (Crickmore et al., 2002) e é ativa contra dípteros e coleópteros (Monnerat e Bravo, 2000). A toxina do tipo Cry15 apresenta atividade específica contra lepidópteros, codifica uma proteína de 34 kDa e foi isolada da estirpe B. thuringiensis subsp thompsoni (Brown & Whiteley, 1992), Ressalta-se, contudo, que nem todos os cristais são oriundos da mesma espécie de bactéria. Por exemplo, as proteínas Cry16 e Cry17 cujos genes cry16Aa e cry17Aa foram isolados a partir da estirpe CH18 da bactéria anaeróbica Clostridium bifermentans subsp. malaysia e não de uma subespécie de B. thuringiensis. A proteína Cry16 apresentou atividade contra três insetos da ordem Diptera: A. aegypti, C. pipiens e Anopheles stephensi, entretanto a proteína Cry17 não apresentou atividade significativa contra insetos da ordem Diptera. Estas toxinas apresentaram peso molecular de 71 e 72 kDa, respectivamente (Barloy et al, 1996, 1998). 14 As proteínas Cry18, do mesmo modo que as proteínas Cry16 e Cry17, não foram isoladas de nenhuma estirpe de B. thuringiensis. As proteínas Cry18Aa, Cry18Ba e Cry18Ca foram isoladas do cromossomo do patógeno obrigatório Bacillus poppiliae e apresentaram peso molecular de 79, 76 e 78 kDa, respectivamente (Crickmore et al., 1998). O gene cry18Aa codifica uma proteína com atividade contra o coleóptero Melolontha melolontha L (Coleoptera: Scarabaeidae), que apresenta 40% de identidade com a proteína Cry2 de B. thuringiensis (Zhang et al., 1997). As proteínas Cry19 mostraram atividade contra dípteros e possuem dois integrantes: Cry19Aa e Cry19Ba. Cry19Aa foi isolada de B. thuringiensis subsp. jegathesan, com peso molecular de 75 kDa (Rosso & Delecluse, 1997), enquanto a Cry19Ba foi isolada de B. thuringiensis subsp higo e apresenta peso molecular de 78 kDa e apresenta atividade para C. pipiens, mas não para A. stephensi, além disso, possui 49% de identidade e 56% de similaridade com Cry19Aa. Cry20Aa foi isolada da estirpe B. thuringiensis subsp. fukuokaensis e mostrou atividade contra os dípteros A. aegypti e C. quinquefasciatus e codifica uma proteína de 86 kDa (Lee & Gill, 1997). Cry21Aa e Cry21Ba são eficazes contra nematóides, enquanto Cry22Aa é eficaz contra himenópteros e apresenta peso molecular de 79kDa; já as proteínas Cry22Ab e Cry22Ba apresentam toxicidade a insetos da ordem Coleoptera (Crickmore et al., 2002). As proteínas Cry23 e Cry24 cujos alvos ainda não foram determinados, embora se saiba que elas são codificadas por um gene críptico. A proteína do tipo Cry25Aa foi isolada da estirpe de B. thuringiensis subsp. jegathesan é ativa contra dípteros e apresenta peso molecular de 76 kDa (Crickmore et al., 2002). Cry26Aa e Cry28Aa foram isoladas de B. thuringiensis subsp. finitimus e não tiveram ainda sua atividade determinada (Wojciechowska et al., 1999). Cry27Aa foi isolada da estirpe de B. thuringiensis subsp. higo e apresenta peso molecular de 94 kDa (Crickmore et al., 2002). Cry29Aa e Cry30Aa foram isoladas da estirpe B. thuringiensis subsp medellin e são eficazes contra insetos da ordem Diptera. As proteínas do tipo Cry31, Cry32 e Cry33 não tiveram seus alvos determinados até o momento. As proteínas Cry32Aa, Cry32Ba e Cry32Ca foram isoladas de B. thuringiensis subsp. yunnanensis e a proteína Cry33Aa foi isolada da estirpe B. thuringiensis subsp. dakota (Crickmore et al., 2002). 15 As proteínas do grupo Cry34 apresentam quatro integrantes: Cry34Aa, Cry34Ab, Cry34Ac e Cry34Ba com peso molecular de 14 kDa. Já as proteínas Cry35Aa, Cry35Ab e Cry35Ac apresentam peso molecular de 44 kDa. As toxinas do grupo Cry34 e Cry35 mostraram-se ativas contra o coleóptero Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae) (Crickmore et al., 2002; Ellis et al., 2002). As proteínas Cry36 e Cry38 são ativas contra insetos da ordem Coleoptera. A proteína Cry37 ainda não teve seu alvo determinado. As proteínas Cry39 e Cry40 foram isoladas da estirpe de B. thuringiensis subsp. aizawai e apresentaram atividade mosquitocida (Crickmore et al., 2002). As proteínas Cyt são constituídas pelos grupos Cyt1 e Cyt2. A classe Cyt1 possui três integrantes: Cyt1Aa, Cyt1Ab e Cyt1Ba os quais foram isolados, respectivamente, de estirpes de B. thuringiensis subsp. israelensis (Ward et al., 1988), B. thuringiensis subsp. medellin (Thiery et al., 1997) e B. thuringiensis subsp. neoboensis. Todas apresentaram peso molecular de 27 kDa (Crickmore et al., 2002). A classe Cyt2 possui cinco integrantes: Cyt2Aa, Cyt2Ba, Cyt2Bb, Cyt2Bc e Cyt2Ca. As proteínas Cyt2Aa e Cyt2Ba foram isoladas, respectivamente, das estirpes de B. thuringiensis subsp. kyushuensis e B. thuringiensis subsp israelensis, ambas apresentaram peso molecular de 29 kDa. A proteína Cyt2Bb foi isolada de B. thuringiensis subsp jegathesan e apresenta peso molecular de 30 kDa (Cheong & Gill, 1997). Todas essas proteínas são ativas contra insetos da ordem Diptera. Com relação a Cyt2Bc pouco se sabe e, até o momento, seu alvo ainda não foi determinado. Finalmente a Cyt2Ca apresenta atividade contra insetos da ordem Coleoptera e contra Ctenocephalides spp. (Siphonaptera: Pulicidae) (Crickmore et al., 2002). -exotoxina A -exotoxina conhecida também como fosfolipase C, lecitinase ou fosfatidilcolina fosfohidrolase é uma enzima que possui atividade citolítica ao atuar sobre os fosfolipídeos que formam as membranas de diversos tipos celulares (Faust & Bulla Jr., 1982). Esta toxina é encontrada no sobrenadante de culturas e é altamente tóxica para certos insetos através de administração oral ou intra-hemocélica, causando degeneração e lise de hemócitos (Krieg, 1971). O gene correspondente a esta exotoxina já foi clonado e seqüenciado (Lechner et al., 1989). 16 -exotoxinas A -exotoxina ou thuringiensina é uma toxina termoestável produzida por certas estirpes de Bt durante a fase vegetativa e secretada no meio de cultura. Ela é produzida em grande quantidade por estirpes do sorotipo H1 e em menores quantidades por algumas estirpes dos sorotipos H4a4b, H4a4c, H5, H9, H10, H11, H12 (Sebesta et al., 1981). A toxina do tipo I é um análogo do ATP e é composta de adenina, ribose, glicose e ácido fosfoalárico, com massa molecular de 701 daltons (Farkas et al., 1969). Esta toxina atua inibindo a ação da RNA polimerase, através da competição pelo ATP e é altamente tóxica para várias ordens de insetos, ácaros, nematóides e também vertebrados, com efeitos teratogênicos e mutagênicos (Sebesta et al., 1981). Assim, a partir de 1970, os produtos comerciais de Bt à base de linhagens do sorotipo H1 foram substituídos por outros à base de linhagens não produtoras de -exotoxina (Sebesta et al., 1981). A -exotoxina do tipo II é produzida por estirpes pertencentes ao sorotipo H8a8b (morrisoni), é um análogo do UTP e apresenta toxicidade superior à toxina do tipo I, principalmente para coleópteros (Levinson et al., 1990). Estes autores afirmaram que os genes responsáveis pela síntese de -exotoxina estão localizados em plasmídeos de 75 ou 110 MDa. Vip3A Uma nova classe de proteínas inseticidas, Vip3A, com atividade contra larvas de lepidópteros foi descrita por Estruch et al. (1996). Essas proteínas são produzidas e secretadas por algumas estirpes durante a fase vegetativa e de esporulação, têm uma massa molecular predita de 88,5 kDa, não têm homologia com proteínas conhecidas e apresentam atividade contra insetos pouco sensíveis à maioria das -endotoxinas, como os noctuídeos Agrotis ipsilon, S. frugiperda e S. exigua. A clonagem e caracterização de dois genes homólogos, vip3A(a) e vip3A(b), de diferentes estirpes foram descritas (Estruch et al., 1996). Esta foi uma descoberta importante, pois atualmente não só se aproveitam a mistura de esporos e cristais obtidos após o cultivo de Bt, como também poderá ser utilizado o sobrenadante das mesmas. 17 Utilização B. thuringiensis pode ser considerado como o agente biológico de maior potencial para o controle de insetos-praga florestais, agrícolas e vetores de doença, graças à especificidade das -endotoxinas aos insetos e invertebrados-alvo, e sua inocuidade aos vertebrados e meio ambiente, inclusive insetos benéficos e inimigos naturais (Krieg & Langenbruch, 1981), fazendo deste agente um componente-chave em estratégias de manejo integrado de pragas (Bravo & Quintero, 1993; Schnepf et al., 1998). Além disto, pesticidas à base de proteínas Cry têm baixo custo de desenvolvimento e registro, em relação a um novo inseticida químico sintético (Schnepf et al., 1998). Bioinseticidas à base de Bt têm sido usados em todo o mundo com sucesso há quase quatro décadas, correspondendo a cerca de 90% dos biopesticidas comercializados no mundo (Bravo & Quintero, 1993) e a 1,5-2,0% do mercado total de inseticidas (Dias, 1992), tendo sido responsável por um mercado de US$ 100 milhões em 1990. No início de 1998, havia aproximadamente 200 produtos à base de Bt registrados nos Estados Unidos (Schnepf et al., 1998), desenvolvidos por várias companhias tais como Abbott, Sandoz, Bactec, Novo Nordisk, Mycogen. Exemplos de produtos à base de Bt podem ser vistos na tabela. Os produtos contendo toxinas específicas para lepidópteros são, comercialmente, as mais importantes, pois a maioria dos biopesticidas à base de Bt usados para controlar pragas agrícolas é à base da estirpe HD-1 da subespécie kurstaki, a qual tem alta toxicidade e amplo espectro de ação dentro da ordem Lepidoptera (Navon, 1993). A maior parte do mercado de Bt (60-70%) é dirigida para o controle de pragas florestais (Lymantria dispar nos EUA e Choristoneura spp. no Canadá), através de pulverizações aéreas, sendo o principal pesticida usado nessas florestas (Navon, 1993; van Frankenhuyzen, 1993). Produtos à base de B. thuringiensis subsp. israelensis são responsáveis por aproximadamente 20% desse mercado (Navon, 1993), sendo estes pesticidas muito efetivos e potentes no controle de mosquitos culicídeos e simulídeos, muitos dos quais vetores de doenças. Pesquisas visando obter produtos mais eficientes, mais estáveis e com espectro de atividade mais amplo estão sendo desenvolvidas usando tecnologias modernas como a do DNA recombinante. Já existem produtos engenheirados com maior persistência em campo 18 do que os convencionais. Um dos primeiros produtos de B. thuringiensis geneticamente engenheirados e aprovado para uso agrícola nos EUA foi o bioinseticida MVP (Mycogen, San Diego, CA), recomendado para o controle de P. xylostella e outros lepidópteros. Neste produto, o gene cry1Ac é expresso em altos níveis em células de Pseudomonas fluorescens, onde os cristais permanecem encapsulados (processo denominado CellCap), o que lhe confere maior persistência no campo (Gelernter & Schwab, 1993). Outros produtos, como o M-One Plus (Mycogen) à base da estirpe san diego, específica para o controle de coleópteros, desenvolvida usando o mesmo processo e recomendada para o controle do crisomelídeo L. decemlineata em batata, já estão à disposição. Há produtos geneticamente manipulados para criar combinações de genes, através da conjugação de estirpes distintas, com ação contra pragas diversas como coleópteros e lepidópteros, como, por exemplo, o produto Foil (Ecogen), recomendado para o controle do complexo de insetos da batata. Também já é possível a clonagem e expressão de genes de delta-endotoxinas em vírus, algas e bactérias habitantes do solo e do sistema vascular de plantas, que servem como sistema de transporte. Como exemplo de vírus temos o Vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) com o gene cry1Ab ou cry1Ac de delta-endotoxina no seu genoma. Neste sistema, as células do inseto expressam a toxina e a velocidade de ação do vírus é acelerada. A introdução do gene cry1Ac de Btk já foi feita na bactéria endofítica Clavibacter xyli subsp. cynodontis a qual é usada para o controle do lepidoptero Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Pyralidae) em milho. Bactérias do solo, como Pseudomonas cepacia e fluorescens transformadas com genes de Bt passam a expressar toxinas e ter ação tóxica contra insetos na risosfera. Bradyrhizobium expressando, nos nódulos, toxina de B.t. subsp. tenebrionis são usados contra coleópteros que atacam raízes de plantas. MATERIAIS E MÉTODOS 1- Recuperação na planta, e dosagem de B. thuringiensis inoculado no solo 19 Este experimento terá como objetivo verificar o tempo de permanência do B. thuringiensis nos tecidos da planta de algodão. Para isso será utilizada uma estirpe de B. thuringiensis marcada com proteína fluorescente, o que a diferenciará de outras estirpes de B. thuringiensis. Este trabalho será realizado em cooperação com a Universidade de Cardiff. O pesquisador responsável irá inserir o gene green fluorescent protein (gfp) no genoma do B. thuringiensis kurstaki (Btk) que é a estirpe padrão para matar lepidópteros. O método de transformação será por bombardeamento. A estirpe marcada será crescida em meio NYSM (Yousten, 1983) em incubador rotativo (200 rpm, 30°C, 48 horas). Em seguida, serão inoculadas 60 plantas semeadas em solo estéril e 60 plantas semeadas em solo não estéril. Será aplicado 1 ml de cultivo de Btgfp no solo próximo às raízes. Duas vezes por semana os tecidos de 3 plantas provenientes de cada solo, serão coletados para detectar a presença da estirpe marcada. Será determinada ainda a quantidade de Bt-gfp em cada um dos tecidos da planta. Para isso os tecidos serão pesados antes do isolamento da bactéria. Três folhas de cada planta serão coletadas e oferecidas como alimento para S. frugiperda e A. argilacea a fim de verificar se existe toxicidade das folhas a esses insetos. 2- Determinação da melhor forma de inoculação do B. thuringiensis Este trabalho será realizado em cooperação com a Embrapa Cerrados. Diferentes formas de inoculação do B. thuringiensis serão testadas, de forma a se recuperar as maiores quantidades de Bt-gfp na planta, tais como: adicionados à turfa, adicionados à semente com diferentes substancias adesivas, formulados como microencapsulados, etc. A proporção de bactéria será de 40 ml de caldo de Bt-gfp para cada 100 gramas de turfa ou semente. A forma de avaliação será realizada como a descrita no ítem anterior, verificandose a presença e quantidade da bactéria em cada um dos tecidos. Três folhas de cada planta serão coletadas e oferecidas como alimento para S. frugiperda e A. argilacea a fim de verificar se existe toxicidade das folhas a esses insetos. 20 3- Ensaios utilizando as estirpes de B. thuringiensis pertencentes ao Banco de Bactérias Entomopatogênicas da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Uma vez determinada a forma e viabilidade da utilização de B. thuringiensis, as melhores estirpes do banco serão testadas para controle de lepidópteros e coleópteros. No caso dos lepidópteros serão utilizados como modelo S. frugiperda e A. argilacea. No caso de coleópteros, será utilizado o bicudo-do-algodoeiro. As estirpes utilizadas serão aquelas que apresentaram maior toxicidade aos insetos supra-citados em experimentos anteriormente realizados; no caso de lepidópteros as de número S811, S845, S1905 e no caso de coleópteros as de número S811, S601. Em ambos os ensaios serão utilizados os padrões B. thuringiensis kurstaki (lepidópteros) e B. thuringiensis tenebrionis (coleópteros). Para cada inseto, serão utilizadas 4 repetições com 20 plantas para cada bactéria e para o controle. Serão colocados 10 insetos por planta. O experimento será repetido pelo menos 3 vezes. 4- Testes em condições simuladas de campo Uma vez definidos a estirpe de B. thuringiensis, a forma de aplicação e a freqüência da aplicação, serão realizados testes de campo em condições simuladas. Este trabalho será realizado na Embrapa Algodão, que conta com área experimental e condições propícias para a realização do ensaio. O dispositivo experimental será delineado em blocos ao acaso, com quatro tratamentos e sete repetições. Cada parcela será constituída de cinco linhas de algodoeiro, compreendendo cada uma vinte e cinco plantas. Os tratamentos serão: Cepa de Bt selecionada para lepidópteros, cepa Bt selecionada para coleópteros, mistura das duas cepas, produto químico. 21 RECURSOS FÍSICOS O projeto aqui proposto é de natureza multidisciplinar e envolve a utilização de conceitos e técnicas de diversas áreas, sendo as principais: microbiologia geral, microbiologia de solos, Bioquímica e biologia molecular e entomologia . O projeto será desenvolvido por quatro instituições: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, nos laboratórios de Bacteriologia e microscopia eletrônica, que contam com quase toda a infra-estrutura necessária para a caracterização de estirpes, realização de bioensaios, caracterização de tecidos; a Universidade de Cardiff, que conta com estrutura e equipamentos de biologia molecular; a Embrapa Cerrados, que conta com estrutura para desenvolver diferentes inoculantes e a Embrapa Algodão, que conta com infra-estrutura necessária a realização de testes de campo simulados. Esses centros contam com quase todos os equipamentos necessários à execução do projeto e almejam adquirir os outros equipamentos restantes com a aprovação desta proposta. A listagem completa dos equipamentos disponíveis e necessários estão descritos no item Equipamentos, na listagem dos formulários obrigatórios. 22 RECURSOS HUMANOS A equipe técnica é composta por pesquisadores da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Embrapa Algodão, Embrapa Cerrados, Universidade de Cardiff, alunos de pós-graduação em biologia molecular da Universidade Católica de Brasília e de agronomia da Universidade de Brasília e estudantes de gradução dos cursos de agronomia e biologia da Universidade de Brasília e da Universidade Católica de Brasília. Na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia os laboratórios envolvidos são o de bacteriologia e microscopia eletrônica, sob responsabilidade da Dra. Rose Monnerat e do Dr. Guy Capdeville. O laboratório de Bacteriologia possui uma coleção de Bactérias entomopatogênicas, onde estão armazenadas muitas estirpes de Bacillus thuringiensis isoladas a partir de amostras coletadas no Brasil. Essas estirpes estão sendo testadas contra S.a frugiperda e serão testadas contra as demais lagartas da cultura do algodão. A Embrapa Cerrados participará dos experimentos com inoculantes. Os testes de campo serão realizados na Embrapa Algodão e a transformação da bactéria será efetuada pela Universidade de Cardiff. 23 EQUIPE TÉCNICA Nome Rose Gomes Função Formação acadêmica % Dedicação Coordenador PhD – Microbiologia/Entomologia 100 Pesquisador PhD 50 colaborador Molecular Monnerat Solon de Pontes Colin Berry Roseane Cavalcanti Pesquisador Santos colaborador Ieda Mendes Pesquisador Bioquímica e Biologia PhD Biologia Molecular 50 PhD 30 Colaborador Lilian Botelho Praça Erica Martins Técnica de MSc- Agronoma 100 nível superior Estudante de BSc - Biologia 100 BSc - Biologia 100 mestrado Caroline Demo Estudante Mestrado 4 técnicos de nível 100 superior 24 Referências Bibliograficas Aronson, A.I., Beckman, W. y P. Dunn. Bacillus thuringiensis and related insect pathogens. Microbiol. Rev. 50, 1-24. 1986. Azevedo, J.L. Microorganismos endofíticos. In: Ecologia Microbiana. Melo, I.S. and Azevedo, J.L. (edts). Editora EMBRAPA, Jaguariúna, São Paulo, Brasil. Pp. 117137. 1998. 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Descrição do Projeto título do projeto período de execução Utilização de Bacillus thuringiensis endofíticos para controle de início maio de 2004 insetos-praga do algodoeiro término abril de 2005 Identificação do objeto Testar diferentes formas de aplicação de B. thuringiensis em algodão para que este, colonizando a planta, combata insetos-praga da cultura justificativa da proposição 30 O Bacillus thuringiensis vem sendo utilizado há muitos anos como bioinseticida para controle de diversos insetos-praga. A grande limitação do seu uso, é o fato do inseto ter de ingerir esta bactéria para morrer, pois a toxina do Bt atua a nível do intestino da larva. Com isso, insetos que não entram em contato com a bactéria não podem ser combatidos. Este fato fez com que pesquisadores buscassem novas estratégias para controle de insetos, como as plantas transgênicas. Recentes trabalhos realizados em nosso laboratório indicaram que o Bt pode ser uma bactéria endofítica, pois isolamos diversas estirpes desta bactéria de diferentes partes do algodão. Estas plantas vieram de um campo onde nunca foi detectada a presença de lagartas e constatamos que Spodoptera frugiperda alimentada com folhas desse algodão tinham seu desenvolvimento larval alterado e ao fim de 5 dias morriam. Num experimento posterior, inoculamos Bt marcado próximo às raízes do algodão e o recuperamos no inseto que se alimentou das folhas desta mesma planta. Este tipo de trabalho nunca foi realizado em nenhum local do mundo, mas sabe-se que muitas vezes as plantas podem se tornar resistentes a insetos devido a presença de fungos no seu interior. O objetivo do trabalho é verificar se realmente o Bt pode colonizar tecidos da planta de algodão, tornando-a resistente a insetos e neste caso ser utilizado como inoculante ou como produto para aplicação nas raízes. É importante salientar que esta é uma estratégia diferente, que pode tornar a planta resistente, sem ser via transgenia. Como se trata de algo novo, gostaríamos de um apoio financeiro de um ano, para que tenhamos subsídios científicos para, caso nossas hipóteses sejam confirmadas, submeter o projeto posteriormente para a realização de testes de campo. Valor pleiteado junto ao FUNDO: R$98.730,00 Valor da Contrapartida: R$ 411.844,00 Valor TOTAL do projeto: R$ 510.574,00 Solicitou apoio a outra Instituição? Não( x ) Sim( ) Qual? Autorizo a análise desta CARTA CONSULTA e do eventual PROJETO TÉCNICO, segundo a sistemática estabelecida e, em particular que seja submetido ao exame de consultores Ad Hoc escolhidos pelo FACUAL, cujas identidades serão mantidas em sigilo. Declaro a regularidade junto aos órgãos, da Receita Federal, Estadual e obrigações trabalhistas, disponibilizando as competentes certidões a qualquer tempo que forem solicitadas. Assinatura Local e Data 31 FORMULÁRIO 2 Cronograma de Execução e Plano de Aplicação meta 1- Determinar a melhor forma de inoculação do B. thuringiensis para proteger a planta do ataque de insetos etapa fase especificação 1 Marcar a estirpe de B. thuringiensis com gene da proteína fluorescente Estirpe marcada 1 2 Testar diferentes formas de inoculação do B. thuringiensis 1 3 Avaliar a periodicidade da aplicação 4 Selecionar dentre as estirpes tóxicas do banco, quais as melhores para matar S. frugiperda, A. argilacea e A. grandis Determinar em quais tecidos a bactéria se localiza e se reproduz Disponibilizaçã o de metodologia Disponibilizaçã o de metodologia Número de estirpes Trabalho científico 1 2- Esclarecer o mecanismo 1 de colonização da planta pelo B. thuringiensis 2 3- Testar a eficiência da tecnologia em condições controladas de campo 4- Avaliação geral dos resultados 1 1 natureza da despesa Especificação Equipamentos importados e nacionais Material de consumo nacional Material de consumo importado Passagens aéreas Recursos Humanos Manutenção de equipamentos Diárias Serviços de terceiros total geral indicador físico unidade quantidade 1 2 Verificar o tipo de interação entre a planta e Trabalho a bactéria científico Executar testes de campo Número de testes 1 Compilação dos resultados, avaliação geral 1 total 407.400,00 23.130,00 12.200,00 50.444,00 2.000,00 9.000,00 6.400,00 510.574,00 Relatório concedente 42.000,00 23.130,00 12.200,00 6.000,00 9.000,00 6.400,00 98.730,00 3 Proponente 365.400,00 44.444,00 2.000,00 411.844,00 32
