detecção simultânea dos vírus do enrolamento (plrv

605
tubers after artificial break of dormancy. Potato
Research, Wageningen, v. 23, n. 2, p. 353359,1980. (Short Communication).
HOOKER, W. J. Compendium of potato disease. St
Paul: American Phytopathological Society, 1981.
125 p.
MAAT, D. Z.; HUTTINGA, H. Serology In: DE
BOKX, J. A.; VAN DER WANT, J. P. H. Viruses
of potatoes and seed-potato production.
Wageningen: Pudoc, 1987. Cap. 4, p. 45-57.
MARTINS, C. F. R.; LIMA, M. I.; KITAJIMA, E. W.
Caracterização serológica do Rhabdovirus da mancha amarela da graviola. Fitopatologia Brasileira,
Brasília, v.19, p. 321, ago.1994. (SuplementoResumo 337).
MONTHLY BULLETIN OF STATISTICS – Rome:
FAO, v.7, 1994.
SIQUEIRA, O. Indexação e formação de estoque básico
de batata semente. Revista da Sociedade Brasileira de Fitopatologia, Viçosa, v. 2, n. 2, p. 100-113,
fev. 1968.
TAMADA, T.; HARRISON B. D. Factors affecting the
detection of potato leafroll virus in potato foliage by
enzyme-linked immunosorbent assay. Annals
Applied Biology, Warwickshire, v. 95, n. 2, p. 209219, July 1980.
VAN REGENMORTEL , M. H. V. Serology and
immunochemistry of plant viruses. New York:
Academic Press, 1982. 302p.
VOLLER, A.; BATTLETT, A.; BIDWELL, D.;
CLARK, F.; ADAMS, A. N. The detection of
viruses by Enzyme Linked Immunosorbent Assay.
Journal of General Biology, London, v. 33, n. 1,
p.165-167, 1976.
SHEPARD, J. F; CLAFLIN, L. E. Critical analysis of
principles of seed potato certification. Annual
Rewiew Phytopathology, Palo Alto, v.13. p. 271293, 1975.
Ciênc. agrotec., Lavras, v.24, n.3, p.597-604, jul./set., 2000
604
* Combinações não testadas.
A utilização de mistura de anti-soros para detecção simultânea de vírus não tem sido explorada, de
modo que praticamente não são encontradas referências
na literatura sobre esse assunto. Entretanto, pelos resultados deste trabalho, conclui-se que a adoção dessa prática é bastante viável e poderá ser utilizada
como técnica de rotina com a mesma facilidade que
se encontra quando se utilizam os anti-soros isoladamente. Como o ELISA ainda é considerado muito
dispendioso em países como o Brasil, que tem que
importar as microplacas e a maioria dos reagentes
empregados, o seu uso ainda é bastante restrito e
tem dificultado a implantação desses testes para a
indexação de vírus em batata-semente, nas diversas
regiões produtoras do país, tornando pouco eficientes os sistemas de certificação. A utilização de uma
mistura de anti-soros significa uma economia substancial, tanto de material como de mão-de-obra, o
que diminui o custo final dessa técnica e a torna
mais acessível para uso rotineiro.
General Virology, London, v. 34, n.3, p. 475-483,
1977.
COSTA. A. S. Doenças de virus do fumo, batata e
tomateiro. Rio de Janeiro: Ministério da Agricultura, 1948. 82p. (Boletim).
CUPERTINO, F. P. Controle das doenças de vírus na
cultura da batata mediante certificação. In:
ENCONTRO NACIONAL DE FITOSSANITARISTAS, 3., Florianópolis, 1984. Anais... Brasília:
MA - Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária,
1984. p.131-139.
DANIELS, J. Métodos imunológicos utilizados na diagnose de doenças de plantas. Revisão Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo, v. 2, p. 53-84,
1994.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
DANIELS, J.; PAIVA, E.; ASSIS, M. DE; CASTRO,
L. A. S. Produção e utilização de anti-soro para
diagnose de viroses em batata. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 9, p.344, ago. 1994. (Suplemento-Resumo, 412).
BARKER, H. Incidence of potato virus Y infection in
seed and ware tubers of the potato cv. Record.
Annals Applied Biology, Warwickshire, v. 8, n. 44,
p. 140-143, Sept. 1993.
D'ARCY, C. J.; HEWINGS, A. D.; EASTMAN, C. E.
Reliable detection of barley uellow dwarf viruses in
field samples by monoclonal antibodies. Plant
Disease, St. Paul, v. 76, p. 273 - 276, 1992.
BERIAN, L. O. S. A serologia como método auxiliar no controle de fitovirus. Summa Phytopathologica, Piracicaba, v. 1, n. 2, p. 121-126, jul.
1985.
DE BOKX, J. A.; MOOI, J. C. Methods of quality
assessment of seed potatoes. Potato Research,
Wageningen, v.17, n. 3, p. 410-433, 1974.
BRADISH, C. J. ; CRAWFORD, L. V. Biophysical
studies on the interactions between the viruses of
tobacco mosaic and tomato bushy stunt and their
rabbit antisera. Virology, London, v. 11, p. 48 - 37,
1960.
BRAUN, A. L; OPGENORT, D. C. Comparative
detectability of Potato Leafroll Virus, Potato Virus
X and Potato Virus S using Enzyme Linked
Immunosorbent Assay (ELISA) and Serologically
specific Eletron Microscopy (SSEM). American
Potato Journal, Orono, v. 64, p. 205-212. Apr.
1987. (Short Communication).
CLARK, M. F; ADAMS, A. N. Caracteristics of the
Microplate Method of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for detection of plant viruses. Journal of
DE BOKX, J. A.; PIRON, P. G. M; MAAT D. Z.
Detection of potato vírus X in tubers with the
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Potato Research, Wageningen, v.23, n. 1, p.129131, 1980.
DUSI, A. N.; CARVALHO, M. G. DE; ZAMBOLIM,
L. O teste de difusão radial simples comparado ao
ELISA na detecção de VMCF em sementes de feijoeiro. Fitopatologia Brasileira, Brasilia, v.12,
p.149, jul. 1987. (Suplemento-Resumo, 179).
FIGUEIRA, A.R.; DOMIER, L.L.; DARCY, C. D.
Detection of Barley Yellow Dwarf Virus-PVA- IL
by using differnts techiniques. Phytopathology, St.
Paul, v. 85, n. 10, Oct. 1995. (Resumo, 730).
Ciênc. agrotec., Lavras, v.24, n.3, p.597-604, jul./set., 2000
GUGERLI, P.; GEHRIGER, W. Enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) for the detection of
potato leafroll virus and potato virus Y in potato
603
para detectar esses vírus em plantas de batata com infecções mistas. Os resultados obtidos estão representados na tabela 2 e confirmam a eficiência da técnica
para detecção dos vírus em plantas de batata com infecções mistas, pois o menor valor de absorbância das
amostras foi igual a 10 vezes a absorbância média dos
respectivos controles.
Quando o DAS-ELISA foi desenvolvido, era
utilizado um volume de 200 µl/orifício (Voller et al.
1976; Clark e Adams, 1977) para cada reagente. Entretanto, além de se empregar um volume muito grande
dos antígenos, anti-corpos e reagentes envolvidos, ainda facilitava o aparecimento de reações positivas falsas,
devido ao fato de o orifício ficar muito cheio e haver a
probabilidade de contaminar o orifício adjacente no
decorrer da manipulação da microplaca, durante a
realização da técnica. Por isso, alguns pesquisadores
investigaram a possibilidade de se diminuir o volume
empregado no DAS e TAS-ELISA, para a detecção de
estirpes do vírus do nanismo amarelo da cevada
(Barley
Yellow dwarf virus - BYDV), sem diminuir a sua sensibilidade e eficiência, e descobriram que o volume de 50
µl/orifício foi capaz de proporcionar resultados repetitivos, com a mesma sensibilidade e confiabilidade que se
obtinha quando se empregavam 200 µl (D'Arcy ,
Hewings e Eastman, 1992; Figueira, Domier e Darcy,
1995). Os resultados aqui obtidos, na detecção dos três
principais vírus que infectam a batateira no Brasil,
também demonstraram que a utilização de 50 µl na
técnica DAS-ELISA não comprometeu a sua eficiência
e sensibilidade.
A única limitação é que quando se utiliza
uma mistura de anti-soros, e se obtêm resultados
positivos, não é possível saber com qual dos vírus a
planta está infectada ou se ela está infectada com
um ou mais vírus. Entretanto, se existir a necessidade de se conhecer a identidade dos vírus, pode-se
repetir os testes somente para as amostras que mostrarem reação positiva, o que, ainda assim, significará
uma economia substancial.
TABELA 2 - Detecção simultânea de vírus, por DAS-ELISA, em extratos de plantas de batata cv. Achat infectadas com um ou mais vírus, utilizando-se diferentes combinações de antígenos e de anti-soros.
Anti-Soros
Média da absorbância das amostras dividida pela média da
absorbância dos controle nas diferentes combinações testadas
----------------------------------------------------------------------------------
Antígenos
PVX + PVY
PVY + PLRV
Média da
Absorbância
dos controles
PVX + PLRV
PVX+ PVY + PLRV
PVX
6,58
-*
5,02
2,21
0,22
PVY
17,07
9,64
-
11,14
0,18
PLRV
-
6,44
2,66
3,90
0,17
PVX+PVY
12,39
5,32
2,33
4,01
0,22
PVY+PLRV
2,30
11,07
2,61
7,53
0,17
PVX+PLRV
4,99
2,60
5,00
7,71
0,16
PVX+PVY+PLRV
3,91
5,33
7,72
11,06
0,14
Ciênc. agrotec., Lavras, v.24, n.3, p.597-604, jul./set., 2000
Ciênc. agrotec., Lavras, v.24, n.3, p.597-604, jul./set., 2000
23,69
22,34
23,66
21,74
22,50
20,56
11,63
PLRV
PVX+PVY(50**)
PVX+ PVY(100)
PVX+PLRV(50)
PVX+PLRV(100)
PVY+PLRV(50)
PVY+PLRV(100)
PVX+PVY+PLRV(50)
PVX+PVY+PLRV(100)
PVX+PVY+PLRV(150)
-
-
-
3,72
19,14 12,78 -
-
a
PLRV
3,90
8,31
6,67
2,17
5,90
5,14
23,14 19,07 22,24 18,98
15,24 9,14
-
-
-
-
1,76
-
-
b
7,00
13,37 4,08
8,54
6,58
18,10 23,84 23,19 23,92 23,35
11,22 28,50 21,09 25,37 19,96
-
-
12,34 -
11,21 -
14,99 21,39 22,92 -
12,41 22,32 13,66 -
-
-
-*
b
17,12
27,61
33,55
-
-
-
-
21,99
33,04
-
20,42
28,61
a
9,35
27,14
27,16
-
-
-
-
22,87
21,46
-
14,59
11,71
b
PVX+PVY
13,69
26,20
30,39
-
-
21,91
29,16
-
-
3,39
-
26,83
a
8,82
25,79
23,36
-
-
15,05
13,82
-
-
2,55
-
9,62
b
PVX+PLRV
15,49
26,64
31,18
23,62
15,19
-
-
-
-
3,52
18,62
-
a
7,92
25,98
25,87
18,05
10,60
-
-
-
-
2,62
13,88
-
b
PVY+PLRV
15,44
24,85
30,18
23,58
16,77
22,23
27,20
21,91
31,24
4,79
20,94
25,20
13,06
24,8
3,50
15,87
5,04
21,66
12,09
22,82
12,79
2,64
14,72
8,72
b
PVX+PVY+PLRV
a
0,193
0,120
0,098
0,128
0,166
0,137
0,085
0,140
0,083
0,130
0,138
0,096
Média da
Absorbância
dos Controles
* combinações não testadas; ** µl/orifício da placa; a: diluição do antígeno 1:80; b: Maior diluição do antígeno que mostrou ELISA positivo em testes.
-
PVY
11,4
a
23,5
PVY
b
a
Antígenos
Valores médios da absorbância das amostras divididos pela média da absorbância dos controles nas diferentes
combinações testadas
PVX
PVX
Anti-Soros
a)
TABELA 1 - Detecção simultânea de vírus por DAS ELISA, em extratos de folhas de plantas indicadoras, utilizando-se
diferentes volumes e diferentes combinações de antígenos e de anti-soros.
602
601
a diminuição do volume para 50 µl, o DAS-ELISA
pode ser empregado com uma alta eficiência para
detecção simultânea do PVX, PVY e do PLRV.
Após a triagem inicial, que revelou ser possível
a detecção simultânea de dois ou três vírus, com um
volume de 50 µl/orifício, foi então testada essa técnica
Ciênc. agrotec., Lavras, v.24, n.3, p.597-604, jul./set., 2000
600
dicadoras e de batata sadias, obedecendo à mesma metodologia, com a mesma combinação e quantidade de
folhas utilizada para as plantas infectadas.
Após a adição dos antígenos, as placas foram incubadas a 4oC por uma noite e, em seguida, foram lavadas como descrito anteriormente. Em seguida, fezse a
adição do anticorpo conjugado, utilizando-se os mesmos volumes e concentrações da cobertura das respectivas placas, e incubando-se por duas horas a 37oC, com
posterior lavagens e adição do substrato pnitofenilfosfato. Após nova incubação por duas horas, à
temperatura ambiente, fez-se a leitura em leitor de placa fabricado pela Dynatech Laboratories, modelo MRX,
com filtro de 405 nm.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados dos testes realizados para verificar
a possibilidade de detecção simultânea dos vírus em
plantas indicadoras, numa mesma amostra, encontramse na Tabela 1. Pode-se observar que foi possível a
detecção de vírus em todas as combinações de antisoros utilizadas, juntos ou separadamente, bem como
em todos os volumes testados. Quando foi utilizado um
único anti-soro (PVY, PVX ou PLRV) para detectar o
vírus específico em misturas de dois ou três vírus, o
valor da absorbância a 405 nm foi semelhante ao valor
obtido quando este foi utilizado para detectar o vírus
isoladamente. Quando se utilizou um único anti-soro,
para detecção de cada vírus isoladamente, as maiores
concentrações dos antígenos sempre resultaram em
uma maior absorbância.
No emprego de diferentes volumes e diferentes
combinações de antígeno/anti-soro, para a detecção de
vírus em plantas indicadoras, nem sempre a maior concentração dos antígenos resultaram numa maior absorbância. Essas variações podem ser consideradas compreensíveis, pois a reação antígeno/anticorpo é de natureza bioquímica e depende da concentração do antígeno
e do anticorpo, além de estar sujeita a uma série de influências do meio e do ambiente onde ocorre. Desse
modo, seria normal que numa mistura de anti-soros e
de antígenos, em extratos de diferentes plantas, pudesse
haver alguma interferência na reação afetando o seu resultado final (Bradish e Crawford, 1960; Van Regenmortel, 1982).
No caso específico deste trabalho, notaram-se
variações que podem ter sido provenientes da concentração antígeno/anticorpo e de outras interferências de
natureza desconhecida ocorridas durante a reação. Por
exemplo, na detecção do PVY, isoladamente e de combinações
dos
antígenos:
PVX+PVY,
PVX+
PVY+PLRV, pela mistura de anti-soros PVX+PVY
(100 µl), bem como na detecção de quase todas as
combinações de
antígenos pela mistura dos três anti-soros (100 µl),
provavelmente a concentração de moléculas de anticorpos presentes no anti-soro possa ter sido menor
do que o número de partículas virais presentes no
extrato concentrado. Isso porque pode-se notar que
as absorbâncias obtidas com os extratos concentrados foram praticamente as mesmas dos extratos diluídos, mostrando que mesmo no extrato diluído
poderia haver um número de partículas suficiente
para reagir com todas as moléculas de anticorpos
presentes na mistura.
Na maioria dos casos em que se empregaram os
três anti-soros juntos, a absorbância nos testes com 50
µl/orifício foi igual ou maior que nos testes com 100
µl/orifício para a detecção da maioria dos antígenos,
em extratos foliares concentrados, sozinhos ou combinados. Nesses casos, parece ter havido uma interferência de componentes do extrato concentrado no resultado
final da reação, pois em quase todos os casos, a absorbância dos testes com o extrato diluído aumentou com o
maior volume dos anti-soros. Quando se testou essa
combinação dos três anti-soros, contra os três antígenos
juntos, essa diferença de comportamento entre os extratos concentrados e diluídos foi muito mais evidente.
Este foi o motivo de se fazer esse trabalho, ou seja, investigar se essa possível interferência seria capaz de
comprometer a eficiência do DAS-ELISA na diagnose
simultânea desses vírus.
A menor absorbância obtida com o volume de
150 µl/orifício, dos três anti-soros juntos, provavelmente foi causada pelo fato de esses anti-soros estarem muito mais diluídos. De qualquer modo, independentemente das variabilidades observadas, os resultados mostraram que a menor absorbância obtida
quando se empregaram 50 µl de uma mistura de anti-soros para detectar um ou mais vírus foi de 13
(2,17) a 35 (3,50) vezes a absorbância dos respectivos controles. Baseando-se no fato de que é considerada positiva a amostra que apresentar um valor de
absorbância igual a duas vezes a média de absorbância do controle, os resultados obtidos foram altamente satisfatórios, demonstrando que, mesmo com
Ciênc. agrotec., Lavras, v.24, n.3, p.597-604, jul./set., 2000
599
de P. floridana Rydb infectadas com o PLRV, por 48
horas. Após esse período, foram transferidos para as
plantas a serem inoculadas, onde permaneceram por
mais 48 horas, antes de serem eliminados com inseticida. Foram utilizados 50 pulgões por planta.
O PVX e o PVY foram inoculados em plantas
de G. Globosa e de Nicotiana tabaccum L., respectivamente, pelo método de fricção com carborundum: 1 g
de folhas de plantas infectadas foram maceradas em 5
ml de tampão fosfato 0,01 M pH 7,0, contendo sulfito
de sódio 0,01 M. Após a inoculação, as plantas foram
lavadas e mantidas em casa-de-vegetação até o final dos
experimentos. Nas plantas de batata com infecções
mistas, os dois vírus foram inoculados simultaneamente. Quando as plantas foram infectadas também com o
PLRV, este foi inoculado primeiro e os outros dois vírus, sozinhos ou misturados, foram inoculados cerca 3 a
4 dias depois da eliminação do inseto- vetor.
Para realização da técnica sorológica DASELISA, foram utilizados anti-soros provenientes da
firma comercial Boehringer Mannheim. As soluções
para cobertura (tampão carbonato/bicarbonato pH 9,5 ),
extração das amostras (tampão fosfato salino (PBS) pH
7,4 + polivinilpirolidona (PVP) 20g/l), diluição do
conjugado (PBS + 0,1 % de leite desnatado + 0,01 % de
Tween 20), lavagens (PBS + Tween 20 a 0,1 %), solução de bloqueio ( PBS + 0,5 % de leite desnatado) e
para a diluição do substrato (tampão dietanolamina pH
9,8) foram preparados no Laboratório do DFP/UFLA.
Para avaliar a possibilidade da detecção simultânea do PVX, PVY e do PLRV em plantas indicadoras, as placas, com 96 orifícios, foram cobertas com diversas combinações dos três anti-soros, como segue: a)
PLRV + PVY; b) PLRV + PVX; c) PVY + PVX; d)
PLRV + PVY + PVX e também placas para PVY, PVX
e PLRV, isoladamente. Para a cobertura das placas com
dois anti-soros, foram empregados volumes de 50 e de
100 (µl/orifício). No volume de 50 µl/orifício, a diluição final de cada anti-soros foi de 1:5000 (0,01) (1 µl
de cada um dos dois anti-soros concentrados mais
49,98 µl do tampão de diluição). No volume de
100µl/orifício, misturaram-se 50µl de cada um dos dois
anti-soros diluídos 1:2500 (0,02 µl do anti-soro mais
49,98 µl do tampão de diluição), o que significa também uma diluição final de 1:5000 no volume total de
100 µl.
Quando se empregaram três anti-soros, foram
testados os volumes de 50, 100 e 150 µl por orifício da
microplaca. Para o volume de 50 e 100 µl, empregou-se
a diluição final de 1:5.000, feita conforme descrito an-
teriormente. Para o volume de 150µl, foram misturados
50 µl de cada anti-soro diluído 1:5000, o que significa
que a diluição final de cada um, nesse volume, foi de
1:15.000.
Nos testes realizados com as plantas de batata
cv. Achat, infectadas com dois ou mais vírus, utilizaram-se as mesmas combinações de anti-soros acima
descritas, porém com o volume de 50 µl/orifício, sendo
que em qualquer das combinações, de dois ou três antisoros, estes foram empregados na diluição final de
1:5000.
Depois de cobertas, as microplacas foram incubadas por 2 horas em estufa a 37oC, lavadas três vezes
em água deionizada, e uma vez em tampão de lavagem. Após as lavagens, adicionaram-se 50-150
µl/orifício da solução de bloqueio, e essas placas foram
incubadas por duas horas a 37oC. Então, se descartou a
solução de bloqueio e fez-se a adição do extrato foliar
das plantas infectadas (antígeno).
Os antígenos foram testados também em diversas combinações, utilizando-se ou uma mistura das
folhas das plantas indicadoras, infectadas com os respectivos vírus, em proporções que permitissem a diluição final desejada para cada vírus, ou a planta de batata
infectada ao mesmo tempo com dois ou três vírus. As
combinações de vírus foram: a) PLRV + PVY; b)
PLRV + PVX; c) PVY + PVX; d) PLRV + PVY +
PVX, e PVX, PVY e PLRV isoladamente, para todas as
combinações de anti-soros testadas. Foram testadas duas concentrações dos antígenos, tanto quando foram
utilizadas plantas indicadoras infectadas com um único
vírus como quando foram utilizadas plantas de batata
infectadas com mais de um vírus. Em ambos os casos, o
extrato foliar mais concentrado foi constituído por um
grama de folhas infectadas/80 ml do tampão de extração. O menos concentrado, no caso de plantas indicadoras, foi constituído pela última diluição capaz de ser
detectada pelo DAS-ELISA, determinada durante os
testes preliminares realizados neste trabalho, ou seja,
1:640 para PVY, 1:1280 para PVX e 1:160 para PLRV.
No caso das plantas de batata com infecções mistas, ou
seja, a mesma planta estava infectada com dois ou três
vírus, a maior diluição foi de 1:160 para todas as combinações em que o PLRV estava presente, e 1:640 em
combinações contendo o PVY.
Esses extratos foram distribuídos ao acaso, nas
placas, de modo a se obter oito repetições de cada antígeno para cada combinação de anti-soros utilizada.
Como controle, empregaram-se extratos das plantas inCiênc. agrotec., Lavras, v.24, n.3, p.597-604, jul./set., 2000
598
3. Professora do Departamento de Fitopatologia/UFLA.
contaminados darão origem a plantas infectadas e pouco produtivas, tornando o custo de produção inviável.
Os vírus mais freqüentemente relacionados com a degenerescência de batata-semente no Brasil são os do enrolamento-da-folha (Potato leafroll virus- PLRV), vírus
Y (Potato virus Y - PVY) e o vírus X (Potato virus X PVX) da batata, que podem causar perdas variáveis, dependendo da época da introdução e disseminação das viroses no campo (Costa, 1948; Hooker, 1981; Barker, 1993).
Para que haja um controle da incidência de vírus
na batata-semente produzida, existe a necessidade de
um controle rígido do sistema de produção, o que é
feito através dos programas de certificação. Eles envolvem uma fiscalização que se inicia logo após o plantio,
quando se faz uma inspeção visual do campo, seguida
por uma eliminação das plantas com sintomas suspeitos
de viroses, até a fase pré-colheita, quando, então, se faz
uma amostragem das batatas-semente produzidas para
submetê-las a testes de indexação de vírus em laboratório (Siqueira, 1978; De Bokx e Mooi, 1974; Shepard e
Claflin, 1975; Cupertino, 1984). Esses testes de indexação podem ser usados para determinar a incidência do
PLRV, PVY e PVX, ou qualquer outro vírus que se
queira detectar, e os resultados obtidos são decisivos
para a classificação da batatas-semente, pois as inspeções visuais, se realizadas isoladamente, são insuficientes para uma diagnose segura, pois diversas outras
causas podem ser responsáveis por sintomas semelhantes àqueles induzidos por vírus, tais como deficiências nutricionais e fitotoxidade.
Apesar de os programas de indexação de sementes já serem bastante antigos, só recentemente os
resultados de inspeções de campo vêm sendo complementados por testes em laboratório, obtendo-se, assim,
resultados mais confiáveis. Nas últimas décadas, o
DAS-ELISA (Double antibody sandwich - Enzyme
linked immunosorbent assay) tem sido a técnica sorológica preferida para detectar vírus de plantas, pela sua
simplicidade, adaptabilidade, rapidez e sensibilidade,
podendo ser utilizado em grande escala para diagnose
de um grande número de amostras ao mesmo tempo,
como acontece nos testes de indexação de vírus para
certificação da batata-semente (Tamada e Harrison,
1980; Gugerli e Gehriger, 1980; Maat e Huttinga,
1987; Braun e Opgenort, 1987). No Brasil, ele tem
sido utilizado para a detecção de diversos tipos de vírus
de plantas, e tem aumentado a eficiência dos programas de certificação de batata-semente (Berian, 1985;
Dusi, Carvalho e Zambolin, 1987; Daniels, 1994; Daniels et al., 1994; Martins, Lima e Kitajima, 1994; FiCiênc. agrotec., Lavras, v.24, n.3, p.597-6-4, jul./set., 2000
gueira, Domier e Darcy, 1995; De Bokx, Piron e Maat,
1980).
Apesar das inúmeras vantagens dessa técnica, a
sua aplicação é relativamente recente, havendo ainda
alguns aspectos a serem investigados para otimização e
racionalização do seu uso. Neste trabalho foram feitos
experimentos com a finalidade de investigar a possibilidade de se fazer a diagnose simultânea do PVX, PVY
e PLRV, do DAS-ELISA, utilizando uma combinação
de anti-soros para esses vírus. Isso poderia economizar
reagentes, materiais e a mão-de-obra envolvida na execução dos testes, barateando o seu custo e tornando-a
acessível a um público mais numeroso, o que influenciaria diretamente na qualidade e no preço final da semente produzida. Os resultados obtidos são apresentados e discutidos a seguir.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido no período de setembro
de 1996 a abril de 1997, utilizando como fontes de vírus plantas infectadas provenientes da coleção mantida
nas casas-de-vegetação do Departamento de Fitopatologia da UFLA (DFP/UFLA), sob condições controladas.
A detecção simultânea de vírus foi obtida utilizando as seguintes plantas indicadoras infectadas com
os respectivos vírus: Gomphrena globosa L. (PVX), Nicotiana tabacum L. cv. TNN (PVY), e Physalis floridana Rydb. (PLRV). Foram também testadas plantas de
batata cv. Achat infectadas com as seguintes combinações de vírus: a) PVY + PVX; b) PVY + PLRV; c) PVX
+ PLRV e d) PVX + PVY + PLRV.
As plantas indicadoras utilizadas foram obtidas
por semeadura em bandejas plásticas, transplantadas
para vasos com capacidade de 2 kg, tendo sido inoculadas cerca de 10 a 15 dias após transplantio. As plantas
de batata cv. Achat foram obtidas pelo plantio de tubérculos, previamente submetidos a forçamento de brotação, em vasos com capacidade de 5 kg, realizando-se
um desbaste para que houvesse apenas uma haste por
planta, no momento da inoculação experimental, que
foi feita cerca de 15 dias após a sua emergência.
O PLRV foi inoculado em plantas de batata e de
P. floridana Rydb., através do afídeo vetor Myzus persicae Sulz., criado em plantas sadias de pimentão
(Capsicum annum L.) e de Nicandra physaloides L,
estabelecidas em gaiolas apropriadas. Esses afídeos foram submetidos a um período de jejum de 30 minutos e,
em seguida, colocados para se alimentarem em plantas
DETECÇÃO SIMULTÂNEA DOS VÍRUS DO ENROLAMENTO (PLRV),
VÍRUS Y (PVY) E O VÍRUS X (PVX) DA BATATA (Solanum tuberosum L.)
POR DAS-ELISA1
ADRIANA A C. TRUTA2
ANTÔNIA DOS R. FIGUEIRA3
RESUMO – Foi investigada a eficiência da técnica sorológica DAS-ELISA para efetuar a detecção simultânea dos vírus do enrolamento (Potato leafroll virus PLRV), vírus X (Potato virus X -PVX) e vírus Y (Potato
virus Y -PVY) da batata, utilizando-se uma mistura de anti-soros e plantas infectadas com um ou mais vírus. O
DAS-ELISA foi realizado com 50, 100 e 150 (µl/orifício,
com diversas combinações de anti-soros, misturados na
mesma solução, em diluições finais variáveis). Os antíge-
nos foram constituídos por extratos foliares, concentrados
e diluídos, de plantas de batata da cultivar Achat, infectadas com PVX+PVY, PVY+PLRV, PVX+PLRV e
PVX+PVY+PLRV e também das seguintes plantas indicadoras: Gomphrena globosa L., Nicotiana tabacum
L. e Physalis floridana Rydb., infectadas com o PVX,
PVY e o PLRV, respectivamente. Foi possível a detecção de todos os vírus em todas as combinações e volumes de anti-soros e antígenos testados.
TERMOS PARA INDEXAÇÃO: PLRV, PVY, PVX, Detecção simultânea, DAS-ELISA
SIMULTANEOUS DETECTION OF THREE POTATO VIRUSES IN
MIXED INFECTIONS BY DAS-ELISA TECHNIQUE
ABSTRACT - The efficiency of DAS-ELISA technique
was investigated for the simultaneous detection of the
potato leafroll virus (PLRV), Potato virus X (PVX) and
Potato virus Y (PVY) by using mixed antisera and plants
infected with one, two or three viruses. DAS-ELISA was
performed with 50, 100 and 150 (µl/well, and with several
antisera combinations and dilutions. The antigens
consisted of concentrated and diluted foliar extracts of
potato plants, cv. Achat, infected with PVX+PVY,
PVY+PLRV, PVX+PLRV and PVX+PVY+PLVR and
also concentrated and diluted extracts from the
following indicator plants: Gomphrena globosa L.,
Nicotiana tabaccum L. and Physalis floridana Rydb.,
infected respectively with PVX, PVY and PLRV. The
three viruses were detected in every antigen/antiserum
combinations and volumes.
INDEX TERMS: DAS-ELISA, PLRV, PVY, PVX, Simultaneous detection DAS-ELISA
INTRODUÇÃO
o
A batata (Solanum tuberosum L.) ocupa o 4
lugar entre os principais alimentos produzidos no
mundo, desempenhando relevante papel na alimentação
humana (FAO, 1994). É cultivada no Brasil em praticamente todos os Estados e em diferentes épocas do
ano; porém, a maioria das cultivares exploradas é suscetível a viroses.
A qualidade da batata-semente é um fator de
suma importância no rendimento da cultura, pois se
trata de uma planta propagada vegetativamente por
meio dos tubérculos, que, por sua vez, são facilmente
afetados por enfermidades fúngicas, bacterianas e principalmente viróticas. As doenças viróticas, transmitidas
de geração a geração, tornam-se acumulativas, adquirindo um papel fundamental no processo de degenerescência da batata-semente, o que afeta consideravelmente a produção no campo.
As viroses têm ocupado um lugar de destaque na
degenerescência da batata, pois são doenças que não
possuem controle curativo. Isso significa que tubérculos
1. Parte da dissertação de mestrado do primeiro autor para obtenção do grau de mestre em Agronomia, área de
concentração em Fitopatologia apresentada à UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS (UFLA).
2. Aluna de mestrado do Departamento de Fitopatologia/UFLA, Caixa Postal 37, 37.200-000 - Lavras-MG.