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Análise dos Efeitos Terapêuticos
dos Electrões de Auger em
Culturas de Células
Porto, 17 de Julho de 2008
Análise dos Efeitos Terapêuticos dos
Electrões de Auger em Culturas de Células
Disciplina: Trabalhos Práticos
Curso: Mestrado em Engenharia Biomédica da Universidade do Porto
Aluna: Adriana Alexandre dos Santos Tavares
Orientador:
João Manuel R. S. Tavares
Professor Auxiliar do Departamento de Engenharia Mecânica e Gestão Industrial da FEUP
Co-Orientador:
Luís F. Metello
Professor Adjunto do Curso de Medicina Nuclear da ESTSP
Trabalhos Práticos
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Análise dos Efeitos Terapêuticos dos
Electrões de Auger em Culturas de Células
•
Conteúdos da Apresentação:
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–
–
Culturas de Células;
Ciclo Celular;
Possíveis Destinos Finais das Células Irradiadas;
Apoptose ou Morte Celular Programada – Principais Vias para Início;
•
Apoptose e Necrose;
– Radiofármaco;
•
–
–
–
–
–
–
Radiofármaco Ideal para Terapêutica com Electrões de Auger;
Citometria de Fluxo;
Procedimento de Irradiação;
Estudos de Influxo e Efluxo;
Análise da Apoptose Radioinduzida;
Conclusões Finais;
Perspectivas Futuras.
Trabalhos Práticos
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Cultura de Células
• Cultura células – o que são?
– Tipo de cultura de tecidos que envolve um conjunto de técnicas que
permitem cultivar e/ou manter células isoladas fora do organismo de
origem.
– Remover células de fragmentos de órgãos antes ou durante a cultura,
com concomitante separação das células vizinhas.
Trabalhos Práticos
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Tipos de Cultura de Células
•
•
Culturas Primárias
– Obtidas por recolha cirúrgica de
pequenas peças de tecido;
– Culturas inicialmente
heterogéneas, com o tempo
tornam-se dominadas por
fibroblastos;
– Tempo de sobrevivência in vitro
reduzido;
– Propícia a desenvolvimento de
contaminações.
Trabalhos Práticos
Linhas Celulares
– Crescimento rápido e contínuo;
– Proliferação limitada (cerca de 30
divisões celulares) ou ilimitada
(ex: células tumorais);
– Mais homogéneas, estáveis e
reprodutíveis que culturas
primárias;
– Ampla disponibilidade.
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Ciclo Celular
• Definição: conjunto de transformações dinâmicas e contínuas que
decorrem desde a formação da célula até ao momento em que ela própria,
por divisão, origina duas células-filhas D carácter cíclico, com períodos de
crescimento e de divisão.
Trabalhos Práticos
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Ciclo Celular
•
Células de mamíferos
em cultura
•
•
•
•
Fase G1 D 1 a 8 horas;
Fase S D 6 a 8 horas;
Fase G2 D 2 a 4 horas;
Fase M D < 1 hora.
•
Total ≈ 10 a 20 horas
Início ciclo
celular
Mitose
A célula divide-se
A célula aumenta de
tamanho, biossíntese
A célula preparase para se dividir
Célula
retida
A célula replica o
seu ADN
Trabalhos Práticos
A célula decide se
prossegue ou não no ciclo
celular
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Possíveis Destinos Finais de Células
Irradiadas
•
Ausência de efeito;
•
Atraso na divisão;
•
Apoptose;
•
Falha reprodutiva;
•
Instabilidade genómica;
•
Mutação;
•
Transformação;
•
Efeito bystander;
•
Respostas adaptativas.
Trabalhos Práticos
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Apoptose ou Morte Celular Programada –
Principais Vias para Início
Apoptose
Iniciada via receptores de
morte
Trabalhos Práticos
Iniciada por estímulos agentes
externos (ex: radiação)
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Apoptose e Necrose
Normal
Edema reversível
Edema Irreversível
Desintegração
Normal
Condensação
Fragmentação
Corpos Apoptóticos
Trabalhos Práticos
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Radiofármaco
• Dois componentes:
– Radionuclídeo D emissões energéticas corresponder aos
objectivos esperados e ao detector de radiação utilizado.
– Fármaco D seleccionado, com base na sua localização
preferencial num dado tecido ou órgão ou na participação
fisiológica que terá sobre determinadas células ou receptores.
Trabalhos Práticos
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Citometria de Fluxo
•
Técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas
suspensas num meio líquido em fluxo.
•
Através de um aparelho de detecção óptico-eletrónico é possível analisar
características físicas e/ou químicas de uma simples célula.
Comparação da Citometria Fluxo e Microscopia Clássica
Microscopia Clássica
Citometria de Fluxo
Detecção visual
Detecção electrónica
Centenas de células analisadas
Milhares e milhões de células analisadas
Análise qualitativa
Análise quantitativa
Células imobilizadas na lâmina e contadas
manualmente
Células em suspensão, passam individualmente
em frente ao laser do citómetro de fluxo
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Procedimento de Irradiação
• Culturas de fibroblastos expostas a actividades de 740, 1480, 2220, 2960 e
3700 MBq/ml (20, 40, 60, 80 e 100 mCi/ml) de 99mTc;
• Concluído o processo de irradiação D determinar quais as doses ideais
de irradiação;
• Irradiar apenas com as doses ideais e para diferentes doses absorvidas,
que se prevê situarem entre 1 e 2 Gy, utilizando-se intervalos cada 0.5 Gy.
Trabalhos Práticos
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Estudos de Influxo e Efluxo
• Estudo de influxo
• Estudo de efluxo
•
•
Quantidade de 99mTc-Pertecnetato de
Sódio que penetrou a membrana
celular.
Quantidade de 99mTc- Pertecnetato
de Sódio que entrou na célula, mas
foi de seguida expulso para o seu
exterior.
Centrifugação amostras cultura de células.
Compreender a capacidade de difusão do radiofármaco pela membrana
celular e sua consequente captação por parte da célula.
Trabalhos Práticos
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Análise da Apoptose Radioinduzida
• Citometria de fluxo com recurso à técnica da dupla marcação com
anexina V e iodeto de propídio.
Reagente
Diagnóstico Celular
Anexina V
Iodeto de Propídio
Células Viáveis
2
2
Início de Apoptose
3
2
Final Apoptose e Necrose
3
3
Trabalhos Práticos
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Conclusões Finais
• Linhas celulares D grande disponibilidade e elevada capacidade de
reprodutibilidade.
• Radiação D apoptose, pela indução de danos ao ADN irreparáveis.
• Crescente interesse da comunidade científica relativamente aos
radionuclídeos emissores de electrões de Auger, dos quais o 99mTc faz
parte.
Pertinência e relevância da presente Dissertação
Trabalhos Práticos
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Perspectivas Futuras
1.
Contribuição para a criação de um texto de revisão actualizado e
completo sobre o tema da Dissertação;
2.
Melhorar o conhecimento actual do papel do 99mTc enquanto agente
irradiante no contexto terapêutico, pela análise dos efeitos
radiobiológicos em culturas de células seleccionadas;
3.
Utilização de técnicas de citometria de fluxo para avaliação dos efeitos
da radiação na célula, nomeadamente, a indução da apoptose;
4.
Estudo de efluxo e influxo do 99mTc-Pertecnetato de Sódio em culturas
de células, de forma a relacionar o seu papel enquanto agente
terapêutico com a sua dinâmica celular.
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Referências
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Trabalhos Práticos
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Obrigada pela vossa atenção!
FIM